KR20020063890A - 매크로사이클릭 락톤의 제조방법 - Google Patents

매크로사이클릭 락톤의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020063890A
KR20020063890A KR1020027006098A KR20027006098A KR20020063890A KR 20020063890 A KR20020063890 A KR 20020063890A KR 1020027006098 A KR1020027006098 A KR 1020027006098A KR 20027006098 A KR20027006098 A KR 20027006098A KR 20020063890 A KR20020063890 A KR 20020063890A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
compound
formula iii
cells
compounds
Prior art date
Application number
KR1020027006098A
Other languages
English (en)
Inventor
파흐라트코요하네스파울
핏테르나토마스
융만폴커
Original Assignee
신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 신젠타 파티서페이션즈 아게 filed Critical 신젠타 파티서페이션즈 아게
Publication of KR20020063890A publication Critical patent/KR20020063890A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

본 발명은 화학식 II의 화합물을, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시킬 수 있는 생물학적 촉매와 접촉시켜 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계(1)와
화학식 III의 화합물을, 환원제의 존재하에, 공지되어 있는 화학식 HN(R8)R9의 아민(여기서, R8및 R9는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다)과 반응시키는 단계(2)를 포함하는,
각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물 및, 경우에 따라, 이의 E/Z 이성체, 이의 E/Z 이성체 혼합물 및/또는 이의 토오토머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
화학식 I
위의 화학식 I에서,
R1내지 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 치환체이고,
m은 0, 1 또는 2이고,
n은 0, 1, 2 또는 3이고,
A, B, C, D, E 및 F는 결합을 나타내고, 서로 독립적으로, 2개의 인접한 탄소원자가 이중결합, 단일결합, 단일결합과 에폭사이드 브릿지, 또는 단일결합과 메틸렌 브릿지에 의해 결합되어 있음을 나타낸다.
화학식 II
위의 화학식 II에서,
R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
화학식 III
위의 화학식 III에서,
R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.

Description

매크로사이클릭 락톤의 제조방법{Preparation of a macrocyclic lactone}
본 발명은 매크로사이클릭 락톤의 제조방법, 중간체 화합물의 제조방법 및 당해 방법에 사용되는 중간체 화합물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은
화학식 II의 화합물을, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시킬 수 있는 생물학적 촉매와 접촉시켜 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계(1)와
화학식 III의 화합물을, 환원제의 존재하에, 공지되어 있는 화학식 HN(R8)R9의 아민(여기서, R8및 R9는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다)과 반응시키는 단계(2)를 포함하고,
각각의 경우, 경우에 따라, 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머를, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 상이한 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머로 전환시키는 단계, 당해 방법에 따라 수득할 수 있는 E/Z 이성체 혼합물을 분리하고 목적하는 이성체를 단리하는 단계, 및/또는 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는 유리 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머를 염으로 전환시키는 단계 또는 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는 화학식 I의화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머의 염을 유리 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체, 이의 토오토머 또는 상이한 염으로 전환시키는 단계를 포함하여, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물 및, 경우에 따라, 이의 E/Z 이성체, 이의 E/Z 이성체 혼합물 및/또는 이의 토오토머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
위의 화학식 I에서,
R1내지 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 임의의 치환체이고,
m은 0, 1 또는 2이고,
n은 0, 1, 2 또는 3이고,
A, B, C, D, E 및 F는 결합을 나타내고, 서로 독립적으로, 2개의 인접한 탄소원자가 이중결합, 단일결합, 단일결합과 화학식의 에폭사이드 브릿지, 또는 단일결합과 화학식의 메틸렌 브릿지에 의해 결합되어 있음을 나타낸다.
위의 화학식 II에서,
R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
위의 화학식 III에서,
R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
화학식 I의 화합물의 합성방법은 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 문헌에 공지된 당해 방법은 기본적으로 수율이 낮고 제조과정이 복잡하기 때문에, 제조하는 동안 상당한 문제를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 공지된 방법은 이러한 관점에서 만족스럽지 않아, 당해 화합물의 제조방법에 대한 개선이 요구되었다.
화학식 I, II 및 III의 화합물은 토오토머 형태일 수 있다. 따라서, 본원에서, 경우에 따라, 화학식 I, II 및 III의 화합물은, 비록 상응하는 토오토머가 각각의 경우 구체적으로 언급되지 않을지라도, 이를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
화학식 I, II 및 III의 화합물은 산 부가 염을 형성할 수 있다. 이들 염은, 예를 들면, 무기 강산, 예를 들면, 광산(mineral acid), 예를 들면, 과염소산, 황산, 질산, 아질산, 인산 또는 할로겐산(hydrohalic acid); 강한 유기 카복실산, 예를 들면, 치환되지 않거나 치환된, 예를 들면, 할로-치환된, C1-C4알칸카복실산, 예를 들면, 아세트산, 포화 또는 불포화 디카복실산, 예를 들면, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산 또는 프탈산, 하이드록시카복실산, 예를 들면, 아스코르브산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트르산, 또는 벤조산; 또는 유기 설폰산, 예를 들면, 치환되지 않거나 치환된, 예를 들면, 할로-치환된, C1-C4알칸- 또는 아릴-설폰산, 예를 들면, 메탄- 또는 p-톨루엔-설폰산을 사용하여 형성한다. 또한, 하나 이상의 산성 그룹을 갖는 화학식 I, II 및 III의 화합물은 염기와의 염을 형성할 수 있다. 염기와의 적합한 염은, 예를 들면, 금속 염, 예를 들면, 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들면, 나트륨 염, 칼륨 염 또는 마그네슘 염,또는 암모니아 또는 유기 아민과의 염, 예를 들면, 모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 모노-, 디- 또는 트리-저급 알킬아민, 예를 들면, 에틸-, 디에틸-, 트리에틸- 또는 디메틸-프로필-아민 또는 모노-, 디- 또는 트리-하이드록시-저급 알킬아민, 예를 들면, 모노-, 디- 또는 트리-에탄올아민이다. 추가로, 상응하는 내부 염도 형성할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 농학적으로 유리한 염이 바람직하다. 유리 형태 및 염 형태의 화학식 I, II 및 III의 화합물 간의 밀접한 관계를 고려하여, 본원에서 화학식 I, II 및 III의 유리 화합물 또는 이들 각각의 염을 언급하는 경우, 경우에 따라 용이하게는, 화학식 I, II 및 III의 화합물의 상응하는 염 또는 유리 화합물도 포함하는 것으로 이해해야 한다. 이는 화학식 I, II 및 III의 화합물의 토오토머 및 이의 염의 경우에도 적용된다. 각각의 경우, 유리 형태가 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 범위 내에서, n이 1이고, m이 1이고, A가 이중결합이고, B가 단일결합 또는 이중결합이고, C가 이중결합이고, D가 단일결합이고, E가 이중결합이고, F가 이중결합, 단일결합과 에폭시 브릿지, 또는 단일결합과 메틸렌 브릿지이고, R1, R2및 R3이 H이고, R4가 메틸이고, R5가 C1-C10-알킬, C3-C8-사이클로알킬 또는 C2-C10-알케닐이고, R6이 H이고, R7이 OH이고, R8및 R9가 서로 독립적으로 H, C1-C10-알킬 또는 C1-C10-아실이거나, 함께 -(CH2)q-(여기서, q는 4, 5 또는 6이다)를 형성하는 화학식 I의 화합물의 제조방법이 바람직하다.
본 발명의 범위 내에서, n이 1이고, m이 1이고, A, B, C, E 및 F가 이중결합이고, D가 단일결합이고, R1, R2및 R3이 H이고, R4가 메틸이고, R5가 2급-부틸 또는 이소프로필이고, R6이 H이고, R7이 OH이고, R8이 메틸이고, R9가 H인 화학식 I의 화합물의 제조방법이 특히 바람직하다.
에마멕틴의 제조방법이 매우 특히 바람직하고, 에마멕틴의 벤조에이트 염이 더욱 특히 바람직하다. 에마멕틴은 4"-데옥시-4"-N-메틸아미노 아베르멕틴 B1a/B1b혼합물로서, 미국 특허 제4,874,749호에 기재되어 있고 문헌[참조: Journal of Organic Chemistry, Vol. 59(1994), 7704-7708]에 MK-244로서 기재되어 있다. 농학적으로 특히 중요한 에마멕틴 염은 미국 특허 제5,288,710호에 기재되어 있다. 화학식 I의 화합물은 특히 해충 및 대표적인 진드기목을 방제하는 데 중요한 살충제이다. 언급한 해충은, 예를 들면, 유럽 공개특허공보 제736 252호의 제5면 제55행 내지 제58행, 제6면 및 제7면 제1행 내지 제21행에 기재된 것들을 포함한다. 여기에 언급된 해충은 본 발명의 논제에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 일반적인 용어들은 달리 언급하지 않는 한 아래의 의미를 갖는다.
탄소-함유 그룹 및 탄소-함유 화합물 각각은 탄소원자를 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 1 내지 4개, 더욱 특히 1개 또는 2개 함유한다.
알킬은 직쇄, 즉 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실, 또는 측쇄, 즉 이소프로필, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 또는 이소헥실이다.
그룹 자체로서의 알케닐 및, 다른 그룹 및 화합물의 구조적 요소로서의 알케닐, 예를 들면, 할로알케닐 및 아릴알케닐은, 각각의 경우, 당해 그룹 또는 화합물에 함유된 탄소원자의 수를 고려하여, 직쇄, 예를 들면, 비닐, 1-메틸비닐, 알릴, 1-부테닐 또는 2-헥세닐, 또는 측쇄, 예를 들면, 이소프로페닐이다.
C3-C6-사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실, 특히 사이클로헥실이다.
본 발명의 추가의 양태는,
- 위에 정의된 바와 같은 화학식 III의 화합물,
- 위의 단계(1)에 따라 화학식 II의 화합물로부터 출발하는 화학식 III의 화합물의 제조방법 또는
- 위의 단계(2)에 따라 화학식 III의 화합물로부터 출발하는 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 "생물학적 촉매"는
(a) 예를 들면, 영양 세포, 휴면 세포 또는 동결건조 세포 형태의 생존 미생물,
(b) 당해 미생물의 포자,
(c) 바람직하게는 부분적으로 분해된 형태, 즉 세포벽/세포막이 기계적으로, 화학적으로 또는 분무 건조에 의해 침투성화된 사멸 미생물,
(d) 당해 미생물의 세포 내용물의 조 추출물 및
(e) 화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시키는 효소를 포함한다.
세균 및 진균은 본 발명에 따르는 방법에 특히 적합한 미생물이다. 특히, 적합한 세균은 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 악티노마이세테스(Actinomycetes)의 대표적인 세균이다. 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스(Streptomyces tubercidicus), 스트렙토마이세스 카타노오겐시스(Streptomyces chattanoogensis), 스트렙토마이세스 라이디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토마이세스 사라세티쿠스(Streptomyces saraceticus) 및 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스트렙토마이세스속 균주가 바람직하다. 균주 스트렙토마이세스 R-922(스트렙토마이세스 투베르시디쿠스) 및 특히 스트렙토마이세스 I-1529(스트렙토마이세스 투베르시디쿠스)는 화학식 II의 화합물의 4" 위치에서 하이드록시 그룹의 영역 특이적(regiospecific) 산화에 특히 적합한 것으로 입증되었다.
스트렙토마이세스 균주인 스트렙토마이세스 I-1529 및 스트렙토마이세스 R-922는 부다페스트 조약하에, 1999년 11월 5일 각각 수탁번호 DSM-13135 및 DSM-13136으로 독일 데-38124 브라운슈바익 마쉐로더 벡 1베 소재의 DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁되었다.
예를 들면, 스트렙토마이세스 균주 MAAG-7027(스트렙토마이세스 투베르시디쿠스), 스트렙토마이세스 균주 DSM-40241(스트렙토마이세스 사라세티쿠스, 스트렙토마이세스 카타노오겐시스로서도 동정됨), 스트렙토마이세스 균주 NRRL-2433(스트렙토마이세스 라이디쿠스 아종 라이디쿠스) 및 스트렙토마이세스 균주 A/96-1208710(스트렙토마이세스 카수가엔시스)을 포함하는, 본 발명에 따르는 영역 특이적 산화를 수행하는 데 적합하게 사용할 수 있는 추가의 균주가 동정되었다. 위의 모든 균주는 각각 스트렙토마이세스 균주인 스트렙토마이세스 I-1529 및 스트렙토마이세스 R-922와 밀접하게 관련되어 있으며, 이는 16s rDNA 분석 결과 동일성이 99.4 내지 100%인 사실로부터 입증할 수 있다.
화학식 I의 화합물은 활성이 높은 식물 해충 방제제인 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 유럽 특허 제301 806호에 기재된 바와 같은 화학식 I의 화합물의 공지된 제조방법 및 본 발명에 따르는 미생물학적 방법에서, 화학식 II의 화합물이 출발 물질로서 사용된다.
공지된 방법에서는, 제1 단계에서, 문헌[참조: Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 1999]에 기재된 바와 같은 통상적인 보호 그룹 기술을 사용하여, 화학식 II의 화합물의 5 위치의 산소를 보호한 후, 4"-케톤으로 산화시킨 다음, 아민으로 전환시키고, 5 위치의 마스킹된 하이드록시 그룹을 탈보호시킨다.
본 발명에 따르는 방법은 공지된 방법의 4단계와 비교하여 단지 2단계를 포함한다는 이점을 갖는다. 추가로, 당해 방법은 보호 그룹을 사용하지 않으며, 화학약품을 더 적게 사용하므로 생태학적으로 더 안전하다. 본 발명에 따르는 생물학적 촉매 단계로부터 수득된 화학식 III의 화합물은 유럽 특허 제401 029호에 공지되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명에 따르는 방법은 상세하게는 아래와 같이 수행할 수 있다.
제1 단계에서, 화학식 III의 화합물을 제조한다. 이는 화학식 II의 화합물을, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시킬 수 있는 생물학적 촉매와 직접 접촉시키고, 산화반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 이러한 접촉을 유지시킴으로써 수행할 수 있다.
더욱 용이하게는, 당해 방법은 생물학적 촉매로서, 본 발명에 따르는 산화반응을 수행할 수 있는 미생물을 사용하여 수행한다. 바람직하게는, 당해 미생물은 미생물 증식을 촉진시키는 적합한 배양 배지 속에서 화학식 II의 화합물의 존재하에, 조절되는 조건에서 배양하고, 당해 미생물 및 이의 기질을 산화반응이 일어나기에 충분한 시간 동안, 바람직하게는 화학식 II의 화합물의 첨가량의 25 내지 99.9%, 더욱 바람직하게는 50 내지 99.9%, 가장 바람직하게는 80 내지 99.9%가 화학식 III의 화합물로 전환될 때까지 계속 함께 배양한다.
또한 더욱 바람직하게는, 당해 방법은 먼저, 미생물 증식을 촉진시키는 적합한 배양 배지 속에서 조절되는 조건하에 본 발명에 따르는 산화반응을 수행할 수 있는 미생물을 배양한 후, 예를 들면, 여과 또는 원심분리와 같은 적합한 방법을 사용하여 미생물의 바이오매스(biomass)를 수집함으로써 수행한다. 이어서, 미생물의 바이오매스를, 화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시키기 위한 생물학적 촉매로서 즉시 사용하거나, 그 자체로 또는 동결 건조 또는 분무 건조를수행한 후 저온 저장하여 반응에 사용한다. 이어서, 새로이 수집되거나 위에 기재한 바와 같이 저장된 당해 미생물 및 화학식 II의 화합물을, 산화반응이 일어나기에 충분한 시간 동안, 바람직하게는 화학식 II의 화합물의 첨가량의 25 내지 99.9%, 더욱 바람직하게는 50 내지 99.9%, 가장 바람직하게는 80 내지 99.9%가 화학식 III의 화합물로 전환될 때까지, 미생물 증식에 유리하지 않은 반응 배지 속에서 함께 배양한다.
이러한 방법으로 수득한 화학식 III의 반응 생성물은, 통상적인 분리방법, 예를 들면, 분별 결정 또는 크로마토그래피에 의해 상당한 기술을 사용하지 않고서 화학식 II의 출발 물질로부터 분리할 수 있다. 크로마토그래피는, 예를 들면, 실리카 겔과 같은 광물 담체 물질 또는 유기 이온 수지 상에서의 컬럼 크로마토그래피, 후층 크로마토그래피(thick layer chromatography) 또는 박층 크로마토그래피를 포함한다.
영양 세포 구조물 대신에, 미생물 포자를 사용할 수 있는데, 당해 포자는 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시켜 화학식 III의 케톤을 형성시킬 수 있는 미생물로부터 수집된 후, 상응하는 산화반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 화학식 II의 화합물과 함께 배양한다. 포자 및 기질의 배양은 바람직하게는 배양 배지의 부재하에 수행하여 포자의 발아를 방지한다.
화학식 II의 화합물은 본 발명에 따르는 산화반응용 기질로서 사용한다. 당해 화합물은 공지되어 있거나[참조: 독일 특허 제2717040호], 공지된 화합물로부터 공지된 방법과 유사하게 제조할 수 있다. 이들은 동물 및 식물의 해충 방제에 적합하고, 또한 화학식 I의 화합물의 제조시 중요한 출발 물질 또는 중간체이다. 또한, 화학식 III의 화합물은 미생물 자체가 아니라, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시켜 화학식 III의 케톤을 형성시킬 수 있는 당해 미생물로부터 유래된 활성 구성성분[위의 정의 (b) 내지 (e)에 따름]을 사용하여 화학식 II의 화합물을 산화시켜 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태는 고정화 형태의, 영양 미생물 세포, 세포-비함유 추출물(cell-free extract), 포자, 효소 및 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시켜 화학식 III의 케톤을 형성시킬 수 있는 당해 미생물의 효소 혼합물의 용도에 관한 것이다.
당해 생물학적 촉매의 고정화는 본래 공지된 방법과 유사하게 수행할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 일반적으로 수불용성인 고체 담체 물질에 대한 당해 생물학적 촉매의 흡착 결합, 이온 결합 또는 공유 결합, 이관능성 또는 다관능성 제제에 의한 생물학적 촉매의 가교결합, 매트릭스 캡슐화(matrix encapsulation), 막 분리 또는 위에 언급한 방법 중 둘 이상의 조합을 기본으로 하는 방법을 특히 언급할 수 있다.
수불용성 담체(흡착제)에 대한 흡착 결합은 특히 반 데르 발스의 힘에 의해 이루어진다. 다수의 무기 및 유기 화합물, 및 합성 중합체가 흡착제로서 적합하다.
미생물의 이러한 고정화 방법은 빅커슈타프(Bickerstaff)[참조: (Ed.), 1997, Immobilisation of Enzymes and Cells], 반 해크트(van Haecht) 등(1985)(효모 세포/유리), 블랙(Black) 등(1984)(효모 세포/정제 스틸, 폴리에스테르), 비겔(Wiegel)과 디크스트라(Dykstra)(1984)[클로스트리디아(Chlostridia)/셀룰로즈, 헤미셀룰로즈], 푀르베르크(Forberg)와 해그스트룀(Haggstrom)(1984)(클로스트리디아/목재 쉐이빙(wood shavings)) 및 에르하르트(Ehrhardt)와 렘(Rehm)(1985)[슈도모나스(Pseudomonas)/활성탄]에 의해 기재되어 있다. 흡착 결합에 의해 고정화된 효소의 용도에 대한 상응하는 세부사항은 특히 크라코비아크(Krakowiak) 등(1984)(글루코아밀라제/산화알루미늄), 카브랄(Cabral) 등(1984)(글루코아밀라제/티탄-활성화 유리), 미야와키(Miyawaki)와 빈가르트(Wingard)(1984)(글루코스 옥시다제/활성탄) 및 가토(Kato)와 호리코시(Horikoshi)(1984)(글루코스 트랜스퍼라제/합성 수지)에 의해 기재되어 있다. 이온 결합은 담체 물질(예: 예를 들면, 다당류 또는 합성 수지를 기재로 하는 시판 이온 교환체) 및 결합시킬 생물학적 촉매의 반대로 하전된 그룹들 사이의 정전기적 인력을 기본으로 한다.
이온 결합을 기본으로 하는 미생물의 고정화 방법은 딜루치오(DiLuccio)와 키르반(Kirwan)(1984)[아조토박터 종(Azotobacter spec.)/셀렉스 E(Cellex E)(셀룰로즈)] 및 기아르트(Giard) 등(1977)[동물 세포/DEAE-세파덱스(Sephadex)]에 의해 기재되어 있다. 상응하는 효소의 고정화는 안겔리노(Angelino) 등(1985)[알데히드 옥시다제/옥틸아미노-세파로스 4B(octylamino-Sepharose 4B)], 호프스티(Hofstee)(1973)(락테이트 데하이드로게나제/옥틸아미노-세파덱스), 퀸(Kuhn) 등(1980)(글루코스 옥시다제/DEAE-세파덱스, DEAE-셀룰로즈) 및 다른 사람들에 의해 제시된 세부사항에 따라 수행할 수 있다.
추가의 고정화 방법은 생물학적 촉매들끼리 고정 결합시키거나 생물학적 촉매와 담체 물질을 고정 결합시키는 공유 결합력의 사용을 기본으로 한다. 적합한 담체 물질은 다공성 물질, 예를 들면, 유리, 실리카 또는 다른 불용성 무기 물질이다.
본 발명에 따르는 방법의 범위 내에서, 미생물은, 예를 들면, 메싱(Messing) 및 오페르만(Oppermann)(1979)[엔테로박테리아(Enterobacteria)/붕규산염 유리; 효모 세포/산화지르코늄], 로마노브스카야(Romanovskaya) 등(1981)[메탄 세균/실로크롬(Silochrome)] 및 나바로(Navarro)와 두란트(Durand)(1977)(효모 세포/다공성 실리카)의 방법과 유사하게 고정화할 수 있다.
효소의 고정화는 비탈(Weetall)과 마손(Mason)(1973)(파파인/다공성 유리) 및 몬산(Monsan) 등(1984)(인버타제/다공성 실리카)에 의해 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르는 방법에서, 이미 언급한 담체 물질 뿐만 아니라, 일련의 모든 천연 또는 합성 중합체, 예를 들면, 셀룰로즈, 덱스트란, 전분, 아가로스 등 또는, 예를 들면, 일반적으로 반응성 공중합체 제조시 사용되는 아크릴산 및 메타크릴산 유도체를 기본으로 하는 중합체도 고정화에 적합하다. 생물학적 촉매에 대한 결합을 형성시키는 적합한 반응성 그룹은 반응성 디니트로플루오로페닐 또는 이소티오시아네이트 그룹, 또는 특히 옥시란 및 산 무수물 그룹이다. 추가로,예를 들면, 상품명 앰버라이트(AmberliteR) XE-64 및 앰버라이트 IRC-50으로 시판중인 카복시 그룹을 갖는 수지의 염화물 활성화를 수행할 수 있다.
천연 또는 합성 담체 물질을 사용하는 미생물의 고정화는 치플리(Chipley)(1974)[바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)/아가로스], 가이너(Gainer) 등(1980)(아조토박터 종/셀룰로즈), 잭(Jack)과 차직(Zajic)(1977)[마이크로코쿠스(Micrococcus)/카복시메틸셀룰로즈], 지르쿠(Jirku) 등(1980)(효모 세포/하이드록시알킬메타크릴레이트) 및 쉬미츠(Shimizu) 등(1975)(세균 세포/에틸렌 말레산 무수물 공중합체)이 기재한 바와 같이 수행할 수 있다. 효소의 고정화는 특히 캐논(Cannon) 등(1984)(락테이트 옥시다제/셀룰로즈), 데니스(Dennis) 등(1984)(키모트립신/세파로스), 이브라임(Ibrahim) 등(1985)(에폭시 하이드롤라제/덱스트린), 베도우즈(Beddows) 등(1981)(α-갈락토시다제/나일론-아크릴레이트 공중합체) 및 라구나트(Raghunath) 등(1984)(우레아제/메타크릴레이트-아크릴레이트)의 방법과 유사하게 수행할 수 있다.
가교결합 방법에서, 생물학적 촉매는 이관능성 또는 다관능성 제제, 예를 들면, 특히 글루타르디알데하이드 및 디이소시아네이트에 의해 서로 결합되고, 특징적으로 고분자량인 일반적인 불용성 젤라틴 응집물을 형성한다.
이러한 미생물의 고정화는 데 로사(De Rosa) 등(1981)(세균 세포/글루타르디알데하이드에 의한 계란 알부민과의 공-가교결합)의 방법과 유사하게 수행할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있는 효소의 고정화 방법은바르바릭(Barbaric) 등(1984)(인버타제/아디프산 디하이드라지드와의 가교결합), 탈스키(Talsky)와 기아니초풀로스(Gianitsopoulos)(1984)(키모트립신/가교결합제 부재하의 효소 분자 간의 펩타이드 결합), 보르크만(Workman)과 다이(Day)(1984)(이눌리나제/글루타르디알데하이드의 효소-함유 세포와의 가교결합), 칸(Khan)과 시디키(Siddiqi)(1985)(펩신/글루타르디알데하이드와의 가교결합), 바흐만(Bachmann) 등(1981)(글루코스 이소머라제/글루타르디알데하이드에 의한 젤라틴과의 가교결합) 및 카울(Kaul) 등(1984)(α-갈락토시다제/글루타르디알데하이드에 의한 계란 알부민과의 공-가교결합)에 의해 기재되어 있다.
매트릭스 캡슐화는 일반적으로 젤라틴 구조를 갖는 천연 또는 합성 중합체 중에 생물학적 촉매를 봉입시킴을 포함한다. 세포, 세포 소기관 및 포자의 봉입에 특히 적합한 매트릭스 물질은 알기네이트, 카라기난, 펙틴, 한천, 아가로스 또는 젤라틴과 같은 천연 중합체이며, 그 이유는 이들 화합물이 무독성이고 취급 동안 세포를 보호하기 때문이다. 또한, 예를 들면, 특히 폴리아크릴아미드 및 광가교결합된 수지와 같은 합성 수지도 적합하다. 매트릭스 캡슐화 형태는 광범위한 범위 내에서 변화시킬 수 있고, 예를 들면, 구형, 실리더형, 섬유형 및 시트형을 포함할 수 있다. 천연 또는 합성 매트릭스 물질을 사용하는 미생물의 고정화는 마춤더(Mazumder) 등(1985)(세균 세포/광가교결합된 수지), 베트만(Bettmann)과 렘(Rehm)(1984)(세균 세포/폴리아크릴아미드 하이드라지드), 우메무라(Umemura) 등(1984)(세균 세포/카라기난), 카루베(Karube) 등(1985)(세균 프로토플라스트/한천-아세틸셀룰로즈), 칸타렐라(Cantarella) 등(1984)(효모 세포/하이드록시에틸메타크릴레이트), 쿠레쉬(Qureshi)와 타만(Tamhane)(1985)(효모 세포/알기네이트), 데오(Deo)와 가우셔(Gaucher)(1984)[히포마이세테스(Hypomycetes)/카라기난], 아이크마이어(Eikmeier)와 렘(1984)(히포마이세테스/알기네이트), 비하리(Bihari) 등(1984)[히포마이세테스 코니디알(Hypomycetes conidial)/폴리아크릴아미드], 포겔(Vogel)과 브로델리우스(Brodelius)(1984)(식물 세포/알기네이트, 아가로스) 및 나카지마(Nakajima) 등(1985)(식물 세포/한천, 알기네이트, 카라기난)이 기재한 바와 같이 수행할 수 있다.
효소의 고정화는 모리 등(1972)(아미노아실라제/폴리아크릴아미드)의 방법과 유사하게 수행할 수 있다.
막 분리는 반응이 진행되는 특정한 한정 영역의 형성을 포함한다. 막 분리의 기본적인 변형법은 아래와 같이 변경된다.
(a) 미세캡슐화,
(b) 리포솜 기술 및
(c) 막 반응기 내에서의 생물학적 촉매의 사용.
위에 기재한 고정화 방법은, 예를 들면, 흡착 및 가교결합과 같이, 서로 조합할 수 있다. 이 경우, 효소는 먼저 담체에 흡착된 후, 이관능성 제제에 의해 서로 가교결합된다.
특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시켜 화학식 III의 케톤을 형성시키기 위한 화학식 II의 화합물과 함께, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 생물학적 촉매를 배양시키는 것은 응용 미생물학에서 통상적인 방법들을 사용하여 수행할 수 있다. 진탕 배양의 사용 뿐만 아니라, 특히 오래 동안 미생물학 연구 및 공업적 생산에서 확립되어 온 각종 발효기 시스템을 언급할 수 있다.
생물 반응기(bioreactor)의 주 역할은 최적의 유체역학적 조건을 형성하여 겉보기 미하엘리스 상수(Michaelis constant)를 감소시키고 반응 속도를 증가시키는 것이다.
필수적으로 이것은 생물학적 촉매와 주위 매질 간의 적합한 상대적 이동을 유지하여 외부 질량 이동을 더 이상 실질적으로 저해되지 않는 정도로 증가시킴으로써 달성된다.
당해 방법에 적합한 반응기 유형은, 예를 들면, 교반식 용기형 반응기, 루프형 반응기, 침상 반응기, 유동상 반응기, 막 반응기 및 다수의 특정 형태의 반응기, 예를 들면, 특히 체(sieve)-교반되는 반응기, 장사방형(rhomboid) 반응기 및 튜브 반응기를 포함한다[참조: W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger and A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Prave et al., Handbuch der Biotechnologie, 1984]. 본 발명의 범위 내에서, 교반식 용기형 반응기를 사용하는 것이 바람직하다.
교반식 용기형 반응기는 생물공학 분야의 발효에 가장 많이 사용되는 반응기 유형이다. 당해 유형의 반응기는 교반 용량이 높고 산소 전달 용량이 높아서 기질과 생물학적 촉매를 신속하고 균일하게 혼합한다.
교반식 용기형 반응기의 이점은 간단한 경제적인 구조 및 잘 연구된 특성에 있다.
원칙적으로, 교반식 용기형 반응기를 사용하는 경우, 두 가지 종류의 작업이 가능하다: 먼저 "배치형" 작업 공정, 이른바 "배치" 공정 및 두 번째로 연속 공정을 수행할 수 있다.
"배치" 공정에서는, 일단 공정이 종결되면 생물학적 촉매를 분리 또는 여과하고, 폐기(영양 세포)하거나 제2 배치(고정화 생물학적 촉매)에 재사용한다.
연속 공정을 사용하는 경우, 반응의 최종 생성물을 위한 새로운 기질을 영구적 및 연속적으로 교환한다. 적합한 수단(체, 여과기 및 회수 장치)을 사용하여 생물학적 촉매가 반응기로부터 이탈되는 것을 방지해야 한다.
본 발명의 범위 내에서 증식성 미생물의 배양은 일반적으로 공지된 통상적인 방법에 따라 수행하며, 바람직하게는 액체 영양 배지가 실용적이므로 이를 사용한다.
영양 배지의 조성은 사용하는 미생물에 따라 달라진다. 일반적으로, 경계가 불분명한 즉시 동화 가능한 탄소(C) 및 질소(N) 공급원을 포함하는 복합 배지가, 예를 들면, 항생제 제조용으로 통상적으로 사용되는 바와 같이 바람직하다.
그러나, 일반적으로, 사용되는 복합 영양 배지 중의 구성성분 또는 불순물로서 적합한 농도로 함유되는 비타민 및 필수 금속 이온도 필수적이다. 경우에 따라, 당해 구성 성분, 예를 들면, 특히 필수 비타민, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4 +, (SO4)2-, Cl-및 (CO3)2-이온 및 미량 원소인 코발트, 망간 및 아연을 염 형태로 첨가할 수 있다. 효모 추출물, 효모 가수분해물, 효모 자가분해물 및 효모 세포와 별도로, 특히 적합한 질소 공급원은 특히 대두분, 옥수수분, 오트분, 에다민(효소 분해된 락트알부민), 펩톤, 카제인 가수분해물, 옥수수 침지액 및 고기 추출물이다.
당해 N-공급원의 바람직한 농도는 0.1 내지 6g/ℓ이다. 적합한 탄소 공급원은 특히 글루코스, 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 말토스, 전분, 셀렐로스, 셀룰로즈, 만니톨, 맥아 추출물 및 당밀이다. 당해 탄소 공급원의 바람직한 농도 범위는 1.0 내지 25g/ℓ이다. 특히 사용되는 미생물이 스트렙토마이세스 속의 대표적인 미생물인 경우, D-글루코스, 가용성 전분 또는 맥아 추출물 및 셀렐로스의 사용은 아래에 기재된 산화공정에 유리하다. 따라서, 예를 들면, 아래의 배양 배지가 스트렙토마이세스 속의 대표적인 미생물에 매우 적합하다:
배지 1
가용성 전분 1.0g
펩톤 0.2g
효모 추출물 0.2g
증류수를 사용하여 1ℓ로 조정하고, NaOH를 사용하여 pH 7로 조정한 후, 오토클레이브 처리한다.
배지 2
D-글루코스 4.0g
맥아 추출물 10.0g
효모 추출물 4.0g
증류수를 사용하여 1ℓ로 조정하고, NaOH를 사용하여 pH 7로 조정한 후, 오토클레이브 처리한다.
배지 3
글리세롤 10.0g
덱스트린 20.0g
소이톤(soytone)[Difco Manual, 9th ed.,
Detroit, Difco Laboratories, 1969] 10.0g
(NH4)2SO42.0g
CaCO32.0g
증류수를 사용하여 1ℓ로 조정하고, NaOH를 사용하여 pH 7로 조정한 후, 오토클레이브 처리한다.
배지 4
D-글루코스 10.0g
맥아 추출물 10.0g
효모 추출물 3.0g
파마미디어(Pharmamedia)[Traders Protein,
써던 코튼 오일 캄파니(Southern Cotton Oil Co.)
미국 테네시주 멤피스 소재] 10.0g
고기 추출물 1.0g
증류수를 사용하여 1ℓ로 조정하고, NaOH를 사용하여 pH 7로 조정한 후, 오토클레이브 처리한다.
배지 5 (ISP-2 한천)
효모 추출물[옥소이드 리미티드(Oxoid Ltd.)
영국 햄프셔 배싱스토크 소재] 4g
D(+)-글루코스 4g
박토 맥아 추출물[디프코(Difco) 제0186-17-7번] 10g
한천(디프코 제0140-01번) 20g
상기 성분들을 탈염수 1ℓ에 용해시키고 pH를 7.0으로 조정한다. 당해 용액을 121℃에서 20분 동안 멸균시키고 냉각시켜, 한천 플레이트를 즉시 제조하는 데 필요한 짧은 시간 동안 55℃에서 유지한다.
배지 6 (PHG 배지)
펩톤[시그마(Sigma) 0521] 10g
효모 추출물(디프코) 10g
D(+)-글루코스 10g
NaCl 2g
MgSO4×7H2O 0.15g
NaH2PO4×H2O 1.3g
K2HPO44.4g
상기 성분들을 탈염수 1ℓ에 용해시키고 pH를 7.0으로 조정한다.
또한, 위에 언급한 배지는 스트렙토마이세스 속의 대표적인 미생물을 배양하고 산화반응을 수행하는 데 탁월하게 적합하다. 배지 조성에 대한 위의 일반적인 데이터와 본원에 상세하게 기재된 배지 둘 다 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이고 본 발명을 제한하지는 않는다.
배지 조성과는 별도로, 배지 제조에 사용된 방법, 예를 들면, 특히 용해 또는 현탁 순서, 영양물 용액 전체의 멸균 또는 각각의 구성 성분의 멸균, 및 오염 방지도 중요한 역할을 하며, 따라서 관련된 제조방법을 위해 최적화하여야 한다.
또한, 멸균은 영양 배지의 pH 값을 변화시키고 침전을 유발할 수 있다는 사실을 주목해야 한다.
또한, 나머지 배양방법은 미생물 배양용으로 통상적으로 사용되는 방법에 상응한다.
소규모 스케일에서, 임의의 예비 배양을 포함하는 본 발명의 범위 내에서 수행되는 발효는 일반적으로 진탕 배양 형태이며, 이 경우에는 0.05 내지 2ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 2ℓ의 영양 배지를 함유하는 0.1 내지 5ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 5ℓ 용량의 유리 플라스크를 사용하는 것이 유리하다. 바람직하게는 플라스크에 배플이 장착되어 있다. 오토클레이브 처리를 하고 pH를 4 내지 8, 특히 7.0 내지 7.5의 값(세균) 또는 6 내지 7.5의 값(진균)으로 조정한 후, 멸균 조건하에 상응하는 미생물 배양물을 플라스크에 접종한다. 일반적으로, 사용된 접종 물질은 아래에 기재된 데이터에 따르는 보존된 접종물로부터 제조된 예비 배양물이다.
유리하게는, 임의의 예비 배양물을 포함하는 배양물은 회전 진탕기에서 약 80 내지 약 300rpm(분당 회전수), 바람직하게는 약 100 내지 250rpm, 특히 약 120rpm으로 연속 진탕하면서 약 25 내지 약 37℃, 바람직하게는 약 26 내지 약 30℃, 특히 바람직하게는 약 28℃의 온도에서 호기성 조건하에 배양한다. 위에 언급한 조건하에, 스트렙토마이세스의 경우, 일반적으로 1.5 내지 7일 동안 배양한 후에 최적 산화 활성에 도달한다.
일단 세포의 촉매 용량이 목적하는 산화반응을 수행하기에 충분히 높으면, 바람직하게는 40시간 후, 기질(화학식 II의 화합물)을 가하여 미생물 및 산화시킬 물질을 임의의 방법으로 서로 접촉시킬 수 있다. 실질적인 이유로, 기질, 즉 화학식 II의 화합물을 영양 용액 중의 미생물에 가하는 것이 유리한 것으로 입증되었다.
산화시킬 기질은, 예를 들면, 분말 형태이거나, 적합한 용매, 예를 들면, 미메틸포름아미드, 아세톤, 디메틸 설폭사이드, N-메틸-2-피롤리돈, 알콜성 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 3급-부탄올, 에테르 용매, 예를 들면, 테트라하이드로푸란 또는 1,4-디옥산(0.5 내지 15용적%, 바람직하게는 2용적%), 에스테르 용매, 예를 들면, 에틸 아세테이트, 또는 탄화수소 용매, 예를 들면, 옥탄, 사이클로헥산, 톨루엔 또는 크실렌, 또는 적합한 용매와 적합한 계면활성제와의 혼합물 중의 용액 형태로 사용할 수 있다. 용어 "계면활성제"는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 쯔비터 이온성 계면활성제를 포함하며, 또한 계면활성제들의 혼합물을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
수용성 비누 및 수용성 합성 계면활성 화합물 둘 다 적합한 음이온성 계면활성제이다. 적합한 비누는 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 치환되지 않거나 치환된 고급 지방산(C10-C22) 암모늄 염, 예를 들면, 올레산, 스테아르산, 또는 예를 들면, 코코넛유 또는 우지로부터 수득할 수 있는 천연 지방산 혼합물의 나트륨 염 또는 칼륨 염이다. 추가의 적합한 계면활성제는 또한 지방산 메틸타우린 염이다. 그러나, 더욱 빈번하게는 이른바 합성 계면활성제, 특히 지방 설포네이트, 지방 설페이트, 설폰화 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아릴설포네이트를 사용한다. 지방 설포네이트 또는 설페이트는 일반적으로 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 치환되지 않거나 치환된 암모늄 염의 형태이며, 아실 라디칼의 알킬 잔기를 포함하는 C10-C22-알킬 라디칼을 함유하며, 예를 들면, 리그노설폰산, 도데실설페이트 또는 천연 지방산으로부터 수득된 지방 알콜 설페이트의 혼합물의 나트륨 염 또는 칼륨 염이다. 이들 화합물은 또한 황화 및 설폰화 지방 알콜/에틸렌 옥사이드 부가물의 염을 포함한다. 설폰화 벤즈이미다졸 유도체는 바람직하게는 설폰산 그룹 2개와 탄소수 8 내지 22의 지방산 라디칼 1개를 함유한다. 알킬아릴설포네이트의 예는 도데실벤젠설폰산, 디부틸나프탈렌설폰산 또는 나프탈렌설폰산과 포름알데히드의 축합물의 나트륨, 칼슘 또는 트리에탄올아민 염이다. 또한, 적합한 음이온성 계면활성제는 담즙산 염, 예를 들면, 콜산 또는 데옥시콜산의 나트륨 염이다. 상응하는 포스페이트, 예를 들면, 에틸렌 옥사이드 4 내지 14mol과의 p-노닐페놀 부가물의 인산 에스테르 염, 또는 인지질도 적합하다.
적합한 양이온성 계면활성제는 테트라알킬 암모늄 염, 예를 들면, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드이다.
적합한 중성 계면활성제는 알킬 글리코시드, 예를 들면, C6-C12-알킬 라디칼을 함유하는 알킬-β-D-말토시드, 알킬-β-D-글루코피라노시드 또는 알킬-β-D-티오글루코피라노시드이다. 추가의 적합한 중성 계면활성제는 글루카미드, 예를 들면, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)-콜아미드, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)-데옥시콜아미드 또는 C7-C12-알킬 라디칼을 함유하는 지방산 N-메틸글루카미드이다. 추가의 적합한 중성 계면활성제는 단분산성 및 다분산성 폴리옥시에틸렌, 예를 들면, 브리즈(BRIJR), 게나폴(GENAPOLR), 루브롤(LUBROLR), 플루로닉(PLURONICR), 테시트(THESITR), 트리톤(TRITONR) 및 트윈(TWEENR)이다.
적합한 쯔비터 이온성 계면활성제는 N,N,N-트리알킬 글리신, 예를 들면, N-n-도데실-N,N-디메틸글리신이다. 추가의 적합한 쯔비터 이온성 계면활성제는 ω-N,N,N-트리알킬암모늄 알킬 설포네이트, 예를 들면, C8-C16-알킬 라디칼을 함유하는 3-(N-알킬-N,N-디메틸)-1-프로판-설포네이트이다. 추가의 적합한 쯔비터 이온성 계면활성제는 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판-설포네이트 및 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판-설포네이트이다.
가용화 및 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제는 특히 문헌에 기재되어 있다[참조: Bhairi S.M.(1997) "A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego CA; "1999 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, U.S.A.].
미생물 연구에서 일반적으로 사용되는 크로마토그래피 방법으로 반응 과정을 연속적으로 모니터링한다.
또한, 본 발명은 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시켜 화학식 III의 케톤을 형성시킬 수 있는 미생물의 배양 및, 생물 반응기, 특히 교반식 용기형 반응기 유형의 생물 반응기 속에서의 당해 화합물에 대한 당해 미생물의 접종에 관한 것이다. 실제 제조 발효기에서 생성물 형성 속도를 최적화하기 위해, 무엇보다도 미생물을 예비 배양물 속에서 증식시키는 것이 권장된다. 발효기 예비 배양물의 수는 각각의 특정 경우에 최적인 접종 물질 농도에 따라 달라진다. 유리하게는, 사용되는 미생물에 따라, 다음의 접종 물질의 농도를 발효 단계를 위해 생성시킨다: 세균 0.1 내지 3%, 진균 5 내지 10%, 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 5내지 10%.
소형 발효기(용량 20ℓ 이하)의 접종은 일반적으로 진탕된 플라스크 예비 배양물을 사용하여 수행한다. 이 경우, 전체 플라스크 내용물을 사용하여 발효기에 접종한다. 예비 배양물의 제조에 사용되는 출발 물질은 일반적으로, 예를 들면, 동결건조물 형태이거나 냉동 또는 저온 저장된 물질 형태일 수 있는 보존된 접종 물질이다. 본 발명의 범위 내에서 사용되는 보존된 접종 물질은 바람직하게는 -80℃에서 저장된 물질이다.
바람직하게는 접종 물질의 증식은 회전 진탕기에서 유리 플라스크 속의 액체 배지 중에서 수행하거나, 포자를 사용하는 경우에는 고체 영양 기질 상에서 수행한다. 영양 기질 및 배양 파라미터, 예를 들면, 특히 온도, pH 및 산소 도입과 관련된 조건은 사용되는 미생물 또는 방법에 따라 최적화시켜야 한다. 보존된 접종 물질에 대한 성장 시간은 사용되는 출발 물질에 따라 수 시간 내지 수 일일 수 있다.
동결 건조물3 내지 10일
냉동 보존된 배양물
세균 4 내지 18시간
악티노마이세탈레스 1 내지 5일
진균 1 내지 7일
저온 저장된 배양
세균 4 내지 24시간
악티노마이세탈레스 1 내지 3일
진균 15일
접종 물질로서 포자를 사용하는 경우, 먼저 포자를 표준 조건[멸균 에어레이션, 내후성 챔버(climatic chamber)]하에 고체 영양 기질 상에서, 보존된 접종 물질로부터 증식시킨다. 토탄(peat), 밀기울, 쌀 또는 보리를 기본으로 하는 다공성 영양 기질을 사용하는 경우, 배양물을 끊임없이 균일하게 진탕시켜 높은 밀도의 포자를 수득한다. 추가로, 보존된 접종 물질을 한천 또는 다른 통상적인 겔화제에 의해 고화된 영양 배지 상에서 배양할 수 있으며, 이 경우 포자 형성 유도를 개시하는 영양 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
발아 시간은 사용된 미생물 및 사용된 영양 배지에 따라 7 내지 30일이다.
예비 배양 발효기 또는 제조 발효기를 접종시키기 위해, 포자를 계면활성제, 예를 들면, 트윈 80[시그마-알드리히 캄파니(Sigma-Aldrich Co.)(미국 몬타나주 소재)에서 시판중인 계면활성제] 용액을 사용하여 현탁시켜 당해 영양 배지와 함께 발효기에 넣거나, 고체 영양 배지를 사용하는 경우, 또한 위의 계면활성제를 사용하여 고체 영양 기질로부터 세척 분리한다. 이어서, 이렇게 하여 수득한 포자 함유 용액을 발효기에 접종한다. 바람직하게는, 포자의 회수 및 발효기의 접종 모두 멸균 조건하에 수행한다.
본 발명의 범위 내에서 화학식 III의 화합물을 제조하기 위해, 생성물의 필요량에 따라 0.001 내지 450m3의 용량을 수용하는 다양한 치수의 생물 반응기를 사용할 수 있다.
교반식 용기형 생물 반응기를 사용하는 경우, 아래의 발효 파라미터를 최적 반응 과정에 중요한 것으로 간주해야 한다:
1. 온도: 본 발명에 따르는 방법의 범위 내에서 생물학적 촉매에 의한 산화반응을 바람직하게는 중간 온도 범위(20 내지 45℃의 온도 범위)에서 수행한다. 성장 및 생성물 형성을 위한 최적 온도 범위는 20 내지 32℃, 특히 24 내지 30℃이다.
2. 에어레이션: 에어레이션 속도는 0.1 내지 2.5vvm(분당 액체 용적당 공기 용적), 바람직하게는 0.3 내지 1.75vvm이다. 에어레이션 속도는, 경우에 따라, 발효 과정에서 획득된 산소 요구량에 적합하게 한다.
3. 압력: 교반식 용기형 반응기는 일반적으로 0.2 내지 1.0bar, 바람직하게는 0.5 내지 0.7bar의 약간의 과압하에 작동시켜 오염 위험을 줄인다.
4. pH 값: pH 값은 사용된 미생물에 따라 특정 범위 내에서 변화시킬 수 있다. 악티노마이세테스 그룹의 미생물을 사용하는 경우, 초기 pH 값은 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5이다.
진균을 사용하는 경우, 배양액의 초기 pH는 바람직하게는 4 내지 8, 특히 6 내지 7.5이다.
5. 교반: 교반 속도는 사용된 교반기 유형 및 발효기 크기에 따라 달라진다.본 발명의 범위 내에서 디스크형 임펠러가 장착된 교반기가 바람직하며, 크기가 0.002m3인 교반식 용기형 반응기의 경우, 150 내지 550rpm, 특히 200 내지 500rpm의 속도로 작동시킨다.
본 발명의 범위 내에서, 발효 시간은 사용된 미생물에 따라 20시간 내지 10일일 수 있다. 생물학적 촉매에 의한 반응은 기질(화화식 II의 화합물)의 초기 첨가량의 약 25 내지 약 99.9%, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 99.9%, 가장 바람직하게는 약 80 내지 약 99.9%가 화학식 III의 화합물로 전환될 때 중단한다.
산화반응을 종결시킬 최적 시간을 확인하기 위해, 반응 과정의 전체 발효 상태를 통상적인 분석 방법, 특히 크로마토그래피 방법, 예를 들면, HPLC 또는 박층 크로마토그래피 방법에 의해 모니터링한다.
위에 약술한 방법의 개질된 방법에서, 생물 반응기는 단지 바이오매스를 생성시키기 위해 사용할 수 있으며, 이어서 바이오매스를 여과 또는 원심분리에 의해 수집한다. 이어서, 미생물의 바이오매스를, 화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시키기 위한 생물학적 촉매로서 즉시 사용하거나, 그 자체로 저온 저장하거나 동결 건조 또는 분무 건조 후 저온 저장한다. 이어서, 새로 수집하거나 위에 기재된 바와 같이 저장된 미생물을 다른 용기, 예를 들면, 바람직하게는 배플이 장착된 플라스크 또는 교반식 용기형 반응기에 추가로 분배하며, 여기서 생물학적 전환이 일어난다. 기질(화학식 II의 화합물)을 가하여, 미생물 및 산화시킬 물질을 임의의 방법으로 서로 접촉시킨다. 실질적인 이유로, 기질, 즉 화학식 II의화합물을, 증식에 유리하지 않은 완충액 중의 미생물에 가하는 것이 유리한 것으로 입증되었다. 산화시킬 기질(화학식 II의 화합물)은, 예를 들면, 분말 형태 또는 위에 기재한 바와 같은 적합한 용매 중의 용액 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 먼저 기질(화학식 II의 화합물)을 적합한 용매, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드, 트윈 40[시그마-알드리히 캄파니(미국 몬타나주 세인트 루이스 소재)에서 시판중인 계면활성제] 또는 이들의 혼합물에 용해시키고, 완충액, 바람직하게는 인산염 완충액, 더욱 바람직하게는 pH 7.0의 0.07M 인산염 완충액이 담긴 배플달린 플라스크에 가한다. 이어서, 수득된 용액을 멸균시킨 후, 생물학적 촉매(미생물의 바이오매스)를 가한다. 이어서, 당해 반응 혼합물을 실온에서 배양하고, 미생물 균주에 따라, 약 2 내지 7일 동안 100 내지 150rpm, 바람직하게는 약 120rpm에서 진탕시킨다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 먼저 기질(화학식 II의 화합물)을 적합한 용매, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드, 트윈 40[시그마-알드리히 캄파니(미국 몬타나주 세인트 루이스 소재)에서 시판중인 계면활성제] 또는 이들의 혼합물에 용해시키고, 목적하는 산화반응을 수행하는 데 사용할 미생물의 성장을 촉진시키는 배양 배지가 담긴 배플달린 플라스크에 가한다. 이어서, 수득된 용액을 멸균시킨 후, 생물학적 촉매(미생물의 바이오매스)를 가한다. 이어서, 당해 반응 혼합물을 실온에서 배양하고, 미생물 균주에 따라, 약 2 내지 9일 동안 100 내지 150rpm, 바람직하게는 약 120rpm에서 진탕시킨다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 적합한 완충액 중에서 세척하고 붕괴 완충액(disruption buffer)에 재현탁시킨 후, 예를 들면, 기계적 수단에 의해 2 내지 15℃, 바람직하게는 3 내지 6℃, 가장 바람직하게는 4℃의 온도에서 붕괴시킨 습윤 세포를 사용하여 세포-비함유 추출물을 제조한다. 수득된 현탁액을 원심분리하고 상등액인 세포-비함유 추출물을 수집한다.
이렇게 하여 수득한 세포-비함유 추출물에, 적합한 분획량의 외래 전자 공급 시스템, 예를 들면, 페레독신 및 페레독신 리덕타제, 및 기질을 포함하는 용액을 가한다. 기질 첨가 후, 혼합물을 바람직하게는 즉시 균일하게 혼합하고 에어레이션시킨다. 이어서, 적합한 분획량의 NADPH를 가하고 당해 혼합물을 15 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 35℃, 가장 바람직하게는 30℃의 온도에서 배양한다.
산화 생성물(화학식 III의 화합물)을 회수하기 위한 발효 액체 배지의 가공은 발효 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행할 수 있다[참조: W. Crueger and A. Crueger, 1984; P. Prave, 1984].
먼저, 입상 구성성분을 여과기, 원심분리기 또는 분리기를 사용하여 반응 액체 배지로부터 제거하여 여액으로부터 별도로 추출한다.
영양 세포 또는 사멸 세포를 생물학적 촉매로서 사용하는 경우 및 반응 생성물(화학식 III의 화합물)의 일부가 세포 내부에 존재하는 경우, 세포를 분해한 후, 추출해야 한다. 이러한 목적을 위해, 기계적, 열적, 화학적 또는 효소적 방법을 기본으로 한 다양한 세포 분해방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에서 사용하기에 적합한 기계적 방법은, 예를 들면, 교반식 볼 밀 또는 콜리이드 밀 속에서의 분쇄, 균질화기 속에서의 압력 및 이완사용 및 초음파 작용에 의한 세포 분해이다. 비-기계적 방법은 건조에 의한 세포 분해, 삼투압 충격에 의한 세포 분해, 화학적 자가분해 및 효소에 의한 세포분해를 포함한다.
일단 입상 구성성분이 제거되면, 적합한 용매를 사용하여 배양액 및 분리된 세포 구성성분을 추출하여 반응 생성물을 농축시킨다. 추출을 위해, 발효 분야에서 통상적으로 사용되는 다수의 시판 보조장치, 예를 들면, 특히 혼합기-침강 탱크(mixer-settler), 역류 컬럼 및 추출 원심분리기를 사용한다.
또한, 예를 들면, 무엇보다도 막 여과, 한외 여과, 냉동 농축 및 이온 교환방법으로 반응 생성물을 농축시킬 수 있다.
추출 후 수득된 조 생성물의 추가의 가공은 미생물 및 화학 연구 및 산업적 용도에서 익히 확립된 방법으로 수행할 수 있다.
이들 방법은, 예를 들면, 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 공유 크로마토그래피 등 뿐만 아니라, 각종 결정화 방법을 포함한다.
그 자체 또는 혼합물로서의, 추출용으로 적합한 용매는 방향족 탄화수소, 예를 들면, 톨루엔, 크실렌 혼합물, 또는 치환된 나프탈렌, 프탈레이트, 예를 들면, 부틸 프탈레이트 또는 디옥틸 프탈레이트, 지방족 탄화수소, 예를 들면, 헥산, 헵탄, 옥탄 또는 파라핀의 이성체 또는 사이클로헥산, 알콜, 글리콜 및 이들의 에테르 및 에스테르, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-부탄올, 3급-부탄올,에틸렌 글리콜, 메틸 3급-부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노메틸 또는 모노에틸 에테르, 케톤, 예를 들면, 아세톤 또는 2-부타논 또는 사이클로헥사논, 염소화 탄화수소, 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 사염화탄소이다.
또한, 용어 "계면활성제"는 계면활성제 혼합물을 포함하는 것으로 이해된다. 수용성 비누 및 수용성 합성 계면활성 화합물 둘 다 적합한 음이온성 계면활성제이다. 적합한 비누는 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 치환되지 않거나 치환된 고급 지방산(C10-C22) 암모늄 염, 예를 들면, 올레산, 스테아르산, 또는 예를 들면, 코코넛유 또는 우지로부터 수득할 수 있는 천연 지방산 혼합물의 나트륨 염 또는 칼륨 염이다. 추가의 적합한 계면활성제는 또한 지방산 메틸타우린 염이다. 그러나, 더욱 빈번하게는 이른바 합성 계면활성제, 특히 지방 설포네이트, 지방 설페이트, 설폰화 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아릴설포네이트를 사용한다. 지방 설포네이트 또는 설페이트는 일반적으로 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 치환되지 않거나 치환된 암모늄 염의 형태이며, 아실 라디칼의 알킬 잔기를 포함하는 C10-C22-알킬 라디칼을 함유하며, 예를 들면, 리그노설폰산, 도데실설페이트 또는 천연 지방산으로부터 수득된 지방 알콜 설페이트의 혼합물의 나트륨 염 또는 칼륨 염이다. 이들 화합물은 또한 황화 및 설폰화 지방 알콜/에틸렌 옥사이드 부가물의 염을 포함한다. 설폰화 벤즈이미다졸 유도체는 바람직하게는 설폰산 그룹 2개와 탄소수 8 내지 22의 지방산 라디칼 1개를 함유한다. 알킬아릴설포네이트의 예는 도데실벤젠설폰산, 디부틸나프탈렌설폰산 또는 나프탈렌설폰산과 포름알데히드의축합물의 나트륨, 칼슘 또는 트리에탄올아민 염이다. 상응하는 포스페이트, 예를 들면, 에틸렌 옥사이드 4 내지 14mol과의 p-노닐페놀 부가물의 인산 에스테르 염, 또는 인지질도 적합하다. 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제는 특히 문헌에 기재되어 있다[참조: "1986 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents", The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, U.S.A.].
본 발명의 바람직한 양태는 생물학적 촉매, 예를 들면, 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물을 아베르멕틴과 접촉시킨 후, 생성된 4"-옥소-아베르멕틴을 반응 혼합물로부터 분리함으로써, 4"-옥소-아베르멕틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 양태는
화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로, 바람직하게는 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 세포 성장을 촉진시키는 영양 배지에 접종하여 세포를 생산하는 단계(1),
성장 후 세포를 수집하는 단계(2),
화학식 II의 화합물, 바람직하게는 아베르멕틴을 적합한 용매에 용해시키는 단계(3),
단계(3)으로부터 수득된 용액을 세포 증식을 촉진시키지 않는 반응 배지에 가하는 단계(4),
단계(2)의 세포를 단계(4)의 반응 배지에 가하는 단계(5),
공기의 존재하에 단계(5)의 반응 혼합물을 진탕 또는 교반하는 단계(6),
배지로부터 세포를 분리하는 단계(7),
적합한 용매를 사용하여 상등액 및 세포를 추출하는 단계(8),
단계(8)로부터의 유기 용매 상을 농축시키는 단계(9) 및
단계(9)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(10)를 포함하여, 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태는
화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로, 바람직하게는 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 세포 성장을 촉진시키는 영양 배지에 접종하여 세포를 생산하는 단계(1),
성장 후 세포를 수집하는 단계(2),
화학식 II의 화합물, 바람직하게는 아베르멕틴을 적합한 용매에 용해시키는 단계(3),
단계(3)으로부터 수득된 용액을 세포 증식을 촉진시키지 않는 반응 배지에 가하는 단계(4),
단계(2)의 세포를 단계(4)의 반응 배지에 가하는 단계(5),
공기의 존재하에 단계(5)의 반응 혼합물을 진탕 또는 교반하는 단계(6),
적합한 용매를 사용하여 전체 육즙을 추출하는 단계(7),
상을 분리하는 단계(8),
단계(8)로부터의 용매 상을 진공 농축시키는 단계(9) 및
단계(9)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(10)를 포함하여, 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태는
화학식 II의 화합물, 바람직하게는 아베르멕틴을 적합한 용매에 용해시키는 단계(1),
단계(1)로부터 수득된 용액을 세포 증식을 촉진시키는 영양 배지에 가하는 단계(2),
화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로, 바람직하게는 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 단계(2)의 영양 배지에 접종하는 단계(3),
화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로, 바람직하게는 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물을 배양하는 단계(4),
배지로부터 세포를 분리하는 단계(5),
적합한 용매를 사용하여 상등액 및 세포를 추출하는 단계(6),
단계(6)으로부터의 유기 용매 상을 진공 농축시키는 단계(7) 및
단계(7)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(8)를 포함하여, 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태는
화학식 II의 화합물, 바람직하게는 아베르멕틴을 적합한 용매에 용해시키는 단계(1),
단계(1)로부터 수득된 용액을 세포 성장을 촉진시키는 영양 배지에 가하는 단계(2),
아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 단계(2)의 영양 배지에 접종하는 단계(3),
화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로, 바람직하게는 아베르멕틴을 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환시킬 수 있는 미생물을 배양하는 단계(4),
적합한 용매를 사용하여 전체 육즙을 추출하는 단계(5),
상을 분리하는 단계(6),
단계(6)으로부터의 용매 상을 진공 농축시키는 단계(7) 및
단계(7)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(8)를 포함하여, 화학식 III의 화합물, 바람직하게는 4"-옥소-아베르멕틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 순수한 화학적 단계에서, 이렇게 하여 수득한 화학식 III의 화합물을, 공지된 바와 같이 환원제의 존재하에, 화학식 HN(R8)R9의 아민(여기서, R8및 R9는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다)과 반응시킬 수 있다.
반응 성분은 용매의 부재하에, 그러나 바람직하게는 용매의 존재하에 반응시킬 수 있다. 추가로, 특히 액체 아민 중에서, 반응물 중 한 가지를 과량으로 사용하여 반응을 수행할 수 있다. 그러나, 일반적으로 불활성 액체 용매 또는 희석제를 첨가하는 것이 유리하다. 이러한 용매 또는 희석제의 예는 방향족, 지방족 및 지환족 탄화수소 및 할로겐화 탄화수소, 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 메시틸렌, 테트랄린, 클로로벤젠, 디클로로벤젠, 브로모벤젠, 석유 에테르, 헥산, 사이클로헥산, 디클로르메탄, 트리클로르메탄, 테트라클로르메탄, 디클로르에탄, 트리클로르에탄 또는 테트라클로르에탄; 에스테르, 예를 들면, 아세트산 에틸에스테르; 에테르, 예를 들면, 디에틸에테르, 디프로필에테르, 디이소프로필에테르, 디부틸에테르, 3급-부틸메틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 디메톡시디에틸에테르, 테트라하이드로푸란 또는 디옥산; 케톤, 예를 들면, 아세톤, 메틸에틸케논 또는 메틸이소부틸케톤; 알콜, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌글리콜 또는 글리세린; 아미드, 예를 들면, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디에틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 또는 헥사메틸 인산 트리아미드; 니트릴, 예를 들면, 아세토니트릴 또는 프로피오니트릴; 설폭사이드, 예를 들면, 디메틸설폭사이드; 유기 산, 예를 들면, 아세트산 및 물이다.
바람직한 용매는 에테르, 예를 들면, 테트라하이드로푸란 및 에틸렌글리콜디메틸에테르, 특히 테트라하이드로푸란; 알콜, 예를 들면, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올; 할로겐화 용매, 예를 들면, 디클로로메탄 또는 디클로로에탄; 방향족 용매, 예를 들면, 벤젠 또는 톨루엔; 니트릴, 예를 들면, 아세토니트릴; 아미드, 예를 들면, N,N-디메틸포름아미드; 카본산, 예를 들면, 아세트산; 물 및 이들의 혼합물이다.
매우 특히 바람직한 용매는 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합물이다.
반응은 바람직하게는 pH 0 내지 14, 특히 pH 2 내지 10, 대부분의 경우 pH 6 내지 9의 범위, 매우 특히 pH 9에서 수행한다.
바람직하게는 반응은 -80 내지 140℃, 바람직하게는 -30 내지 100℃, 대부분의 경우 -10 내지 80℃, 특히 0 내지 50℃의 온도 범위에서 수행한다.
바람직한 환원제는 수소화물, 예를 들면, 붕수소화물; 보란; 포름산; 포르메이트 또는 수소이다. 특히 바람직한 것은 수소화물, 예를 들면, 붕수소화나트륨, 붕수소화아연, 붕소수화리튬, 나트륨 시아노보로하이드라이드, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 또는 테트라메틸-암모늄 트리아세톡시보로하이드라이드이다. 붕수소화나트륨이 특히 바람직하다.
반응은 -적용 가능한 경우- 특정의 추가의 화학약품, 예를 들면, 균질화 또는 비균질화 촉매 또는 산의 존재하에 수행할 수 있다. 산, 예를 들면, 염산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 프로피온산, 타르타르산 또는 프탈산; 루이스 산, 예를 들면, 사염화티탄, 티탄 테트라이소프로필레이트 또는 염화아연; 염, 예를 들면,마그네슘 퍼클로레이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 칼륨 타르트레이트, 염화이테르븀 또는 피리디늄-p-톨루엔설포네이트; 흡수제, 예를 들면, 황산나트륨, 분자체 또는 실리카 겔; 또는 이들의 혼합물이 특히 적합하다. 바람직한 추가의 제제는 산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산 또는 타르타르산이고, 아세트산이 바람직하다. 수소를 사용하여 반응을 수행하는 경우, 한 가지 또는 몇 가지의 적합한 균질 또는 비균질 촉매를 첨가하는 것이 유리하다. 바람직한 당해 촉매는 당해 분야에 공지된 비균질 금속 촉매, 바람직하게는 Ni-, Pt- 또는 Pd-촉매, 특히 라니-니켈 및 린들라 촉매(Lindlar catalyst)(Pd-CaCO3-PbO)이다. 적합한 균질 촉매는 특히 로듐 착물, 예를 들면, 빌킨슨스 촉매(Wilkinsons catalyst)(클로로-트리스-트리페닐-로듐)이다.
각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물은 가능한 이성체 중 하나의 형태 또는 이들의 혼합물 형태일 수 있고, 예를 들면, 분자 내의 비대칭 탄소원자 수 및 이의 절대적 및 상대적 구조에 따라 및/또는 분자 내의 비-방향족 이중결합의 구조에 따라, 이들은 순수한 이성체 형태, 예를 들면, 광학 대칭체 및/또는 부분입체이성체 형태 또는 이성체 혼합물 형태, 예를 들면, 엔안티오머 혼합물, 예를 들면, 라세미체, 부분입체이성체 혼합물 또는 라세미체 혼합물 형태일 수 있다. 본 발명은 순수한 이성체 및 가능한 모든 이성체 혼합물에 관한 것이며, 비록 각각의 경우에 입체화학적 세부사항이 상세하게 언급되어 있지 않더라도, 위와 같이 이해해야 한다.
선택된 출발 물질 및 방법에 따라 달라지는 당해 방법에 따라 또는 다른 수단에 의해 수득할 수 있는, 화학식 I의 화합물의 부분입체이성체 혼합물 및 라세미체 혼합물 또는 이의 염은 구성성분들 간의 물리화학적 차이를 기준으로 하여 공지된 방법, 예를 들면, 분별 결정, 증류 및/또는 크로마토그래피에 의해 순수한 부분입체이성체 또는 라세미체로 분리할 수 있다.
이렇게 수득할 수 있는 엔안티오머 혼합물, 예를 들면, 라세미체를 공지된 방법, 예를 들면, 광학 활성 용매로부터의 재결정, 키랄 흡착제 상에서의 크로마토그래피, 예를 들면, 아세틸 셀룰로즈 상에서의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 적합한 미생물의 도움으로, 예를 들면, 키랄 크라운 에테르를 사용하여 봉입 화합물을 형성시켜 특정 고정화 효소에 의해 분해시키는 방법(이 경우 단지 하나의 엔안티오머만이 복합체를 형성한다) 또는, 예를 들면, 염기성 최종 생성물인 라세미체를 광학 활성 산, 예를 들면, 카복실산, 예를 들면, 캄포르산, 타르타르산 또는 말산, 또는 설폰산, 예를 들면, 캄포르설폰산과 반응시켜 부분입체이성체 염으로 전환시키는 방법 및, 예를 들면, 이들의 상이한 용해도를 기준으로 하여 분별 결정에 의해, 수득된 부분입체이성체 혼합물을 부분입체이성체로 분할하고 이로부터 목적하는 엔안티오머를 적합한 제제, 예를 들면, 염기성 제제의 작용에 의해 제거할 수 있는 방법에 의해 광학 대칭체로 분할할 수 있다.
상응하는 이성체 혼합물의 분리와는 별도로, 본 발명에 따라, 일반적으로 공지된 부분입체선택적(diastereoselective) 또는 엔안티오선택적(enantioselective) 합성방법을 사용함으로써, 예를 들면, 상응하게 적합한 입체화학을 갖는 출발 물질을 사용하여 본 발명에 따르는 방법을 수행함으로써, 순수한 부분입체이성체 또는 엔안티오머를 수득할 수 있다.
또한, 화학식 I 및 III의 화합물, 산 부가 생성물 및 이의 염은 이의 수화물 형태로 수득하고/하거나 다른 용매, 예를 들면, 고체 형태로 생성되는 화합물의 결정화에 사용할 수 있는 용매를 포함할 수 있다.
본 발명은, 당해 방법의 임의의 단계에서 출발 물질 또는 중간체로서 수득될 수 있는 화합물이 출발 물질로서 사용되고 나머지 단계들 중 전체 또는 일부가 수행되거나, 출발 물질이 유도체 또는 염 및/또는 이의 라세미체 또는 광학 대칭체 형태로 사용되거나 특히 반응 조건하에 형성되는, 모든 형태의 방법에 관한 것이다.
당해 방법 또는 다른 수단에 의해 수득할 수 있는 화학식 I 및 III의 화합물은 본래 공지된 방법으로 상이한 화학식 I 및 III의 화합물로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 바람직하게는, 각각의 경우, 유리 형태 또는 염 형태인 당해 출발 물질 및 중간체를 사용하며, 이들은 서두에서 특히 중요하다고 기재한 화학식 I 및 III의 화합물 또는 이의 염을 형성한다.
R9가 수소인 경우, 반응 단계(2)를 2개의 개별적인 단계로 나눌 수 있으며, 여기서, 제1 단계에서 화학식 III의 화합물을 화학식 H2N(R8)의 화합물(여기서, R8은 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다)과 반응시켜 화학식 IV의 화합물을 형성시키고, 제2 단계에서 당해 화학식 IV의 화합물을 위의 단계(2)의 방법에 따라환원시킨다. 당해 2개의 개별적인 단계는 화학식 IV의 화합물을 분리하지 않고 원 포트 합성법(one pot synthesis)으로 수행할 수 있다. 그러나, 예를 들면, 정제 목적으로 화학식 IV의 화합물을 분리하는 것이 유리할 수 있다. 화학식 IV의 화합물은 신규 화합물이며 본 발명의 한 양태이다.
위의 화학식 IV에서,
R1내지 R8, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
본 발명을 아래의 상세한 실시예를 참고로 하여 추가로 기재한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명할 목적으로 제공된 것이며, 달리 언급하지 않는 한 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명은 특히 실시예에 기재된 제조방법에 관한 것이다.
실시예 1: 세포 생산
1.1 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 균주 I-1529
균주 I-1529(스트렙토마이세스 투베르시디쿠스; DSM-13135)의 예비 배양물을 각각 100㎖의 배지 2를 함유하는, 20개의 500㎖ 용량의 배플달린 에를렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 속에서, 28℃에서 3일 동안 120rpm으로 회전 진탕시키면서 성장시킨다.
이들 배양물을 40ℓ의 배지 4를 함유하는 50ℓ 용량의 발효기에 접종시킨다. 세포를 0.7vvm(=30ℓ/분)의 속도로 에어레이션시키면서 28℃에서 성장시킨다. 교반기 속도는 pO2-감지기로 감지하면서 200 내지 300rpm으로 유지하여 pO2가 25% 미만으로 감소하는 것을 방지한다. 2일 동안 성장시킨 후, 플로우-트루 원심분리기(flow-through centrifuge)를 사용하여 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 세포 4.2kg(습윤)이 수득된다.
1.2 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 균주 R-922
스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 균주 R-922(DSM-13136)를 페트리 디쉬 내의 ISP-2 한천 상에서 성장시킨다. 당해 배양물을 사용하여 각각 100㎖의 PHG 배지(배지 6)를 함유하는, 4개의 500㎖ 용량의 배플달린 진탕 플라스크에 접종한다. 당해 예비 배양물을 28℃에서 96시간 동안 120rpm으로 궤도 진탕기에서 성장시킨후, 이를 사용하여 8ℓ의 PHG 배지를 함유하는 기계적 교반기가 장착된 10ℓ 용량의 발효기에 접종한다. 당해 주 배양물을 에어레이션 속도 1.75vvm(=14ℓ/분) 및 압력 0.7bar하에 500rpm으로 교반하면서 28℃에서 성장시킨다. 약 20분 후 대수 성장(exponential growth) 말기에, 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 습윤 세포의 수율은 70 내지 80g/배양물ℓ이다. 추가의 가공을 위해, 습윤 세포를 4℃에서 바람직하게는 1주일 이하 동안 저장할 수 있다.
실시예 2: 반응 과정
2.1 휴면 배양물
2.1.1 반응 조건
아베르멕틴 35.5g(공업용)을 디메틸 설폭사이드/트윈 40(1:1) 1.05ℓ에 용해시킨다. 25㎖의 분획량을 각각 1ℓ의 반응 배지를 함유하는, 42개의 3ℓ 용량의 배플달린 에를렌메이어 플라스크에 가함으로써 당해 용액을 분배시킨다. 당해 용액을 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 실온으로 냉각시킨 후, 각각 실시예 1.2 및 1.2에서 제조된 바와 같은 습윤 세포 100g(신선한 것 또는 4일 이하 동안 4℃에서 저장한 것)을 가한다. 이어서, 당해 반응 혼합물을 실온에서 120rpm으로 4 내지 5일 동안 진탕시킨다.
반응 배지:
당밀 0.5g
MgCl20.5g
ZnCl212.5mg
MnCl2·4H2O 12.5mg
CoCl2·6H2O 25mg
NiCl2·6H2O 12.5mg
CuCl2·2H2O 2.5mg
NaMoO4·2H2O 6.3mg
1M HCl 0.15㎖
pH 6.0의 70mM 인산염 완충액을 사용하여 1ℓ로 조정한 후, 오토클레이브 처리한다.
2.1.2 후처리
반응 생성물을 4℃에서 15분 동안 13000×g로 500㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심분리 플라스크에서 원심분리한다. 반응 혼합물 40ℓ로부터의 상등액을 풀링(pooling)하고 메틸 3급-부틸 에테르(0.5용적 당량, 0.4용적 당량)로 2회 추출한다. 이어서, 풀링된 메틸 3급-부틸 에테르 상을 0.185용적 당량의 증류수로 3회 재추출한다. 메틸 3급-부틸 에테르 상을 회전 증발기에서 진공 농축시킨다. 잔사를 건조시키면 10 내지 12g의 추출물 S가 수득된다. 수성 상은 폐기한다. 120 내지 132개의 원심분리 플라스크로부터 원심분리된 세포를 아래와 같이 추출한다: 24개의 원심분리 플라스크로부터 수득한 세포를 2ℓ 용량의 에를렌메이어 플라스크에 옮긴다. 각각의 에를렌메이어 플라스크에 규조토[하이플로 수퍼셀(Hyflo Supercell), 정제된 것] 80g 및 아세톤 1.2ℓ를 가한다. 수동 혼합 후, 대형 자기 교반 막대기를 사용하여 혼합물을 균질화한다. 수득된 펄프를 직경이 20cm인 부흐너 깔때기 상에서 종이를 통해 진공 여과시키고, 무색 용출될 때까지 아세톤으로 세척한다. 이렇게 하여 여액 C1 및 여과 케이크 C1을 수득한다.
여액 C1을 회전 증발기에서 진공 농축시켜 아세톤을 제거한다. 이어서, 수득된 수성 상을 톨루엔 0.7ℓ로 3회 추출한다. 합한 톨루엔 상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨다. 여과하고 회전 증발기에서 진공 증발시켜 추출물 C1을 수득한다.
여과 케이트 C1을 2ℓ 용량의 에를렌메이어 플라스크에 옮기고 1.5ℓ 톨루엔과 수동 혼합한다. 대형 자기 교반 막대기를 사용하여 혼합물을 균질화한다. 수득된 펄프를 직경이 20cm인 부흐너 깔때기 상에서 종이를 통해 진공 여과시키고, 무색 용출될 때까지 톨루엔으로 세척한다. 이렇게 하여 여액 C2 및 여과 케이크 C2를 수득한다. 여과 케이크 C2는 폐기한다.
여액 C2를 회전 증발기에서 진공 농축시켜 추출물 C2를 수득하고 이를 고 진공하에 건조시킨다.
반응 혼합물 40ℓ로부터 수득된 합한 추출물 C1 및 C2를 고 진공하에 건조시켜 추출물 C 30 내지 35g을 수득한다. 합한 추출물 S 및 C 45g을,클라크-스틸(Clark-Still) 등이 기재한 바와 유사하게, 1.5kg의 실리카 겔[머크(Merck) 60, 0.040 내지 0.063mm]로 충전된 컬럼 상에서 N2압력 0.5bar에서 에틸 아세테이트:헥산(3:2)으로 용출시키면서 섬광 크로마토그래피 처리하고, 박층 크로마토그래피에 의해 모니터링한다. 정제된 4"-옥소-아베르멕틴의 수득량은 5.6g이다.
2.2 증식 배양물
2.2.1 반응 조건
아베르멕틴 1g(공업용)을 디메틸 설폭사이드/트윈 40(1:1) 50㎖에 용해시킨다. 2.5㎖의 분획량을 각각 100㎖의 배지 4를 함유하는, 20개의 500㎖ 용량의 배플 달린 에를렌메이어 플라스크에 가함으로써 분배한다. 당해 용액을 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 실온으로 냉각시킨 후, 각각 실시예 1.1 및 1.2에서 제조된 바와 같은 예비 배양물 5㎖를 가한다. 이어서, 당해 접종된 배양물을 120rpm으로 회전 진탕시키면서 28℃에서 7일 동안 배양한다.
2.2.2 후처리
반응 혼합물을 4℃에서 15분 동안 13000×g으로 500㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심분리 플라스크에서 원심분리하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 유사하게 가공한다. 정제된 4"-옥소-아베르멕틴 252mg이 수득된다.
2.3. 세포-비함유 생물학적 촉매의 작용
2.3.1 세포-비함유 추출물의 제조
원액:
PP-완충액: 50mM K2HPO4/KH2PO4(pH 7.0)
붕괴 완충액: 50mM K2HPO4/KH2PO4(pH 7.0)
5mM 벤즈아미딘
2mM 디티오트레이톨
0.5mM 페파블록(Pefabloc)
[로쉐 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) 제조]
기질: 아베르멕틴 10mg을 이소프로판올 1㎖에 용해시킨다.
PP-완충액 중에서 세척된 6g의 습윤 세포를 붕괴 완충액 35㎖에 재현탁시킨고 4℃에서 프렌치 프레스(French press)에서 붕괴시킨다. 수득된 현탁액을 1시간 동안 35000×g에서 원심분리한다. 상등액인 세포-비함유 추출물을 수집한다.
2.3.2 효소 활성 검정의 진행
원액:
페레독신: 트리스/HCl-완충액(플루카 제조) 중의 페레독신(시금치로부터 수득) 1 내지 3mg/㎖의 용액 5mg,
트리스/HCl-완충액(플루카 제조) 중의 페레독신(클로스트리디움 파스퇴리아눔으로부터 수득) 1 내지 3mg/㎖의 용액 5mg 또는
트리스/HCl-완충액(플루카 제조) 중의 페레독신(포르피라 움빌리칼리스로부터 수득) 1 내지 3mg/㎖의 용액 5mg
페레독신 리덕타제: H2O(시그마 제조) 1㎖ 중의 동결 건조된 페레독신 리덕타제(시금치로부터 수득) 3.9U/mg의 용액 1mg
NADPH: H2O(로쉐 디아그노스틱스 제조) 중의 100mM NADPH
(모든 원액은 -20℃에서 저장하며, 사용시 빙상에 유지한다)
HPLC 조건:
HPLC 장치: 머크-히다치(Merck-Hitachi)
HPLC-컬럼: 70×4mm, 크로마실(Kromasil) 100 C18,
3.5μ[마쉐레이-나겔(Macherey-Nagel)(스위스 소재) 제조]
용매 A: 0.0075%의 트리플루로오아세트산을 함유하는 아세토니트릴
용매 B: 0.01%의 트리플루오로아세트산을 함유하는 물
유량: 1.5㎖/분
검출: UV 243nm
샘플: 30㎕
보유 시간: 아베르멕틴 B1a 3.18분
4"-옥소-아베르멕틴 B1a 4.74분
펌프 표: 0.0분 75% A 25% B
7.0분까지 직선형 구배 100% A 0% B
9.0분 100% A 0% B
9.1분까지 단계적 구배 75% A 25% B
12.0분 75% A 25% B
세포-비함유 추출물 475㎕에 다음 용액을 가한다: 페레독신 10㎕, 페레독신 리덕타제 10㎕ 및 기질 1㎕. 기질 첨가 후, 혼합물을 즉시 균일하게 혼합하고 에어레이션시킨다. 이어서, NADPH 5㎕를 가하고 혼합물을 30℃에서 30분 동안 배양한다. 이어서, 메틸-3급-부틸 에테르 1㎖를 반응 혼합물에 가하고 균일하게 혼합한다. 혼합물을 14000rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 메틸-3급-부틸 에테르 상을 10㎖ 용량의 플라스크에 옮긴 후, 회전 증발기를 사용하여 진공 증발시킨다. 잔사를 아세토니트릴 200㎕에 용해시키고 HPLC 샘플 바이얼에 옮긴다. 샘플 30㎕를 주입시, 4.74분에서 피크가 나타나며, 이는 4"-옥소-아베르멕틴 B1a가 존재함을 의미한다. HPLC-질량 분석 결과 당해 피크에 870Da의 질량이 할당되며, 이는 4"-옥소-아베르멕틴의 분자량에 상응한다.
HPLC 및 HPLC-질량 분석에 의해 생성물 형성을 분석하는 경우, 또 다른 피크가 2.01분에서 나타나는데, 이는 케토하이드레이트 4"-하이드록시-아베르멕틴에 상응한다. 이는 세포-비함유 추출물이 아베르멕틴을 하이드록실화시켜 4"-하이드록시-아베르멕틴(이로부터 탈수에 의해 4"-옥소-아베르멕틴이 형성됨)으로 전환시킴을 의미한다.
시금치 페레독신은, 예를 들면, 세균인 클로스트리디움 파스퇴리아눔 또는 적조류인 포르피라 움빌리칼리스로부터 수득된 페레독신으로 대체될 수 있으며, 이 경우에도 생물학적 촉매 작용에 의해 아베르멕틴이 4"-옥소-아베르멕틴으로 전환된다.
실시예 3: 스트렙토마이세스 균주
본 발명에 따르는 방법에 사용할 수 있는 스트렙토마이세스속 균주 및 16s rDNA 분석을 기준으로 한 이의 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 균주 I-1529 및 R-922에 대한 관계는 아래의 표에 나타나 있다.
균주 번호 가장 근접한 진뱅크(GenBank) 대상 16s rDNA 동일성(%)
I-1529 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 DSM 40261형 균주 100
R-922 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 DSM 40261형 균주 100
MAAG-7027 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스 DSM 40261형 균주 100
DSM-40241 (스트렙토마이세스 사라세티쿠스 = ATCC 25496으로서 기재됨)스트렙토마이세스 카타노오겐시스스트렙토마이세스 라이디쿠스 ATCC 25470 = NRRL 2433 10099.8
A/96-1208710 스트렙토마이세스 카수가엔시스 DSM 40819형 균주스트렙토마이세스 카수가엔시스 M338-M1 99.599.4
NRRL-2433 (균주 유형 스트렙토마이세스 라이디쿠스 아종 라이디쿠스 = ATCC 25470 = CBS 703.69 = DSM 40461로서 기재됨)
실시예 4: 아래의 화학식의 4"-데옥시-4"-에피-(메틸아미노)-아베르멕틴 B1의 제조
(여기서, R은 메틸 또는 에틸이다)
메탄올 30㎖ 중의 아세트산 3㎖를 0 내지 5℃로 냉각시킨다. 기상 메틸아민을 가하여 용액의 pH를 9로 만든다.
당해 메틸아민 용액 8.25㎖에 메탄올 6㎖ 중의 4"-옥소-아베르멕틴 B1 1.0g의 용액을 0℃에서 가한다. 혼합물을 주의 온도까지 승온시킨 후, 실온에서 추가로 50분 동안 교반한다. 이어서, 에탄올 2.5㎖ 중의 붕수소화나트륨 90mg을 가하고 생성된 혼합물을 추가로 45분 동안 교반한다. 에틸 아세테이트 10㎖를 반응 혼합물에 가하고, 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 3회 추출한 후, 유기 상을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조시킨다. 용매를 증류 제거하여 4"-데옥시-4"-에피-(메틸아미노)-아베르멕틴 B1을 수득한다. 순도는 90% 이상이다.
참고 문헌
인용된 특허 문헌:
미국 특허 제5,288,710호
유럽 공개특허공보 제736 252호
유럽 특허 제301,806호
유럽 특허 제401,029호
독일 특허 제2,717,040호

Claims (14)

  1. 화학식 II의 화합물을, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시킬 수 있는 생물학적 촉매와 접촉시켜 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계(1)와
    화학식 III의 화합물을, 환원제의 존재하에, 공지되어 있는 화학식 HN(R8)R9의 아민(여기서, R8및 R9는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다)과 반응시키는 단계(2)를 포함하고,
    각각의 경우, 경우에 따라, 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머를, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 상이한 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머로 전환시키는 단계, 당해 방법에 따라 수득할 수 있는 E/Z 이성체 혼합물을 분리하고 목적하는 이성체를 단리하는 단계, 및/또는 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는 유리 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머를 염으로 전환시키는 단계 또는 당해 방법에 따라 또는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있는 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체 또는 이의 토오토머의 염을 유리 형태의 화학식 I의 화합물, 이의 E/Z 이성체, 이의 토오토머 또는 상이한 염으로 전환시키는 단계를 포함하여, 각각 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물 및, 경우에 따라, 이의 E/Z 이성체, 이의 E/Z 이성체 혼합물 및/또는 이의 토오토머를 제조하는 방법.
    화학식 I
    위의 화학식 I에서,
    R1내지 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 치환체이고,
    m은 0, 1 또는 2이고,
    n은 0, 1, 2 또는 3이고,
    A, B, C, D, E 및 F는 결합을 나타내고, 서로 독립적으로, 2개의 인접한 탄소원자가 이중결합, 단일결합, 단일결합과 화학식의 에폭사이드 브릿지, 또는 단일결합과 화학식의 메틸렌 브릿지에 의해 결합되어 있음을 나타낸다.
    화학식 II
    위의 화학식 II에서,
    R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
    화학식 III
    위의 화학식 III에서,
    R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
  2. 화학식 II의 화합물을, 특이적으로 알콜을 4" 위치에서 산화시킬 수 있는 생물학적 촉매와 접촉시키고, 산화반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 이러한 접촉을 유지시킨 후, 화학식 II의 화합물을 분리 및 정제하는 단계(1)를 포함하여, 화학식 III의 화합물을 제조하는 방법.
    화학식 II
    위의 화학식 II에서,
    R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 제1항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
    화학식 III
    위의 화학식 III에서,
    R1내지 R7, m, n, A, B, C, D, E 및 F는 제1항에서 화학식 I의 화합물에 대해 정의한 바와 같다.
  3. 제1항에 있어서, n이 1이고, m이 1이고, A가 이중결합이고, B가 단일결합 또는 이중결합이고, C가 이중결합이고, D가 단일결합이고, E가 이중결합이고, F가 이중결합, 단일결합과 에폭시 브릿지, 또는 단일결합과 메틸렌 브릿지이고, R1, R2및 R3이 H이고, R4가 메틸이고, R5가 C1-C10-알킬, C3-C8-사이클로알킬 또는 C2-C10-알케닐이고, R6이 H이고, R7이 OH이고, R8및 R9가 서로 독립적으로 H, C1-C10-알킬 또는 C1-C10-아실이거나, 함께 -(CH2)q-(여기서, q는 4, 5 또는 6이다)을 형성하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, n이 1이고, m이 1이고, A, B, C, E 및 F가 이중결합이고, D가 단일결합이고, R1, R2및 R3이 H이고, R4가 메틸이고, R5가 2급-부틸 또는 이소프로필이고, R6이 H이고, R7이 OH이고, R8이 메틸이고, R9가 H인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 4"-데옥시-4"-N-메틸아미노 아베르멕틴 B1a/B1b벤조에이트 염을 제조하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 촉매가 미생물인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 촉매가
    (a) 영양 세포, 휴면 세포 또는 동결건조 세포 형태의 생존 미생물,
    (b) 바람직하게는 부분적으로 분해된 형태, 즉 세포벽/세포막이 기계적으로, 화학적으로 또는 분무 건조에 의해 침투성화된 사멸 미생물,
    (c) 당해 미생물의 세포 내용물의 조 추출물,
    (d) 화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시키는 효소 및
    (e) 미생물 포자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스속의 대표적인 미생물인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스(Streptomyces tubercidicus), 스트렙토마이세스 카타노오겐시스(Streptomyces chattanoogensis), 스트렙토마이세스 라이디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토마이세스 사라세티쿠스(Streptomyces saraceticus) 및 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스트렙토마이세스속 균주인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 미생물이 수탁번호 DSM-13136으로 기탁된 균주 스트렙토마이세스 R-922인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 미생물이 수탁번호 DSM-13135로 기탁된 균주 스트렙토마이세스 I-1529인 방법.
  12. 화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 세포 성장을 촉진시키는 영양 배지에 접종하여 세포를 생산하는 단계(1),
    성장 후 세포를 수집하는 단계(2),
    화학식 II의 화합물을 적합한 용매에 용해시키는 단계(3),
    단계(3)으로부터 수득된 용액을 세포 증식을 촉진시키지 않는 반응 배지에 가하는 단계(4),
    단계(2)의 세포를 단계(4)의 반응 배지에 가하는 단계(5),
    공기의 존재하에 단계(5)의 반응 혼합물을 진탕 또는 교반하는 단계(6),
    배지로부터 세포를 분리하는 단계(7),
    적합한 용매를 사용하여 상등액 및 세포를 추출하는 단계(8),
    단계(8)로부터의 유기 용매 상을 농축시키는 단계(9) 및
    단계(9)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(10)를 포함하여, 화학식 III의 화합물을 제조하는 방법.
  13. 화학식 II의 화합물을 적합한 용매에 용해시키는 단계(1),
    단계(1)로부터 수득된 용액을 세포 증식을 촉진시키는 영양 배지에 가하는 단계(2),
    화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시킬 수 있는 미생물의 예비 배양물을 단계(2)의 영양 배지에 접종하는 단계(3),
    화학식 II의 화합물을 화학식 III의 화합물로 전환시킬 수 있는 미생물을 배양하는 단계(4),
    배지로부터 세포를 분리하는 단계(5),
    적합한 용매를 사용하여 상등액 및 세포를 추출하는 단계(6),
    단계(6)으로부터의 유기 용매 상을 진공 농축시키는 단계(7) 및
    단계(7)로부터의 추출물에 함유되어 있는 화학식 III의 화합물을 크로마토그래피 또는 결정화로 정제하는 단계(8)를 포함하여, 화학식 III의 화합물을 제조하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 아베르멕틴이고 화학식 III의 화합물이 4"-옥소-아베르멕틴인 방법.
KR1020027006098A 1999-11-12 2000-11-10 매크로사이클릭 락톤의 제조방법 KR20020063890A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9926887.2 1999-11-12
GBGB9926887.2A GB9926887D0 (en) 1999-11-12 1999-11-12 Organic compounds
PCT/EP2000/011139 WO2001036434A1 (en) 1999-11-12 2000-11-10 Preparation of a macrocyclic lactone

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020063890A true KR20020063890A (ko) 2002-08-05

Family

ID=10864471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027006098A KR20020063890A (ko) 1999-11-12 2000-11-10 매크로사이클릭 락톤의 제조방법

Country Status (24)

Country Link
US (1) US6808903B1 (ko)
EP (1) EP1228078B1 (ko)
JP (1) JP3671003B2 (ko)
KR (1) KR20020063890A (ko)
CN (2) CN1165542C (ko)
AR (1) AR026411A1 (ko)
AT (1) ATE240340T1 (ko)
AU (1) AU763109B2 (ko)
BR (1) BR0015489B1 (ko)
CA (1) CA2388824A1 (ko)
CZ (1) CZ20021616A3 (ko)
DE (1) DE60002751T2 (ko)
DK (1) DK1228078T3 (ko)
ES (1) ES2199883T3 (ko)
GB (1) GB9926887D0 (ko)
HK (1) HK1051204A1 (ko)
HU (1) HUP0204437A3 (ko)
IL (2) IL149369A0 (ko)
MX (1) MXPA02004512A (ko)
PL (1) PL354894A1 (ko)
PT (1) PT1228078E (ko)
RU (1) RU2234511C2 (ko)
WO (1) WO2001036434A1 (ko)
ZA (1) ZA200203612B (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR034703A1 (es) * 2001-05-16 2004-03-17 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones para preparar emamectina.
AU2006100665B4 (en) * 2006-07-06 2006-09-07 Wyeth Biocatalytic oxidation process and use thereof
CN109485683A (zh) * 2018-11-27 2019-03-19 齐鲁晟华制药有限公司 一种含氟系列阿维菌素衍生物及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) * 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4427663A (en) 1982-03-16 1984-01-24 Merck & Co., Inc. 4"-Keto-and 4"-amino-4"-deoxy avermectin compounds and substituted amino derivatives thereof
US4874749A (en) * 1987-07-31 1989-10-17 Merck & Co., Inc. 4"-Deoxy-4-N-methylamino avermectin Bla/Blb
US5030622A (en) * 1989-06-02 1991-07-09 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
IL98599A (en) * 1990-06-28 1995-06-29 Merck & Co Inc Stable salts of "4-deoxy-" 4-epi-methylamino abramectin and insecticides containing them
EP0736252A3 (en) * 1995-04-05 1997-05-02 Ciba Geigy Ag Synergistic compositions with diafanthiuron

Also Published As

Publication number Publication date
HK1051204A1 (en) 2003-07-25
PT1228078E (pt) 2003-09-30
BR0015489A (pt) 2002-06-25
HUP0204437A2 (hu) 2003-04-28
EP1228078B1 (en) 2003-05-14
CN1165542C (zh) 2004-09-08
BR0015489B1 (pt) 2012-11-27
WO2001036434A1 (en) 2001-05-25
CN1390226A (zh) 2003-01-08
CA2388824A1 (en) 2001-05-25
US6808903B1 (en) 2004-10-26
GB9926887D0 (en) 2000-01-12
CN1523116A (zh) 2004-08-25
AU763109B2 (en) 2003-07-10
EP1228078A1 (en) 2002-08-07
ZA200203612B (en) 2003-02-26
CN100519574C (zh) 2009-07-29
AU1520901A (en) 2001-05-30
RU2234511C2 (ru) 2004-08-20
ATE240340T1 (de) 2003-05-15
CZ20021616A3 (cs) 2002-07-17
ES2199883T3 (es) 2004-03-01
IL149369A0 (en) 2002-11-10
MXPA02004512A (es) 2002-09-02
RU2002113754A (ru) 2004-01-20
IL149369A (en) 2007-07-04
DE60002751T2 (de) 2004-02-26
JP3671003B2 (ja) 2005-07-13
PL354894A1 (en) 2004-03-22
DK1228078T3 (da) 2003-09-15
HUP0204437A3 (en) 2005-05-30
DE60002751D1 (de) 2003-06-18
JP2003514542A (ja) 2003-04-22
AR026411A1 (es) 2003-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2942574B2 (ja) グリコシダーゼ阻害剤サルボスタチンおよびその製法
AU2016287537A1 (en) Use of Microbacterium strains for the production of antibacterial agents
JP3428027B2 (ja) コルヒチノイド化合物を対応する３―グリコシル誘導体類にバイオトランスフォーメーションする方法
US5183749A (en) Microbial process for the preparation of milbemycin derivatives
WO2008005381A2 (en) Process for the preparation of moxidectin comprising a step of microbiologically mediated oxidation of 23 -hydroxy- ll- f28249 -alpha to 23-keto-ll-f28249-alpha
KR20020063890A (ko) 매크로사이클릭 락톤의 제조방법
JPH0226957B2 (ko)
US4335108A (en) Paulomycin A and B and preparation thereof
JPH06234784A (ja) 新規抗生物質ｓｆ２７６８物質及びその製造法
JPS61141889A (ja) 新抗生物質ｓｆ−２１９７ｂ物質及びその製造法
JPH0639480B2 (ja) 新規マクロライド系抗生物質ｍ１１９
FUKAGAWA et al. DEEPOXIDATION OF 16-MEMBERED EPOXYENONE MACROLIDE ANTIBIOTICS I. MICROBIAL DEEPOXIDATION AND SUBSEQUENT ISOMERIZATION OF DELTAMYCINS A 1, A 2, A 3, A 4 (CARBOMYCIN A) AND X
JP3380595B2 (ja) 新規抗生物質ｓｆ２７４１ａ物質及びｓｆ２７４１ｂ物質並びにそれらの製造法
AU620595B2 (en) Process for the preparation of macrolide compounds
JPH01101893A (ja) Ｆｒ−６６９７９物質の製造法
JPH0488993A (ja) トランス―４，５―デヒドロ―ｌ―リジンの製造法及びその生産菌
JPH0482135B2 (ko)
JPH0374678B2 (ko)
JP2000166546A (ja) β−１，３−キシラナーゼの製造方法
JPH0656875A (ja) 新規マクロライド抗生物質ｓｆ２７５７物質及びその製造法
JPH0627103B2 (ja) 新規物質ｕｃｎ―１０２８ｃ
HU213349B (en) Method for the preparation of macrolide compounds by fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application