BRPI0617598A2 - processo de produção de sacarose-6-acetato por meio de catálise biológica de células inteiras - Google Patents

Abstract

<B>PROCESSO DE PRODUçãO DE SACAROSE-6-ACETATO POR MEIO DE CATáLISE BIOLóGICA DE CéLULAS INTEIRAS.<D> Que consiste em um processo que utiliza preparados de células inteiras, imobilizadas ou não imobilizadas, de um microorganismo, incluindo Aureobasidium puilulans, que possa formar enzimas do grupo das frutosiltransferases, para a catalisação de uma reação entre a sacarose e a glicose 6-O-protegida, para a formação da sacarose 6-O-protegida, um intermediário na síntese da triclorogalactosacarose. A sacarose 6-O-protegida é separada por osmose reversa dos subprodutos da reação com alto pesom olecular, cujo peso molecular seja igual ou superior a 500 Daltons, e depois purificada por cromatografia em coluna.

Description

"PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SACAROSE-6-ACETATO POR MEIO DECATALISE BIOLÓGICA DE CÉLULAS INTEIRAS"

Campo Técnico

Trata-se a presente invenção de um processo inovador euma estratégia original para a produção de 1',6'-dicloro-1'-6'-dideoxi-beta-frutofuranosil-4-cloro-4-deoxi-galactopiranosídeo (TGS), que envolve o uso decatálise biológica de células inteiras, para a produção do seu derivado sacarose-6-acetato.

Fundamentos da Invenção

As estratégias dos processos da técnica anterior deprodução de 4, 1', 6'-triclorogalactosacarose (TGS) geralmente envolvem acloração de sacarose 6-O-protegida, por meio do uso do reagente Vilsmeier-Haack derivado de sacarose-6-protegida clorada, para a formação de 6-acetil-4,1',6'-triclorogalactosacarose, por meio do uso de diversos agentes de cloração,como, por exemplo, oxicloreto de fósforo, cloreto de oxalila, pentacloreto defósforo, etc., e uma amida terciária, como, por exemplo, dimetilformamida (DMF).Após a dita reação de cloração, a massa de reação é neutralizada até atingir o pHentre 7,0 e 7,7, por meio do uso de hidróxidos alcalinos apropriados de cálcio,sódio, etc. O pH da massa neutralizada é então aumentado para 9,5 ou mais,para desacilar/desacetilar a 6-acetil-4,1', 6'-triclorogalactosacarose, para formar4,1', 6'-triclorogalactosacarose.

A presente invenção se refere à preparação de umintermediário-chave, sacarose-6-acetato, para a produção de cloro-açúcar, 4,1',6'-triclorogalactosacarose, por meio de catálise biológica microbiana.

Sacarose-6-acetato é um intermediário-chave noesquema acima de produção de TGS. Mufti e outros, em 1983, na Patente Norte-Americana No. 4.380.476, descreveram um processo, no qual a sacarose-6-acetato era o produto principal de uma reação de acilação de sacarose empiridina com anidro acético, a uma temperatura abaixo de -20 graus Celsius. Asimpurezas incluem outros monoacilatos e também alguns acilatos superiores.Este processo dependia de isolar e obter os monoacilatos desejados em umaforma pura a partir de outros ou clorar todos estes acilatos e desenvolver meiospara separar o TGS de outros açúcares clorados.

Um processo de produção foi desejado para produzirsacarose-6-acetato sem a formação de outros monoacilatos ou acilatossuperiores, de tal forma que o isolamento e a purificação de TGS permaneçam omais simples possível.

Sumário da Invenção

A presente invenção descreve um processo no qual abiomassa, incluindo uma massa de células inteiras, derivada de ummicroorganismo capaz de produzir uma enzima frutosiltransferase, é utilizadapara catalisar a transferência de uma porção de frutose de um dissacarídeofrutosil para um monossacarídeo aceptor ou para um monossacarídeo aceptorderivado, para produzir um dissacarídeo frutosil ou um derivado de dissacarídeofrutosil.

Uma modalidade preferida da presente invenção se refereà preparação de um intermediário-chave, sacarose-6-acetato, para a produção decloro-açúcar, 4,1', 6'-triclorogalactosacarose, por meio de catálise biológicamicrobiana. A dita modalidade preferida da presente invenção descreve umprocesso para o preparo de sacarose-6-acetato e compostos análogos a parir deglicose-6-acetato ou a respectiva glicose 6-O-protegida, biocatalisada por célulasinteiras de Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud. A sacarose-6-acetatoobtida desta maneira é separada dos sacarídeos de peso molecular mais alto, pormeio do uso de filtração por membrana e pode ser utilizada para a preparação deaçúcares halogenados.

Descrição Detalhada da Invenção

Existem diferentes tipos de enzimas frutosiltransferasesproduzidas por uma variedade de microorganismos. A ação de diferentes enzimasfrutosiltransferases provenientes de diversas fontes é descrita em Enzyme andMicrobial Technology, 19, 107-117, 1996.A Ievanasacarase1 uma enzima típica do grupo defrutosiltransferase, é conhecida por catalisar a formação de Ievana1 um derivadode polifrutose, por meio da repetição de um processo de intensa ligação deglicose-frutose em sacarose e da transferência da frutose para um açúcaraceptor. Conseqüentemente, se o dito açúcar aceptor for a própria sacarose, seráformada uma cadeia de frutose de alto peso molecular. O trabalho de Hestrin eAvigad, em Biochem. J. 69 (1958), pp. 388-398, indica que uma variedade deaçúcares atua, com grau variado de capacidade, como bons aceptores parafrutose, competindo e inibindo a formação de levana. A glicose substituídademonstrou ser uma aceptora ineficiente. Porém, quando a proporção do doadorde frutose (isto é, sacarose) em relação à razão do aceptor é alta, tipicamente nafaixa de 5:1 a 10:1, e a concentração é baixa, observa-se que a glicosesubstituída também pode atuar como um aceptor. Assim, Kunst e outros, em Eur.J. Biochem., 42, 611-620 (1974), tiveram sucesso ao utilizarem D-glicose-6-fosfato como um aceptor com sacarose, por meio do uso de uma enzima derivadade um mutante de Bacillus subtilis Marburg linhagem 168.De forma similar, aPatente Britânica No. GB2046757B apresentou o uso como um aceptor de umavariedade de aldoses, materiais de partida com sacarose ou rafinose, sendo queuma enzima Ievanasacarase foi utilizada a partir de uma variedade demicroorganismos, incluindo Actinomyces viscosus e B.subtilis (Linhagem ATCC6051 isto é, Linhagem de Marburg). No pedido de patente, entretanto, a aldose ésempre um açúcar não-derivatizado e a razão molar do doador para o doadorutilizada é 1:5, supostamente para minimizar as reações de formação de cadeias.

Rathbone e outros, em 1986, na Patente Norte-AmericanaNo. 4.617.269, reivindicaram e descreveram um processo para o preparo dederivados de sacarose 6-derivatizada, por meio da reação da galactose ou glicose6-derivatizada correspondente com a frutosiltransferase, na presença de rafinoseou estaquiose, com uma limitação específica de que a frutosiltransferase utilizadano dito processo seja isolada de uma bactéria.

Na presente invenção, a preparação da célula inteira deum microorganismo é utilizada com êxito para a transferência da porção frutoseda sacarose para glicose-6-éster, para a produção de sacarose-6-éster, sendoque o dito microorganismo é capaz de sintetizar uma ou mais de uma enzima dogrupo frutosiltransferase e cujas células inteiras são receptivas para a separaçãoda mistura de reação, por meio de um processo simples de separação, incluindofiltração, centrifugação e algo do gênero. Observou-se que os rendimentos daconversão foram ótimos mesmo com estas preparações brutas, aumentando aeconomia e a conveniência do processo.

Na modalidade preferida da presente invenção, alevedura Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud é utilizada como umbiocatalisador para a obtenção da preparação de sacarose-6-acetato, por meio dareação de glicose-6-acetato com sacarose. Entretanto, qualquer outromicroorganismo pode ser utilizado em um processo da presente invenção, quepossa apresentar a mesma atividade e funcione como Aureobasidium pullulans,sendo que tais microorganismos incluem, mas não ficam limitados a Aspergillusoryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp., Aspergillusniger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penieillium janeezewskii,Saehharomyees, Bacillus subtilis, Erwinia e algo do gênero.

As características da colônia de Aureobasidium pullulanssão que crescem rapidamente em ágar extrato de malte (MEA), mostrando-selisa, em seguida coberta com um exudado viscoso, com cor creme ou rosa,posteriormente, ficando geralmente marrom ou preto.

A enzima proveniente do microorganismo Aureobasidiumpullulans atua sobre a sacarose na presença de vários tipos de monossacarídeos,álcoois de açúcar, álcoois alquílicos, glicosídeos, oligossacarídeos e algo dogênero, como um receptor, para transferir o grupo frutosil para a moléculareceptora, exibindo uma especificidade de recepção muito ampla. A enzimaproveniente do microorganismo Aureobasidium pullulans é ativa na decomposiçãode sacarose, neocestose, xilo-sacarose, rafinose e estaquiose. A reação dascélulas inteiras é suscetível ao efeito inibidor dos íons de prata, mercúrio, zinco,cobre e estanho.A dita molécula receptora pode ser qualquer uma entre asseguintes: D-arabinose, L-frutose, 6-deoxiglicose, 6-O-metilgalactose, glicose-6-acetato, glicose-6-propionato, glicose-6-laurato, melibiose, galactose, xilose,glicose-6-fosfato, glicose-6-glutarato, lactose, galactose-6-acetato, manose,maltose, 1-tio-glicose, maltotriose, maltopentose, D-arabinose, maltohexose,isomaltose, L-arabinose, ribose, lixose, ácido glucônico, L-ramnose, 6-O-metilglicose, metal-alfa-D-glicósido, xilitol, glicerol e algo do gênero.Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud é um dos microorganismos, umalevedura que produz a enzima frutosiltransferase (SST) e é encontrada intra eextracelularmente. A enzima proveniente da cultura de Aureobasidium pullulans(de Bary) Arnaud é altamente regioespecífica na reação da enzimafrutosiltransferase. Na presente invenção, uma cultura de Aureobasidiumpullulans (de Bary) Arnaud produtora da enzima frutosiltransferase ATCC No.9348 é utilizada para realizar a preparação de sacarose-6-acetato, por meio dareação da sacarose com 6-O-acetilglicose. Os outros sacarídeos de pesomolecular mais alto são separados da sacarose-6-acetato através de separaçãomolecular e técnicas cromatográficas.

A enzima frutosiltransferase é produzida pela cultura deAureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud através da fermentação submersa, pormeio do uso de meios apropriados, durante um período de 72 horas. Na presenteinvenção, a enzima não foi isolada do organismo e, em vez disso, são utilizadascélulas inteiras para obter a catálise. Na presente invenção, as célulasmicrobianas são, de preferência, separadas do meio líquido através decentrifugação e lavadas com água desmineralizada. Porém, acredita-se que ascélulas sejam utilizadas depois de atingir uma fase de crescimento crítico paraproduzir uma biomassa suficiente para realizar uma reação da transfrutosil, com opróprio meio residual, sem separação, como um meio para dissolver o doador etambém o aceptor de uma reação da transfrutosil e os produtos da reaçãoisolados e purificados após o término da reação.

A massa de célula microbiana fica diretamente suspensano meio de reação contendo sacarose e glicose-6-acetato, em uma soluçãotampão. A proporção de sacarose em relação à glicose-6-acetato empregada nareação é, de preferência, de 2:0,5. A reação é mantida sob agitação e a formaçãode sacarose-6-acetato é monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC). Aditivos apropriados, incluindo, mas não ficando limitados a inibidores dainvertase, que também incluem Conduritol-B-epóxido, trestatina e algo do gênero,são acrescentados à reação para evitar qualquer reação adversa que possaafetar a formação do produto desejado. Assim que o valor apropriado do título dasacarose-6-acetato é obtido, a agitação é parada e a mistura de reação é filtradapara separar as células microbianas.^

Então, o filtrado contendo sacarose-6-acetato e outrossacarídeos de peso molecular mais alto é submetido à separação molecular.Aqui, o peso molecular acima de 500 Daltons é separado por meio do uso deapropriados sistemas de separação de membranas. Os sacarídeos de pesomolecular mais baixo são concentrados. Observou-se que a pureza da sacarose-6-acetato obtida foi de 60%. Uma purificação adicional foi realizada por meio decromatografia em sílica silanizada com água, como a fase móvel.

A reação descrita acima pode ser feita de forma continua,mantendo as proporções entre sacarose e glicose-6-acetato constantes paramanter a reação na direção de avanço. Além disso, as células microbianasseparadas da reação podem ser reutilizadas, dependendo da atividade daenzima.

A massa de células microbianas também pode serimobilizada antes de um dos vários processos de imobilização de células inteirasconhecidos na técnica anterior. O processo ilustrativo utilizado aqui é adotado deGeri, B., Sassi, G., Specchia, V., Bosco, F. e Marzona, M., Process Biochem.,1991, 21, 331-335. A sacarose-6-acetato purificada é levada para cloração, para apreparação do TGS.

Abaixo, são descritos exemplos que ilustram ofuncionamento da presente invenção, sem limitar, de qualquer maneira, o âmbitoda mesma. Os reagentes, a proporção dos reagentes utilizados e a variedade dascondições de reação descritas são apresentados apenas a título de ilustração e oâmbito da presente invenção engloba seus reagentes análogos e condições dereação análogas, bem como as reações de natureza genérica análoga. Em geral,qualquer alternativa equivalente, que seja evidente para os especialistas versadosna técnica de produção de sacarose clorada, será incluída no âmbito do presenterelatório descritivo. Conseqüentemente, a citação de um acetato abrangeráqualquer grupo acila equivalente que possa executar a mesma função e o uso deuma glicose substituída abrangerá qualquer aldose substituída, que ofereça omesmo tipo de reações análogas sob condições de reação análogas. Váriasoutras adaptações das modalidades serão facilmente previsíveis por aquelesespecialistas versados nesta técnica e que também estão incluídas no âmbito dopresente relatório descritivo. A citação no singular pretende também incluir o seuplural, a menos que o contexto não permita isso, ou seja: a utilização daexpressão "um solvente orgânico" para extração abrange a utilização de um oumais de um solvente orgânico, seja sucessivamente ou em combinação, comouma mistura.

EXEMPLO 1

Crescimento de células de Aureobasidium para

catálise biológica

Em uma experiência, a cultura pura da cultura deAureobasidium obtida de ATCC No. 9348 cresceu em frascos agitados de 200ml, por meio da inoculação de uma alça cheia da dita cultura proveniente dadeclinação. O meio de cultura constituído de um ótimo nível de fontes de carbonoe nitrogênio foi preparado por meio do uso de "Maida" (farinha de trigo refinadafeita na índia), farinha de soja, extrato de levedura, fosfato e cloretos. A culturacresceu por um período de 48 horas, em um agitador rotativo a 200 RPM. Ascélulas bem-crescidas foram transferidas a uma segunda fase de cultura decrescimento e o crescimento foi continuado por um período de 120 horas. Ocaldo obtido depois de 120 horas foi centrifugado a 8000 RPM e as células foramseparadas. As células foram lavadas duas vezes com solução tampão paraeliminar todos os componentes do meio que aderem às células. As células foramentão congeladas e secas por congelamento até posterior uso.

EXEMPLO 2

Conversão de glicose-6-acetato em sacarose-6-acetato através de células de Aureobasidium

Foram colocados 100g de glicose-6-acetato e 380g desacarose para reação. Os reagentes foram dissolvidos em 1,2 litros de soluçãotampão constituída de acetato de sódio a um pH entre 6,5 e 7,0. A solução foimantida sob agitação. 250g de células secas por congelamento de Aureobasidiumforam suspensas na solução e a temperatura foi ligeiramente aumentada até35°C. Foram adicionados 0,25g de trestatina à massa de reação para inibir aatividade da invertase.

A formação de sacarose-6-acetato foi monitorada porcromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Depois de um tempo de reação de90 horas, 45g da formação de sacarose-6-acetato foram observados na misturade reação. A reação também foi continuada até 120 horas e a conversão foiobtida até 45% da glicose-6-acetato adicionada para conversão.

Os conteúdos da reação foram filtrados para remover ascélulas suspensas e então levados para o isolamento da sacarose-6-acetato,através de separação por osmose inversa. A membrana de osmose reversaseparou todos os compostos de peso molecular mais baixo, como, por exemplo,glicose e frutose, e os compostos de peso molecular mais alto foram retidos.Então, os compostos retidos foram diluídos novamente com 1:5 vezes com águae foram submetidos à nanofiltração a um peso molecular de corte de 500 Daltons,e o permeado foi coletado, sendo que o dito permeado coletado erapredominantemente sacarose-6-acetato e outros compostos, cujo peso molecularestava faixa entre 350 e 400 Daltons. Estes compostos foram novamentesubmetidos à filtração por meio de osmose reversa para concentrá-los a mais de20% de concentração. Aqui, a pureza de sacarose-6-acetato era deaproximadamente 85% e foi então carregada em uma coluna de sílica gelsilanizada. A fase móvel utilizada foi a solução tampão constituída de acetato aum pH entre 9,0 e 9,5 e as frações de sacarose-6-acetato pura foram separadas elevadas para uma concentração adicional e remoção da água. Depois daremoção completa da água, a sacarose-6-acetato foi colhida em dimetilformamida(DMF) e levada para cloração. A sacarose-6-acetato isolada era 90% pura e foilevada para a preparação de TGS.

EXEMPLO 3

Conversão de glicose-6-acetato em sacarose-6-acetato por meio de células de Aureobasidium imobilizadas em Eudragit RL100 (copolímero de resina acrílica)

As células de Aureobasidium foram imobilizadas emEudragit RL 100 por meio do seguinte processo:

350g de células de Aureobasidium separados depois dacentrifugação foram capturados em 350g de alginato de sódio por meio da misturadas mesmas e extrusão como microesferas. Estas microesferas foram entãorevestidas com Eudragit RL 100, um copolímero de resina poliacrílica.

Foram colocados 100g de glicose-6-acetato e 380g desacarose para reação. Os reagentes foram dissolvidos em 1,2 litros de soluçãotampão constituída de acetato de sódio a um pH entre 6,5 e 7,0. A solução foimantida sob agitação. Foram adicionados 175g de células de Aureobasidiumimobilizadas em Eudragit RL100 à solução e a temperatura foi ligeiramenteelevada a 45°C.

A formação de sacarose-6-acetato foi monitorada porcromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Depois de um tempo de reaçãode 75 horas, 52g da formação de sacarose-6-acetato foram observados namistura de reação. A reação também foi continuada até 100 horas e a conversãofoi obtida até 62g de sacarose-6-acetato, que era 32% da sacarose inicial.Os conteúdos da reação foram filtrados para remover ascélulas suspensas e então levados para o isolamento da sacarose-6-acetato,através de separação por osmose inversa. A membrana de osmose reversaseparou todos os compostos de peso molecular mais baixo, como, por exemplo,glicose e frutose, e os compostos de peso molecular mais alto foram retidos.Então, os compostos retidos foram diluídos novamente com 1:5 vezes em água eforam submetidos à nanofiltração a um peso molecular de corte de 500 Daltons, eo permeado foi coletado, sendo que o dito permeado coletado erapredominantemente sacarose-6-acetato e outros compostos, cujo peso molecularestava faixa entre 350 e 400 Daltons. Estes compostos foram novamentesubmetidos à filtração por meio de osmose reversa para concentrá-los a mais de20% de concentração. Aqui, a pureza de sacarose-6-acetato era deaproximadamente 85% e foi então carregada em uma coluna de sílica gelsilanizada.

A fase móvel utilizada foi a solução tampão constituída deacetato a um pH entre 9,0 e 9,5 e as frações de sacarose-6-acetato pura foramseparadas e levadas para uma concentração adicional e remoção da água.Depois da remoção completa da água, a sacarose-6-acetato foi colhida emdimetilformamida (DMF) e levada para cloração. A sacarose-6-acetato isolada era92% pura e foi levada para a preparação de TGS.

EXEMPLO 4

Cloração de sacarose-6-acetato com um reagenteVilsmeier-Haack para produzir TGS

Em um frasco de reação de 3 litros, 275 ml dedimetilformamida (DMF) foram adicionados e resfriados a uma temperatura entre0°C e 5°C. Então, foram adicionados, lentamente, 158g de pentacloreto fosforososob agitação, para formar um reagente Vilsmeier-Haack, enquanto a temperaturada massa de reação foi mantida abaixo de 30°C. A massa também foi resfriada auma temperatura abaixo de 0°C e a sacarose-6-acetato preparada do Exemplo 1foi lentamente adicionada a uma temperatura entre 0°C e 5°C. Em seguida, amassa de reação foi aquecida a uma temperatura de 80°C e mantida por umperíodo de uma hora, e depois também foi aquecida a uma temperatura de IOO°Ce mantida por um período de 6 horas e, finalmente, foi aquecida a umatemperatura entre 110°C e 115°C e mantida por um período entre 2 e 3 horas. Oprogresso da reação foi controlado por análise por cromatografia líquida de altaeficiência (HPLC). Depois disso, a mistura de reação foi resfriada a umatemperatura entre -5°C e -8°C e uma solução de hidróxido de sódio 20% foiadicionada lentamente, de modo a levar o pH da massa entre 5,5 e 6,5. Isto éfeito para reter o produto na forma de acetato, o que facilita a partição do produtodesejado em solventes orgânicos. O rendimento obtido por este processo foi de42,3% de teor de sacarose.

EXEMPLO 5

Conversão de glicose-6-acetato em sacarose-6-benzoato por meio de células de Aureobasidium imobilizadas em EudragitRL 100 (copolímero de resina acrílica)

Uma solução 3% (600 ml) de glicose-6-benzoato foipreparada em uma solução tampão constituída de acetato de sódio a um pH 6,5.Esta solução foi bombeada por meio do uso de uma bomba peristáltica para umacoluna (2 cm de diâmetro X 8 cm de altura), que foi empacotada com 12 g deEudragit RL 100 contendo células de Aureobasidium. A saída da coluna foireutilizada no frasco de alimentação. A taxa do fluxo foi mantida a 5 ml/minuto.Foram adicionados 60g de sacarose ao frasco de alimentação, dissolvidos emantidos sob constante agitação.

A reação foi continuada durante um período de 36 horascom análise periódica de conversão de glícose-6-benzoato em sacarose-6-benzoato, juntamente com outra formação de impurezas Ao término do períodode 36 horas 1,2 g de sacarose-6-benzoato foram formados e a reação foifinalizada. Observou-se que a glicose-6-benzoato avaliada na solução foi inferiora 1% e isto foi compensado 3%, pela adição de glicose-6-benzoato fresca. O pHtambém foi ajustado a 6,5 e a reação foi continuada. Isto resultou novamente emuma conversão de até 3,6g de sacarose-6-benzoato no término do período de 72horas.

Claims (9)

1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, a partir de umdissacarídeo frutosil, caracterizado pelo fato de:a. colocar o dito dissacarídeo frutosil em contato com oéster correspondente de uma aldose ou éster correspondente de um derivado deuma aldose, na presença de uma biomassa de um microorganismo produtor defrutosiltransferase, para produzir o dito éster do dissacarídeo frutosil ou seuderivado, e;b. isolar o dito éster de dissacarídeo frutosil ou seuderivado.

2. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de:a. o dito derivado de dissacarídeo frutosil compreenderum ou mais de um éster, incluindo sacarose-6-acetato, sacarose-6-benzoato,sacarose-6-metil-sacarose, 6-deoxi-sacarose, galacto-sacarose, xilo-sacarose,sacarose-6-glutaro, sacarose-6-propionato, sacarose-6-laurato e algo do gênero.b. o dito dissacarídeo frutosil compreender um ou maisentre sacarose, rafinose ou estaquiose;c. o dito éster de uma aldose ou éster correspondente deum derivado de uma aldose compreender um ou mais entre glicose, galactose,glicose-6-acetato, glicose-6-benzoato, glicose-6-butirato, glicose-6-glutarato,glicose-6-laurato, glicose-6-propionato, glicose-6-benzoato e algo do gênero.d. o dito isolamento do dissacarídeo frutosil ser obtido pormeio de um ou mais de método ou por uma combinação de um método deisolamento e purificação, incluindo, filtração, osmose reversa, nanofiltração,cromatografia em coluna e algo do gênero.

3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de o dito microorganismo compreenderum ou mais de um microorganismo produtor de frutosiltransferase, incluindoAureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillussydowi, Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii,Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii, Sachharomyces, Bacillus subtilis,Erwinia e algo do gênero.

4. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 3, caracterizado pelo fato de uma biomassa de células inteiras deAureobasidium pullulans ser preparada por meio de:a. subcultura repetida de uma cultura pura, em um meiolíquido contendo nutrientes suficientes, para promover seu rápido crescimento;b. separação das células do meio, através de um ou maisde um método de separação, de preferência, por meio de centrifugação;c. de preferência, a lavagem das células liberadas domeio;d. uso da massa de células inteiras para catalisação comotal ou depois de uma etapa de refinamento ou conservação, incluindo secagempor congelamento.

5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de a dita biomassa de células inteiras serutilizada na forma livre ou imobilizada ou mais de um suporte sólido.

6. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 5, para o preparo de sacarose-O-protegida, de preferência,sacarose-6-acetato ou sacarose-6-benzoato, caracterizado pelo fato decompreender as seguintes etapas:a. colocar em contato a sacarose e a glicose 6-0-protegida, de preferência, glicose-6-acetato ou glicose-6-benzoato, tambémpreferivelmente acompanhada de agitação, em presença de uma biomassa secapor congelamento de Aureobasidium pullulans, na forma livre ou em uma formaimobilizada por um método de imobilização, incluindo imobilização emmicroesferas de alginato revestidas com Eudragit RL 100, um copolímero deresina acrílica;b. remover a biomassa de células, livre ou imobilizada,por meio de um método de separação, de preferência, por filtração, e;c. submeter o fluxo de tratamento para o isolamento dasacarose 6-O-protegida.

7. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 5, para o preparo de sacarose-O-protegida, de preferência,sacarose-6-acetato ou sacarose-6-benzoato, caracterizado pelo fato decompreender as seguintes etapas:a. empacotar a biomassa de Aureobasidium pullulansimobilizada em um suporte sólido em uma coluna, e;b. passar, repetidamente, uma solução de sacarose e aglicose-6-O-protegida para formar a sacarose 6-O-protegida, e;c. separar a sacarose 6-O-protegida do fluxo detratamento.

8. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ÉSTER DE UMDISSACARÍDEO FRUTOSIL OU DE SEU DERIVADO, de acordo com areivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:a. submeter o dito fluxo de tratamento contendo asacarose 6-O-protegida à osmose reversa, para remover um ou mais de umcomponente de peso molecular mais baixo, incluindo glicose, frutose e algo dogênero, para a obtenção de um retentado contendo sacarose 6-O-protegida eimpurezas;b. submeter o dito retentado à nanofiltração, depreferência, após a diluição de aproximadamente 1:5, a um peso molecular decorte de 500 Daltons, para a obtenção de um permeado contendo,predominantemente, sacarose 6-O-protegida;c. submeter o dito permeado contendo sacarose 6-O-protegida à osmose reversa para concentrar o permeado a aproximadamente-20% ou a uma concentração maior, e;d. submeter o dito permeado concentrado também àpurificação e ao isolamento, por meio de cromatografia em coluna.

9. PROCESSO DE CROMATOGRAFIA EM COLUNA, deacordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o dito permeadoconcentrado:a. ser carregado em uma coluna de sílica gel silanizada,por meio do uso de uma solução tampão alcalina, com um pH entreaproximadamente 9,0 e 9,5, de preferência, uma solução tampão constituída deacetato, como a fase móvel, e;b. separar a sacarose-6-acetato como uma fração pura.