KR20080052639A

KR20080052639A - 전세포 생체촉매반응에 의한 수크로스-6-아세테이트제조방법

Info

Publication number: KR20080052639A
Application number: KR1020087008004A
Authority: KR
Inventors: 라케쉬 라트남; 선디프 오로라; 피 숩라마니얌
Original assignee: 팜드 메디케어 프리베이트 리미티드
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2008-06-11
Also published as: ZA200802519B; US20100151526A1; WO2007054972A2; AU2006313334A1; WO2007054972A3; MX2008003781A; EP1940857A4; EP1940857A2; LV13761B; NO20081868L; EA200800653A1; JP2009508518A; IL190252A0; CN101268090A; CA2623234A1; ZA200802520B

Abstract

본 발명은, 트리클로로갈락토수크로스 합성의 중간체인 6-0-보호된 수크로스 형성을 위한 6-0-보호된 글루코스와 수크로스간 반응에 촉매작용 하기 위하여, 프룩토실 전이효소군 효소를 형성할 수 있는 미생물, 특히 흑효모(Aureobasidium pullulans)등과 같은 미생물의 부동화되거나 부동화되지 않은 전세포(whole-cell) 조제물을 사용하는 방법에 대해 개시한다. 6-0-보호된 수크로스는 500 달톤 이상의 분자량을 갖는 고분자량 반응 부산물로부터 역삼투법으로 분리 후 컬럼 크로마토그래피로 정제 처리된다.

Description

전세포 생체촉매반응에 의한 수크로스-6-아세테이트 제조방법 {METHOD OF PRODUCING SUCROSE-6-ACETATE BY WHOLE-CELL BIOCATALYSIS}

본 발명은 1'-6'-디클로로-1'-6'-디데옥시-β-프룩토푸라나실-4-클로로-4-데옥시-갈락토피라노시드(TGS)를, 이것의 중간체인 수크로스-6-아세테이트의 제조를 위한 전세포 생체촉매반응을 이용하여 제조하는 방법과 기술에 관한 것이다.

4,1',6' 트리클로로갈락토수크로스(TGS) 제조에 관한 종래 기술은 주로, 인 옥시염화물, 염화옥살릴, 5염화인 등의 각종 염소화제 및 디메틸 포름아미드(DMF)나 디메틸 아세타미드 등에 의해 염소화 6-O-보호된 수크로스로부터 유래된 빌스마이어-하케 (Vilsmeier-Haack) 시약을 이용하여, 6-0-보호된 수크로스를 염소화 처리하여 6-아세틸-4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스를 형성하는 염소화 반응을 수반한다. 상기 염소화 반응 뒤에, 상기 반응물을 칼슘, 나트륨 등의 적절한 알칼리 수산화물을 사용하여 pH 7.0 내지 7.5로 중화 처리한다. 이것의 pH값을 추가로 9.5까지 상승시켜 상기 6-아세틸-4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스를 탈아실화 및/또는 탈아세틸화 함으로써 4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스를 제조하였다.

본 발명은 미생물 생체촉매반응에 의한 클로로슈가 4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스의 제조에서 핵심이 되는 중간체인 수크로스-6-아세테이트의 조제에 관 한 것이다.

수크로스-6-아세테이트는 상기 TGS 제조 과정에서 중요한 중간체이다. Mufti et al.의 미국 특허 제4,380,476호(1983년)는 피리딘에 용해된 수크로스를 -20℃ 이하의 온도에서 아세트산 무수물과 아실화 반응시켜 얻는 주요 산물로서 수크로스-6-아세테이트의 제조방법을 개시하였다. 이 방법은 다른 아실산염들로부터 원하는 모노아실레이트를 순수 형태로 분리 및 수득하는 것 또는, 이들 아실산염을 염소화 처리하고 기타의 염소화 당으로부터 TGS를 분리하기 위한 수단을 고안하는 것에 근거한다.

TGS의 분리 및 정제공정을 가능한 용이하고 간단히 수행할 수 있도록 다른 모노아실산염이나 고급 아실산염의 형성 없이 수크로스-6-아세테이트를 제조하는 방법이 요구되었다.

본 발명은, 프룩토실 전이효소를 형성할 수 있는 미생물로부터 유래된 것으로서 전세포물(whole-cell)을 포함하는 생체물을 사용하여, 프룩토실 디사카라이드의 프룩토실 성분이 수용체 모노사카라이드 혹은 수용체 모노사카라이드 유도체로 전이하는 과정에 촉매 작용함으로써 프룩토실 디사카라이드 혹은 이의 유도체를 제조하는 방법을 개시한다.

본 발명의 바람직한 구현예는 미생물 생체-촉매반응에 의한 클로로슈가 4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스의 제조를 위한 주요 중간체인 수크로스-6-아세테이트의 조제방법에 관한 것이다. 이 구현예는 흑효모(Aureobasidium pullulans:de Bary Arn.)의 전세포에 의해 생체-촉매반응된 글루코스-6-아세테이트나 6-0-보호된 글루코스로부터 수크로스-6-아세테이트 및 그의 유사체 화합물을 제조하는 방법에 대해 기술한다. 수득된 수크로스-6-아세테이트는 막필터법에 따라 고분자량의 당류로부터 분리되며 할로 슈가(halo sugar) 조제에 이용될 수 있다.

각종 미생물에 의해 상이한 종류의 프룩토실 전이효소가 생성된다. 다양한 공급원으로부터 얻은 각종 프룩토실 전이효소들의 작용은 Enzyme and Microbial Technology, 19, 107-117 (1996)에 개시되어 있다.

레반수크라제(levansucrase)는 프룩토실 전이효소군의 대표적인 효소로서, 수크로스 내의 글루코스-푸룩토스 결합의 분할 과정을 반복하여 푸룩토스를 수용체 당으로 전이시킴으로써 폴리프룩토스 유도체인 레반(levan)의 형성에 촉매 작용하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 상기 수용체 당이 수크로스 자체일 경우 고분자량의 푸룩토스 사슬을 구성하게 된다. Hestrin 및 Avigad의 논문, Biochem. J. 69 (1958)의 pp388 내지 pp398을 참조하면, 당류 중 일부가 다양한 역량도로 우수한 푸룩토스-수용체 역할을 하며 레반 형성을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 치환 글루코스는 수용체로서의 효과가 낮은 것으로 나타났다. 그러나, 수용체에 대한 푸룩토스 공여체 (예, 수크로스)의 상대 몰비가 5:1 내지 10:1로 높고 농도가 낮은 경우, 상기 치환 글루코스는 수용체 역할을 할 수 있다. 따라서, Kunst et al. 의 Eur. J. Biochem. 42, 611-620 (1974)에서는, 고초균(Bacillus subtilis) 마르부르그 균주 168의 돌연변이체로부터 유래된 효소를 이용하여, 수크로스와 함께 D-글루코스 6-포스페이트를 수용체로서 성공적으로 사용하는 방법을 소개하였다. 마찬가지로, 영국 특허 GB 2046757B에서는 수크로스 또는 라피노스와 함께 수용체로서 각종 알도스 출발물질의 용도에 대해 개시하였으며 여기서 레반수크라제는 액티노마이세스 비스코수스 (Actinomyces viscosus) 및 고초균 (수탁번호 ATCC 6051, 즉, 마르부르그 균주)를 포함한 각종 미생물로부터 유래되었다. 그러나 상기 특허출원에서 알도스는 유도화되지 않는 당으로서, 수용체에 대한 공여체의 몰비는 1:5이며 따라서 사슬형성 반응도 최저일 것으로 예상된다.

Rathbone et al (1986)의 미국특허 제4,617,269는 6-유도체화 수크로스 유도체를, 이에 상응하는 6-유도체화 글루코스나 갈락토스와 프룩토실 전이효소를 수크로스, 라피노스 또는 스타치요스의 존재하에 반응시켜 제조하는 방법을 특허청구범위로 하고 있지만, 상기 방법에 이용되는 프룩토실 전이효소를 박테리아로부터 분리해야 하는 제약이 있다.

본 발명에서, 미생물의 전세포 조제물은 수크로스에서 글루코스-6-에스테르로 푸룩토스 성분을 전이시켜 수크로스-6-에스테르를 제조하는데 성공적으로 이용되며, 상기 미생물은 프룩토실 전이효소군에 속하는 하나 이상의 효소를 합성할 수 있으며 또한 상기 미생물의 전세포는 여과, 원심분리 등을 포함하는 간단한 분리공정에 따라 반응 혼합물로부터 분리할 수 있도록 조정가능하다. 상기의 초기 조제물을 이용해도 매우 높은 전환 수율을 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 구현예에서, 글루코스-6-아세테이트와 수크로스간 반응에 의한 수크로스-6-아세테이트의 조제를 위해 이스트 흑효모를 생체 촉매로 사용한다. 그러나 상기 흑효모와 동일한 활성 및 기능을 나타낸다면 다른 미생물도 역시 본 발명의 제조방법에 이용할 수 있으며 특별한 제한은 없지만, 예를 들면, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 시도위 (Aspergillus sydowi), 흑효모 균주 (Aureobasidium sp .), 아스페르길루스 나이거 (Aspergillus niger), 페니실리움 로퀘포르티 (Penicillium roquefortii), 스트렙토코쿠스 돌연변이 (Streptococcus mutans), 페니실리움 얀세제우스키 (Penicillium jancezewskii), 사카로마이스 (Sachharomyces), 고초균, 에르위니아 등을 포함한다.

흑효모의 집락성은 맥아 추출 한천에서 급속히 증가하며 제일 먼저 묽은 삼출액으로 덮이고, 이어서 크림색 혹은 핑크 마지막엔 갈색이나 검정색으로 덮인다. 미생물 흑효모로부터 나온 효소는 다양한 종류의 모노사카라이드, 당 알코올, 알킬 알코올, 글리코사이드, 올리고당류 등 수용체의 존재 하에 수크로스에 작용하여, 프룩토실기를 광범위한 수용체 특이성을 나타내는 수용체 분자로 전이시킨다. 흑효모에서 나온 효소는 수크로스, 네오케스토스, 크실수크로스, 라피노스 및 스타치요스 등의 분해에 활성 작용한다. 전세포 반응은 은, 수은, 아연, 구리 및 주석 등의 이온에 의해 방해받기 쉽다.

상술한 수용체 분자는 다음을 예로 들 수 있다: D-아라비노스, L-프룩토스, 6-데옥시글루코스, 6-O-메틸갈락토스, 글루코스-6-아세테이트, 글루코스-6-프로피오네이트, 글루코스-6-라우레이트, 멜리비오스, 갈락토스, 크실로스, 글루코스-6-포스페이트, 글루코스-6-글루타레이트, 락토스, 갈락토스-6-아세테이트, 만노오스, 말토스, 1-티오-글루코스, 말트로트리오스, 말토펜타오스, D-아라비노스, 말토헥사오스, 이소말토스, L-아라비노스, 리보스, 라이속스(lyxose), 글루콘산, L-람노스, 6-O-메틸글루코스, 메틸-알파-D-글루코시드, 크실리톨, 글리세롤 등을 포함한다. 흑효모는 미생물 중 하나로서, 프룩토실 전이효소(SST)를 생산하는 이스트이며 세포내 및 세포외에서 모두 발견된다. 고초균 배양물로부터 얻은 효소는 프룩토실 전이 반응에서 위치특이성이 높다. 본 발명에서, 프룩토실 전이효소 생성 고초균 배양물 ATCC No. 9348은 수크로스를 6-O-아세틸글루코스와 반응시켜 수크로스-6-아세테이트를 조제하는데 이용된다. 생성되는 또다른 고분자량 당류는 분자 분리법 및 크로마토그래피법으로 수크로스-6-아세테이트로부터 분리한다.

프룩토실 전이효소는 적당한 배지를 이용한 심부배양(submerged fermentation)에 의해 흑효모로부터 수득된다. 본 발명에서 효소는 유기물로부터 분리되는 것이 아니라 전세포를 이용하여 촉매반응을 달성한다. 미생물 세포는 원심분리를 통해 액상 배지로부터 바람직하게 분리되며 이것을 탈염수로 세척한다. 그러나 상기 미생물 세포는, 트랜스프룩토실 반응을 행하기에 충분한 생체물을 생성하는데 중요한 성장 단계가 완료된 후, 트랜스프룩토실 반응의 수용체, 반응 종료후 분리 정제된 반응 산물, 및 공여체를 용해하기 위한 매질로서 잔류 배지를 함께 이용할 수도 있다.

미생물 세포체는 완충액에 용해된 수크로스 및 글루코스-6-아세테이트를 함유하는 반응 배지에 직접 현탁한다. 반응에 이용되는 수크로스 대 글루코스-6-아세테이트의 비는 2:0.5이다. 반응은 교반 하에 행해지며 수크로스-6-아세테이트의 형성을 HPLC로 관찰한다. 적절한 첨가제는 특별히 한정되지 않으나, 콘듀리톨-B-에폭시드(Conduritol-B-epoxide), 트레스타틴 등을 포함한 전화효소(invertase) 억제제를 첨가하여 원하는 산물 형성에 악영향을 미칠 수 있는 기타의 부반응을 피한다. 수크로스-6-아세테이트의 적절한 역가를 달성하면 교반을 중지하고 반응 혼합물을 여과하여 미생물 세포를 분리한다.

다음으로, 수크로스-6-아세테이트 및 기타 고분자량의 당류를 함유하는 여액을 분자 분리한다. 적절한 막분리 장치를 이용하여 500 이상의 분자량을 가진 물질을 분리한다. 저분자량의 당류가 농축된다. 수득된 수크로스-6-아세테이트의 순도는 60%로 나타났다. 추가의 정제 처리는 이동상으로 물을 이용하는 실란화 실리카 상에서 크로마토그래피로 행하였다.

상술한 반응은, 전방향(진행 방향)으로 반응이 지속되게 하는 수크로스 및 글루코스-6-아세테이트 비율 상수를 유지함으로써 연속으로 수행될 수 있다. 또한 반응에서 분리된 미생물 세포는 효소 활성에 따라 재이용될 수도 있다.

미생물체는 또한 종래 기술에서 공지된 다양한 전세포 부동화 방법 중 하나로 부동화 처리할 수 있다. 본 발명은 geri, B., Sassi, G., Specchia, V., Bosco, F. and Marzona, M., Process Biochem.(1991, 21, 331-335 참조)에서 소개한 방법을 예시적으로 이용하였다.

정제된 수크로스-6-아세테이트를 TGS 조제를 위한 염소화 방법에 사용한다.

아래의 실시예는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한도에서 본 발명의 작용에 관하여 구체적으로 설명하기 위한 것이다.

반응물, 반응물의 사용비율, 반응 조건의 범위 등은 예시를 위한 것이며 본 발명은 이에 국한되지 않고 이들의 유사 반응물, 반응 범위 및 유전적 특성이 유사한 반응까지 대상 범위가 확대된다. 일반적으로, 염소화 수크로스 제조에 있어서 당업자에게 분명한 등가의 대체물도 본 발명의 상세한 설명에 기재된 범위에 포함된다. 따라서 아세테이트에는 동일한 기능을 행할 수 있는 아실기 균등물도 포함되며, 치환 글루코스는 유사 반응 조건 하에 동일한 종류의 유사 반응을 제공하는 치환 알도스도 포함한다. 본 발명에서 응용된 그 밖의 구현예는 당업자라면 용이하게 실시할 수 있는 것으로서 본 발명의 범주에 속한다. 또한 별도의 언급이 없는 한 특정 물질에 대한 단수형 표현은 복수형에도 적용된다. 예를 들어 "유기 용매"라는 단수형 표현은 한가지 이상의 유기 용매를 연속으로 혹은 조합하여 혼합물 형태로 사용하는 것을 모두 포함한다.

실시예 1

생체 촉매반응을 위한 흑효모 세포의 성장

본 실험에서, ATCC No. 9348에서 얻은 순수한 흑효모 배양물은 사면배지 (slant)로부터 상기 배양물의 원루프풀(one loop full)을 접종시켜 200ml의 쉐이크 플라스크에서 성장시켰다. 적정 농도의 탄소 및 질소 공급원으로 구성된 배양 배지를 "Maida" (인도에서 생산된 정제 밀가루), 콩가루, 이스트 추출물, 인산염 및 염화물을 이용하여 제조했다. 배양물을 200rpm의 회전식 쉐이커에서 48시간 성장시켰다.

적절히 성장한 세포를 제2단계의 성장 배양물로 옮겨 추가로 120시간 계속 성장시켰다. 120시간 후 수득한 액상 배지를 8000rpm으로 원심분리하여 세포를 분리했다. 분리된 세포를 완충액으로 2회 세척하여 세포에 붙어있는 배지 성분을 모두 제거했다. 세포를 동결건조하여 후속 사용 전까지 유지했다.

실시예 2

흑효모 세포에 의한 글루코스 -6-아세테이트에서 수크로스 -6-아세테이트로의 전환

100g의 글루코스-6-아세테이트 및 380g의 수크로스를 반응시켰다. 반응물을 1.2리터의 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.5 내지 7.0)에 용해하여 계속 교반했다. 250g의 동결건조된 흑효모 세포를 상기 용액에 현탁시키고 온도를 35℃까지 천천히 상승시켰다. 0.25g의 트라스타틴을 반응물에 첨가하여 전화효소의 활성을 방지했다.

수크로스-6-아세테이트의 형성을 HPLC로 관찰했다. 90시간 반응 후, 반응 혼합물에 함유된 수크로스-6-아세테이트의 생성량은 45g으로 기록되었다. 반응을 추가로 120시간 지속하면 첨가된 글루코스-6-아세테이트의 전환율이 최고 45%에 달하였다.

반응 함유물은 여과하여 현탁된 세포를 제거한 뒤 역삼투 분리법에 따라 수크로스-6-아세테이트 분리를 행하였다. RO(역삼투)막은 글루코스 및 프룩토스 등의 저분자량 화합물을 모두 통과하고 고분자량 화합물만 잔류시켰다. 상기 잔류 화합물은 물을 이용하여 1.5배로 희석한 후 500달톤의 분자량 컷오프로 나노여과 처리했다. 수거된 투과물은 주로 수크로스-6-아세테이트 및 분자량 범위가 350 내지 400달톤인 기타의 화합물이었다 이들 화합물을 추가로 RO 여과처리한 후 20% 이상의 농도로 농축시켰다. 상기 수크로스-6-아세테이트의 순도는 약 85%이었으며 이것을 실란화 실리카겔 컬럼에 충전했다.

이 실험에 사용된 이동상은 pH 9.0 내지 9.5의 아세트산 완충액이며 정제된 수크로스-6-아세테이트 분획물을 분리한 후 농축 및 수분 제거를 행하였다. 물을 완전히 제거한 후 수크로스-6-아세테이트를 DMF에 가하여 염소화 처리했다.

분리된 수크로스-6-아세테이트의 순도는 90%이며 이를 TGS 조제에 이용했다.

실시예 3

에우드라짓 RL100 (아크릴 수지 공중합체)상에 부동화 처리된 흑효모 세포에 의한 글루코스 -6-아세테이트에서 수크로스 -6-아세테이트로의 전환

다음의 방법으로 에우드라짓 RL100 상에 흑효모 세포를 부동화했다.

농축후 분리한 350g의 흑효모 세포를 350g의 알긴산나트륨에 혼합하여 포집시킨 후 비이드 형태로 압출했다. 비이드를 에우드라짓 RL100으로 코팅했다. 에우드라짓 RL100은 폴리아크릴수지 공중합체이다.

100g의 글루코스-6-아세테이트 및 380g의 수크로스를 반응시켰다. 반응물을 1.2리터의 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.5 내지 7.0)에 용해하여 계속 교반했다. 에우드라짓 RL100 상에 부동화 처리된 흑효모 세포 175g을 상기 용액에 가하고 온도를 45℃까지 천천히 상승시켰다.

수크로스-6-아세테이트의 형성을 HPLC로 관찰했다. 75시간 반응후, 반응 혼합물에 함유된 수크로스-6-아세테이트의 생성량은 52g으로 기록되었다. 반응을 추 가로 100시간 지속하면 글루코스-6-아세테이트의 전환량은 최고 62g에 달하며 이는 수크로스 초기량의 32%에 해당한다.

반응 함유물은 여과하여 현탁된 세포를 제거한 뒤 역삼투 분리법에 따라 수크로스-6-아세테이트를 분리했다. RO막은 글루코스 및 프룩토스 등의 저분자량 화합물을 모두 통과하고 고분자량 화합물만 잔류시켰다. 상기 잔류 화합물은 물을 이용하여 1.5배로 희석한 후 500달톤의 분자량 컷오프로 나노여과 처리했다. 수거된 투과물은 주로 수크로스-6-아세테이트 및 분자량 범위가 350 내지 400달톤인 기타의 화합물이었다 이들 화합물을 추가로 RO 여과처리한 후 20% 이상의 농도로 농축시켰다. 상기 수크로스-6-아세테이트의 순도는 약 85%이었으며 이것을 실란화 실리카겔 컬럼에 충전했다.

이 실험에 사용된 이동상은 pH 9.0 내지 9.5의 아세트산 완충액이며 정제된 수크로스-6-아세테이트 분획물을 분리 후 농축 및 수분 제거했다. 물을 완전히 제거한 후 수크로스-6-아세테이트를 DMF에 가하여 염소화 처리했다.

실시예 4

TGS 제조를 위한 빌스마이어 시약을 이용한 수크로스 -6-아세테이트의 염소화 처리

3리터의 반응 플라스크에 275ml의 디메틸포름아미드를 넣고 0 내지 5℃로 냉각했다. 여기에 158g의 오염화인을 천천히 교반하면서 첨가하여 빌스마이어 시약을 조제하고 반응물의 온도는 30℃ 이하로 지속 유지했다. 반응물을 다시 0℃ 이하로 냉각하고 실시예 1에서 조제된 수크로스-6-아세테이트를 0 내지 5℃에서 천천히 가했다. 이어서, 상기 반응물을 80℃까지 가열하여 1시간 동안 유지하고 다시 100℃까지 가열하여 6시간을 유지한 후 마지막으로 110 내지 115℃에서 2 내지 3시간 동안 유지했다. 반응 진행 과정을 HPLC 분석으로 관찰했다.

다음으로, 반응 혼합물을 -5 내지 -8℃로 냉각하고 20% 수산화나트륨 용액을 천천히 가하여 상기 반응물의 pH를 5.5 내지 6.5의 범위로 조정했다. 상기의 과정은 반응 산물을 아세트산염 형태로 보존하기 위한 것으로서, 원하는 산물이 유기 용매속으로 분리되는 것을 촉진한다. 상기 방법으로 얻은 산물의 수율은 수크로스-6-아세테이트 유입량의 42.3%였다.

실시예 5

에우드라짓 RL100 (아크릴 수지 공중합체)상에 부동화 처리된 흑효모 세포에 의한 글루코스 -6- 벤조에이트에서 수크로스 -6- 벤조에이트로의 전환

3% 글루코스-6-벤조에이트 용액 (600ml)를 pH 6.5의 아세트산나트륨 완충액에 섞어 조제했다. 연동펌프를 이용하여 상기 용액을 흑효모 세포가 함유된 12g의 에우드라짓 RL100이 충전된 컬럼 (2cm 직경×8cm 높이)에 공급했다. 컬럼의 유출물은 공급 플라스크로 재순환시켰다. 유속은 5ml/분으로 유지했다. 60g의 수크로스를 공급 플라스크에 가하여 용해시키고 일정한 교반하에 유지했다.

반응을 36시간 동안 지속하면서 기타의 불순물 형성과 함께 글루코스-6-벤조에이트에서 수크로스-6-벤조에이트로의 전환 과정을 주기적으로 분석했다. 36시간 종료후, 반응을 중지했다. 1.2g의 수크로스-6-벤조에이트가 형성되었다. 용액내 글 루코스-6-벤조에이트 함량은 1% 미만으로 확인되었으며 이는 글루코스-6-벤조에이트를 새로 공급하면 3%까지 상승하였다. pH값을 6.5로 조정하여 반응을 지속했다. 이 결과로서, 72시간 종료시 수크로스-6-벤조에이트의 전환율은 3.6g으로 더 상승했다.

본 발명에 따르면, 흑효모의 전세포에 의해 생체-촉매반응된 글루코스-6-아세테이트나 6-0-보호된 글루코스로부터 수크로스-6-아세테이트 및 그의 유사체 화합물을 제조할 수 있으며 이렇게 수득된 수크로스-6-아세테이트는 할로 슈가(halo sugar) 조제에 이용될 수 있다.

Claims

프룩토실 디사카라이드(fructosyl disaccharide)로부터 프룩토실 디사카라이드 또는 그 유도체의 에스테르를 제조하는 방법으로서:

프룩토실 전이효소(fructosyl transferase)를 생성할 수 있는 생체 미생물의 존재하에, 알도스계 에스테르 또는 알도스 유도체계 에스테르와 프룩토실 디사카라이드를 접촉시켜 상기 프룩토실 디사카라이드 또는 그 유도체의 에스테르를 제조하는 단계; 및

상기 프룩토실 디사카라이드 또는 그 유도체의 에스테르를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,

(a) 상기 프룩토실 디사카라이드 유도체는 수크로스-6-아세테이트, 수크로스-6-벤조에이트, 6-O-메틸수크로스, 6-데옥시수크로스, 갈락토수크로스, 크실수크로스, 수크로스-6-글루타레이트, 수크로스-6-프로피오네이트, 수크로스-6-라우레이트 등을 포함하는 에스테르 중에서 선택된 하나 이상을 포함하고;

(b) 상기 프룩토실 디사카라이드는 수크로스, 라피노스 및 스타치요스(starchyose) 중 하나 이상을 포함하며;

(c) 상기 알도스계 에스테르 또는 알도스 유도체계 에스테르는 글루코스, 갈락토스, 글루코스-6-아세테이트, 글루코스-6-벤조에이트, 수크로스-6-부티레이 트, 수크로스-6-글루타레이트, 수크로스-6-라우레이트, 수크로스-6-프로피오네이트 및 수크로스-6-벤조에이트 중 하나 이상을 포함하고;

(d) 상기 프룩토실 디사카라이드의 분리는 여과, 역삼투압, 나노여과, 컬럼 크로마토그래피 등을 포함하는 분리 정제 방법 중 하나 이상 또는 이들의 조합에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 2항에 있어서,

상기 미생물은 흑효모 (Aureobasidium pullulans), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 시도위 (Aspergillus sydowi), 흑효모 균주 (Aureobasidium sp .), 아스페르길루스 나이거 (Aspergillus niger), 페니실리움 로퀘포르티 (Penicillium roquefortii), 스트렙토코쿠스 돌연변이 (Streptococcus mutans), 페니실리움 얀세제우스키 (Penicillium jancezewskii), 사카로마이스 (Sachharomyces), 고초균, 에르위니아 등을 포함하는 프룩토실 전이효소 생성 미생물 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3항에 있어서,

아라비돕시스 풀루란(Arabidopsis pullulans)의 전세포 생체물은:

(a) 상기 생체물의 신속한 성장을 촉진하기에 충분한 양의 영양물을 함유하는 액상 배지 내에서 순수 배양물로부터 반복적으로 계대배양(subculture)하는 단 계;

(b) 하나 이상의 분리 방법, 바람직하게는, 원심분리에 의해 배지로부터 세포를 분리하는 단계;

(c) 상기 배지로부터 분리된 세포를 세척하는 단계;

(d) 촉매반응을 위해 상기 전세포 생체물을 그대로 혹은, 정제나 동결건조를 포함한 보존 처리 단계 후에 적용되는 단계에 따라 조제되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서,

상기 전세포 생체물은 유리된 형태 혹은 하나 이상의 고형 지지물 상에 부동화된 형태로 이용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,

6-O-보호된 수크로스, 바람직하게는 수크로스-6-아세테이트나 수크로스-6-벤조에이트를 제조하기 위하여:

(a) 유리 형태 혹은 아크릴수지 공중합체인 에우드라짓(Eudragit) RL100으로 코팅된 알긴산염 비드 내에서의 부동화 처리 등을 포함한 부동화법에 의해 부동화된 형태로서 동결건조된 흑효모 생체물의 존재하에, 수크로스와 6-O-보호된 수크로스, 바람직하게는, 글루코스-6-아세테이트나 글루코스-6-벤조에이트를 흔들어 접촉시키는 단계;

(b) 유리 형태 혹은 부동화된 형태의 세포 생체물을 일반적인 분리 방법, 바람직하게는 여과법으로 제거하는 단계; 및

(c) 형성된 6-0-보호된 수크로스를 공정 흐름을 이용하여 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,

6-O-보호된 수크로스, 바람직하게는, 수크로스-6-아세테이트나 수크로스-6-벤조에이트를 제조하기 위하여:

(a) 고형 지지물 상에 부동화된 흑효모 생체물을 컬럼에 충전하는 단계;

(b) 수크로스와 6-0-보호된 글루코스의 용액을 상기 컬럼에 반복 통과시켜 6-0-보호된 수크로스를 생성하는 단계; 및

(c) 공정 흐름으로부터 6-0-보호된 수크로스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항 또는 7항에 있어서,

(a) 6-O-보호된 수크로스를 함유하는 공정 흐름을 역삼투 처리하여 글루코스, 프룩토스 등을 포함한 하나 이상의 저분자량 성분을 제거하고 6-0-보호된 수크로스 및 불순물이 함유된 잔류물을 수득하는 단계;

(b) 상기 잔류물을, 바람직하게는 약 1:5의 희석비율로 희석처리한 후, 500달톤의 분자량 컷오프에서 나노여과 처리하여 주로 6-0-보호된 수크로스가 함유된 투과물을 수득하는 단계;

(c) 상기 6-0-보호된 수크로스가 함유된 투과물을 역삼투 처리하여 상기 투과물을 약 20% 이상의 농도로 농축시키는 단계; 및

(d) 상기 농축된 투과물을 컬럼 크로마토그래피로 후속 정제 및 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항에 있어서,

상기 컬럼 크로마토그래피 공정은:

(a) 약 pH 9.0 내지 9.5의 알칼리성 완충액, 바람직하게는 아세트산염 완충액을 이동상으로 이용하는 실란화 실리카겔 컬럼에 상기의 농축된 투과물을 충전하는 단계; 및

(b) 수크로스-6-아세테이트를 순수 분획물로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.