CN100519574C

CN100519574C - 大环内酯的制备

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Publication number: CN100519574C
Application number: CNB2004100074552A
Authority: CN
Inventors: J·P·帕奇拉特克; T·皮特纳; V·琼曼
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2020-11-10
Also published as: HK1051204A1; PT1228078E; BR0015489A; HUP0204437A2; EP1228078B1; CN1165542C; BR0015489B1; WO2001036434A1; CN1390226A; CA2388824A1; US6808903B1; GB9926887D0; CN1523116A; AU763109B2; EP1228078A1; ZA200203612B; AU1520901A; RU2234511C2; ATE240340T1; CZ20021616A3

Abstract

本发明的主题是式(I)化合物的制备方法，其中R₁-R₉彼此独立地代表氢或取代基；m是0、1或2；n是0、1、2或3；标以A、B、C、D、E和F的键彼此独立地表示两个相邻的碳原子是通过双键、单键、单键与环氧化物桥或单键与亚甲基桥连接的，合适的话，包括其E/Z异构体、E/Z异构体混合物和/或互变体，在每种情况下均可以为游离形式或盐的形式，该方法包含：1)使式(II)化合物(其中R₁-R₇、m、n、A、B、C、D、E和F具有与上式(I)所示相同含义)与能够特异性氧化4”位醇的生物催化剂接触，目的是生成式(III)化合物(其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、m、n、A、B、C、D、E和F具有与上式(I)所示相同含义)；和2)在还原剂的存在下，使式(III)化合物与式HN(R₈)R₉胺反应，其中R₈和R₉具有与上式(I)所示相同含义，该胺是已知的。

Description

大环内酯的制备

本发明涉及大环内酯的制备方法、中间体化合物的制备方法和用在所述方法中的中间体化合物。更确切地，本发明涉及下式化合物的制备方法：

其中

R₁-R₉彼此独立地代表氢或取代基；

m是0、1或2；

n是0、1、2或3；

标以A、B、C、D、E和F的键彼此独立地表示两个相邻的碳原子是通过双键、单键、单键与下式环氧化物桥

或单键与下式亚甲基桥连接的，

合适的话，包括其E/Z异构体、E/Z异构体混合物和/或互变体，在每种情况下均为游离形式或盐的形式，

该方法包含

1)使下式化合物

其中

R₁-R₇、m、n、A、B、C、D、E和F具有与上式(I)所示相同含义，与能够特异性氧化4”位醇的生物催化剂接触，目的是生成下式化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、m、n、A、B、C、D、E和F具有与上式(I)所示相同含义；和

2)在还原剂的存在下，使式(III)化合物与式HN(R₈)R₉胺反应，其中R₈和R₉具有与上式(I)所示相同含义，该胺是已知的；在每种情况下，如果需要的话，将可按照该方法或另一种方法得到的式(I)化合物或其E/Z异构体或互变体——在每种情况下均为游离形式或盐的形式——转化为不同的式(I)化合物或其E/Z异构体或互变体，在每种情况下均为游离形式或盐的形式，分开可按照该方法得到的E/Z异构体混合物，分离所需的异构体，和/或将可按照该方法或另一种方法得到的游离的式(I)化合物或其E/Z异构体或互变体转化为盐，或者将可按照该方法或另一种方法得到的式(I)化合物或其E/Z异构体或互变体的盐转化为游离的式(I)化合物或其E/Z异构体或互变体，或者转化为不同的盐。

有文献描述过式(I)化合物的合成方法。不过已经发现，文献方法在生产期间导致大量问题，主要是收率低和不得不使用的工艺冗长。例如，EP-A 0465 121公开了4”-酮和4”-氨基-4”-脱氧阿凡曼菌素化合物及其取代的氨基衍生物。阿凡曼菌素化合物的4”-羟基被氧化成酮基或被(取代的)氨基替代。其中5和23位的羟基需要被保护，以避免不需要的氧化反应。将该4”-酮化合物胺化以提供相当于上述式(I)的化合物。因此，已知方法就此而言不是令人满意的，需要改进这些化合物的制备方法。

化合物(I)、(II)和(III)可以是互变体的形式。因此，化合物(I)、(II)和(III)在上下文适当时候被理解为包括相应的互变体，即使后者在每种情况下没有具体提到也是如此。

化合物(I)、(II)和(III)能够生成酸加成盐。盐例如是与下列酸生成的：无机强酸，例如矿物酸，如高氯酸、硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸或氢卤酸；有机强羧酸，例如未取代的或取代、如卤代的C₁-C₄链烷羧酸，例如乙酸，饱和的或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸或邻苯二甲酸，羟基羧酸，例如抗坏血酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸，或苯甲酸；或有机磺酸，例如未取代的或取代、例如卤代的C₁-C₄链烷-或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。此外，具有至少一个酸性基团的式(I)、(II)和(III)化合物能够与碱生成盐。适合的碱盐例如金属盐，如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或镁盐；氨盐或有机胺盐，有机胺例如吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三-低级烷基胺，如乙胺、二乙胺、三乙胺或二甲基丙胺，或单-、二-或三-羟基低级烷基胺，如单-、二-或三-乙醇胺。另外，还可以生成相应的内盐。在本发明范围内优选的是农业化学上有利的盐。鉴于式(I)、(II)和(III)化合物的游离形式与它们的盐形式之间的密切关系，在适当和方便的时候，上下文所有涉及游离的式(I)、(II)和(III)化合物或它们各自的盐之处被理解为也包括相应的盐或游离的式(I)、(II)和(III)化合物。这一点同样适用于式(I)、(II)和(III)化合物的互变体及其盐的情况。在每种情况下一般优选的是游离形式。

在本发明范围内优选的是式(I)化合物的制备方法，其中

n是1；

m是1；

A是双键；

B是单键或双键；

C是双键；

D是单键；

E是双键；

F是双键；或单键与环氧化物桥；或单键与亚甲基桥；

R₁、R₂和R₃是H；

R₄是甲基；

R₅是C₁-C₁₀-烷基、C₃-C₈-环烷基或C₂-C₁₀-链烯基；

R₆是H；

R₇是OH；

R₈和R₉彼此独立地是H、C₁-C₁₀-烷基或C₁-C₁₀-酰基；或者一起构成-(CH₂)_q-；

q是4、5或6。

在本发明范围内尤其优选的是式(I)化合物的制备方法，其中

n是1；

m是1；

A、B、C、E和F是双键；

D是单键；

R₁、R₂和R₃是H；

R₄是甲基；

R₅是仲丁基或异丙基；

R₆是H；

R₇是OH；

R₈是甲基；

R₉是H。

更加优选的是Emamectin的制备方法，更确切为Emamectin的苯甲酸盐。Emamectin是4”-脱氧-4”-N-甲氨基阿凡曼菌素(avermectin)B_1a/B_1b的混合物，描述在US-P-4,4874,749中，在Journal of Organic Chemistry，Vol.59(1994)，7704-7708中称为MK-244。尤其有农业化学价值的Emamectin盐描述在US-P-5,288,710中。式(I)化合物是宝贵的杀虫剂，尤其用于对抗昆虫和螨目的代表。所提到的害虫例如包括在欧洲专利申请EP-A736,252第5页第55至58行、第6页和第7页第1至21行所提到的那些。其中提到的害虫包括在本发明的主题中。

上下文所用通用术语具有下列含义，另有定义除外：

含碳基团和化合物各自含有1至8(含)个、优选为1至6(含)个、尤其为1至4(含)个、更尤其为1或2个碳原子。

烷基要么是直链的，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基，要么是支链的，例如异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基或异己基。

链烯基本身作为一个基团，或者作为其他基团和化合物的结构元素(例如卤代链烯基或芳基链烯基)，在每种情况下考虑有关基团或化合物所含有的碳原子数，要么是直链的，例如乙烯基、1-甲基乙烯基、烯丙基、1-丁烯基或2-己烯基，要么是支链的，例如异丙烯基。

C₃-C₆环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，尤其是环己基。

本发明的进一步方面是

-如上所定义的式(III)化合物；或

-根据上述步骤1)从式(II)化合物制备式(III)化合物的方法；或

-根据上述步骤2)从式(III)化合物制备式(I)化合物的方法。

在本发明范围内，术语“生物催化剂”意味着包括：

a)活的微生物，例如营养细胞、静息细胞或冻干细胞的形式，

b)所述微生物的孢子，

c)死的微生物，优选为部分解体的形式，也就是说通过物理或化学方法或喷雾干燥使细胞壁/细胞膜通透，

d)所述微生物细胞内容物的粗浸膏，和

e)转化式(II)化合物为式(III)化合物的酶。

细菌和真菌是尤其适合于本发明方法的微生物。适合的细菌尤其是放线菌的代表，尤其是链霉菌属。优选的是链霉菌属菌株，选自杀结核菌链霉菌(Streptomyces tubercidicus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、利迪硅霉菌(Streptomyceslydicus)、萨腊赛链霉菌(Streptomyces saraceticus)和春日链霉菌(Streptomyces kasugaensis)。R-922链霉菌(杀结核菌链霉菌)、尤其是I-1529链霉菌(杀结核菌链霉菌)已经证实特别适合于区域专一性氧化式(II)化合物的4”-位羟基。

依照布达佩斯条约的规定，于1999年11月5日将链霉菌属菌株I-1529链霉菌和R-922链霉菌保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 b，D-38124 Braunschweig Germany，入藏号分别为DSM-13135和DSM-13136。

已经鉴别了其他能够适合用于进行根据本发明的区域专一性氧化作用的菌株，例如包括链霉菌属菌株MAAG-7027(杀结核菌链霉菌)、链霉菌属菌株DSM-40241(萨腊赛链霉菌，也被鉴别为恰塔努加链霉菌)、链霉菌属菌株NRRL-2433(利迪链霉菌利迪亚种)和链霉菌属菌株A/96-1208710(春日链霉菌)。所有上述菌株分别与链霉菌属菌株I-1529链霉菌和R-922链霉菌密切相关，16s rDNA分析显示同一性在99.4％与100％之间可以证明这一点。

式(I)化合物已知是控制植物害虫的高效药物。在已知的式(I)化合物的制备方法中，例如EP 301 806所述和根据本发明的微生物方法，使用式(II)化合物作为原料。

已知的方法中，在第一步中，保护式(II)化合物的5位氧，然后氧化为4”-酮，然后转化为胺，并去保护被屏蔽的5位羟基，由此采用常规的保护基团技术，如Greene和Wuts，1999(Protective Groupsin Organic Synthesis)所述。

根据本发明的方法具有这样的优点，它仅包含两个步骤，而已知方法有四个。它进一步避免了保护基团的使用，在生态学上是更安全的，因为使用更少的化学品。从根据本发明的生物催化步骤所得到的式(III)化合物是已知的，例如EP 401 029。

在具体的实施方式中，根据本发明的方法可以详细进行如下：

在第一步中，制备式(III)化合物。这可以这样实现，直接使式(II)化合物与能够特异性氧化4”位醇为式(III)酮的生物催化剂接触，使这种接触维持足以发生氧化反应的时间。

最方便的是，使用微生物作为生物催化剂进行该方法，该微生物能够进行根据本发明的氧化反应。优选地，在式(II)化合物的存在下，在受到控制的条件下，将所述微生物培养在适合促进微生物增殖的培养基中，使所述微生物与其底物的共同培养维持足以发生氧化反应的时间，优选为直至25％至99.9％、更优选为50％至99.9％、最优选为80至99.9％所加入的式(II)化合物已被转化为式(III)化合物。

作为替代选择并且更优选地，该方法是这样进行的，首先在受到控制的条件下，将能够进行根据本发明的氧化反应的微生物培养在适合促进微生物增殖的培养基中，然后利用适合的方法收获微生物的生物量，例如过滤或离心。然后立即使用微生物的生物量作为生物催化剂，用于式(II)化合物向式(III)化合物的转化，或者可以贮存在冷却条件下，要么照其原样，要么在冷冻干燥或喷雾干燥之后，然后用于反应。然后将所述微生物——要么是新鲜收获的，要么如上所述贮存——和式(II)化合物在不支持微生物增殖的反应介质中共同培养足以发生氧化反应的时间，优选为直至25％至99.9％、更优选为50％至99.9％、最优选为80至99.9％所加入的式(II)化合物已被转化为式(III)化合物。

借助惯用的分离方法可以将以这种方式所得式(III)反应产物从式(II)原料中分离，无需大的技术支出，例如分步结晶或色谱。色谱例如包括无机载体材料(例如硅胶)或有机交换树脂上的柱色谱、厚层色谱或薄层色谱。

可以使用微生物孢子代替营养细胞结构，从能够特异性氧化4”位醇为式(III)酮的微生物收获孢子，然后与式(II)化合物培养足以发生相应的氧化反应的时间。孢子与底物的培养优选地在没有培养基的存在下进行，目的是防止孢子萌发。

使用式(II)化合物作为根据本发明的氧化反应底物。这些化合物是已知的(参见DE 2717040)，或者可以通过类似于已知的方法从已知化合物制备。它们适合于控制动物和植物中的害虫，此外是式(I)化合物制备中的宝贵原料或中间体。式(III)化合物的制备还可以这样进行，在氧化式(II)化合物时，不是使用微生物本身，而是来源于这种微生物的活性成分(按照上述定义b)至e))，它们能够特异性氧化4”位醇为式(III)酮。

因此，本发明的进一步方面是营养微生物细胞、所述微生物细胞的无细胞浸膏、孢子、酶和酶混合物的固定形式的用途，它们能够特异性氧化4”位醇为式(III)酮。

所述生物催化剂的固定化可以类似于本身已知的方法进行。在本发明范围内，尤其可以提到的方法基于所述生物催化剂与固体、通常为水不溶性载体材料的吸附性结合或离子或共价键合，基于生物催化剂与双-或多-官能试剂的交联，基于基质包封，基于膜分离，或者基于两种或多种上述方法的组合。

与水不溶性载体(吸附剂)的吸附性结合尤其是通过范德华力进行的。大量无机和有机化合物以及合成聚合物适合作为吸附剂。

这样一种微生物的固定化方法描述在Bickerstaff(Ed.)，1997(Immobilisation of Enzymes and Cells)(酶和细胞的固定化)，vanHaecht et al.，1985(酵母细胞/玻璃)，Black et al.，1984(酵母细胞/精炼钢，聚酯)，Wiegel and Dykstra，1984(梭状芽孢杆菌/纤维素，半纤维素)，Forberg and

，1984(梭状芽孢杆菌/木屑)和Ehrhardt and Rehm，1985(假单胞菌/活性碳)中。关于通过吸附性结合所固定的酶的用途的相应细节尤其见于Krakowiak etal.，1984(葡糖淀粉酶/氧化铝)，Cabral et al.，1984(葡糖淀粉酶/钛-活化玻璃)，Miyawaki and Wingard 1984(葡糖氧化酶/活性碳)，Kato and Horikoshi，1984(葡糖转移酶/合成树脂)。离子键基于带相反电荷的载体材料(例如商业上可得到的离子交换剂，例如基于多糖或合成树脂)与所要键合的生物催化剂的基团之间的静电吸引。

基于离子键的固定微生物的方法描述在DiLuccio and Kirwan，1984(固氮菌类/Cellex E(纤维素))和Giard et al.，1977(动物细胞/DEAE-交联葡聚糖凝胶)中。相应的酶的固定化可以按照下列所示细节进行：Angelino et al.，1985(醛氧化酶/辛氨基-琼脂糖凝胶4B)，Hofstee，1973(乳酸脱氢酶/辛氨基-琼脂糖凝胶)，Kuhn et al.，1980(葡糖氧化酶/DEAE-交联葡聚糖凝胶，DEAE-纤维素)以及其他等等。

进一步的固定化方法基于共价键力的使用，这一般导致生物催化剂彼此或生物催化剂与载体材料之间的固定连接。适合的载体材料是多孔材料，例如玻璃、二氧化硅或其他不溶性无机材料。

在根据本发明的方法范围内，例如可以类似于下述方法固定微生物：Messing and Oppermann，1979(肠杆菌/硼硅酸盐玻璃；酵母细胞/氧化锆)，Romanovskaya et al.，1981(甲烷细菌/Silochrome)，Navarro and Durand，1977(酵母细胞/多孔二氧化硅)。

酶的固定化可以按照Weetall and Mason，1973(木瓜蛋白酶/多孔玻璃)和Monsan et al.，1984(转化酶/多孔二氧化硅)所述进行。

在根据本发明的方法中，不仅已经提到的载体材料，而且全部天然或合成聚合物都适合于固定化，例如纤维素、葡聚糖、淀粉、琼脂糖等，或者例如基于丙烯酸和异丁烯酸衍生物的聚合物，它们常用于反应性共聚物的制造。赖以与生物催化剂成键的适合的反应性基团是反应性二硝基氟代苯基或异硫氰酸酯基团，或者尤其是环氧乙烷和酸酐基团。进一步的可能性在于携带羧基的树脂的氯化物活化，它们是商业上可得到的，例如商品名为

XE-64和IRC-50。

借助天然或合成载体材料的微生物固定化可以如下所述进行：Chipley，1974(枯草芽孢杆菌/琼脂糖)，Gainer et al.，1980(固氮菌类/纤维素)，Jack and Zajic，1977(微球菌/羧甲基纤维素)，Jirku et al.，1980(酵母细胞/羟基烷基异丁烯酸酯)和Shimizu etal.，1975(细菌细胞/乙烯-马来酸酐共聚物)。酶的固定化尤其可以类似于下述进行：Cannon et al.，1984(乳酸氧化酶/纤维素)，Denniset al.，1984(胰凝乳蛋白酶/琼脂糖凝胶)，Ibrahim et al.，1985(环氧水解酶/葡聚糖)；Beddows et al.，1981(α-半乳糖苷酶/尼龙-丙烯酸酯共聚物)，Raghunath et al.，1984(脲酶/异丁烯酸酯-丙烯酸酯)。

在交联方法中，生物催化剂通过双-或多-官能试剂彼此键合，尤其例如戊二醛、二异氰酸酯，生成特性不溶的、通常为凝胶状的高分子聚集体。

这类微生物固定化可以类似于De Rosa et al.，1981(细菌细胞/借助戊二醛与卵白蛋白共交联)进行。可以在本发明范围内使用的酶的固定化方法描述在Barbaric et al.，1984(转化酶/与己二酸二酰肼交联)，Talsky and Gianitsopoulos，1984(胰凝乳蛋白酶/无需交联剂的酶分子之间的肽键)，Workman and Day，1984(菊粉酶/含酶细胞与戊二醛交联)，Khan and Siddiqi，1985(胃蛋白酶/与戊二醛交联)，Bachmann et al.，1981(葡糖异构酶/借助戊二醛与明胶共交联)，Kaul et-al.，1984(α-半乳糖苷酶/借助戊二醛与卵白蛋白共交联)。

基质包封包含将生物催化剂包在通常为凝胶状结构的天然或合成聚合物中。尤其适合于包裹细胞、细胞器和孢子的基质材料是天然聚合物，例如藻酸盐、角叉菜胶、果胶、琼脂、琼脂糖或明胶，因为这些化合物是无毒的，在操作期间保护细胞。合成聚合物也是适合的，尤其例如聚丙烯酰胺、光致交联树脂。基质包封的形状多种多样，例如可以包括球形、圆柱形、纤维状和片状。借助天然或合成基质材料的微生物固定化可以如下所述进行：Mazumder et al.，1985(细菌细胞/光致交联树脂)，Bettmann and Rehm，1984(细菌细胞/聚丙烯酰胺酰肼)，Umemura et al.，1984(细菌细胞/角叉菜胶)，Karube etal.，1985(细菌原生质体/琼脂-乙酰基纤维素)，Cantarella et al.，1984(酵母细胞/羟乙基异丁烯酸酯)，Qureshi and Tamhane，1985(酵母细胞/藻酸盐)，Deo and Gaucher，1984(丝状菌类/角叉菜胶)，Eikmeier and Rehm，1984(丝状菌类/藻酸盐)，Bihari et al.，1984(丝状菌类分生狍子/聚丙烯酰胺)，Vogel and Brodelius，1984(植物细胞/藻酸盐，琼脂糖)，Nakajima et al.，1985(植物细胞/琼脂，藻酸盐，角叉菜胶)。

酶的固定化可以类似于Mori et al.，1972(氨酰酶(aminoacylase)/聚丙烯酰胺)进行。

膜分离涉及产生进行反应的特定区域。膜分离的基本变例区别如下：

a)微囊包封，

b)脂质体技术，

c)在膜反应器中使用生物催化剂。

上述固定化方法可以彼此组合，例如吸附和交联。在这种情况下，酶首先被吸附在载体上，然后通过双官能试剂彼此交联。

用在本发明范围内的生物催化剂与式(II)化合物培养用于特异性氧化4”位醇为式(III)酮可以借助应用微生物学惯用方法进行。除了使用摇瓶培养以外，尤其可以提到在微生物学研究和工业生产中业已成熟的各种发酵系统。

生物反应器的主要任务是创造最佳的水动力学条件，目的是降低表观米氏常数，提高反应速度。

这本质上可通过在生物催化剂与周围介质之间保持适当的相对运动来完成，这样可提高外部质量转移至其在实践中的妨碍不再适用的程度。

适合于有关方法的反应器类型例如包括搅拌容器式反应器、环型反应器、床式反应器、流化床反应器、膜反应器以及大量特殊形状的反应器，尤其例如筛-搅拌式反应器、菱形反应器、管式反应器(W.Hartmeier，Immobilisierte Biokatalysatoren，1986；W.CruegerandA.Crueger，Biotechnologie-Lehrbuch der angewandtenMikrobiologie，1984；P.Prive et al.，Handbuch derBiotechnologie，1984)。在本发明范围内优选使用搅拌容器式反应器。

搅拌容器式反应器在发酵的生物技术领域中是最常用的反应器类型。由于搅拌能力高和氧转移能力高，这种类型的反应器可确保底物与生物催化剂的迅速而彻底的混合。

搅拌容器式反应器的优点在于简单、从而经济的构造和得到充分研究的性质。

原则上，当使用搅拌容器式反应器时，有两种操作是可能的：首先是“分批型”操作的方法，即所谓的“分批”方法，其次是连续方法。

在“分批”方法中，一旦方法完成，即通过分离或过滤除去生物催化剂，要么弃去(营养细胞)，要么再次用于第二批(固定化生物催化剂)。

当使用连续方法时，新的底物连续不断地交换为反应终产物。必须借助适合的措施(筛子、滤器、回收装置)防止生物催化剂离开反应器。

在本发明范围内培养营养微生物细胞是按照已知的一般惯用方法进行的，出于可行性原因，优选使用液体营养培养基。

营养培养基的组成因所用微生物而异。一般地，具有有限的易同化的碳(C)和氮(N)源的复合培养基是优选的，例如习惯上也用于抗生素的生产。

另外，维生素和必需金属离子也是必要的，不过它们通常作为成分或杂质而以适当浓度包含在所用复合营养培养基中。如果需要的话，可以以盐的形式加入所述成分，尤其例如必需维生素以及Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、NH₄ ⁺、(SO₄)^2-、Cl-、(CO₃)^2-离子和痕量元素钴、锰和锌。除了酵母浸膏、酵母水解产物、酵母自溶产物和酵母细胞以外，尤其适合的氮源是大豆粗粉、玉米粗粉、燕麦粗粉、edamine(酶消化的乳白蛋白)、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和肉浸膏。

所述N-源的优选浓度从0.1至6g/l。适合的碳源尤其是葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖、麦芽糖、淀粉、cerelose、纤维素、甘露糖醇、麦芽浸膏和糖蜜。所述碳源的优选浓度范围从1.0至25g/l。使用D-葡萄糖、可溶性淀粉或麦芽浸膏以及cerelose作为碳源有利于下文所述的氧化方法，尤其是如果所用微生物是链霉菌属的代表。因而例如下列培养基极为适合链霉菌属的代表：

培养基1

1.0g可溶性淀粉

0.2g蛋白胨

0.2g酵母浸膏

用蒸馏水调至1升，用NaOH调至pH7，高压灭菌。

培养基2

4.0g D-葡萄糖

10.0g麦芽浸膏

4.0g酵母浸膏

用蒸馏水调至1升，用NaOH调至pH7，高压灭菌。

培养基3

10.0g甘油

20.0g糊精

10.0g soytone(Difco Manual，9th ed.，Detroit，DifcoLaboratories，1969)

2.0g(NH₄)₂SO₄

2.0g CaCO₃

用蒸馏水调至1升，用NaOH调至pH7，高压灭菌。

培养基4

10.0g D-葡萄糖

10.0g麦芽浸膏

3.0g酵母浸膏

10.0g Pharmamedia(Traders Protein，Southern Cotton OilCo.，Memphis TN，USA)

1.0g肉浸膏

用蒸馏水调至1升，用NaOH调至pH7，高压灭菌。

培养基5(ISP-2琼脂)

将酵母浸膏 4g(Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，Engl and)

D(+)-葡萄糖 4g

bacto麦芽浸膏 10g(Difco No.0186-17-7)

琼脂 20g(Difco No.0140-01)

溶于1l软化水，调节pH至7.0。

将溶液在121℃下灭菌20分钟，冷却，在55℃下保持立即制备琼脂平板所需的短时间。

培养基6(PHG培养基)

将蛋白胨 10g(Sigma 0521)

酵母浸膏 10g(Difco)

D-(+)-葡萄糖 10g

NaCl 2g

MgSO₄ x 7H₂O 0.15g

NaH₂PO₄ x H₂O 1.3g

K₂HPO₄ 4.4g

溶于1l软化水，调节pH至7.0。

上述培养基还极为适合于培养链霉菌属的代表和进行氧化反应。上述关于培养基组成的一般数据以及本文详细列举的培养基仅供阐述本发明，并非限制性特征。

除了培养基的组成以外，用于生产培养基的工艺，例如溶解或悬浮顺序、营养溶液的总体灭菌或各成分的单独灭菌、尤其是污染的防止，也扮演重要角色，应当根据有关生产方法加以优化。

应当注意，灭菌可能导致营养培养基的pH值变化以及沉淀。

其余培养方法也相当于习惯上用于培养微生物的方法。

在小规模上，在本发明范围内所进行的发酵、包括所有预培养通常是摇瓶培养的方式，在这种情况下，有利的是使用玻璃烧瓶，容量为0.1至5升，优选为0.5至5升，其中含有0.05至2升、优选为0.1至2升营养培养基。烧瓶优选地装有挡板。在高压灭菌和调节pH值为pH4至pH8、尤其为pH7.0至pH7.5(细菌)或pH6至pH7.5(真菌)后，在无菌条件下用相应的微生物培养物接种烧瓶。所用接种材料一般是按照下面给出的数据已经从所保藏的接种材料生成的预培养物。

培养物、包括任何预培养物的有利生长条件是需氧条件，温度从约25℃至约37℃，优选为约26℃至约30℃，但是尤其在约28℃下，在旋转摇动机上连续摇动，转速在约80rpm至约300rpm之间，优选在约100rpm与250rpm之间，但是尤其在约120rpm(每分钟的转数)下。在上述条件下，一般将链霉菌属培养1.5至7天后达到最佳氧化活性。

一旦细胞的催化能力高到足够进行所需氧化反应的程度，优选地在40小时后，即加入底物(式(II)化合物)，由此使微生物和所要氧化的底物以任意方式彼此接触。出于实用的原因，已经证实向微生物的营养溶液中加入底物、即式(II)化合物是有利的。

可以使用所要氧化的底物的例如粉末形式或溶液形式，溶剂是适合的溶剂，例如二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮，或醇溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇或叔丁醇，或醚溶剂，例如四氢呋喃或1，4-二噁烷(0.5至15体积％，优选为2体积％)，或酯溶剂，例如乙酸乙酯，或烃溶剂，例如辛烷、环己烷、甲苯或二甲苯，或适合的溶剂与适合的表面活性剂的混合物。术语“表面活性剂”包含离子型、非离子型和两性离子表面活性剂，还将被理解为包括表面活性剂的混合物。

水溶性皂类和水溶性合成表面活性化合物都是适合的阴离子型表面活性剂。适合的皂类是高级脂肪酸(C₁₀-C₂₂)或例如可从椰子油或牛油获得的天然脂肪酸混合物的碱金属盐、碱土金属盐或者未取代或取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐。进一步适合的表面活性剂还是脂肪酸甲基牛磺酸盐。不过更频繁地使用所谓的合成表面活性剂，尤其是脂肪酸磺酸盐、脂肪酸硫酸盐、磺化苯并咪唑衍生物或烷基芳基磺酸盐。脂肪酸的磺酸盐或硫酸盐通常是碱金属盐、碱土金属盐或者未取代或取代的铵盐的形式，含有C₁₀-C₂₂-烷基原子团，这也包括酰基原子团的烷基部分，例如木质素磺酸、十二烷基硫酸或从天然脂肪酸获得的脂肪醇硫酸酯混合物的钠盐或钙盐。这些化合物还包含硫酸化与磺酸化脂肪醇/环氧乙烷加合物的盐。磺酸化苯并咪唑衍生物优选地含有两个磺酸基团和一个含有8至22个碳原子的脂肪酸原子团。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸、二丁基萘磺酸或萘磺酸与甲醛的缩合产物的钠盐、钙盐或三乙醇胺盐。适合的阴离子型表面活性剂还有胆汁酸盐，例如胆酸或脱氧胆酸的钠盐。相应的磷酸盐也是适合的，例如对-壬基苯酚与4至14摩尔环氧乙烷的加合物的磷酸酯的盐；或磷脂。

适合的阳离子型表面活性剂是四烷基铵盐，例如溴化鲸蜡基三甲铵。

适合的中性表面活性剂是烷基糖苷，例如含有C₆-C₁₂-烷基原子团的烷基-β-D-吡喃葡糖苷、烷基-β-D-吡喃硫代葡糖苷、烷基-β-D-麦芽糖苷。进一步适合的中性表面活性剂是葡糖酰胺，例如含有C₇-C₁₂-酰基原子团的N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)脱氧胆酰胺、脂肪酸N-甲基葡糖酰胺。进一步适合的中性表面活性剂是单-与多-分散性聚氧化乙烯，例如

适合的两性离子表面活性剂是N，N，N-三烷基甘氨酸，例如N-正十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸。进一步适合的两性离子表面活性剂是ω-N，N，N-三烷基铵烷基磺酸盐，例如含有C₈-C₁₆-烷基原子团的3-(N-烷基-N，N-二甲基)-1-丙磺酸盐。进一步适合的两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐和3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐。

增溶与制剂领域惯用的表面活性剂尤其描述在下列文献中：Bhairi S.M.(1997)″A guide to the Properties and Uses ofDetergents in Biology and Biochemistry″，Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego CA；″1999International McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents″TheManufacturing Confectioner Publishing Co.，Glen Rock，NewJersey，U.S.A.。

通过一般用在微生物学研究中的色谱方法连续监测反应过程。

本发明还涉及能够特异性氧化4”位醇为式(III)酮的微生物的培养，涉及它与所述化合物在生物反应器中、尤其在搅拌容器式反应器类型的生物反应器中的培养。为了确保在实际的生产发酵罐中达到最佳的产物生成速率，建议首先在预培养物中繁殖微生物。发酵预培养的次数取决于在每种特定情况下最佳的接种材料浓度。有利的是，根据所用的微生物，在发酵阶段生产下列浓度的接种材料：细菌0.1-3％，真菌5-10％，放线菌目5-10％。

小型发酵罐(至多20L)的接种通常使用摇瓶预培养物进行。在这种情况下，全部烧瓶内容物都用于接种发酵罐。用于生产预培养物的原料通常是所保藏的接种材料，它例如可以是冻干产物的形式或者是冷冻或冷藏材料的形式。用在本发明范围内的所保藏的接种材料优选地是贮存在-80℃下的材料。

繁殖接种材料优选地在液体培养基中在烧瓶内在旋转摇动机上进行，或者当使用孢子时在固体营养底物上进行。与营养底物有关的条件和培养参数、尤其例如温度、pH、氧的引入必须按照所用的微生物或方法加以优化。所保藏的接种材料的生长时间从几小时至数天不等，这取决于所用原料。

冻干产物 3-10天

冷冻保藏的

细菌 4-18小时

放线菌目 1-5天

真菌 1-7天

冷藏培养物

细菌 4-24小时

放线菌目 1-3天

真菌 15天

如果使用孢子作为接种材料，那么首先在标准化条件(无菌需氧、气候舱)下，在固体营养底物上，从所保藏的接种材料繁殖孢子。如果使用基于泥煤、麦麸、稻米或大麦的多孔营养底物，那么每天彻底摇动培养物，以达到高孢子密度。进一步的可能性在于在被琼脂或其他惯用胶凝剂固化的营养培养基上培养所保藏的接种材料，优选的是使用触发孢子生成诱导作用的营养培养基。

孢子形成时间从7至30天不等，这取决于所用微生物和所用营养培养基。

为了接种预培养物或生产发酵罐，将孢子用表面活性剂悬浮，例如Tween80(表面活性剂，可从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MOUSA得到)溶液，并与它们的营养培养基一起转移到发酵罐内，或者如果使用固体营养培养基，那么也用所述表面活性剂洗去固体营养底物。然后使用以这种方式所得含有孢子的溶液接种发酵罐。优选地，孢子的回收和发酵罐的接种都在无菌条件下进行。

为了在本发明范围内生产式(III)化合物，可以使用各种尺寸的生物反应器，容量数量级从0.001m³至450m³，这取决于所需产物的量。

如果使用搅拌容器式生物反应器，那么下列发酵参数被认为是反应过程达到最佳的关键：

1、温度：在本发明方法范围内的生物催化氧化反应优选地在嗜常温范围(20℃至45℃的温度范围)内进行。关于生长和产物生成的最佳温度范围是从20℃至32℃，尤其是从24℃至30℃。

2、通气：通气速率从0.1至2.5vvm(每分钟每体积液体的空气体积)，优选为0.3至1.75vvm。如果必要的话，通气速率必须根据发酵过程中获得氧的需求加以调整。

3、压力：搅拌容器式反应器一般在轻微超压下操作，压力从0.2至1.0巴，优选为0.5至0.7巴，目的是减少污染的危险。

4、pH值：pH值可以在一定限度内变化，这取决于所用微生物。如果使用来自放线菌族的微生物，那么最初的pH值可以是从pH6至pH8，优选为pH6.5至pH7.5。

如果使用真菌，那么培养溶液的最初pH优选为pH4至pH8，尤其是从pH6至pH7.5。

5、搅拌：搅拌速度取决于所用搅拌器的类型和发酵罐的大小。在本发明的范围内，带有圆盘形叶轮的搅拌器是优选的，搅拌容器式反应器的大小为0.002m³，搅拌器的操作速度是从150rpm至550rpm，尤其是从200rpm至500rpm。

在本发明的范围内，发酵的持续时间从20小时至10天不等，这取决于所用微生物。当开始加入的底物(式(II)化合物)已经有约25％至约99.9％、更优选为约50％至约99.9％、最优选为约80％至约99.9％转化为式(III)化合物时，中断生物催化性反应。

为了确定终止氧化反应的最佳时间，通过惯用分析方法，尤其是色谱方法，例如HPLC或薄层色谱法监测反应过程的总体发酵情况。

在上述方法的改进中，生物反应器可以仅用于产生生物量，然后通过过滤或离心收获之。然后立即使用微生物的生物量作为生物催化剂，用于式(II)化合物向式(III)化合物的转化，或者可以要么照其原样、要么在冷冻干燥或喷雾干燥之后贮存在冷却条件下。然后将所述微生物——要么是新鲜收获的，要么如上所述贮存——进一步分配到其他容器内，例如优选装有挡板的烧瓶，或者分配到搅拌容器式生物反应器内，在那里进行生物转化过程。加入底物(式(II)化合物)，由此使微生物和所要氧化的底物以任意方式彼此接触。出于实用的原因，已经证实向微生物的缓冲溶液中加入底物、即式(II)化合物是有利的，该缓冲溶液不支持增殖。可以使用将要氧化的底物(式(II)化合物)的例如粉末形式或处于例如前文所述那些合适溶剂中的溶液形式。

在优选的发明实施方式中，首先将底物(式(II)化合物)溶于适合的溶剂，例如二甲基亚砜或Tween40(表面活性剂，可从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO USA得到)或二者组合，加入到含有缓冲溶液的带挡板烧瓶内，缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲液，更优选为pH7.0的0.07M磷酸盐缓冲液。然后将所得溶液灭菌，再加入生物催化剂(微生物的生物量)。然后将反应混合物在室温下培养，在100rpm与150rpm之间、优选在约120rpm下摇动约2-7天，这取决于微生物菌株。

在进一步优选的发明实施方式中，首先将底物(式(II)化合物)溶于适合的溶剂，例如二甲基亚砜或Tween40(表面活性剂，可从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO USA得到)或二者组合，加入到含有培养基的带挡板烧瓶内，所述培养基可促进用于进行所需氧化反应的微生物的生长。然后将所得溶液灭菌，再加入生物催化剂(微生物的生物量)。然后将该反应混合物在室温下培养，在100rpm与150rpm之间、优选在约120rpm下摇动约2-9天，这取决于微生物菌株。

在进一步具体的发明实施方式中，使用湿细胞制备无细胞提取物，所述细胞经过适合的缓冲溶液洗涤，再次悬浮在破裂缓冲液中，并例如通过机械手段，在2℃与15℃之间，优选在3℃与6℃之间，最优选为4℃的温度下破裂。离心所得悬液，收集无细胞提取物上清液。

向所得无细胞提取物溶液中加入适合的外来电子供应系统等分试样，例如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，和底物。加入底物后，优选地立即将混合物充分混合和通气。然后加入适合的NADPH试样，将混合物培养在15℃与40℃之间的温度下，优选在20℃与35℃之间的温度下，最优选在30℃下。

发酵肉汤的处理可以通过发酵领域惯用的方法(W.Crueger and A.Crueger，1984；P.Prave，1984)进行，目的是回收氧化产物(式(III)化合物)。

首先，利用滤器、离心机或分离器从反应肉汤中除去微粒成分，以单独从滤液中萃取。

如果使用营养细胞或死细胞作为生物催化剂，并且如果一部分反应产物(式(III)化合物存在于细胞内部，那么在萃取之前必须分解细胞。出于这个目的，可以利用各种基于机械、热、化学或酶过程的细胞分解方法。

适合用在本发明方法中的机械方法例如在搅拌式球磨或胶体磨中研磨、在匀浆器中使用压力和松弛、通过超声波的作用分解细胞。非机械类方法包括通过干燥分解细胞、通过渗透压休克溶解细胞、细胞的化学自溶和酶溶解。

一旦微粒成分已被除去，通过萃取培养溶液浓缩反应产物，利用适合的溶剂分离细胞成分。关于萃取，也有发酵领域惯用的大量辅助手段，例如混合器-沉降器、逆流柱、萃取离心机等等。

浓缩反应产物例如还可能通过膜过滤、超滤、冷冻浓缩、离子交换法等等。

萃取后所得粗产物的进一步加工可以通过在微生物学与化学研究和工业应用中业已成熟的方法进行。

这些方法例如包括色谱法，例如吸附色谱、离子交换色谱、分子筛色谱、亲合色谱、疏水色谱、分配色谱、共价色谱和其他，但是除了这些以外还有各种结晶方法。

适合于萃取的溶剂本身或其混合物是：芳族烃，例如甲苯、二甲苯混合物或取代的萘，邻苯二甲酸酯，例如邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二辛酯，脂族烃，例如己烷、庚烷、辛烷或石蜡的异构体或环己烷，醇与二醇和它们的醚与酯，例如甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、乙二醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙二醇一甲醚或一乙醚，酮，例如丙酮或2-丁酮或环己酮，氯代烃，例如二氯甲烷或氯仿或四氯化碳。

术语“表面活性剂”也将被理解为包括表面活性剂的混合物。水溶性皂类和水溶性合成表面活性化合物都是适合的阴离子型表面活性剂。适合的皂类是高级脂肪酸(C₁₀-C₂₂)或例如可从椰子油或牛油获得的天然脂肪酸混合物的碱金属盐、碱土金属盐或未取代或取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐。进一步适合的表面活性剂还有脂肪酸甲基牛磺酸盐。不过更频繁地使用所谓的合成表面活性剂，尤其是脂肪酸磺酸盐、脂肪酸硫酸盐、磺酸化苯并咪唑衍生物或烷基芳基磺酸盐。脂肪酸的磺酸盐或硫酸盐通常是碱金属盐、碱土金属盐或未取代或取代的铵盐的形式，含有C₁₀-C₂₂-烷基原子团，这也包括酰基原子团的烷基部分，例如木质素磺酸、十二烷基硫酸或从天然脂肪酸获得的脂肪醇硫酸盐混合物的钠盐或钙盐。这些化合物还包含硫酸化与磺酸化脂肪醇/环氧乙烷加合物的盐。磺酸化苯并咪唑衍生物优选地含有两个磺酸基团和一个含有8至22个碳原子的脂肪酸原子团。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸、二丁基萘磺酸或萘磺酸与甲醛的缩合产物的钠盐、钙盐或三乙醇胺盐。相应的磷酸盐也是适合的，例如对-壬基苯酚与4至14摩尔环氧乙烷的加合物的磷酸酯的盐；或磷脂。制剂领域惯用的表面活性剂尤其描述在下列文献中：″1986International McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents″TheManufacturing Confectioner Publishing Co.，Glen Rock，NewJersey，U.S.A.。

优选的发明实施方式是生产4”-氧代阿凡曼菌素的方法，该方法使生物催化剂、例如能够转化阿凡曼菌素为4”-氧代阿凡曼菌素的微生物与阿凡曼菌素接触，再从反应混合物中分离所生成的4”-氧代阿凡曼菌素。

本发明的实施方式是生产式(III)化合物、优选为4”-氧代阿凡曼菌素的方法，该方法包含下列步骤：

(1)生成细胞：向促进细胞生长的营养培养基接种能够转化式(II)化合物为式(III)化合物、优选地转化阿凡曼菌素为4”-氧代阿凡曼菌素的微生物预培养物；

(2)生长后收获细胞；

(3)将式(II)化合物、优选为阿凡曼菌素溶于适当的溶剂；

(4)向不促进细胞增殖的反应介质中加入来自步骤(3)的溶液；

(5)向来自步骤(4)的反应介质中加入来自步骤(2)的细胞；

(6)在空气的存在下摇动或搅拌步骤(5)的反应混合物；

(7)从介质中分离细胞；

(8)用适当的溶剂萃取上清液和细胞；

(9)浓缩来自步骤(8)的有机溶剂相；

(10)通过色谱或结晶法纯化萃取物(9)所含有的式(III)化合物，优选为4”-氧代阿凡曼菌素。

进一步优选的发明实施方式是生产式(III)化合物、优选为4”-氧代阿凡曼菌素的方法，该方法包含下列步骤：

(2)生长后收获细胞；

(3)将式(II)化合物、优选为阿凡曼菌素溶于适当的溶剂；

(4)向不促进细胞增殖的反应介质中加入来自步骤(3)的溶液；

(5)向来自步骤(4)的反应介质中加入来自步骤(2)的细胞；

(6)在空气的存在下摇动或搅拌步骤(5)的反应混合物；

(7)用适当的溶剂进行全培养物萃取；

(8)相分离；

(9)在真空中浓缩来自步骤(8)的溶剂相；

(1)将式(II)化合物、优选为阿凡曼菌素溶于适当的溶剂；

(2)向促进细胞生长的营养培养基中加入来自步骤(1)的溶液；

(3)向步骤(2)的营养培养基接种能够转化式(II)化合物为式(III)化合物、优选地转化阿凡曼菌素为4”-氧代阿凡曼菌素的微生物预培养物；

(4)培养能够转化式(II)化合物为式(III)化合物、优选地转化阿凡曼菌素为4”-氧代阿凡曼菌素的微生物；

(5)从培养基中分离细胞；

(6)用适当的溶剂萃取上清液和细胞；

(7)在真空中浓缩来自步骤(6)的有机溶剂相；

(8)通过色谱或结晶法纯化萃取物(7)所含有的式(III)化合物，优选为4”-氧代阿凡曼菌素。

(1)将式(II)化合物、优选为阿凡曼菌素溶于适当的溶剂；

(2)向促进细胞生长的营养培养基中加入来自步骤(1)的溶液；

(3)向步骤(2)的营养培养基接种能够转化阿凡曼菌素为4”-氧代阿凡曼菌素的微生物预培养物；

(5)用适当的溶剂进行全培养液萃取；

(6)相分离；

(7)在真空中浓缩来自步骤(6)的溶剂相；

在第二个纯粹的化学步骤中，在还原剂的存在下，所得式(III)化合物能够与式HN(R₈)R₉胺反应，其中R₈和R₉具有上式(I)所示相同含义，该胺是已知的。

反应组分可以在没有溶剂的存在下、不过优选地在溶剂的存在下反应。另一种可能性在于在反应参与者之一过量的情况下进行反应，尤其是在液体胺中。不过通常，加入惰性液体溶剂或稀释剂是有利的。这类溶剂或稀释剂的实例是芳族、脂族和脂环族烃和卤代烃，例如苯、甲苯、二甲苯、菜、四氢萘、氯苯、二氯苯、溴苯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烯(trichlorethene)或四氯乙烯(tetrochlorethene)；酯，例如乙酸乙酯；醚，例如二乙醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、叔丁基甲基醚、乙二醇一甲醚、乙二醇一乙醚、乙二醇二甲醚、二甲氧基二乙醚、四氢呋喃或二噁烷；酮，例如丙酮、甲乙酮或甲基异丁基酮；醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇或甘油；酰胺，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二乙基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮或六甲基磷酸三酰胺；腈，例如乙腈或丙腈；亚砜，例如二甲基亚砜；有机酸，例如乙酸；和水。

优选的溶剂是醚，例如四氢呋喃和乙二醇二甲醚，尤其是四氢呋喃；醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇；卤代溶剂，例如二氯甲烷或二氯乙烷；芳族溶剂，例如苯或甲苯；腈，例如乙腈；酰胺，例如N，N-二甲基甲酰胺；碳酸，例如乙酸；水；及其混合物。

非常优选的溶剂是甲醇或乙醇或其混合物。

反应优选地在0与14之间的pH范围内进行，尤其在2与10之间，在很多情况下在6与9之间，尤其在pH9下。

反应优选地在-80℃与+140℃之间的温度范围内进行，优选地在-30℃与+100℃之间，在很多情况下在-10℃与+80℃之间，尤其在0℃与+50℃之间。

优选的还原剂是氢化物，例如硼氢化物；硼烷；甲酸；甲酸酯；或氢。尤其优选的是氢化物，例如硼氢化钠、硼氢化锌、硼氢化锂、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化四甲铵。尤其优选的是硼氢化钠。

合适的话，反应可以在某些进一步的化学品的存在下进行，例如均质或不均匀的催化剂或酸。尤其适合的是酸，例如氢氯酸、对-甲苯磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸或邻苯二甲酸；路易斯酸，例如四氯化钛、四异丙醇钛或氯化锌；盐，例如高氯酸镁、乙酸钠、酒石酸钾钠、氯化镱或吡啶鎓-对-甲苯磺酸盐；吸水剂，例如硫酸钠、分子筛或硅胶；或其混合物。优选的另外的试剂是酸，例如乙酸、丙酸或酒石酸；优选的是乙酸。当用氢进行还原时，加入一种或若干适合的均质或不均匀催化剂是有利的。优选的这类催化剂是不均匀金属催化剂，它们是本领域已知的，优选为Ni-、Pt-或Pd-催化剂，尤其是阮内镍和林德乐催化剂(Pd-CaCO₃-PbO)。适合的均质催化剂尤其是铑配合物，例如Wilkinsons催化剂(氯-三-三苯基-铑)。

式(I)化合物——在每种情况下是游离形式或盐的形式——可以是一种可能的异构体形式或其混合物的形式，例如取决于分子中不对称碳原子数及其绝对与相对构型，和/或取决于分子中非芳族双键的构型，它们可以是纯异构体的形式，例如对映体和/或非对映异构体，或者是异构体混合物的形式，例如对映异构体混合物，例如外消旋物、非对映异构体混合物或外消旋物混合物；本发明既涉及纯的异构体，也涉及所有可能的异构体混合物，上下文对此都是这样理解的，即使在每种情况下没有具体提到立体化学细节也是如此。

可按照该方法或其他手段获得的式(I)化合物或其盐的非对映异构体混合物和外消旋物混合物——取决于所选择的原料和工艺——可以在成分之间的物理化学差异的基础上分离为纯的非对映异构体或外消旋物，方法是已知的，例如分步结晶、蒸馏和/或色谱。

所得对映异构体混合物、例如外消旋物可以拆分为旋光对映体，方法是已知的，例如从旋光活性溶剂中重结晶、手性吸附剂色谱(例如乙酸纤维素-高压液相色谱(HPLC))、借助适合的微生物、用特异性固定化酶裂解、经由包合化合物的生成，例如使用手性冠醚，在这种情况下仅有一种对映异构体被配位化合，或者转化为非对映异构的盐，例如通过碱性终产物外消旋物与旋光活性酸的反应，后者例如一种羧酸，如樟脑酸、酒石酸或苹果酸，或一种磺酸，如樟脑磺酸，和所得非对映异构体混合物的分离，例如在它们的不同溶解度的基础上，通过分步结晶分离为非对映异构体，通过适合的、例如碱性试剂的作用，从中可以游离出所需的对映异构体。

除了分离相应的异构体混合物以外，按照本发明还有可能通过公知的非对映选择性或对映选择性合成法得到纯的非对映异构体或对映异构体，例如进行根据本发明的方法，使用具有相应适合的立体化学的原料。

式(I)与(III)化合物及其酸加成产物和盐还可以得到它们的水合物的形式和/或可以包括其他溶剂，例如可能已经用于结晶以固体形式存在的化合物的溶剂。

本发明涉及该方法的所有形式，按照它们可在该方法任意阶段作为原料或中间体获得的化合物被用作原料，进行全部或一些其余步骤，或者使用原料的衍生物或盐的形式和/或其外消旋物或对映体，或者原料尤其是在反应条件下生成的。

可按照该方法或其他手段获得的式(I)与(III)化合物可以按本身已知的方式转化为不同的式(I)与(III)化合物。

在本发明的方法中，优选地使用这样的原料和中间体，在每种情况下均为游离形式或盐的形式，如开头所述它们生成尤其宝贵的式(I)与(III)化合物或其盐。

在R₉是氢的情况下，反应步骤2)可以分成两个单独的步骤，其中在第一步中，下式化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、m、n、A、B、C、D、E和F具有上式(I)所示含义，是这样生成的：通过式(III)化合物与式H₂N(R₈)化合物的反应，其中R₈具有与上式(I)所示相同含义；在第二步中，按照上述步骤2)工艺还原所述式(IV)化合物。所述两个独立的步骤可以按一罐合成法进行，无需分离式(IV)化合物；不过有利的是分离化合物(IV)，例如出于纯化的目的。式(IV)化合物是新颖的，也是本发明的一个方面。

实施例

参照下列详细实施例将进一步描述发明。提供这些实施例仅仅是出于阐述的目的，不打算是限制性的，另有指定除外。本发明尤其涉及实施例所述制备方法。

实施例1：细胞的生成

1.1 杀结核菌链霉菌菌株I-1529

使菌株I-1529(杀结核菌链霉菌；DSM-13135)的预培养物生长在20支带挡板的500ml埃伦迈厄烧瓶内，每瓶含有100ml培养基2，在28℃下以120rpm轨道摇动3天。

这些培养物用于接种含有401培养基4的50升发酵罐。使细胞生长在28℃下，通气速率为0.7vvm(＝30升/min)。搅拌速度保持在200rpm与300rpm之间，受pO₂-传感器的支配，以防止pO₂下降至25％以下。生长2天后，利用流通式离心机离心收获细胞。得到4.2kg细胞(湿)。

1.2 杀结核菌链霉菌菌株R-922

使杀结核菌链霉菌菌株R-922(DSM-13136)生长在Petri培养皿中ISP-2琼脂(培养基5)上。该培养物用于接种带挡板的4个500ml摇瓶，每瓶含有100ml PHG培养基(培养基6)。使这些预培养物生长在轨道摇动器上，在28℃下以120rpm摇动96小时，然后用于接种装有机械搅拌器并含有8升PHG培养基的10升发酵罐。使这种主培养物在28℃下生长，在500rpm下搅拌，通气速率为1.75vvm(14l/min)，压力为0.7巴。在指数生长结束时，即约20小时后，离心收获细胞。湿细胞的收率为70-80g/l培养物。关于进一步加工，可以将湿细胞贮存在4℃下，优选地不超过一周。

实施例2：反应工艺

2.1 静息培养

2.1.1 反应条件

将35.5g阿凡曼菌素(技术级)溶于1.05l二甲基亚砜/Tween401:1。将25ml试样加入到带挡板的42支3l埃伦迈厄烧瓶内，每瓶含有1l反应介质。将这些溶液在121℃下灭菌20分钟。冷却至室温后，分别加入如实施例1.1和1.2制备的100g湿细胞(新鲜的或者贮存在4℃下不超过4天)。随后在室温下将反应混合物在120rpm下摇动4-5天。

反应介质：

0.5g糖蜜

0.5g MgCl₂

12.5mg ZnCl₂

12.5mg MnCl_2·4H₂O

25mg CoCl_2·6H₂O

12.5mg NiCl_2·6H₂O

2.5mg CuCl_2·2H₂O

6.3mg NaMoO_4·2H₂O

0.15ml 1M HCl

用70mM磷酸盐缓冲液pH6.0调至1升，高压灭菌。

2.1.2 逐步操作

在4℃下将反应混合物在500ml聚丙烯离心烧瓶内以13000xg离心15分钟。

汇集来自40l反应混合物的上清液，用甲基叔丁基醚萃取两次(0.5vol.eq.，0.4vol.eq.)。然后将所汇集的甲基叔丁基醚相用0.185vol.eq.蒸馏水反萃取三次。在旋转蒸发器上真空浓缩甲基叔丁基醚相。干燥残余物，得到10-12g萃取物S。弃去含水相。

如下萃取来自120至132支离心烧瓶的经过离心的细胞：

将来自24只离心烧瓶的细胞转移到2l埃伦迈厄烧瓶内。向每支埃伦迈厄烧瓶内加入80g硅藻土(Hyflo

，纯化的)和1.2l丙酮。手工混合后，借助大型磁力搅拌杆使混合物匀浆。使所得浆液通过20cmΦ布氏漏斗真空过滤，用丙酮洗至无色。从而得到滤液C1和滤饼C1。

在旋转蒸发器上真空浓缩滤液C1，以除去丙酮。然后将所得含水相用0.7l甲苯萃取三次。合并甲苯相，经无水硫酸钠干燥。过滤，在旋转蒸发器上真空蒸发，得到萃取物C1。

将滤饼C1转移到2l埃伦迈厄烧瓶内，与1.5l甲苯手工混合。借助大型磁力搅拌杆使混合物匀浆。使所得浆液通过20cmΦ布氏漏斗真空过滤，用甲苯洗至无色。从而得到滤液C2和滤饼C2。弃去滤饼C2。

在旋转蒸发器上真空浓缩滤液C2，得到萃取物C2，在高真空中干燥。

合并来自40l反应混合物的萃取物C1和C2，在高真空中干燥，得到30-35g萃取物C。

类似于Clark-Still等的说明，对45g合并后的萃取物S和C进行装有1.5kg硅胶(Merck 60，0.040-0.063mm)的柱快速色谱，在0.5巴N₂-压力下用乙酸乙酯:己烷3:2洗脱，用薄层色谱监测。纯4”-氧代-阿凡曼菌素的收率为5.6g。

2.2 增殖培养物

2.2.1 反应条件

将1g阿凡曼菌素(技术级)溶于50ml二甲基亚砜/Tween40 1:1。将2.5ml试样加入到20支带挡板的500ml埃伦迈厄烧瓶内，每瓶含有100ml培养基4。将这些溶液在121℃下灭菌20分钟。冷却至室温后，分别加入如实施例1.1和1.2制备的5ml预培养物。随后将这些接种后的培养物在28℃下培养7天，按120RPM轨道摇动。

2.2.2 逐步操作

在4℃下，将反应混合物在500ml聚丙烯离心烧瓶内在13000xg下离心15分钟，过程类似于实施例3所述。得到252mg纯4”-氧代阿凡曼菌素。

2.3 无细胞的生物催化剂

2.3.1 无细胞萃取物的制备

储备溶液：

PP-缓冲液： 50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH7.0)

破裂缓冲液：50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH7.0)，

5mM苄脒，

2mM二硫苏糖醇，

0.5mM Pefabloc(Roche Diagnostics)

底物：将10mg阿凡曼菌素溶于1ml异丙醇。

将经过PP-缓冲液洗涤的6g湿细胞再次悬浮在35ml破裂缓冲液中，在4℃French压力机内破裂。将所得悬液在35000xg下离心1小时。收集无细胞的萃取物上清液。

2.3.2 酶活性测定的开展

储备溶液：

铁氧还蛋白：将5mg铁氧还蛋白(来自菠菜)按1-3mg/ml溶

于Tris/HCl-缓冲液(Fluka)

或者将5mg铁氧还蛋白(来自巴斯德氏梭状芽孢杆菌)

按1-3mg/ml溶于Tris/HCl-缓冲液(Fluka)

或者将5mg铁氧还蛋白(来自Porphyra

umbilicalis)按1-3mg/ml溶于Tris/HCl-缓冲

液(Fluka)

铁氧还蛋白还原酶：将1mg冷冻干燥的铁氧还蛋白还原酶(来自菠菜)

3，9U/mg溶于1ml H₂O(Sigma)

NADPH：含有100mM NADPH的H₂O(Roche Diagnostics)

(所有储备溶液均贮存在-20℃下，使用时保持在冰上)

HPLC条件：

HPLC仪器： Merck-Hi tachi

HPLC-柱： 70 x 4mm，Kromasil 100 C18，3.5μ

(Macherey-Nagel，Switzerland)

溶剂A：乙腈，含有0.0075％三氟乙酸

溶剂B：水，含有0.01％三氟乙酸

流速： 1.5ml/min

检测： UV 243nm

样本： 30μl

保留时间：阿凡曼菌素B1a 3.18min

4”-氧代-阿凡曼菌素B1a 4.74min

泵表： 0.0min 75％ A 25％ B

线性梯度至 7.0min 100％ A 0％ B

9.0min 100％ A 0％ B

逐步至 9.1min 75％ A 25％ B

12.0min 75％ A 25％ B

向475μl无细胞萃取物中加入下列溶液：10μl铁氧还蛋白、10μl铁氧还蛋白还原酶和lμl底物。加入底物后，立即将混合物充分混合和通气。然后加入5μl NADPH，将混合物在30℃下培养30分钟。然后，向反应混合物中加入1ml甲基叔丁基醚，充分混合。将混合物在14000rpm下离心2分钟，将甲基叔丁基醚相转移到10ml烧瓶内，借助旋转蒸发器在真空中蒸发。将残余物溶于200μl乙腈，转移到HPLC-样本小瓶内。注射30μl样本后，在4.74min时出现峰，说明存在4”-氧代-阿凡曼菌素B1a。HPLC-质谱测定质量为870Da，相当于4”-氧代-阿凡曼菌素B1a的分子量。

当用HPLC和HPLC-质谱分析产物的生成时，在2.01min时出现第二个峰，相当于酮基水合物4”-羟基-阿凡曼菌素。这说明无细胞萃取物通过羟基化作用转化阿凡曼菌素为4”-羟基-阿凡曼菌素，再通过脱水作用生成4”-氧代-阿凡曼菌素。

菠菜铁氧还蛋白例如可以用来自巴斯德氏梭状芽孢杆菌或红藻Porphyra umbilicalis的铁氧还蛋白代替，它们也导致阿凡曼菌素向4”-氧代-阿凡曼菌素的生物催化性转化。

实施例3：链霉菌属菌株

从下表可以看出能够用在本发明方法中的链霉菌属菌株和它们基于16s rDNA分析与杀结核菌链霉菌菌株I-1529和R-922的关系：

菌株编号	最接近的GenBank匹配	16s rDNA同一性％
菌株编号	最接近的GenBank匹配	16s rDNA同一性％	I-1529	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100
R-922	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100	I-1529	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100
R-922	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100	MAAG-7027	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100
DSM-40241	(被列为萨腊赛链霉菌＝ATCC-25496)恰塔努加链霉菌利迪链霉菌ATCC 25470＝NRRL-2433	10099.8	MAAG-7027	杀结核菌链霉菌DSM 40261型菌株	100
DSM-40241	(被列为萨腊赛链霉菌＝ATCC-25496)恰塔努加链霉菌利迪链霉菌ATCC 25470＝NRRL-2433	10099.8	A/96-1208710	春日链霉菌DSM 40819型菌株春日链霉菌M338-M1	99.599.4
NRRL-2433	(被列为典型菌株利迪链霉菌利迪亚种＝ATCC25470＝CBS 703.69＝DSM 40461)		A/96-1208710	春日链霉菌DSM 40819型菌株春日链霉菌M338-M1	99.599.4

实施例4：下式4”-脱氧-4”-表-(甲氨基)-阿凡曼菌素B1的制备

其中R是甲基和乙基。

将3ml乙酸的30ml甲醇溶液冷却至0至5℃。加入气态甲胺，直至溶液的pH是9。

在0℃下，向8.25ml该甲胺溶液中加入1.0g 4”-氧代-阿凡曼菌素B1的6ml甲醇溶液。使混合物升温至环境温度，然后在室温下搅拌另外50分钟。然后加入90mg硼氢化钠的2.5ml乙醇溶液，将所得混合物搅拌另外45分钟。向反应混合物中加入10ml乙酸乙酯，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液萃取三次，分离有机相，经硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂，得到4”-脱氧-4”-表-(甲氨基)-阿凡曼菌素B1。纯度超过90％。

文献

Angelino S.A.G.F.，Müller F.，Plas H.C.van der(1985)兔肝脏醛氧化酶的纯化和固定。Biotechnol.Bioeng.27：447-455.Bachmann S.，Gebicka L.，Gasyna Z.，(1981)辐射改性的明胶凝胶上葡萄糖异构酶的固定。Starch/

33：63-66.

Barbaric S.，Kozulic B.，Leustek I.，Pavlovic B.，Cesi V.，Mildner P.(1984)糖酶经过其碳水化合物链的交联。Eur.Congr.Biotechnol.(第三版)，Vol.1.Verlag Chemie，Weinheim，p.307-312.

Beddows C.G.，Guthrie J.T.，Abdel-Hay F.I.(1981)利用接枝共聚物作为酶支持物在水解的尼龙-共丙烯腈系统上固定蛋白质和酶。Biotechnol.Bioeng.23：2885-2889.

Bettmann H.，Rehm H.J.(1984)通过聚合物俘获的微生物降解苯酚。Appl.Microbiol.Biotechnol.20：285-290.

Bhairi S.M.(1997)去污剂的性质和用途指南。Biology andBiochemistry，Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego CA，1997.

Bickerstaff G.F.(Ed.)(1997)酶和细胞的固定(Methods inBiotechnology Series)，Humana Press，Totowa NJ USA，1997.Bihari V.，Goswami P.P.，Rizvi S.H.M.，Kahn A.W.，Basu S.K.，Vora V.C.(1984)固定化真菌孢子的类固醇微生物转化研究：利用固定在聚丙烯酰胺凝胶和其它基质上的赭曲霉G8孢子对孕酮进行IIa羟化。Biotechnol.Bioeng.26：1403-1408.

Black G.M.，Webb C.，Matthews T.M.，Atkinson B.(1984)使用生物质支持颗粒对酵母细胞进行固定的实用反应器体系。Biotechnol.Bioeng.26：134-141.

Cabral J.M.S.，Novais J.M.，Cardoso J.P.(1984)利用鞣酸将葡糖淀粉酶偶联到钛(IV)活化的受控孔玻璃的烷基胺衍生物上。Biotechnol.Bioeng.26：386-388.

Cannon J.J.，Chen L.-F.，Flickinger M.C.，Tsao G.T.(1984)开发固定化乳酸氧化酶系统用于乳酸分析。Biotechnol.Bioeng.26：167-173.

Cantarella M.，Migliaresi C.，Tafuri M.G.，Afani F.(1984)在羟基甲基丙烯酸酯凝胶上固定酵母细胞。Appl.Microbiol.Biotechnol.20：233-237.

Chipley J.R.(1974)2，4-二硝基苯酚和N，N’-双环-己基碳二亚胺对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的细胞包膜伴随酶的影响。10：115-120.

Clark-Still W.，Kahn M.，Mitra A.(1978)用于中度分辨率的制备性分离的快速色谱技术。J.Org.Chem.43：2923-2925.

Crueger W.，Crueger A.(1984)Biotechnologie-Lehrbuch derangewandten Mikrobiologie，2nd edition，R.OldenbourgVerlag Munich，Vienna，1984.

Dennis，K.E.；Clark，D.S.；Bailey，J.E.；Cho，Y.K.；Park，Y.H.(1984)酶在多孔支持物中的固定。Biotechnol.Bioeng.26：892-900.

Deo Y.M.，Gaucher G.M.(1984)利用固定在K角叉菜胶珠中的产黄青霉细胞半连续和连续生产青霉素G。Biotechnol.Bioeng.26：285-295.

De Rosa M.，Gambacorta A.，Lama L.，Nicolaus B.(1981)嗜热微生物细胞在粗制蛋白中的固定。Biotechnol.Lett3：183-188.DiLuccio R.C.，Kirwan D.J.(1984)溶解氧对氮固定的影响A.Vinelandii.II.Ionically adsorbed cells.Biotechnol.Bioeng.26：87-91.

Erhardt H.M.，Rehm H.J.(1985)吸附在活化碳上的微生物对苯酚的降解。Appl.Microbiol.Biotechnol.21：32-36.

Eikmeier H.，Rehm H.J.(1984)利用固定化黑曲霉生产柠檬酸。Appl.Microbiol.Biotechnol.20：365-370.

C.，

L.(1984)通过营养物给与技术控制吸附的细胞体系。Eur.Congr.Biotechnol(第三版).Vol.2.VerlagChemie，Weinheim，p.115-120.

Gainer J.L.，Kirwan D.J.，Foster J.A.，Seylan E.(1980)吸附的和共价结合的微生物在反应器中的用途。Biotechnol.Bioeng.Symp.10：35-42.

Giard D.J.，Loeb D.H.，Thilly W.G.，Wang D.I.C.，Levine D.W.(1979)利用生长在微载体上的二倍体成纤维细胞生产人干扰素。Biotechnol.Bioeng.21：433-442.

Greene Th.W.，Wuts P.G.M.(1999)有机合成中的保护基(第三版)，John Wiley & Sons，New York NY 1999.

Hartmeier W.(1986)，Immobilisierte Biokatalysatoren，Springer Verlag，Berlin，Heidelberg，New York，Tokyo，1986.Hofstee B.H.J.(1973)通过非共价结合剂取代琼脂上固定酶。Biophys.Res.Commun.53：1137-1144.

Ibrahim M.，Hubert P.，Dellacherie E.，Magadalou J.，MullerJ.，Siest G.(1985)环氧化物水解酶对葡聚糖的共价连接。Enz.Microbiol.Technol.7：66-72.

Jack T.R.，Zajic J.E.(1977)利用固定在经碳二亚胺活化的羧甲基纤维素上的藤黄微球菌完整细胞将L-组氨酶酶促转变为尿刊酸。Biotechnol.Bioeng.19：631.

Jirku V.，Turkova J.，Krumphanzl V.(1980)固定细胞分裂停止的酵母并胞外生产大分子。Biotechnol.Lett.2：509-513.Karube，I.；Kawarai，M.；Matsuoka，H.；Suzuki，S.(1985)利用固定化原生质体生产L-谷氨酸。Appl.Microbiol.Biotechnol.21：270-272.

Kato T.，Horikoshi K.(1984)嗜碱性的芽孢杆菌之种No.38-2的固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶。Biotechnol.Bioeng.26：595-598.

Kaul R.，D’Souza S.F.，Nadkarni G.B.(1984)利用固定化的半乳糖苷酶-鸡蛋白粉水解乳中乳糖。Biotechnol.Bioeng.26：901-904.

Khan S.S.，Siddiqi A.M.(1985)利用戊二醛研究化学聚集的胃蛋白酶。Biotechnol.Bioeng.27：415-419.

Krakowiak W.，Jach M.，Korona J.，Sugier H.(1984)在活化的氧化铝上固定葡糖淀粉酶。Starch/

36：396-398.

Kühn W.，Kirstein D.，MohrP.(1980)Darstellung undEigenschaften Glukoseoxydase.Acta Biol.med.Germ.39：1121-1128.

Mazumder T.K.，Sonomoto K.，Tanaka A.，Fukui S.(1985)利用弯孢的固定化菌丝体和简单节杆菌的固定化细胞依次将11-脱氧皮醇转变为孕酮。App.Microbial.Biotechnol.21：154-161.

Messing R.A.，Oppermann R.A.(1979)用于积累生物质的各极维度。I：通过裂殖或出芽繁殖的微生物。Biotechnol.Bioeng.21：49-58.Miyawaki O.，Wingard jr L.B.(1984)通过吸附在碳上而固定的黄素二核苷酸和葡萄糖氧化酶的电化学和酶促活性。Biotechnol.Bioeng.26：1364-1371.

Monsan P.，Combes D.，Alemzadeh I.(1984)将转化酶共价接枝到玉米干草上。Biotechnol.Bioeng.26：658-664.

Mori T.，Sato T.，Tosa T.，Chibata I.(1972)对固定化酶的研究。X：俘获到丙烯酰胺凝胶晶格中的氨基酰基转移酶的制备和性质。Enzymologia 43：213-226.

Nakajima H.，Sonomoto K.，Usui N.，Sato F.，Yamada Y.，TanakaA.，Fukui S.，(1985)俘获Lavendula Vera并利用俘获细胞生产色素。J.Biotechnol.2：107-117.

Navarro J.M.，Durand G.(1977)通过固定到多孔玻璃上修饰酵母代谢。Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.4：243-254.

P.，Faust U.，Sittig W.，Sukatsch.D.A.(1984)HandbuchBiotechnologie，2nd edition，R.Oldenbourg Verlag Munich，Vienna，1984.

Qureshi N.，Tamhane D.V.(1985)利用固定化的酿酒酵母完整细胞生产蜂蜜酒。Appl.Microbiol.Biotechnol.21：280-281.

Raghunath K.，Rao K.P.，Joseph U.T.(1984)固定到胶原蛋白-聚(甲基丙烯酸脱水甘油酯)接枝共聚物上的脲酶的制备和鉴定。Biotechnol.Bioeng.26：104-109.

Romanovskaya V.A.，Karpenko V.I.，Pantskhava E.S.，Greenberg T.A.，Malashenko Y.R.(1981)甲烷氧化和甲醇原性细菌的固定化细胞的催化性质：Moo-Young M.(Ed.)Advances inBiotechnology，Vol.3 Pergamon，Toronto，p.367-372.

Shimizu S.，Morioka H.，Tani Y.，Ogata K.(1975)利用固定化微生物细胞生产辅酶A。J.Ferm.Technol.53：77-83.

Talsky G.，Gianitsopoulos G.(1984)酶的分子间交联：Eur.Congr.Biotechnol.(第三版)，Vol.1，Verlag Chemie，Weinheim，p.299-305.

Umemura I.，Takamatsu S.，Sato T.，Tosa T.，Chibata I.(1984)利用固定化微生物细胞改进L-天冬氨酸的生产。Appl.Microbiol.Biotechnol.20：291-295.

Van Haecht J.L.，Bolipombo M.，Rouxhet P.G.(1985)通过粘附固定酿酒酵母：利用AI离子处理细胞。Biotechnol.Bioeng.27：217-224.

Vogel H.J.，Brodelius P.(1984)游离悬浮的和固定化的Catharanthus roseus植物细胞的体内31P NMR比较。J.Biotechnol.1：159-170.

WeetallH.H.，Mason R.D.(1973)固定化木瓜蛋白酶的研究。Biotechnol.Bioeng.15：455-466.

Wiegel J.，Dykstra M.(1984)热纤维梭菌：粘附于纤维素和半纤维素上时的附着和孢子形成。Appl.Microbiol.Biotechnol.20：59-65.

Workman W.E.，Day D.F.(1984)利用戊二醛固定化酵母细胞将菊粉水解成果糖。Biotechnol.Bioeng.26：905-910.

所引用的专利文献

US-P-5,288,710

EP-A-736,252

EP-301,806

EP-401,029

DE-2,717,040

Claims

1、下式化合物的制备方法

其中

R₁-R₉彼此独立地代表氢或取代基；

m是0、1或2；

n是0、1、2或3；并且

或单键与下式亚甲基桥连接的，

包括其E/Z异构体、E/Z异构体混合物和/或互变体，在每种情况下均可以为游离形式或盐的形式，

该方法包含

1)使下式化合物

其中

2)在还原剂的存在下，使式(III)化合物与式HN(R₈)R₉胺反应，其中R₈和R₉具有与上式(I)所示相同含义，

其中所述生物催化剂是属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物。

2、根据权利要求1的方法，用于式(I)化合物的制备，其中

n是1；

m是1；

A是双键；

B是单键或双键；

C是双键；

D是单键；

E是双键；

F是双键；或单键与环氧化物桥；或单键与亚甲基桥；

R₁、R₂和R₃是H；

R₄是甲基；

R₅是C₁-C₁₀-烷基、C₃-C₈-环烷基或C₂-C₁₀-烯基；

R₆是H；

R₇是OH；

q是4、5或6。

3、根据权利要求1的方法，用于式(I)化合物的制备，其中

n是1；

m是1；

A、B、C、E和F是双键；

D是单键；

R₁、R₂和R₃是H；

R₄是甲基；

R₅是仲丁基或异丙基；

R₆是H；

R₇是OH；

R₈是甲基；

R₉是H。

4、根据权利要求1的方法，用于4”-脱氧-4”-N-甲氨基阿凡曼菌素B_1a/B_1b苯甲酸盐的制备。

5、根据权利要求1-4中任一项的方法，其中该生物催化剂选自下组中的任意一种：

a)活的微生物，为营养细胞、静息细胞或冻干细胞的形式，

b)所述微生物的孢子，

c)死的微生物，

d)部分解体形式的死亡微生物，也就是说通过机械或化学方法或喷雾干燥使细胞壁/细胞膜通透，

e)所述微生物细胞内容物的粗提取物，和

f)转化式(II)化合物为式(III)化合物的酶。

6、根据权利要求1的方法，其中该微生物是链霉菌属菌株，选自杀结核菌链霉菌(Streptomyces tubercidicus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、萨腊赛链霉菌(Streptomyces saraceticus)和春日链霉菌(Streptomyceskasugaensis)。

7、根据权利要求6的方法，其中该微生物是以保藏号DSM-13136保藏的R-922链霉菌菌株。

8、根据权利要求6的方法，其中该微生物是以保藏号DSM-13135保藏的I-1529链霉菌菌株。