LV13761B - Method of producing sucrose-6-acetate by whole-cell biocatalysis - Google Patents

Method of producing sucrose-6-acetate by whole-cell biocatalysis Download PDF

Info

Publication number
LV13761B
LV13761B LVP-08-58A LV080058A LV13761B LV 13761 B LV13761 B LV 13761B LV 080058 A LV080058 A LV 080058A LV 13761 B LV13761 B LV 13761B
Authority
LV
Latvia
Prior art keywords
sucrose
acetate
glucose
protected
benzoate
Prior art date
Application number
LVP-08-58A
Other languages
English (en)
Inventor
Ratnam Rakesh
Sundeep Aurora
P Subramaniyam
Original Assignee
V B Medicare Private Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by V B Medicare Private Ltd filed Critical V B Medicare Private Ltd
Publication of LV13761B publication Critical patent/LV13761B/lv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Description

VIRSRAKSTS
SAHAR0ZES-6-ACETĀTA RAŽOŠANAS PAŅĒMIENS IZMANTOJOT VIENGABALAINAS ŠŪNAS BIOKATALĪZI
TEHNISKĀ JOMA
Šis izgudrojums attiecas uz jauno procesu un jaunu stratēģiju 1 ’-G'-dihlorT-6'-DIDEOKSI-p-fruktofuranazil-4-hlor-4-deoksi-galaktopiranozīda (TGS) ražošanu, ietverot viengabalainas šūnas biokatalīzi - tās starpprodukta saharozes-6-acetāta ražošanai.
IZGUDROJUMA PRIEKŠNOSACĪJUMI
4,1',6' trihlorgalaktosaharozes (TGS) ražošanas prototipa metožu stratēģijas galvenokārt ietver 6-0- aizsargātās saharozes hlorēšanu izmantojot Vilsmeier-Haack reaģentu, kas iegūts no hlorētas 6-0aizsargātas saharozes, lai izveidotu 6 acetil 4,1',6'trihlorgalaktosaharozi, izmantojot dažādus hlorēšanas līdzekļus, piemēram, fosfora oksihlorīdu, oksalilhlorīdu, fosfora pentahlorīdu u.tml., un trešējo amīdu, piemēram, dimetilformamīdu (DMF). Reakcijas masa pēc iepriekšminētās hlorēšanas reakcijas tiek neitralizēta līdz pH 7,0 - 7,5 izmantojot kalcija, nātrija u.tml. sārmainos hidroksīdus. Neitralizētās masas pH vērtība pēc tam tiek palielināta līdz 9,5 vai vairāk, lai deacilētu / deacetilētu 6 acetil 4,1',6' trihlorgalaktosaharozi, lai izveidotu 4,1',6' trihlorgalaktosaharozi.
Šis izgudrojums attiecas uz noteicošā starpprodukta saharozes-6-acetāta pagatavošanu, lai izmantojot mikrobu biokatalīzi ražotu hlorētu cukuru 4,1 '6' trihlorgalaktosaharozi.
Saharozes-6-acetāts ir noteicošais starpprodukts iepriekšminētajā TGS ražošanas shēmā. Mufti u.c. (1983) ASV patentā Nr. 4380476 norādīja procesu, kurā saharozes-6-acetāts ir saharozes acilēšanas reakcijas galvenais produkts piridinā ar etiķanhidridu temperatūrā zem -20°C.
Piemaisījumi ietver citus monoacilātus un arī dažus augstākus acilātus.
Šis process ir atkarīgs no vajadzīgā monoacilāta izdalīšanas un iegūšanas tīrā formā no citiem vai no visu šo acilātu hlorēšanas un līdzekļu izstrādāšanas, lai atdalītu TGS no citiem hlorētiem cukuriem.
Ražošanas process bija vajadzīgs, tam ir jāražo saharozes-6-acetāts neveidojot citus monoacilātus vai augstākus acilātus, lai TGS izdalīšana un attīrīšana paliktu pēc iespējas vienkārša.
KOPSAVILKUMS PAR IZGUDROJUMU
Šis izgudrojums apraksta procesu, kur biomasa, ietverot visas šūnas masu, kas iegūta no mikroorganisma, kurš spēj ražot fruktoziltransferāzi, tiek izmantota, lai katalizētu fruktozes daļas pārvietošanu no fruktozildisaharīda līdz akceptora monosaharīdam vai akceptora monosaharīda atvasinājumam, lai izveidotu fruktozildisaharīdu vai fruktozildisaharīdu atvasinājumu.
Labākie šī izgudrojuma formulējumi attiecas uz noteicošā starpprodukta saharozes-6-acetāta pagatavošanu hlorēta cukura 4,1',6'trihlorgalaktosaharozes ražošanai izmantojot mikrobu biokatalīzi. Šis formulējums apraksta saharozes-6-acetāta un analogu savienojumu izveidošanas procesu no glikozes-6-acetāta vai atbilstošas 6-0aizsargātas glikozes, kas bioloģiski katalizētas Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn. visās šūnās. Tādā veidā iegūtais saharozes-6-acetāts tiek atdalīts no augstākiem molekulāriem saharīdiem izmantojot membrānas filtrēšanu un izmantojams halogenizētu cukuru sagatavošanai.
IZGUDROJUMA DETALIZĒTS APRAKSTS
Pastāv dažāda tipa fruktoziltransferāzes fermenti, kurus veido dažādi mikroorganismi. Dažādu fruktoziltransferāžu no dažādiem avotiem iedarbība ir aprakstīta Enzyme and Microbial Technology, 19, 107-117,
1996.
Levansukrāze, fruktoziltransferāzes grupas fermentu pārstāvis, kā zināms, katalīzē levāna, polifruktozes atvasinājuma, veidošanos, atkārtojot glikozes un fruktozes saites pārraušanas procesu saharozē un pārnesīs fruktozi uz akceptora cukuru. Tādā veidā, ja akceptora cukurs ir pati saharoze, tad tā veido augstmolekulāru fruktozes ķēdi. Hestrin un Avigad darbs Biochem. J. 69 (1958) 388.-398. Ipp, norāda, ka iedarbojas daudzi cukuri ar dažādu aktivitātes spēju kā labi fruktozes akceptori traucējot un kavējot levāna veidošanos. Aizstātā glikoze izrādās ir slikts akceptors. Tomēr, ja fruktozes donora (t.i., saharozes) proporcija pret akceptora porciju ir augsta, parasti diapazonā no 5:1 līdz 10:1, un koncentrācija ir zema, tad konstatēts, ka aizstātā glikoze var iedarboties arī kā akceptors. Tā Kunst u.c. Eur.J.Biochem. 42, 611-620 (1974) guva sekmes izmantojot D-glikozes 6-fosfātu kā akceptoru ar saharozi, izmantojot fermentu, kas iegūts no Bacillus subtilis Mārburgas pasugas 168 mutanta. Līdzīgā veidā patents Nr. GB2046757B atklāja aldozes kā akceptora izmantošanu sākuma materiālos ar saharozi vai rafīnozi, kur tika izmantota levansaharoze, kas iegūta no dažādiem mikroorganismiem, kas ietvēra Actinomyces viscosus un B.subtilis (Pasuga ATCC 6051, t.i., Mārburgas pasuga). Tomēr, šajā patenta pielietojumā aldoze vienmēr ir nepietiekami atvasināts cukurs un izmantotā donora pret akceptoru molu proporcija ir
1:5, iespējams, lai samazinātu līdz minimumam ķēžu veidošanās reakcijas.
Rathbone u.c. (1986) ASV patentā Nr. 4617269 pieteica procesu, lai pagatavotu 6-atvasinātus saharozes atvasinājumus reaģējot ar atbilstošo
6-atvasināto glikozi vai galaktozi ar fruktoziltransferāzi saharozes, rafinozes vai stahiozes klātbūtnē, bet ar īpašu ierobežojumu, ka šādā procesā izmantotā fruktoziltransferāze ir izdalīta no baktērijām.
Šajā izgudrojumā visas mikroorganisma šūnas sagatavošana tiek veiksmīgi izmantota fruktozes daļas pārnešanai no saharozes uz glikozes6-esteri, lai izveidotu saharozes-6-esteri. Iepriekšminētais mikroorganisms, kas spēj sintezēt vienu vai vairākas fruktoziltransferāzes fermenta grupas un veselas šūnas, kas ir pakļaujamas atdalīšanai no reakcijas maisījuma, izmantojot vienkāršu atdalīšanas procesu, iekļaujot filtrēšanu, centrifugēšanu un tamlīdzīgi. Konstatēts, ka pārveidošanas iznākumi bija labi pat šādām neattīrītām sagatavošanām, uzlabojot metodes ekonomiju un izdevīgumu. Kā labākās atzītajā formulējumā tiek izmantotas rauga sēnītes Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn. kā biokatalizators saharozes-6-acetāta pagatavošanai glikozes-6-acetātam reaģējot ar saharozi. Tomēr, šajā izgudrojumā var izmantot jebkādu citu mikroorganismu, kam ir tāda pati aktivitāte un funkcija kā Aureobasidium pullulans, ieskaitot, bet neaprobežojoties ar, Aspergillus oryzae,
Aspergillus avvamori, Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penicillium jancezevvskii, Sachharomyces, Bacillus subtilis, Ervvinia un tamlīdzīgi.
Aureobasidium pullulans kolonijas raksturojumi ir tādi, ka tā aug ātri iesala ekstrakta agaragarā, izskatoties gludi, ātri pārklājoties ar krēmkrāsas vai sārtas krāsas gļotainiem izdalījumiem, kas vēlāk galvenokārt kļūst brūni vai melni.
Ferments no mikroorganisma Aureobasidium pullulans iedarbojas uz saharozi dažāda veida monosaharīdu, cukuru spirtu, alkilspirtu, glikozīdu, oligosaharidu un tamlīdzīgi klātbūtnē, kā receptors, lai pārnestu fruktozilgrupu uz receptora molekulu izrādot ļoti plašu receptora specifiskumu. Ferments no Aureobasidium pullulans aktīvi no rāda saharozi, neokestozi, ksilsaharozi, rafinozi un stahiozi. Visas šūnas reakcija ir uzņēmīga attiecībā pret sudraba, dzīvsudraba, cinka, vara un alvas jonu kavējošo efektu.
Iepriekšminētā receptora molekula var būt jebkura no šīm: D-arabinoze, 10 L-fruktoze, 6-deoksigIikoze, 6-O-metilgalaktoze, glikozes-6-acetāts, glikoze-6-propionats, glikoze-6-laurats, mellibioze, galaktoze, ksiloze glikoze-6-fosfats,glikoze-6-gluturats,laktoze,galaktoze-6-acetats mannoze, maltoze, 1-tioglikoze, maltrotrioze, maltopentaoze, D-arabinoze, maltoheksaoze, izomaltoze, L-arabinoze, riboze, lyksoze, glikonskābe,
L-ramnoze, 6-O-metilglikoze, metil-a-D-glikozīds, ksilitols, glicerols, un tamlīdzīgi. Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn. ir viens no rauga sēnīšu mikroorganismiem, kas rada fruktoziltransferāzes (SST) fermentu un ir atrodams šūnas iekšpusē un ārpus šūnas. Ferments no Aureobasidium kultūras ir ļoti regiospecifisks fruktozila pārnešanas reakcijā. Šajā izgudrojumā fruktoziltransferāze, kas tiek iegūta no
Aureobasidium kultūras ATCC Nr. 9348, tiek izmantota saharozes-6acetāta iegūšanai saharozei reaģējot ar 6-O-acetilglikozi. Citi iegūtie augstākmolekulārie saharīdi tiek atdalīti no saharozes-6-acetāta izmantojot molekulārās separācijas un hromatogrāfiskos tehniskos paņēmienus.
Fruktoziltransferāze tiek iegūta 72 stundās no Aureobasidium pullulans dziļuma fermentācijas procesā izmantojot piemērotu vidi. Šajā izgudrojumā ferments netika izdalīts no organisma, bet tā vietā tika izmantotas visas šūnas, lai panāktu katalīzi. Šajā izgudrojumā tiek atzīts par labāku atdalīt mikrobu šūnas no šķidrās vides izmantojot centrifūgu un mazgāt ar deminarilizētu ūdeni. Tomēr, iespējams, ka šūnas tiek izmantotas pēc kritiskās augšanas stadijas, lai izgatavotu biomasu, kas ir pietiekama, lai veiktu transfruktozila reakciju ar pašu atlikušo vidi bez vides atdalīšanas donora un transfruktozila reakcijas akceptora izšķīdināšanai, un reakcijas produkti tiek izdalīti un attīrīti pēc reakcijas beigšanās.
Mikrobu šūnu masa tiek tiešā veidā suspendēta reakcijas vidē, kas satur saharozi un glikozes-6-acetātu bufera šķīdumā. Par labāku atzīstama saharozes reakcijas proporcija attiecībā pret glikozes-6-acetātu 2:0,5. Reakcijas laikā tiek uzturēta maisīšana, un saharozes-6-acetāta veidošanās tiek kontrolēta izmantojot HPLC. Reakcijai tiek pievienotas atbilstošas piedevas, ieskaitot, bet neaprobežojoties ar, invertāzes inhibitoriem, ietverot Conduritol-B-epoksīdu, trestatīnu un tamlīdzīgi, lai nepieļautu nekādas blakusreakcijas, kas var ietekmēt vajadzīgā produkta veidošanos. Tiklīdz tiek iegūta atbilstoša saharozes-6-acetāta titra vērtība, maisīšana tiek pārtraukta, un reakcijas maisījums tiek filtrēts, lai atdalītu mikrobu šūnas.
Pēc tam filtrāts, kas satur saharozes-6-acetātu un citus augstākus molekulārus saharīdus, tiek pakļauts molekulārai separācijai. Šeit daļiņas ar molekulāro svaru virs 500 daltoniem tiek atdalītas izmantojot piemērotas membrānas separācijas sistēmas. Zemāk molekulārie saharīdi tiek koncentrēti. Konstatēts, ka iegūtā saharozes-6-acetāta tīrības pakāpe bija 60%. Tālāka attīrīšana tika veikta izmantojot hromatogrāfiju uz silanizēta silīcija dioksīda ar ūdeni kā kustīgo fāzi.
Iepriekšminēto reakciju var veikt nepārtraukti uzturot konstantu saharozes proporciju attiecībā pret saharozes-6-acetātu, lai uzturētu reakciju tiešā virzienā. Turklāt, mikrobu šūnas, kas atdalītas reakcijā, var izmantot atkārtoti atkarībā no fermenta aktivitātes.
Mikrobu šūnu masu var arī imobilizēt izmantojot vienu no vairākām visu šūnu imobilizācijas metodēm, kas zināmas prototipā. Šeit izmantota ilustratīva metode ir pieņemta Geri, B., Sassi, G., Specchia, V., Bosco, F. un Marzona, M., Process Biochem., 1991, 21, 331-335.
Attīrīts saharozes-6-acetāts tiek ņemts TGS hlorēšanas sagatavošanai.
Zemāk aprakstītais ir piemēri, kas ilustrē darbu ar šo izgudrojumu, nekādā veidā neierobežojot šī izgudrojuma darbības sfēru. Reaģenti, izmantoto reaģentu proporcija, aprakstīto reakcijas apstākļu diapazons ir tikai ilustratīvi, un darbības sfēra paplašinās attiecībā uz to analogiem reaģentiem, reakcijas apstākļiem un analoģiska rakstura reakcijām.
Vispārējā gadījumā šīs specifikācijas darbības sfērā ir ietverta jebkāda ekvivalenta alternatīva, kas ir acīmredzama personai, kura ir kompetenta hlorētas saharozes ražošanas prasmē. Turklāt, acetāta pieminēšana aptver jebkuru ekvivalentu acilgrupu, kas var izpildīt tādu pašu funkciju, un aizstāta glikozes izmantošanai ir jāietver jebkāda aizstāta aldoze, kas rada tāda paša tipa analoģiskas reakcijas analoģiskos reakcijas apstākļos.
Vairāki citi formulējumi pielāgojumi ir prognozējami tiem, kuri ir kompetenti šajā jomā, un arī tie tiek ietverti šīs specifikācijas darbības sfērā. Vienskaitļa pieminēšana tiek konstruēta tā, lai ietvertu arī tā daudzskaitli, ja vien to neatļauj konteksts, tas ir: organiskā šķīdinātāja izmantošana ekstrakcijai ietver viena vai vairāku organisko šķīdinātāju izmantošanu secībā vai kombinācijā kā maisījums.
1. PIEMĒRS
Aureobasidium šūnu augšana biokatalīzei
Eksperimentā tīra Aureobasidium kultūra, kas iegūta no ATCC Nr. 9348, tika audzēta 200 ml kratāmās kolbās okulējot vienu pilnu iepriekšminētās kultūras gredzenu. Kultūras barošanas vide, kas satur optimāla līmeņa oglekļa un slāpekļa avotus, tika sagatavota izmantojot Maida (Indijā izgatavoti attīrīti kviešu milti), sojas miltus, rauga ekstraktu, fosfātus un hlorīdus. Kultūra tika audzēta 48 stundu periodā rotējošā iekārtā ar ātrumu 200 apgr./min.
Rūpīgi izaudzētās šūnas tika pārnestas uz otrās augšanas stadijas kultūru, un augšana tika turpināta 120 stundas. Pēc 120 stundām iegūtais buljons tika centrifugēts ar ātrumu 8000 apgr./min., un šūnas tika atdalītas. Šūnas tika divreiz mazgātas ar bufera šķīdumu, lai atbrīvotos no visām barošanas vides sastāvdaļām, kas pielipušas šūnām. Šūnas tika sasaldētas un izžāvētas sasaldētā stāvoklī līdz tālākai lietošanai.
2. PIEMĒRS
Glikozes-6-acetāta pārveidošana līdz saharozes-6-acetātam izmantojot Aureobasidium šūnas
Reakcijai tika ņemti 100 g glikozes-6-acetāta un 380 g saharozes. 20 Reaģenti tika izšķīdināti 1,2 I nātrija acetāta buferī pie pH 6,5-7,0.
Šķīdums tika nepārtraukti maisīts. Šķīdumā tika suspendētas 250 g sasaldētā stāvoklī izžāvētas Aureobasidium šūnas, un temperatūra tika nedaudz paaugstināta līdz 35°C. 0,25 g trestatīna tika pievienoti reakcijas masai, lai nomāktu invertāzes aktivitāti.
Saharozes-6-acetāta veidošanās tika kontrolēta izmantojot HPLC. Pēc 90 stundu reakcijas laika reakcijas maisījumā tika konstatēta 45 g saharozesLV 13761
6-acetāta veidošanās. Reakcija pēc tam tika turpināta līdz 120 stundām, un tika sasniegta līdz pat 45% glikozes-6-acetāta pārveidošanās, kas tika pievienots pārveidošanai.
Reakcijas saturs tika filtrēts, lai atdalītu suspendētās šūnas, un pēc tam 5 ņemts saharozes-6-acetāta izdalīšanai izmantojot atgriezeniskās osmozes atdalīšanu. Atgriezeniskās osmozes membrāna, atdalīja visus mazāk molekulāros savienojumus, piemēram, glikozi un fruktozi, bet augstāk molekulārie savienojumi palika. Pēc tam atlikušie savienojumi atkal tika izšķīdināti līdz 1:5 ar ūdeni un pakļauti nanofiltrēšanai pie 500 daltonu molekulārā svara, cauri izgājušais tika savākts, kas pamatā bija saharozes-6-acetāts un citi savienojumi ar molekulāro svaru 350-400 daltoniem. Šie savienojumi atkal tika pakļauti atgriezeniskās osmozes filtrēšanai līdz to koncentrācija nekļuva vairāk kā 20%. Šeit saharozes-6acetāta tīrības pakāpe bija apmēram 85%, un pēc tam tā tika ievadīta silanizētā silikagēla kolonnā.
Izmantotā kustīgā fāze bija acetāta buferis ar pH 9,0-9,5, un tīrās saharozes-6-acetāta frakcija tika atdalīta un koncentrēta, kā arī atdalīts ūdens. Pēc pilnīgas ūdens atdalīšanas saharozes-6-acetāts tika ņemts
DMF un hlorēts.
Izdalītais saharozes-6-acetāts bija 90% tīrs un tika ņemts TGS sagatavošanai.
3. PIEMĒRS
Glikozes-6-acetāta pārveidošana saharozes-6-acetātā izmantojot
Aureobasidium šūnas, kas imobilizētas Eudragit RL 100 (akrilsveķu kopoiimērs)
Aureobasidium šūnas tika ('mobilizētas uz Eudragit RL100 izmantojot šādu metodi.
350 g Aureobasidium šūnas, kas atdalītas pēc centrifugēšanas, tika ietvertas 350 g nātrija alginātā tās samaisot un izspiežot kā krelles. Šīs krelles pēc tam tika pārklātas ar Eudragit RL 100, poliakrilsveķu kopolimēru.
Reakcijai tika ņemti 100 g glikozes-6-acetāta un 380 g saharozes. Reaģenti tika izšķīdināti 1,21 nātrija acetāta buferī pie pH 6,5-7,0. Šķīdums tika nepārtraukti maisīts. Šķīdumam tika pievienotas 175 g
Aureobasidium šūnas uz Eudragit RL 100, un temperatūra tika lēnām palielināta līdz 45°C.
Saharozes-6-acetāta veidošanās tika kontrolēta izmantojot HPLC. Pēc 75 stundu reakcijas laika tika konstatēta 52 g saharozes-6-acetāta veidošanās reakcijas maisījumā. Reakcija tika turpināta vēl 100 stundas, tika sasniegta 62 g saharozes-6-acetāta pārveidošanās, kas bija 32% no sākotnējās saharozes.
Reakcijas sastāvs tika filtrēts, lai atdalītu suspendētās šūnas un saharozes-6-acetāta izdalīšanai izmantojot apgrieztās osmozes separāciju. Apgrieztās osmozes membrāna atdalīja mazāk molekulāros savienojumus, piemēram, glikozi un fruktozi, un augstāk molekulārie savienojumi tika saglabāti. Pēc tam saglabātie savienojumi atkal tika izšķīdināti līdz 1:5 ar ūdeni un tiks pakļauti nanofiltrēšanai līdz 500 daltoniem molekulārā svara, un cauri izgājušais tika savākts, kas pamatā bija saharozes-6-acetāts un citi savienojumi ar molekulāro svaru 350-400 daltoni. Šie savienojumi atkal tika pakļauti atgriezeniskās osmozes filtrēšanai līdz to koncentrācija nekļuva vairāk kā 20%. Šeit saharozes-6LA713761 acetāta tīrības pakāpe bija apmēram 85%, un pēc tam ta tika ievadīta silanizētā silikagēla kolonnā.
Izmantotā kustīgā fāze bija acetāta buferis ar pH 9,0-9,5, un tīrās saharozes-6-acetāta frakcija tika atdalīta un koncentrēta, kā arī atdalīts ūdens. Pēc pilnīgas ūdens atdalīšanas saharozes-6-acetāts tika ņemts
DMF un hlorēts. Izdalītā saharozes-6-acetāta tīrības pakāpe bija 92%, kas tika izmantots TGS sagatavošanai.
4. PIEMĒRS
Saharozes-6-acetāta hlorēšana izmantojot Vilsmeier reaģentu, lai iegūtu TGS
I reakcijas kolbā tika ievietots 275 ml dimetilformamīds un atdzesēts līdz 0 - 5°C, pēc tam tika lēnām nepārtraukti maisot pievienots 158 g fosfora pentahlorīda, lai izveidotu Vilsmeier reaģentu, uzturot reakcijas masas temperatūru zem 30°C. Masa pēc tam tika tālāk atdzesēta zem 0°C un
1. piemēram sagatavotais saharozes-6-acetāts tika lēnām pievienots 0-5°C. Pēc tam reakcijas masa tika uzkarsēta līdz 80°C un noturēta uz 1 stundu, pēc tam karsēta līdz 100°C un noturēta uz 6 stundām, bet beigās pie 110-115°C noturēta uz 2-3 stundām. Reakcijas gaita tika kontrolēta izmantojot HPLC analīzi.
Pēc tam reakcijas maisījums tika atdzesēts -5 līdz -8°C, un lēnām tika pievienots 20% nātrija hidroksīda šķīdums tā, lai masas pH būtu 5,5-6,5. Tas tika darīts, lai saglabātu produktu acetāta formā, kas veicina vajadzīgā produkta sadalīšanu organiskos šķīdinātājos. Izmantojot šo metodi iegūtās saharozes-6-acetāta iznākums bija 42,3%.
5. PIEMĒRS
Glikozes-6-benzoāta pārveidošana saharozes-6-benzoātā izmantojot
Aureobasidium šūnas, kas imobilizētas uz Eudragit RL 100 (akrilsveķu kopolimērs)
600 ml 3% glikozes-6-benzoāta šķīdums tika pagatavots nātrija acetāta buferī pie pH 6,5. Šis šķīdums tika sūknēts izmantojot peristaltisku sūkni kolonnā (2 cm diametrs χ 8 cm augstums), kurā iepakoti 12 g Eudragit RL 100, kas saturēja Aureobasidium šūnas. Kolonnas izeja tika izlietota atkārtoti uz barošanas kolbu. Plūsmas ātrums tika uzturēts uz 5 ml/min.
60 g saharozes tika pievienotas barošanas kolbā, tika izšķīdināta un tika nepārtraukti maisīta.
Reakcija tika turpināta 36 stundas ar glikozes-6-benzoāta pārveidošanās uz saharozes-6-benzoātu kopā citu piemaisījumu veidošanās periodisku analīzi. 36 stundu beigās bija izveidojušies 1,2 g saharozes-6-benzoāta, un reakcija tika pārtraukta. Glikozes-6-benzoāts šķīdumā tika konstatēts mazāk nekā 1%, un tas tika izveidots līdz 3% pievienojot svaigu glikozes6-benzoātu. pH tika koriģēta uz 6,5, un reakcija tika turpināta. Tas rezultātā deva atkal līdz 3,6 g saharozes-6-benzoāta 72 stundu beigās.

Claims (9)

  1. PRETENZIJAS
    1. Fruktozildisaharīda vai tā atvasinājuma estera iegūšanas paņēmiens no fruktozildisaharīda, kas satur:
    a. iepriekšminētā fruktozildisaharīda kontakts ar atbilstošu aldozes
    5 esteri vai atbilstošu aldozes atvasinājuma esteri fruktoziltransferāzi veidojoša mikroorganisma biomasas klātbūtnē, lai iegūtu iepriekšminēto esteri no iepriekšminētā fruktozildisaharīda vai tā atvasinājuma, un
    b. iepriekšminētā estera izdalīšana no fruktozildisaharīda vai tā
    10 atvasinājuma.
  2. 2. paņēmiens saskaņā ar 1. pretenziju, kur:
    a. iepriekšminētais fruktozildisaharīda atvasinājums satur vienu vai vairākus esterus, ietverot saharozes-6-acetātu, saharozes-6benzoātu, 6-O-metilsaharozi, 6-deoksisaharozi, galaktosaharozi,
    15 ksilsaharozi, saharozes-6-glutarātu, saharozes-6-propionātu, saharozes-6-laurātu un tamlīdzīgi,
    b. iepriekšminētais fruktozildisaharīds satur vienu vai vairākus saharozi, rafinozi vai stahiozi,
    c. iepriekšminētais aldozes esteris vai atbilstošs aldozes
    20 atvasinājuma esteris satur vienu vai vairākus glikozi, galaktozi, glikozes-6-acetātu, glikozes-6-benzoātu, saharozes-6-butirātu, saharozes-6-glutarātu, saharozes-6-laurātu, saharozes-6propionātu, saharozes-6-benzoātu un tamlīdzīgi,
    d. iepriekšminētā fruktozildisaharīda izdalīšana tiek panākta
    25 izmantojot vienu vai vairākas izdalīšanas un attīrīšanas metodes vai metožu kombinācijas, ietverot filtrēšanu, atgriezenisko osmozi, nanofiltrēšanu, kolonnu hromatogrāfiju un tamlīdzīgi.
  3. 3. paņēmiens saskaņā ar 2. pretenziju, kur iepriekšminētais mikroorganisms satur vienu vai vairākas fruktoziltransferāzes, kuru veido mikroorganisms,
    5 ieskaitot Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii, Sachharomyces, Bacillus subtilis, Ervvinia un tamlīdzīgi.
  4. 4. paņēmiens saskaņā ar 3. pretenziju, kur sagatavota biomasa no
    10 Arabidopsis pullulans viengabalainām šūnām:
    a. atkārtoti subkulturējot no tīras kultūras šķidrā vidē, kas satur pietiekamas barības vielas, lai veicinātu to ātru augšanu,
    b. atdalot šūnas no vides, izmantojot vienu vai vairākas atdalīšanas metodes, labāk centrifugēšanu,
    15 c. labāk atmazgājot šūnas no vides,
    d. izmantojot visu šūnu masu katalīzei kā tādai vai pēc rafinēšanas, vai pēc konservēšanas stadijas ietverot žāvēšanu sasaldētā stāvoklī.
  5. 5. paņēmiens saskaņā ar 4. pretenziju, kur izmantota biomasa no
    20 viengabalainām šūnām brīvā formā vai (mobilizētā formā uz viena vai vairākiem citiem atbalstiem.
  6. 6. paņēmiens saskaņā ar 5. pretenziju 6-0- aizsargātas saharozes sagatavošanai, labāk no saharozes-6-acetāta vai saharozes-6-benzoāta, kas ietver stadijas no:
    a. saharozes un 6-0- aizsargātas glikozes kontaktēšanas, labāk glikozes-6-acetāta vai glikozes-6-benzoāta, papildus labāk pielietojot kratīšanu izžāvēti sasaldētā stāvoklī biomasas klātbūtnē no Aureobasidium pullulans brīvā formā vai imobilizētā formā
    5 izmantojot imobilizēšanas metodi algināta krellēs, kas pārklātas ar
    Eudragit RL 100, akrilsveķu kopolimēru,
    b. brīvu vai imobilizētu šūnu biomasas atdalīšanu izmantojot atdalīšanas metodi, labāk filtrēšanu, un
    c. procesa plūsmas pakļaušanu izveidotās 6-0- aizsargātās
    10 saharozes izdalīšanai.
  7. 7. paņēmiens saskaņā ar 5. pretenziju 6-0- aizsargātas saharozes sagatavošanai, labāk no saharozes-6-acetāta vai saharozes-6-benzoāta, kas ietver stadijas no:
    a. imobilizētas Aureobasidium pullulans biomasas iepakošana uz
    15 cieta atbalsta kolonnā, un
    b. saharozes un 6-0- aizsargātas glikozes šķīduma atkārtota caurlaišana, lai izveidotu 6-0- aizsargātu saharozi, un
    c. 6-0- aizsargātas saharozes atdalīšana no procesa plūsmas.
  8. 8. paņēmiens saskaņā ar 6. pretenziju vai 7. pretenziju, kas satur,
    20 a. iepriekšminētā procesa plūsmas, kas satur 6-0- aizsargāto saharozi, pakļaušana atgriezeniskai osmozei, lai atdalītu vienu vai vairākus zemāk molekulāros komponentus, ietverot glikozi, fruktozi un tamlīdzīgi, lai iegūtu atlikumu, kas satur 6-0- aizsargāto saharozi un piemaisījumus,
    b. iepriekšminētā atlikuma pakļaušana nanofiltrēšanai, labāk pēc apmēram 1:5 atšķaidīšanas pie molekulārā svara 500 daltoni, lai iegūtu izšķīdušu vielu, kas galvenokārt satur 6-0- aizsargāto saharozi,
    5 c. iepriekšminētās izšķīdušās vielas, kas satur 6-0- aizsargāto saharozi, pakļaušana atgriezeniskai osmozei, lai koncentrētu izšķīdušo vielu līdz apmēram 20% vai lielākai koncentrācijai, un
    d. koncentrētās izšķīdušās vielas pakļaušana tālākai attīrīšanai un izdalīšanai izmantojot kolonnu hromatogrāfiju.
  9. 10 9. Kolonnas hromatogrāfijas paņēmiens saskaņā ar 8. pretenziju, kur iepriekšminētā koncentrētā izšķīdušā viela tiek:
    a. ielādēta silanizētā silikagēla kolonnā izmantojot sārmainu buferi pie apmēram pH 9,0-9,5, labāk acetāta buferi kā kustīgo fāzi, un
    b. saharozes-6-acetāta kā tīras frakcijas atdalīšana.
LVP-08-58A 2005-09-22 2008-04-09 Method of producing sucrose-6-acetate by whole-cell biocatalysis LV13761B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN1174MU2005 2005-09-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
LV13761B true LV13761B (en) 2009-01-20

Family

ID=38023685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LVP-08-58A LV13761B (en) 2005-09-22 2008-04-09 Method of producing sucrose-6-acetate by whole-cell biocatalysis

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20100151526A1 (lv)
EP (1) EP1940857A4 (lv)
JP (1) JP2009508518A (lv)
KR (1) KR20080052639A (lv)
CN (1) CN101268090A (lv)
AU (1) AU2006313334A1 (lv)
CA (1) CA2623234A1 (lv)
EA (1) EA200800653A1 (lv)
IL (1) IL190252A0 (lv)
LV (1) LV13761B (lv)
MX (1) MX2008003781A (lv)
NO (1) NO20081868L (lv)
WO (1) WO2007054972A2 (lv)
ZA (2) ZA200802519B (lv)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886100B (zh) * 2010-07-12 2012-08-08 江南大学 一种酶法制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
CN107821795B (zh) * 2011-12-02 2021-12-21 普莱瑞阿夸泰克公司 用于高质量蛋白质浓缩物的基于微生物的方法
CN103288891B (zh) * 2013-04-10 2016-04-20 湖北同源甜味制品有限责任公司 一种蔗糖-6-乙酸酯的纯化方法
CN103451125B (zh) * 2013-07-02 2015-02-25 广西大学 一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法
CN106047744B (zh) * 2016-05-06 2019-09-24 杭州鑫富科技有限公司 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
JP6914534B2 (ja) * 2018-08-30 2021-08-04 株式会社アウレオ β−グルカン高産生菌株、β−グルカンの製造方法、及びβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法
CN111575327A (zh) * 2020-05-25 2020-08-25 安徽金禾实业股份有限公司 一种米黑根毛霉脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法
CN112888782A (zh) * 2021-01-13 2021-06-01 安徽金禾实业股份有限公司 液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8316790D0 (en) * 1983-06-21 1983-07-27 Tate & Lyle Plc Chemical process

Also Published As

Publication number Publication date
EP1940857A4 (en) 2009-07-29
WO2007054972A3 (en) 2007-07-12
US20100151526A1 (en) 2010-06-17
EP1940857A2 (en) 2008-07-09
IL190252A0 (en) 2008-11-03
NO20081868L (no) 2008-06-23
ZA200802520B (en) 2009-08-26
MX2008003781A (es) 2009-02-27
CN101268090A (zh) 2008-09-17
WO2007054972A2 (en) 2007-05-18
CA2623234A1 (en) 2007-05-18
ZA200802519B (en) 2009-11-25
AU2006313334A1 (en) 2007-05-18
JP2009508518A (ja) 2009-03-05
EA200800653A1 (ru) 2009-02-27
KR20080052639A (ko) 2008-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LV13761B (en) Method of producing sucrose-6-acetate by whole-cell biocatalysis
CN105683387B (zh) 寡糖的发酵生产
FI85160C (fi) B-fruktosyltransferas-enzym och foerfarande foer framstaellning av fruktosid fraon en fruktosacceptor.
JP6165872B2 (ja) 単糖類の製造方法
EP2859112A1 (en) Method for producing oligosaccharides and oligosaccharide glycosides by fermentation
EP4276171A1 (en) Bacillus subtilis genetically engineered bacterium for producing tagatose and method for preparing tagatose
WO2001073106A1 (fr) Procede de production d'un produit de transfert glycosyle
CN108350474B (zh) 小分子糖基化的方法
JP2017123844A (ja) 配糖体の製造方法
US20150133647A1 (en) Method for Producing Oligosaccharides and Oligosaccharide Glycosides by Fermentation
US20100041106A1 (en) Recombinant gras strains expressing thermophilic arabinose isomerase as an active form and method of preparing food grade tagatose by using the same
EP0717047B1 (en) Process for producing disaccharides and novel saccharides
US4962026A (en) Process for the production of panosyl derivatives
JP7441178B2 (ja) シクロイソマルトテトラオース、シクロイソマルトテトラオース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
KR101801908B1 (ko) 알부틴의 제조방법
CA2220675A1 (en) Process for enzymically galactosylating monosaccharides and oligosaccharides
CN100519574C (zh) 大环内酯的制备
BRPI0617598A2 (pt) processo de produção de sacarose-6-acetato por meio de catálise biológica de células inteiras
JP2009291120A (ja) オリゴ糖鎖の生産方法
JPH0440998B2 (lv)