BR0015489B1 - processos para preparação de uma lactona macrocìclica. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS PARA PREPARAÇÃO DE UMA LACTONA MACROCÍCLICA".

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma Iactona macrocíclica, um processo para a preparação dos compos- tos intermediários e os compostos intermediários usados no dito processo. Mais particularmente a invenção refere-se a um processo para a preparação um composto da fórmula

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no qual

R1-Rg representam, independentemente um do outro hidrogênio ou um substituinte;

m é O, 1 ou 2; η é O, 1, 2 ou 3; e

as ligações marcadas com A, B1 C1 D, E e F indicam, indepen- dentemente uma da outra, que dois átomos de carbono adjacentes estão conectados por uma ligação dupla, uma ligação simples, uma ligação sim- ples e uma ponte de epóxido da fórmula

<formula>formula see original document page 2</formula>, ou uma ligação dupla e uma ponte de metileno

da fórmula

<formula>formula see original document page 2</formula>, incluindo onde aplicável, um isômero E/Z, uma mistura de isômeros E/Z, e/ou um tautômero do mesmo, em cada caso em forma livre ou em forma de sal,

tal processo compreende

1) formando ponte em um composto da fórmula

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onde

Ri-R7, m, η, A, B, C, D, E e F têm os mesmos significados como dados para fórmula (I) acima, em contato com um biocatalisador que é ca- paz de especificamente oxidar o álcool em posição 4" a fim de formar um composto da fórmula

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na qual R1l R2lR3, R4, R5, R6jR7, m, η, A, B, C, D, E e F têm os significados dados para fórmula (I); e

2) reagindo o composto da fórmula (III) com uma amina da fór- mula HN(R8)Rg1 onde R8 e R9 têm os mesmos significados como dado para fórmula (I), e o qual é conhecido, na presença de um agente redutor;

e, em cada caso, se desejado, convertendo um composto de fórmula (I) obtenível de acordo com o processo ou por outro método, ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, em um composto diferente de fórmula (I) ou um isômero E/Z ou do mesmo disso, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, separan- do uma mistura de isômeros E/Z obteníveis de acordo com o processo e isolando o isômero desejado, e/ou convertendo um composto livre de fór- mula (I) obtenível de acordo com o processo ou por outro método conhecido, ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo, em um sal ou convertendo um sal, obtenível de acordo com o processo ou por outro método, de um com- posto de fórmula (I) ou de um isômero E/Z ou tautômero disso no composto livre de fórmula (I) ou um ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo ou em um sal diferente.

Métodos de síntese para os compostos de fórmula (I) são des- critos na literatura. Descobriu-se, entretanto, que os processos conhecidos na literatura causam problemas consideráveis durante produção basica- mente por conta dos baixos rendimentos e os procedimentos tediosos os quais têm que ser usados. Conformemente, os processos conhecidos não são satisfatórios a esse respeito, proporcionando aumento à necessidade para fazer processos de preparação aperfeiçoados disponíveis para aqueles compostos.

Os compostos (I), (II) e (III) podem estar na forma de tautôme- ros. Conformemente, antes e nas partes que se seguem, onde apropriado os compostos (I), (II) e (III) são para serem compreendidos a incluir tautômeros correspondentes, mesmo se os últimos não são especificamente menciona- dos em cada caso.

Os compostos (I), (II) e (III) são capazes de formar sais de adi- ção ácidos. Aqueles sais são formados, por exemplo, com ácidos inorgâni- cos fortes, tais como ácidos minerais, por exemplo ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido nitroso, um ácido fosfórico e ou ácido hidroháli- co, com ácidos carboxílicos orgânicos fortes, tais como não-substituídos ou substituídos, por exemplo ácidos alcanocarboxílicos CrC4 halo substituídos, por exemplo ácido acético, ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, por exemplo ácido oxálico, malônico, succínico, maléico, fumárico ou ftálico, ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo ácido ascórbico, lático, málico, tartá- rico ou cítrico, ou ácido benzóico, ou com ácidos sulfônicos orgânicos, tais como não-substituídos ou substituídos, por exemplo ácidos alcano- Ci-C4 ou arila-sulfônicos halo substituídos, por exemplo ácido metano- ou p-tolueno- sulfônico. Além do mais, compostos de fórmula (I), (II) e (III) tendo pelo me- nos um grupo ácido são capazes de formar sais com bases. Sais adequados com bases são, por exemplo, sais metálicos, tais como sais de metais alcali- nos ou metais alcalinos-terrosos, por exemplo, sais de sódio, potássio ou magnésio, ou sais com amônia ou uma amina orgânica, tais como morfolina, piperidina, pirrolidina, uma alquilamina mono-, di-, ou triinferior, por exemplo etila-, dietila-, trietila- ou dimetila-propila-amina, ou uma alquilamina mono-, di- ou trihidróxi-inferior, por exemplo mono-, di- ou trietanolamina. Além dis- so, sais internos correspondentes podem também ser formados. Preferência é dada dentro do objetivo da invenção para sais agroquimicamente vantajo- sos. Em vista do relacionamento próximo entre os compostos de fórmula (I), (II) e (III) em forma livre e na forma de seus sais, qualquer referência antes ou nas partes que se seguem aos compostos livres de fórmula (I), (II) e (III) ou a seus sais respectivos é para ser compreendida com incluindo também os sais correspondentes ou os compostos livres de fórmula (I), (II) e (III), onde apropriado e conveniente. O mesmo aplica-se no caso de tautômeros de compostos de fórmula (I), (II) e (III) e os sais do mesmo. A forma livre é geralmente preferida em cada caso.

Preferido dentro do objetivo desta invenção é um processo para a preparação de compostos da fórmula (I), no qual η é 1; m é 1;

A é uma ligação dupla;

B é ligação simples ou uma ligação dupla; C é uma ligação dupla; D é uma ligação simples;

E é uma ligação dupla;

F é uma ligação dupla; ou uma ligação simples e uma ponte epóxi; ou uma ligação simples e uma ponte de metileno;

R1l R2 e R3 são H;

R4 é metila;

R5 é alquila C1-C10, cicloalquila C3-C8 ou alquenila C2-Ci0;

R6 é H;

R7 é OH;

R8 e R9 são independentemente um do outro H; alquila C1-C10 ou acila CrC10; ou juntos formam -(CH2)q-; e

q é 4, 5 ou 6.

Especificamente preferido dentro do objetivo desta invenção é um processo para a preparação de um composto da fórmula (I) na qual

η é 1;

m é 1;

A, B, C, E e F são ligações duplas;

D é uma ligação simples;

R1lR2 e R3 são H;

R4 é metila;

R5 é s-butila ou isopropila;

R6 éH;

R7 é OH;

R8 é metila;

R9 é H.

Muito especialmente preferido é um processo para a preparação de Emamectina, mais particularmente o sal de benzoato de Emamectina. Emamectina é uma mistura de avermectina de 4"-desóxi-4"-N-metilamino B1a/B-ib e é descrita em US-P-4.4874.749 e como MK-244 em Journal of Or- ganic Chemistry1 vol. 59 (1994), 7704-7708. Sais de emamectina que são especialmente valiosos agroquimicamente estão descritos em US-P- .5.288.710. Os compostos da fórmula (I) são pesticidas valiosos, especial- mente para combater insetos e representativos da ordem Acarina. As pestes mencionadas incluem, por exemplo, aquelas que são mencionadas em pági- na 5, linhas 55 a 58, página 6 e página 7, linhas 1 a 21, Pedido de Patente Européia EP-A 736.252. As pestes mencionadas aqui contidas são incluídas por referência a isso na sujeita matéria presente da invenção.

Os termos gerais usados antes e nas partes que se seguem têm os seguintes significados, a não ser de outro modo definido: Grupos e compostos contendo carbono cada um contém de 1 até e incluindo 8, preferivelmente de 1 até e incluindo 6, especialmente de 1 até e incluindo 4, e mais especialmente 1 ou 2, átomo de carbono.

Alquila é ou cadeia reta, isto é metila, etila, propila, butila, pentila ou hexila, ou ramificado, por exemplo isopropila, isobutila, sec-butila, tert- butila, isopentila, neopentila ou isohexila.

Alquenila, ambos como um grupo per se e como um elemento estrutural de outros grupos e compostos, por exemplo haloalquenila e arilal- quenila, está, em cada caso levando em conta exatamente o número de átomos de carbono contidos no grupo ou composto em questão, ou de ca- deia reta, por exemplo vinila, 1-metilvinila, alila, 1-butanila ou 2-hexenila, ou ramificado, por exemplo isopropenila.

Cicloalquila C3-C6 é ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila ou ciclo- hexila, especialmente ciclohexila.

Aspectos adicionais da invenção são

- os compostos da fórmula (III) como definido acima; ou

- um processo para a preparação do composto da forma de par- tida da fórmula (III) o composto da fórmula (II) de acordo com a etapa 1) acima; ou

- um processo para a preparação do composto da forma de par- tida da fórmula (I) o composto da fórmula (III) de acordo com a etapa 2) aci- ma.

Dentro do objetivo da presente invenção, o termo "biocatalisa- dor" é entendido incluir:

a) um microorganismo vivo, por exemplo na forma de células vegetativas, células em repouso ou células secas congeladas,

b) os esporos do dito microorganismo

c) um microorganismo morto, preferivelmente em uma forma parcialmente desintegrada, isto é com parede celular/membrana celular me- canicamente ou quimicamente ou por atomização permeabilizada,

d) extratos brutos dos conteúdos do dito microorganismo, e

e) uma enzima que converte os compostos da fórmula (II) em compostos de fórmula (III).

Bactérias e fungos são microorganismos especialmente ade- quados para o processo de acordo com a invenção. Bactérias adequadas são especialmente representativas de Actinomycetes, especialmente do gê- nero Streptomyces. Preferidos são cepas do gênero Streptomyces selecio- nada do grupo consistindo em Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saracaticus e Streptomyces kasugaensis. As cepas Streptomyces R-922 (Streptomyces tubercidicus), e especialmente Streptomyces 1-1529 (Streptomyces tuberci- dicus), têm mostrado ser particularmente adequado para a oxidação regio- específica do grupo hidróxi na posição 4" de compostos da fórmula (II).

Streptomyces de cepas Streptomyces 1-1529 e Streptomyces R- .922, são dispostos conforme as condições do Tratado de Budapeste no DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1 b, D - 38124 Braunschweig - Alemanha, sob número de acesso DSM-13135 e DSM-13136, respectivamente, em 5 de novembro de .1999.

Cepas adicionais foram identificadas as quais podem ser ade- quadamente usadas para executar a oxidação regioespecífica de acordo com a invenção incluindo, por exemplo, cepa de Streptomyces MAAG-7027 (Streptomyces tubercidicus), cepa de Streptomyces DSM-40241 (Streptomyces saraceticus, também identificada como Streptomyces chatta- noogensis), cepa de Streptomyces NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp. lydicus) e cepa de Streptomyces A/96-1208710 (Streptomyces kasugaensis). Todas as cepas acima são muito proximamente relacionadas a Streptomyces de cepas Streptomyces 1-1529 e Streptomyces R-922, respec- tivamente, as quais podem ser demonstradas por uma análise de 16 s rDNA mostrando identidades entre 99,4% e 100%.

Os compostos de fórmula (I) são conhecidos a serem agentes ligeiramente ativos para controlar pestes de plantas. No processo conhecido para a preparação de compostos da fórmula (I) como, por exemplo, descrito em EP 301 806 e também no processo microbial de acordo com a invenção, compostos de fórmula (II) são usados como materiais de partida.

Nos processos conhecidos, em uma primeira etapa os compos- tos da fórmula (II) são protegidos no oxigênio em posição 5, então oxidado a .4"-cetona, seguido por conversão a amina e desproteção do grupo hidróxi mascarado em posição 5, desse modo empregando tecnologia de grupo protetor convencional como descrito por Greene e Wuts, 1999 (Protective Groups in Organic Synthesis).

O processo de acordo com a presente invenção tem a vantagem que este compreende somente duas etapas como comparado com quatro dos processo conhecidos. O referido além disso evita o uso de grupos pro- tetores, e é ecologicamente seguro já que menos produtos químicos têm que ser usados. O composto de fórmula (III) resultando da etapa biocatalítica de acordo com a invenção é conhecido, por exemplo de EP 401 029.

Em uma concretização específica o processo de acordo com a invenção pode, em detalhes, ser realizado como segue:

Em uma primeira etapa compostos da fórmula (III) são prepara- dos. Isto pode ser realizado diretamente entrando em contato um composto de fórmula (II) com um biocatalisador que é capaz de especificamente oxidar o álcool em posição 4" a uma cetona de fórmula (III), e mantendo este con- tato por um período de tempo que é suficiente para a reação de oxidação acontecer.

Mais convenientemente, o processo é realizado usando um mi- croorganismo como o biocatalisador, o qual microorganismo é capaz de rea- lizar a reação de oxidação de acordo com a invenção. Preferivelmente, o dito microorganismo é cultivado em um meio de cultivo adequado promovendo proliferação microbial e sob condições controladas na presença de um com- posto da fórmula (II), e mantendo a incubação conjunta do dito microorga- nismo e seu substrato por um tempo suficiente para a reação de oxidação ocorrer, preferivelmente até de 25% a 99,9%, mais preferível mente de 50% a .99.9% e mais preferivelmente de 80 a 99.9% do composto adicionado da fórmula (II) ter sido convertido em compostos da fórmula (III).

Alternativamente e mais preferível, o processo é realizado por primeiramente cultivando um microorganismo que é capaz de realizar a rea- ção de oxidação de acordo com a invenção em um meio de cultivo adequa- do promovendo proliferação microbial e sob condições controladas, e então colhendo a biomassa do microorganismo aplicando métodos adequados tais como, por exemplo, por filtração ou centrifugação. A biomassa do microor- ganismo é então ou imediatamente usada com um biocatalisador para a conversão de compostos de fórmula (II) em compostos de fórmula (III) ou pode ser armazenada no frio ou como tal ou após secagem por congela- mento ou atomização antes de ser usada na reação. O dito microorganismo, quer frescamente colhido ou armazenado como descrito, e um composto de fórmula (II) são então incubados conjuntamente em um meio de reação o qual não favorece proliferação microbial por um tempo suficiente para a rea- ção de oxidação ocorrer, preferivelmente até de 25% a 99,9%, mais preferi- velmente de 50% a 99.9% e mais preferivelmente de 80 a 99.9% do com- posto adicionado da fórmula (II), ter sido convertido em compostos da fór- mula (III).

O produto de reação da fórmula (III) obtido neste modo pode ser separado de material de partida da fórmula (II) sem grande dispêndio técnico por meios de métodos de separação costumeiros, por exemplo por cristali- zação fracional ou por cromatografia. Cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia de coluna, cromatografia de camada grossa ou cromatografia de camada fina em materiais veículos minerais tais como sílica-gel ou em resinas trocadoras orgânicas.

Ao invés de estruturas de células vegetativas, esporos microbi- ais podem ser usados quais esporos são colhidos de microorganismos que são capazes de especificamente oxidar o álcool em posição 4" a uma cetona da fórmula (III), e são então incubados com um composto da fórmula (II) por um período de tempo que é suficiente para a reação de oxidação correspon- dente acontecer. A incubação de esporos e substrato é preferivelmente rea- lizada na ausência de meio de cultura a fim de prevenir os esporos de ger- minarem.

Compostos da fórmula (II) são usados como um substrato para a reação de oxidação de acordo com a invenção. Estes compostos são co- nhecidos (veja DE 2717040) ou podem ser preparados de compostos co- nhecidos analogamente a processos conhecidos. Estes são adequados para controlar pestes em animais e plantas e são além do mais materiais de par- tida valiosos ou intermediários na preparação de compostos da fórmula (I). A preparação de compostos de fórmula (III) pode também ser realizada usan- do para a oxidação dos compostos de fórmula (II) não o próprio microorga- nismo mas constituintes ativos originando deste microorganismo (de acordo com as definições b) a e) acima que são capazes de especificamente oxidar o álcool em posição 4" a uma cetona da fórmula (III).

Conformemente, um aspecto adicional da presente invenção é o uso em forma imobilizada de células de microorganismos vegetativas, ex- tratos sem células, esporos, enzimas e misturas de enzimas dos ditos mi- croorganismos que são capazes de especificamente oxidar o álcool em po- sição 4" a uma cetona da fórmula (III).

A imobilização dos ditos biocatalisadores pode ser realizada analogamente a processos conhecidos per se. Dentro do objetivo da pre- sente invenção a esse respeito pode ser mencionado especialmente proces- sos que são baseados em aglutinação adsortiva ou ligação iônica ou cova- Iente dos ditos biocatalisadores a sólido, geralmente materiais veículos in- solúveis em água, em reticulação de biocatalisadores por reagentes bi- ou poli-funcionais, em encapsulação de matriz, em separação de membrana ou em uma combinação de dois ou mais processos acima mencionados.

Uma aglutinação adsortiva a veículos insolúveis em água (ad- sorventes) é realizada especialmente por forças de van der Waals. Numero- sos compostos inorgânicos e orgânicos e também polímeros sintéticos são adequados como adsorventes.

Métodos para tal imobilização de microorganismos são descritos por Bickerstaff (Ed.), 1997 (lmmobilisation of Enzymes and Cells), van Ha- echt et al., 1985 (células de leveduras/vidro), Black et al., 1984 (células de leveduras/aço refinado, poliéster), Wiegel and Dykstra, 1984 (clostri- dia/celulose, hemicelulose), Fõrberg and Hàggstrõm, 1984 (clostridia/aparas de madeira) e também por Ehrhardt e Rehm, 1985 (Pseudomôna- das/carbono ativo). Detalhes correspondentes para o uso de enzimas imobi- lizadas por aglitinação adsortiva estão para serem encontradas em Krakowi- ak e outros, 1984 (glicoamilase/óxido de alumínio), Cabral e outros, 1984 (glicoamilase/vidro ativado por titânio), Miyawaki e Wingard 1984 (glicose oxidase/carbono ativo), Kato e Horikoshi, 1984 (glicose transferase/resina sintética) entre outros. Ligações iônicas são baseadas em atrações eletros- táticas entre grupos contrariamente carregados do material veículo (tal como, por exemplo, trocadores de íons comercialmente disponíveis, por exemplo baseado em polissacarídeos ou em resinas sintéticas) e do bioca- talisador a ser ligado.

Métodos de imobilizar microorganismos baseados em ligação iônica são descritos por DiLuccio e Kirwan, 1984 (Azotobactéria spec./Cellex E (celulose) e por Giard e outros, 1977 (células animais/DEAE-Sephadex). Uma imobilização correspondente de enzimas pode ser realizada de acordo com os detalhes fornecidos por Angelino e outros, 1985 (aldeído oxida- se/octilamino-Sepharose 4B), Hofstee, 1973 (lactato desidrogena- se/octilamino-Sephadex), Kühn e outros, 1980 (glicose oxidase/DEAE- Sephadex, DEAE-celulose) e outros.

Um método adicional de imobilização é baseado no uso de for- ças de ligações covalentes, as quais geralmente resultam em ligações fixas de biocatalisadores a um outro ou entre biocatalisador e material veículo. Materiais veículos adequados são materiais porosos, tais como vidros, sílica ou outros materiais inorgânicos insolúveis.

Dentro do objetivo do processo de acordo com a invenção, os microorganismos podem ser imobilizados, por exemplo, analogamente a Messing e Oppermann, 1979 (Enterobacterias/vidro de borossilicato; células de levedura/óxido de zircônio), Romanovskaya e outros, 1981 (bactéria de metano/Silocromo), Navarro e Durand, 1977 (células de levedura/sílica poro- sa).

A imobilização de enzimas pode ser realizada de acordo com o método descrito por Weetall e Mason, 1973 (papaína/vidro poroso) e Mon- san e outros, 1984 (invertase/sílica porosa).

No processo de acordo com a invenção não somente são os materiais veículos já mencionados para imobilização mas também uma série completa de polímero naturais ou sintéticos, por exemplo, celulose, dextra- no, amido, agarose etc. ou polímeros, por exemplo baseados em derivados de ácido acrílico e metacrílico, que são geralmente usados na fabricação de copolímeros reativos. Grupos reativos adequados por meios dos quais uma ligação ao biocatalisador é formada são grupos dinitrofluorofenila ou isotioci- anato reativos, ou especialmente grupos oxirano ou anidrido ácidos. Uma possibilidade adicional na ativação do cloreto de resinas transportando gru- pos carboxi, os quais estão comercialmente disponíveis, por exemplo, sob os nomes comerciais Amberlite® XE-64 e Amberlite® IRC-50.

A imobilização de microorganismos com o auxílio de materiais veículos naturais ou sintéticos pode ser realizada como descrito por Chipley, 1974 (Bacillus subtilis/agarose), Gainer e outros, 1980 (espécies de Azoto- bactéria/celulose), Jack e Zajic, 1977 (Micrococcus/carboximetilcelulose), Jirku e outros, 1980 (células de leveduras/hidroxialquilmetacrilato) e também por Shimizu e outros, 1975 (células bacteriais/copolímero de etileno-anidrido maléico). A imobilização de enzimas pode ser realizada analogamente a Cannon e outros, 1984 (lactato oxidase/celulose), Dennis e outros, 1984 (quimiotripsina/Sepharose), Ibrahim e outros, 1985 (epóxi hidrola- se/dextrano); Beddows e outros, 1981 (α-galactosidase/copolímero de nái- lon-acrilato), Raghunath e outros, 1984 (urease/metacrilato-acrilato), entre outros.

No processo de reticulação, os biocatalisadores são ligados um ao outro por reagentes bi- ou poli-funcionais, tais como glutardialdeído, dii- socianatos entre outros e formam-se caracteristicamente insolúveis geral- mente agregados gelatinosos de alto peso molecular.

Tais imobilizações de microorganismos podem ser realizadas analogamente a De Rosa e outros, 1981 (células bacteriais/co-reticulação com albumina do ovo por meios de glutardialdeído). Processos para a imobi- lização de enzimas que podem ser usados com o objetivo da presente in- venção são descritos por Barbaric e outros, 1984 (invertase/reticulação com dihidrazida de ácido adípico), Talsky e Gianitsopoulos, 1984 (quimiotripsi- na/ligação de peptídeo entre as moléculas de enzima sem agente de reticu- Iação), Workman e Day, 1984 (inulinase/reticulação das células contendo enzima com glutardialdeído), Khan e Siddiqi, 1985 (pepsina/reticulação com glutardialdeído), Bachmann e outros, 1981 (glicose isomerase/co-reticulação com gelatina por meios de glutardialdeído), Kaul e outros, 1984 (a- galactosidase/co-reticulação com albumina de ovo por meios de glutardial- deído).

Encapsulação de matriz compreende a inclusão dos biocatalisa- dores em polímeros naturais e sintéticos, os quais são geralmente de estru- tura gelatinosa. Materiais de matrizes que são especialmente adequados para inclusão de células, organelas e esporos são polímeros naturais tais como alginato, carragenina, pectina, ágar, agarose, ou gelatina, já que estes compostos são não tóxicos e protegem as células durante manuseio. Tam- bém adequados são polímeros sintéticos, tais como, por exemplo, poliacri- lamidas, resinas fotorreticuladas transversalmente entre outras. A forma da encapsulação de matriz é variável dentro de amplos limites e pode incluir, por exemplo, formas esféricas, cilíndricas, fibrosas e laminares. A imobiliza- ção de microorganismos com o auxílio de materiais de matriz naturais e sin- téticos podem ser realizados como descrito por Mazumder e outros, 1985 (células bacteriais/resinas fotorreticuladas), Bettmann e Rehm1 1984 (células bacteriais/hidrazida poliacrilamida), Umemura e outros, 1984 (células bacte- riais/carragenina), Karube e outros, 1985 (protoplastos bacteriais/ágar- acetilcelulose), Cantarella e outros, 1984 (células de Ievedu- ras/hidroxietilmetacrilato), Qureshi e Tamhane1 1985 (células de Ievedu- ra/alginato), Deo e Gaucher, 1984 (Hifomicetes/carragenina), Eikmeier e Rehm, 1984 (Hifomicetes/alginato), Bihari e outros, 1984 (Hifomicetes coni- diais/poliacrilamida), Vogel e Brodelius, 1984 (células de planta/alginato, agarose), Nakajima e outros, 1985 (células de plantas/ágar, alginato, carra- genina).

A imobilização de enzimas pode ser realizada analogamente a Mori e outros, 1972 (aminoacilase/poliacrilamida).

Separação de membrana envolve a criação de áreas definidas específicas nas quais a reação procede. As variantes básicas de separação de membrana são diferenciadas como segue:

a) microencapsulação

b) técnica de Iipossoma

c) o uso de biocatalisador em reatores de membrana.

Os métodos de imobilização acima descritos podem ser combi- nados um com o outro, tais como, por exemplo, adsorção e reticulação. Nesse caso as enzimas são antes de tudo adsorvidas em um veículo e en- tão reticuladas com uma outra por um reagente bifuncional.

A incubação dos biocatalisadores usados dentro do objetivo da presente invenção com compostos da fórmula (II) para a oxidação específica do álcool em posição 4" a uma cetona da fórmula (III) pode ser realizada com o auxílio de processos tais como aqueles costumeiros em microbiologia aplicada. Além do uso de culturas agitadas a esse respeito pode ser menci- onado especialmente vários sistemas fermentadores que têm por muito tem- po sido estabelecidos em pesquisa microbiológica e produção industrial.

A tarefa principal dos biorreatores é a criação de condições hi- drodinâmicas ótimas a fim de reduzir as constantes de Michaelis aparentes e para aumentar a velocidade da reação.

Isto é essencialmente alcançado mantendo um movimento rela- tivo adequado entre biocatalisador e em torno do meio, o qual aumenta a transferência de massa externa a tal extensão que seu impedimento em prá- tica não mais aplique-se. Tipos de reatores que são adequados para o processo envolvido inclui-se, por exemplo, reatores de vaso agitado, reatores do tipo arco, reato- res de leito, reatores de leito fluidizado, reatores de membrana e também numerosas formas especiais de reator, por exemplo reatores agitados por peneiras, reatores rombóides, reatores de tubo entre outros (W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger e A. Crueger, Biotechno- Iogie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P, Pave e outros, Handbuch der Biotechnologie, 1984). O uso de reatores de vasos agitados é preferido dentro do objetivo da presente invenção.

Reatores de recipiente agitado estão entre os tipos de reatores mais usados na técnica de biotecnologia de fermentação. Este tipo de reator assegura uma mistura rápida e completa de substrato e biocatalisador como um resultado de altas capacidades de agitação e uma alta capacidade de transferência de oxigênio.

As vantagens dos reatores de vaso agitado residem em sua simples e assim construção econômica e em suas propriedades de boas pesquisa.

Em princípio, quando usando reatores de vaso agitado dois tipos de operação são possíveis: antes de tudo processo operacionado do "tipo em batelada", o suposto processo em "batelada", e, secundariamente, um processo contínuo.

No processo em "batelada" os biocatalisadores são removidos por separação ou filtração uma vez que o processo é terminado e são ou descarregados (células vegetativas) ou são usados novamente em uma se- gunda batelada (biocatalisadores imobilizados).

Quando usando o processo contínuo, existe uma troca contínua permanente de novo substrato para o produto final da reação. Os biocatali- sadores devem ser prevenidos de deixar o reator por meios de medições adequadas (peneira, filtros, dispositivos de retorno).

O cultivo de células de microorganismo vegetativas dentro do objetivo da presente invenção é realizado de acordo com métodos costumei- ros geralmente conhecidos, meios de nutrientes líquidos preferivelmente sendo usado para razões de praticabilidade.

A composição dos meios de nutrientes varia dependendo do mi- croorganismo usado. Geralmente, meios complexos com fontes de carbono (C) e nitrogênio (N) prontamente assimiláveis fracamente definidas são pre- feridos, como costumeiramente usado, por exemplo, também para a produ- ção de antibióticos.

Além disso, vitaminas e íons metálicos essenciais são necessá- rios os quais, entretanto, são como geralmente contido em uma concentra- ção adequada, como constituintes ou impurezas nos meios de nutrientes complexos usados. Se desejado, os ditos constituintes tais como, por exem- plo, vitaminas essenciais e também íons Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4+, (SO4)2", Cl", (CO3)2" e os elementos de traço cobalto e magnésio e zinco, entre ou- tros, podem ser adicionados na forma de seus sais. Fontes de nitrogênio especialmente adequadas separadamente de extratos de leveduras, hidroli- satos de leveduras, autolisatos de leveduras, e células de leveduras são es- pecialmente soja, farinha grossa, maizena, farinha de aveia, adamina (lac- talbumina enzimaticamente digerida), peptona, hidrolisato de caseína, licores de estirpe de trigo e extratos de carne.

A concentração preferida das ditas fontes N é de 0,1 a 6 g/l. Fontes de carbono adequadas são, especialmente, glicose, lactose, sacaro- se, dextrose, maltose, amido, cerelose, celulose, manitol, e extrato de malte, e melaço. O limite concentração preferido de ditas fontes de carbono é de .1,0 a 25 g/l. O uso de D-glicose, amido solúvel ou extrato de malte e também de cerelose como fonte de carbono é de vantagem para o processo de oxi- dação descrito no seguinte, especialmente se os microorganismos usados são representativos do gênero Streptomyces. Assim, por exemplo, os meios de cultura seguintes são excelentemente adequados para representativos do gênero Streptomyces. Meio 1

.1,0 g de amido solúvel .0,2 g de peptona .0,2 g de extrato de levedura ajuste a 1 litro com água destilada, ajuste a pH7 com NaOH1 autoclave. Meio 2

.4,0 g de D-glicose

.10,0 g de extrato de malte

.4,0 g de extrato de levedura

ajuste a 1 litro com água destilada, ajuste a pH7 com NaOH, autoclave. Meio 3

.10,0 g de glicerol .20,0 g de dextrina

.10,0 g de tom de soja (Difco Manual, 9- ed., Detroit, Difco Laboratories,1969)

.2,0 g de (NH4)2SO4 .2,0 g de CaCO3

ajuste a 1 litro com água destilada, ajuste a pH7 com NaOH, autoclave. Meio 4

.10,0 g de D-glicose .10,0 g de extrato de malte .3,0 g de extrato de levedura

.10,0 g de Pharmamedia (Traders Protein, Southem Cotton Oila Co., Mem- phis TN, USA) .1,0 g de extrato de carne

ajuste a 1 litro com água destilada, ajuste a pH7 com NaOH, autoclave. Meio 5 (ISP-2 ágar)

extrato de levedura 4 g (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, Inglaterra)

D(+)-glicose 4g

Extrato de bacto malte 10 g (Difco Nq 0186-17-7)

Ágar 20g (Difco N9 0140-01)

são dissolvidos em 11 de água desmineralizada, e o pH é ajustado a 7,0.

A solução é esterilizada a 1210C por 20 min, esfriada e mantida a 55°C pelo curto tempo necessário para a preparação imediata das placas de ágar.

Meio 5 (meio PHG) Peptona

Extrato de levedura

D(+)-glicose

NaCI

MgSO4 x 7H20 NaH2PO4 x H2O K2HPO4

.10 g (Sigma 0521) .10 g (Difco) .10g .2g

.0,15 g .1,3 g .4,4g

são dissolvidos em 11 de água desmineralizada, e o pH é ajustado a 7,0.

Os meios acima mencionados são também excelentemente adequados para cultivar representativos do gênero Streptomyces e para rea- lizar a reação de oxidação. Ambos dados acima acerca da composição dos meios, e também os meios relacionados em detalhes aqui contidos, servem meramente para ilustrar a presente invenção e não são de uma natureza limitante.

do para produzir o meio, tal como, por exemplo, a seqüência de dissolução suspensão, a esterilização da solução nutriente como um todo ou a esterili- zação dos constituintes individuais, a prevenção de contaminação entre ou- tros, também desempenha um papel significante e deveria ser otimizado conformemente ao processo de produção envolvido.

Deveria também ser mencionado que a esterilização pode cau- sar alterações no valor de pH do meio de nutriente e também precipitações.

Os métodos de cultivo restantes também correspondem aos processos costumeiramente usados para cultivar microorganismos.

Em uma escala pequena, as fermentações realizadas dentro do objetivo da presente invenção, incluindo quaisquer pré-culturas, estão ge- ralmente na forma de cultura agitadas, em qual caso é vantajoso usar fras- cos de vidro de 0,1 a 5 litros, preferivelmente de 0,5 a 5 litros de capacidade, o qual contém de 0,05 a 2 litros, preferivelmente de 0,1 a 2 litros de meio de nutriente. Os frascos são preferivelmente equipados com uma placa defleto- ra. Após autoclavar e ajustar o pH a valores de pH 4 a pH 8, especialmente de pH 7,0 a pH 7,5 (bactérias) ou a valores de pH 6 a pH 7,5 (fungos), os

Separadamente da composição dos meios, o procedimento usa- frascos são inoculados com as culturas de microorganismos corresponden- tes sob condições estéreis. O material de inoculação usado é geralmente uma pré-cultura que tem sido produzida de material de inoculação preserva- do de acordo com os dados proporcionados abaixo.

As culturas, incluindo quaisquer pré-culturas, são vantajosa- mente cultivadas sob condições aeróbias em uma temperatura de aproxima- damente 25°C a cerca de 37°C, preferível mente de aproximadamente 26°C a cerca de 30°C, mas especialmente em aproximadamente 28°C, com agita- ção contínua entre aproximadamente 80 rpm a cerca de 300 rpm, preferi- velmente entre aproximadamente 100 rpm e 250 rpm, mas especialmente em aproximadamente 120 rpm (revoluções por minuto) em uma máquina de agitação rotatória. Sob as condições mencionadas, com Streptomyces uma atividade de oxidação ótima tem geralmente sido alcançada após de 1,5 a 7 dias de cultivo.

Uma vez a capacidade cataiítica das células é suficientemente apta para realizar a reação de oxidação desejada, preferível mente após 40 horas, o substrato (compostos da fórmula (II)) é adicionado, pelo qual os mi- croorganismos e a substância a ser oxidada podem ser levados em contato com o outro em qualquer modo. Para razões práticas, provou-se ser vanta- joso adicionar ao substrato, isto é um composto da fórmula (II), ao microor- ganismo em solução de nutriente.

A substância a ser oxidada pode ser usada, por exemplo, em forma de pó ou na forma de uma solução quer em solvente adequado tal como, por exemplo, dimetilformamida, acetona, dimetila sulfóxido N-metila-2- pirrolidona ou um solvente alcoólico tal como, por exemplo, metanol, etanol, isopropanol ou tert-butanol, ou um solvente de éter tal como, por exemplo, tetrahidrofurano ou 1,4-dioxano (0,5 a 15% por volume, preferivelmente 2% por volume) ou um solvente de éster tal como, por exemplo, etila acetato ou um solvente de hidrocarboneto tal como, por exemplo, octano ou ciclohexa- no ou tolueno ou xileno, ou em uma mistura de solvente adequado e um ten- soativo adequado. O termo "tensoativo" compreende tensoativos iônicos, não-iônicos e zwitteriônicos e também será compreendida a incluir misturas de tensoativos.

Ambos sabões solúveis em água e compostos ativos de superfí- cie sintéticos solúveis em água são tensoativos aniônicos adequados. Sa- bões adequados são os sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos- terrosos ou sais de amônio não-substituídos ou substituídos de ácidos gra- xos superiores (C10-C22), por exemplo os sais de sódio ou potássio de ácido oléico ou esteárico, ou de misturas de ácido graxo naturais os quais podem ser obtidos, por exemplo, de óleo de coco ou óleo de sebo. Tensoativos adequados adicionais são também os sais de metiltaurina de ácido graxo. Mais freqüentemente, entretanto, supostos tensoativos sintéticos são usa- dos, especialmente sulfonatos graxos, sulfatos graxos, derivados de benz- imidazol sulfonados ou alquilarilsulfonatos. Os sulfatos ou sulfatos graxos estão geralmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcali- nos-terrosos ou sais de amônio não-substituídos ou substituídos e contém um radical alquila C10-C22 o qual inclui a porção alquila de radicais de acila, por exemplo o sal de sódio ou cálcio de ácido lignossulfônico, de dode- cilsulfato, ou de uma mistura de sulfatos de álcool graxos obtidos de ácidos graxos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de adutos de álcool/óxido de etileno graxos sulfatados ou sulfonados. Os derivados de benzimidazol sulfonados preferível mente contém 2 grupos de ácido sulfônico e um radical de ácido graxo contendo 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos de alquilarilsulfonatos são os sais de sódio, cálcio ou tretanolamina de ácido dodecilbenzenossulfônico, ácido dibutilnaftalenossulfônico, ou de um con- densado de ácido naftlenossulfônico e formaldeído. Tensoativos aniônicos também adequados são sais ácidos da bile, por exemplo sais de sódio de ácido cólico ou ácido desoxicólico. Também adequados são fosfatos corres- pondentes, por exemplo sais do éster de ácido fosfórico de um aduto de p- nonilfenol com 4 a 14 moles de óxido de etileno; ou fosfolipídeos.

Tensoativos catiônicos adequados são sais de tetralquila amô- nio, por exemplo brometo de cetila trimetilamônio.

Tensoativos neutros adequados são alquila glicosídeos, por exemplo alquila-β-Ο glicopiranosídeos, alquila-β-ϋ tioglicopiranosidos, al- quila-β-ϋ maltosídeos contendo um radical alquila C6-C12. Tensoativos neu- tros adequados adicionais são glucamidas, por exemplo, N,N-bis(3-D- Gluconamidopropil)colamide, N,N-bis(3-D-Gluconamidopropil)-

desoxicolamida, N-metilglucamidas de ácido graxo contendo um radical acila C7-Ci2. Tensoativos neutros adequados adicionais são polioxietilenos mono- e polidispersos, por exemplo BRIJ®, GENAPOL®, LUBROL®, PLURONIC®, THESIT®, TRITON®, TWEEN®.

Tensoativos zwitteriônicos adequados são Ν,Ν,Ν-trialquila glici- nas, por exemplo N-n-dodecila-N,N,-dimetilglicina. Tensoativos zwitteriônicos adequado adicionais são alquila sulfonatos de ω-Ν,Ν,Ν-trialquilammônio, por exemplo 3-(N-alquila-N,N-dimetil)-1-propano-sulfonato contendo um radical alquila C8-Ci6. Tensoativos zwitteriônicos adequados adicionais são 3-[(3- colamidopropil)dimetilamônio]-1 -propano-sulfonato e 3-[(3-colamidopropil)- dimetilamônio ]-2-hidróxi-1 -propano-sulfonato.

Os tensoativos costumeiramente empregados na técnica de so- lubilização descritos, entre outros, nas publicações seguintes: Bhairi S.M. (1997) "A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Bio- chemistry", Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA; "1999 Internati- onal McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confecti- oner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, E.U.A.

O curso da reação é continuamente monitorado por métodos geralmente usados em pesquisa microbiológica.

A presente invenção também refere-se ao cultivo de microorga- nismos que são capazes de especificamente oxidar o álcool em posição 4" a uma cetona da fórmula (III), e a incubação disso com os ditos compostos em biorreatores, especialmente em biorreatores do tipo de reator de recipiente agitado. A fim de assegurar uma taxa ótima de formação de produto no fer- mentador de produção atual, é recomendado que os microorganismos antes de tudo sejam multiplicados em pré-culturas. O número de pré-culturas de fermentador depende da concentração de material de inoculação que é óti- mo em cada caso particular. Vantajosamente, dependendo dos microorga- nismos usados, as concentrações seguintes de material de inoculação são produzidos por um estágio de fermentador: bactéria 0,1-3%, fungos 5-10%, Actinomycetalos 5-10%.

A inoculação de fermentadores pequenos (até 20 L) é geral- mente realizada usando pré-culturas de frasco agitado. Neste caso o conte- údo do frasco total é usado para inocular o fermentador. O material de parti- da usado para a produção de pré-culturas é geralmente material de inocula- ção preservado o qual pode estar, por exemplo, na forma de liofilisatos, ou de material congelado ou armazenado a frio. O material de inoculação pre- servado usado dentro do objetivo da presente invenção é preferivelmente material armazenado a -80°C.

Multiplicação do material de inoculação é preferivelmente reali- zada em meios líquidos em frascos de vidro em uma máquina de agitação rotatória ou, quando usando esporos, em substratos de nutrientes sólidos. As condições relacionando a substratos de nutrientes e parâmetros de cultu- ra, tais como temperatura, pH, introdução de oxigênio entre outras, devem ser otimizadas de acordo com o microorganismo ou processo usado. O tem- po de crescimento para o material de inoculação preservado varia de poucas horas a vários dias dependendo do material de partida usado. Iiofilisados 3-10 dias

preservado congelado bactérias 4-18 horas

Actinomicetalos 1-5 dias fungos 1-7 dias

culturas armazenadas a frio bactérias 4-24 horas

Actinomicetalos 1-3 dias fungos 15 dias

Se esporos são usados como material de inoculação, os esporos de antes de tudo multiplicaram-se de material de inoculação preservado em substratos de nutrientes sólidos sob condições padronizadas (aeração esté- rila, câmara climática). Se substratos de nutrientes porosos baseados em turfa, farelo, arroz, ou cevada são usados, as culturas são agitadas cuidado- samente diariamente para alcançar altas densidades de esporos. Uma pos- sibilidade adicional encontra-se em cultivar o material de inoculação preser- vado em meios de nutrientes solidificados por ágar ou outros agentes de formação de gel costumeiros, sendo preferível usar meios de nutrientes que disparam a indução de formação de esporo.

O tempos de formação de esporo é de 7 a 30 dias dependendo do microorganismo usado e do meio nutriente usado.

Para inocular os fermentadores de pré-cultura ou produção, os esporos são ou suspensos com agentes ativos de superfícies, por exemplo uma solução de Tween80 (tensoativo, disponível de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO EUA), e transferida junto com seu meio de nutriente no fermenta- dor ou, se meios de nutrientes sólidos são usados, são lavados os substra- tos de nutrientes sólidos também usando ditos agentes ativos de superfície. A solução contendo esporro obtida neste mesmo modo é então usada para inocular os fermentadores. Preferivelmente, ambas recuperação dos esporos e a inoculação dos fermentadores sejam realizadas sob condições estéreis.

Para produzir compostos da fórmula (III) dentro do objetivo da presente invenção, biorreatores de várias dimensões, capacidades abran- gentes da ordem de 0,001 m3 a 450 m3, podem ser usados dependendo da quantidade de produto exigido.

Se biorreatores de recipientes agitados são usados, então os parâmteros de fermentação seguintes são para serem considerados como críticos para o curso da reação a ser ótima:

.1. Temperatura: A reação de oxidação biocatalítica dentro do objetivo do processo de acordo com a invenção é preferivelmente realizada no limite de temperatura mesofílico (limite de temperatura de 20°C a 45°C). O limite de temperatura ótimo para crescimento e formação de produto é de20°C a 32°C, especialmente de 24°C a 30°C.

.2. Aeração: A taxa de aeração é de 0,1 a 2,5 vvm (volume de ar por volume de líquido por minuto), preferivelmente de 0,3 a 1,75 vvm. A taxa de aeração deve, se necessário, ser adaptada a exigência de oxigênio ad- quirida no curso da fermentação.

3. Pressão: Reatores de recipiente agitados são geralmente ope- rados sob ligeiro excesso de pressão de 0,2 a 1,0 bar, preferivelmente de0,5 a 0,7 bar, a fim de reduzir o risco de contaminação.

4. Valor de pH pode variar dentro de certos limites dependendo do microorganismo usado. Se microorganismos do grupo Actimomicetos são usados, o valor de pH inicial é de pH 6 a pH 8, preferivelmente de pH 6,5 a pH 7,5.

Se fungos são usados, o pH inicial da solução de cultura é prefe- rivelmente de pH 4 a pH 8, especialmente de pH 6 a pH 7,5.

5. Agitação: A velocidade de agitação depende do tipo de agita- dor usado e o tamanho do fermentador. Dentro do objetivo da presente in- venção agitadores com propulsores do tipo de disco são preferidos os quais, com um tamanho de reator de recipiente agitado de 0,002m3, são operados em velocidades de 150 rpm a 550 rpm, especialmente de 200 rpm a 500 rpm.

Dentro do objetivo da presente invenção a duração da fermenta- ção varia de 20 h a 10 dias dependendo do microorganismo usado. A reação biocatalítica é descontinuada quando de aproximadamente 25% a cerca99,9%, mais preferivelmente de aproximadamente 50% a cerca de 99,9% e mais preferivelmente de aproximadamente 80% a cerca de 99,9% do subs- trato (compostos da fórmula (II)) adicionado no início tem sido convertido em compostos da fórmula (III).

Para verificar o tempo ótimo para término da reação de oxida- ção, o curso da reação é monitorado para toda a fermentação por processos de análise costumeira, especialmente processo cromatográficos, tais como, por exemplo, HPLC ou processos cromatográficos de camada fina.

Em uma modificação do processo delineado acima, o biorreator pode somente ser usado para gerar biomassa, a qual é então colhida por filtração ou centrifugação. A biomassa do microorganismo é então ou imedi- atamente usada como um biocatalisador para a conversão de compostos de fórmula (II) em compostos de fórmula (III) ou armazenados no frio ou como tais ou após secagem por congelamento ou atomização. Dito microorganis- mo, ou recentemente colhido ou armazenado como descrito, é então além disso distribuído a outros recipientes tais como, por exemplo, frascos preferi- velmente equipados com placas defletoras ou para biorreatores de recipiente agitado, onde o processo de bioconversão é realizado. O substrato (com- postos da fórmula (II)) é adicionado, pelo qual o microorganismo e a subs- tância a serem oxidados podem ser levados em contato um com o outro em qualquer modo. Para razões práticas, foi provado ser vantajoso adicionar o substrato, isto é um composto da fórmula (II), ao microorganismo em uma solução compensada, a qual não favorece proliferação. O substrato (com- postos da fórmula (II)) a ser oxidado pode ser usado, por exemplo, em forma de pó ou na forma de uma solução em ou um solvente adequado tal como aqueles descritos previamente aqui contidos.

Em uma concretização preferida da invenção o substrato (com- postos da fórmula (II)) é primeiro dissolvido em um solvente adequado tal como, por exemplo, dimetila sulfóxido ou Tween 40 (tensoativo, disponível de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO EUA) ou uma combinação de ambos, e adicionado a frascos de placa defletoras contendo uma solução compensa- dora, preferivelmente compensador de fosfato, mais preferivelmente um tampão de fosfato de 0,07 M pH 7,0. A solução restante é então esterilizada antes do biocatalisador (biomassa do microorganismo) ser adicionado. Esta mistura de reação é então incubada a temperatura ambiente e agitada entre100 rpm e 150 rpm, preferivelmente em aproximadamente 120 rpm por aproximadamente 2-7 dias, dependendo da cepa microbial.

Em uma concretização preferida adicional da invenção o subs- trato (compostos da fórmula (II)) é primeiro dissolvido em um solvente ade- quado tal como, por exemplo, dimetila sulfóxido ou Tween 40 (tensoativo, disponível de Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO EUA) ou uma combinação de ambos, e adicionado a frascos de placa defletoras contendo um meio de cul- tivação promovendo crescimento do microorganismo a ser usado para reali- zar a reação de oxidação desejada. A solução resultante é então esterilizada antes do biocatalisador (biomassa do microorganismo) ser adicionado. Esta mistura de reação é então incubada à temperatura ambiente e agitada entre .100 rpm e 150 rpm, preferivelmente em aproximadamente 120 rpm por aproximadamente 2-9 dias, dependendo da cepa microbial.

Em uma concretização específica adicional da invenção um ex- trato sem célula é preparado usando células úmidas, os quais são lavados em uma solução tamponada adequada, ressuspenso em compensador de disrupção e rompido por, por exemplo, meios mecânicos e uma temperatura de entre 2°C e 15°C, preferivelmente em uma temperatura entre 3°C e 6°C e mais preferivelmente a 4°C. A suspensão resultante é centrifugada e o ex- trato sem célula do sobrenadante é coletado.

Às soluções de extrato sem célula obtidas são adicionadas com- preendendo uma alíquota adequada de um sistema de fornecimento de elé- tron externo tal como, ferredoxina e ferredoxina reductase e substrato. Após a adição de substrato a mistura é preferivelmente imediatamente e cuidado- samente misturada e aerada. Então uma alíquota adequada de NADPH é adicionada e a mistura incubada em uma temperatura entre 15°C e 40°C, preferivelmente em uma temperatura de entre 20°C e 35°C e mais preferi- velmente a 30°C.

Processamento do caldo de fermentação a fim de recuperar o produto de oxidação (compostos da fórmula (III)) pode ser realizado por pro- cessos costumeiramente usados na técnica de fermentação (W. Crueger e A. Crueger, 1984; P. Pràve, 1984).

Antes de tudo, os constituintes particulares são removidos do caldo de reação usando filtros, centrífugas ou separadores, a serem extraí- dos separadamente do filtrado.

Se células vegetativas ou mortas são usadas como biocatalisa- dores, e se uma porção dos produtos de reação (compostos da fórmula (III) estão presentes dentro das células, as células devem ser desintegradas an- tes da extração. Para este propósito vários métodos de desintegração de célula estão disponíveis baseados em processos mecânicos, térmicos, quí- micos ou enzimáticos.

Métodos mecânicos adequados para uso no processo de acordo com a invenção são, por exemplo, moagem em moinhos de bola agitados ou moinhos de colóides, o uso de pressão e relaxamento em um homogeneiza- dor e desintegração celular pela ação de ultra-som. Processos não mecâni- cos incluem desintegração celular por secagem, quebra das células por cho- que osmótico, autólise química e quebra enzimática das células.

Uma vez os constituintes particulados têm sido removidos, os produtos de reação são concentrados extraindo a solução de cultura e os constituintes celulares separados com solventes adequados. Para extração existe também numerosos auxiliadores disponíveis que são costumeira- mente usados na técnica de fermentação, tal como, por exemplo, mistura- dor-sedimentador, colunas de contra-corrente, centrífugas de extração, entre outros.

É também possível concentrar os produtos de reação, por exemplo, por filtração de membrana, ultrafiltração, concentração por conge- lamento, processos de troca de íon, entre outros.

O processamento adicional do produto bruto obtido após a ex- tração pode ser realizado por métodos que são bem estabilizados em pes- quisa microbiológica e química e em uso industrial.

Estes processos incluem, por exemplo, métodos cromatográfi- cos, tais como cromatografia de adsorção, cromatografia de troca de íon, cromatografia de peneira molecular, cromatografia de afinidade, cromatogra- fia hidrófoba, cromatografia de divisão, cromatografia covalente e outros, mas além destes também vários processos de cristalização.

Solventes adequados para extração, ou como tais ou com mistu- ras disso são: hidrocarbonetos aromáticos tais como tolueno, misturas de xileno ou naftalenos substituídos, ftalatos tais como dibutila ftalato ou dioctila ftalato, hidrocarbonetos alifáticos tais como isômeros de hexano, heptano, octano e parafinas ou ciclohexano, álcoois e glicóis e seus éteres e ésteres, tais como metanol, etanol, 2-propanol, 1-butanol, terc-butanol, etileno glicol, metila terc- butila éter, etila acetato, monometila ou monoetila éter de etileno glicol, cetonas tais como acetona ou 2-butanona ou ciclohexanona, hidrocar- bonetos clorados tais como diclorometano ou clorofórmio ou tetracloreto de carbono. O termo "tensoativos" também será compreendido a incluir mis- turas de tensoativos. Ambos sabões solúveis em água e compostos ativos de superfície sintético solúvel em água são tensoativos aniônicos adequa- dos. Sabões adequados são os sais de metais alcalinos, sais de metais al- calinos-terrosos ou sais de amônio não-substituídos ou substituídos de áci- dos graxos superiores (C10-C22), por exemplo os sais de sódio e potássio de ácido oléico e esteárico, ou de misturas de ácidos graxos naturais os quais podem ser obtidos, por exemplo, de óleo de coco ou óleo de sebo. Tensoati- vos adequados adicionais são também os sais de metiltaurina de ácido gra- xo. Mais freqüentemente, entretanto, supostos tensoativos sintéticos são usados, especialmente sulfonatos graxos, sulfatos graxos, derivados de benz-imidazol sulfonados ou alquilarilsulfonatos. Os sulfatos ou sulfatos gra- xos estão geralmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos-terrosos ou sais de amônio não-substituídos ou substituídos e contém um radical alquila C10-C22 o qual inclui a porção alquila de radicais de acila, por exemplo o sal de sódio ou cálcio de ácido lignossulfônico, de dodecilsulfato, ou de uma mistura de sulfatos de álcool graxos obtidos de ácidos graxos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de adutos de álcool/óxido de etileno graxos sulfatados ou sulfonados. Os deri- vados de benzimidazol sulfonados preferível mente contém 2 grupos de ácido sulfônico e um radical de ácido graxo contendo 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos de alquilarilsulfonatos são os sais de sódio, cálcio ou tretanolami- na de ácido dodecilbenzenossulfônico, ácido dibutilnaftalenossulfônico, ou de um condensado de ácido naftlenossulfônico e formaldeído. Também ade- quados são fosfatos correspondentes, por exemplo sais do éster de ácido fosfórico de um aduto de p-nonilfenol com 4 a 14 moles de óxido de etileno; ou fosfolipídeos. Os tensoativos costumariamente empregados na técnica de formulação são descritos, entre outros, na publicação seguinte: "1986 Inter- national McCuthceon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, E.U.A.

Uma concretização preferida da invenção é um método para produzir 4"-oxo-avermectina aglutinando um biocatalisador tal como um mi- croorganismo capaz de converter avermectina a 4'-oxo-avermectina em contato com avermectina e isolando o 4"-oxo-avermectina produzida da mistura de reação.

Uma concretização da invenção é um método para produzir um composto de fórmula (III), o qual preferivelmente é 4"-oxo-avermectina, o qual compreende as etapas seguintes

(1) produção de células por inoculação de um meio de nutriente promovendo crescimento celular com pré-culturas de um microorganismos capazes de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fór-

mula (III), preferivelmente avermectina a 4"-oxo-avermectina;

(2) colheita das células após crescimento;

(3) dissolvendo um composto de fórmula (II), preferivelmente avermectina, em um solvente apropriado

(4) adição da solução de etapa (3), a um meio de reação o qual não promove proliferação celular

(5) adição de células de etapa (2) ao meio de reação de etapa

(6) sacudir ou agitar a mistura de reação da etapa (5) na presen-

(7) separação das células do meio

(8) extração do sobrenadante e das células com solventes apro-

(9) concentração das fases de solvente orgânico de etapa (8)

(10) purificação de um composto de fórmula (III), o qual preferi- velmente é 4"-oxo-avermectina, contido no extrato (9) por cromatografia ou

cristalização

Uma concretização preferida adicional da invenção é um método para produzir um composto de fórmula (III), o qual preferivelmente é 4"-oxo- avermectina, o qual compreende as etapas seguintes: (1) produção de células por inoculação de um meio de nutriente

promovendo crescimento celular com pré-culturas de um microorganismos capazes de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fór-

(4)

ça de ar

priados mula (III), preferivelmente avermectina a 4"-oxo-avermectina;

(2) colheita das células após crescimento;

(3) dissolvendo um composto de fórmula (II), preferivelmente avermectina, em um solvente apropriado

(4) adição da solução de etapa (3), a um meio de reação o qual não promove proliferação celular

(5) adição de células de etapa (2) ao meio de reação de etapa

(4)

(6) sacudir ou agitar a mistura de reação da etapa (5) na presen- ça de ar

(7) extração de caldo inteiro com um solvente apropriado

(8) separação de fase

(9) concentração das fases de solvente de etapa (8) a vácuo

(10) purificação de um composto de fórmula (III), o qual preferi- velmente é 4"-oxo-avermectina, contido no extrato (9) por cromatografia ou cristalização

Uma concretização preferida adicional da invenção é um método para produzir um composto de fórmula (III), o qual preferivelmente é 4"-oxo- avermectina, o qual compreende as etapas seguintes:

(1) dissolvendo um composto de fórmula (II), o qual preferivel- mente é avermectina, em um solvente apropriado

(2) adição da solução de etapa (1), a um meio de nutriente o qual não promove proliferação celular

(3) inoculação do meio de nutriente de etapa (2) com pré- culturas de um microorganismo capaz de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fórmula (III), preferivelmente avermectina a 4"-oxo- avermectina;

(4) cultivo de um microorganismo capaz de converter um com- posto de fórmula (II) a um composto de fórmula (III), preferivelmente aver- mectina a 4"-oxo-avermectina;

(5) separação das células do meio

(6) extração do sobrenadante e das células com solventes apro- priados

(7) concentração das fases de solvente orgânico de etapa (6) a

vácuo

(8) purificação de um composto de fórmula (III), a qual preferi- velmente é 4"-oxo-avermectina, contido no extrato (7) por cromatografia ou cristalização.

Uma concretização preferida adicional da invenção é um método para produzir um composto de fórmula (III), o qual preferivelmente é 4"-oxo- avermectina, o qual compreende as etapas seguintes:

(1) dissolvendo um composto de fórmula (II), o qual preferivel- mente é avermectina, em um solvente apropriado

(2) adição da solução de etapa (1), a um meio de nutriente pro- movendo crescimento celular

(3) inoculação do meio de nutriente de etapa (2) com pré- culturas de um microorganismo capaz de converter avermectina a 4"-oxo- avermectina;

(4) cultivação de um microorganismo capaz de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fórmula (III), preferivelmente avermectina a 4"-oxo-avermectina;

(5) separação das células do meio

(6) fase de separação

(7) concentração das fases de solvente orgânico de etapa (6) a

vácuo

(8) purificação de um composto de fórmula (III), a qual preferi- velmente é 4"-oxo-avermectina, contido no extrato (7) por cromatografia ou cristalização.

Em um segunda etapa puramente química o composto obtido da fórmula (III) pode ser reagido com uma amina da fórmula HN(R8)R9, onde R8 e R9 têm os mesmos significados como dados por fórmula (I), e o qual é co- nhecido, na presença de um agente redutor.

Os componentes da reação podem ser reagidos na ausência de um solvente, preferivelmente entretanto na presença de um solvente. Outra possibilidade consiste em realizar a reação em um excesso de uma das partes da reação, especialmente em uma amina líquida. Usualmente a adi- ção de um solvente ou diluente líquido inerte é entretanto vantajosa. Exem- plos de tais solventes ou diluentes são hidrocarbonetos aromáticos, alifáticos e alicíclicos e hidrocarbonetos halogenados, tais como benzeno, tolueno, xileno, mesitileno, tetralina, clorobenzeno, diclorobenzeno, bromobenzeno, petroléter, hexano, ciclohexano, diclorometano, triclorometano, tetracloro- metano, dicloroetano, tricloroeteno ou tetracloroeteno; ésteres, tais como ácido acético etilester; éteres, tais como dietiléter, dipropiléter, diisopropilé- ter, dibutléter, terc-butilmetiléter, etilenoglicolemonometiléter, etilenoglicole- monoetiléter, etilenoglicoledimetiléter, dimetoxidietiléter , tetrahidrofurano ou dioxano; cetonas, tais como acetona, metiletilcetona ou metilisobutilcetona; álcoois, tais como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenogli- col ou glicerina; amidas, tais como Ν,Ν-dimetilformamida, N1N- dietilformamida, Ν,Ν-dimetilacetamida, N-metilpirrolidona ou ácido triamida hexametila fosfórico; nitrilas, tais como acetonitrilo ou propionitrila; e sulfóxi- dos, tais como dimetilsulfóxido; ácidos orgânicos, tais como ácido acético; e água.

Solventes preferidos são éteres tais como tetrahidrofurano e eti- lenoglicoledimetiléter; especialmente tetrahidrofurano; álcoois tais como metanol, etanol ou iso-propanol; solventes halogenados tais como dicloro- metano ou dicloroetano; solventes aromáticos tais como benzeno ou tolue- no; nitrilas tais como acetonitrila, amidas tais como Ν,Ν-dimetilformamida, ácidos carbônicos tais como ácido acético; água; e misturas disso.

Solvente muito especialmente preferidos são metanol ou etanol ou misturas disso.

A reação é preferível mente realizada em um limite de pH entre O e 14, especialmente entre 2 e 10, em muitos casos entre 6 e 9, muito espe- cialmente em pH 9.

A reação é preferivelmente realizada em uma faixa de tempera- tura entre -80°C e +140°C, preferido entre -30°C e +100°C, em muitos casos entre -10°C e +80°C, especialmente entre 0°C e +50°C. Agentes redutores preferidos são hidretos tais como borohidre- tos; boranos; ácido fórmico; formiatos; ou hidrogênio. Especialmente preferi- do são hidretos tais como sodioborohidreto, zincoborohidreto, Iitioborohidre- to, sodiocianoborohidreto, sodiotriacetoborohidreto ou tetrametilamoniotria- cetoxiborohidreto. Especialmente é sodioborohidreto.

A reação pode ser realizada - onde aplicável - na presença de certos produtos químicos tais como catalisadores ou ácidos homogêneos ou heterogêneos. Especialmente adequados são ácidos tais como ácido clorí- drico, ácido p-toluenossulfônico, ácido acético, ácido propiônico, ácido tartá- rico ou ácido ftálico; ácidos de Lewis tais como por exemplo titaniotetraclo- reto, titaniotetraisopropilato ou cloreto de zinco; sais tais como por exemplo magnesioperclorato, sodioacetato, sódio-potassiotartrato, iterbiocloreto ou piridínio-p-tolueno-sulfonato; agentes absorventes de água tais como por exemplo sodiosulfato, peneira molecular ou sílica-gel; ou misturas disso. Agentes adicionais preferidos são ácidos tais como ácido acético, ácido pro- piônico ou ácido tartárico; preferido é ácido acético. Quando a redução é realizada com hidrogênio, a adição de um ou vários dos catalisadores ho- mogêneos ou heterogêneos adequados é vantajoso. Preferido tais catalisa- dores são catalisadores de metais heterogêneos os quais são conhecidos na técnica, preferivelmente catalisadores Ni-, Pt- ou Pd, especialmente catali- sador de Raney-níquel e Lindlar (Pd-CaCO3-PbO). Catalisadores homogê- neos adequados são especialmente complexos de Ródio tais como catalisa- dores de Wilkinsons (Cloro-tris-trifenila-ródio).

Os compostos de fórmula (I), em cada caso em forma livre ou em forma de sal, podem ser na forma de um dos isômeros possíveis ou na forma de uma mistura disso, por exemplo dependendo do número de átomos de carbono assimétricos na molécula e a configuração absoluta e relativa disso e/ou dependendo da configuração de ligações duplas não aromáticas na molécula eles podem estar na forma de isômeros puros, tais como antí- podos, e/ou diastereoisômeros, ou na forma de misturas de isômeros, tais como misturas de enantiômeros, por exemplo racematos, misturas de diaste- reoisômeros ou misturas de racematos; a invenção refere-se ambos a isô- meros puros e a todas as misturas possíveis de isômeros e este é para ser compreendido antes e nas partes que se seguem, mesmo se detalhes este- reoquímicos não estejam especificamente mencionados em cada caso.

Misturas de diastereoisômeros e misturas de racematos de compostos de fórmula (I), ou sais disso, obteníveis de acordo com o proces- so dependendo dos materiais de partida e procedimentos escolhidos ou por outros meios, podem ser separados na base das diferenças físico-químicas entre os constituintes nos diastereoisômeros ou racematos puros em modo conhecido, por exemplo por cristalização fracional, destilação e/ou cromato- grafia.

Misturas de enantiômeros, tais como recematos, assim obtení- veis podem ser resolvidas nos antípodos óticos por métodos conhecidos, por exemplo por cristalização de um solvente opticamente ativo, por cromato- grafia em adsorventes quirais, por exemplo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) em acetila celulose, via a formação de compostos de inclu- são, por exemplo usando éteres de coroa quiral, em qual caso somente um enantiômero é complexado, ou por conversão em sais diastereoisômeros, por exemplo por reação de um racemato de produto final básico com um ácido opticamente ativo tal como um ácido carboxílico, por exemplo ácido canfórico, tartárico ou málico, ou um ácido sulfônico, por exemplo ácido canforossulfônico, e separação da mistura resultante de diastereoisômeros, por exemplo na base de duas solubilidades diferentes por cristalização fraci- onal, nos diastereoisômeros dos quais o enantiômero desejado por ser li- bertado pela ação de agentes adequados, por exemplo básicos.

Fora da separação de misturas correspondentes de isômeros, é possível de acordo com a invenção obter diastereoisômeros ou enantiôme- ros também por métodos geralmente conhecidos de sínteses diastereosse- Ietivas ou enantiomerosseletivas, por exemplo realizando o processo de acordo com a invenção usando materiais de partida tendo uma estereoquí- mica correspondentemente adequada.

Os compostos das fórmulas (I) e (II), produtos de adição de áci- dos e os sais disso podem também ser obtidos na forma de seus hidratos e/ou podem incluir outros solventes, por exemplo solventes os quais podem ter sido usados para a cristalização de compostos ocorrendo em forma sóli- da.

A invenção refere-se àquelas formas do processo de acordo com o qual um composto obtenível como material de partida ou intermediário em qualquer estágio do processo é usado como material de partida e todas ou algumas das etapas restantes são realizadas, ou um material de partida é usado na forma de um derivado ou um sal e/ou seus racematos ou antípo- dos ou, especialmente, é formado sob as condições de reação. Compostos de fórmula (I) e (II) obteníveis de acordo com o pro-

cesso ou por outros meios podem ser convertidos em compostos diferentes de fórmula (I) e (III) em um modo conhecido per se.

No processo da presente invenção a esse respeito são preferi- velmente usados aqueles materiais de partida e intermediários, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, o qual resulta nos compostos de fórmulas (I) e (III), ou sais disso, descritos no início como sendo especial- mente valiosas.

No caso R9 é hidrogênio, a etapa de reação 2) pode ser dividida em duas etapas separadas, onde em uma primeira etapa, um composto da fórmula <formula>formula see original document page 36</formula>

no qual R1, R2lR3, R4, R5, R6lR7, R8, m, η, A, B, C, D, E e F têm os significa- dos dados para fórmula (I) acima é formado por reação de um composto de fórmula (III) com um composto de fórmula H2N(R8), onde R8 tem os mesmos significados como dado para fórmula (I) acima, e em uma segunda etapa, o dito composto da fórmula (IV) é reduzido de acordo com o procedimento de etapa 2) acima. As ditas duas etapas podem ser realizadas em uma pós- síntese sem isolar o composto da fórmula (IV); pode, entretanto, ser vantajo- so isolar o composto (IV), por exemplo por propósitos de purificação. Os compostos da fórmula (IV) são novos e são também um aspecto da presente invenção. EXEMPLOS

A invenção será, além disso, descrita por referência aos exem- plos detalhadas seguintes. Estes exemplos são fornecidos para propósitos de ilustração somente, e não são pretendidos a serem Iimitantes a não ser de outro modo especificado. A invenção refere-se especialmente aos pro- cessos de preparação descrito em Exemplos. Exemplo 1: Produção de Célula

.1.1 - Cepa de Streptomvces tubercidicus 1-1529

Pré-culturas de cepa 1-1529 (Streptomyces tubercidicus.; DSM-13135) são cultivadas em 20 500 ml de frascos Erlenmeyer defletores, cada um contendo 100 ml de meio 2, com agitação de orbital a 120 rpm a 28°C por 3 dias.

Estas culturas são usadas para inocular um fermentador de 50 litros contendo 40 I de meio 4. As células foram cultivadas a 28°C com uma aeração de 0,7 vvm (= 30 litros/min). A velocidade do agitador foi mantida entre 200 rpm e 300 rpm, guiada por um sensor de p02, para prevenir queda de p02 abaixo de 25%. Após 2 dias de cultivo, as células são colhidas por centrifugação, usando uma centrífuga de fluxo direto por meio de escoa- mento. 4,2 kg de células (molhada) são obtidos.

.1.2 - Cepa de Streotomvces tubercidicus R-922

Cepa de Streptomyces tubercidicus R-922 (DSM-13136) é culti- vada em uma placa de Petri em ágar ISP-5 (meio 5). Esta cultura é usada para inocular 4 500 ml frascos de agitação com defletor, cada um contendo100 ml de meio PHG (meio 6). Estas pré-culturas são cultivadas em um agi- tador orbital com 120 rpm a 28°C por 96h e então usado para inocular um fermentador de 10 litros equipado com um agitador mecânico e contendo 8 litros de meio PHG. Esta cultura principal é cultivada a 28° agitando a 500 rpm e uma aeração de 1,75 vvm (141/min) e uma pressão de 0,7 bar. No final do cultivo exponencial, após aproximadamente 20h, as células são colhidas por centrifugação. O rendimento de células molhadas é 70-80g/l de cultura. Por processamento adicional, as células molhadas podem ser estocadas a4o, preferivelmente não mais do que uma semana. Exemplo 2: Procedimento da Reação .2.1 - Cultura de Repouso .2.1.1 - Condições de Reação

.35,5 g de avermectina (tecn.) são dissolvidas em 1,05 I de dime- tila sulfóxido/Tween40 1:1. Esta solução é distribuída adicionando alíquotas de 25 ml a 42 frascos de Erlenmeyer de 3 L com defletor, cada um contendo .1 L de meio de reação. Estas soluções são esterilizadas a 121° por 20 min. Após resfriamento a temperatura ambiente, 100 g de células molhadas (fres- ca, ou estocada a 4°C por não mais do que 4 dias), como preparado em Exemplo 1.1 e 1.2, respectivamente, são adicionadas. Subseqüentemente estas misturas de reação são agitadas à temperatura ambiente com 120 rpm por 4-5 dias. Meio de reação

.0,5 g de melaço .0,5 g de MgCI2 .12,5 g de ZnCI2 .12,5 mg de MnCI2 · 4H20 .25 mg de CoCI2 · 6H20 .12,5 mg de NiCI2 · 6H20 .2,5 mg de CuCI2 · 2H20 .6,3 mg de NaMoO4 · 2H20 .0,15 ml de HCI 1M ajustar a 1 litro com tampão de fosfato 70 mM pH 6,0, autoclave. .2.1.2-Trabalho

As misturas de reação são centrifugadas em 500 ml de frascos de centrífuga de propileno a 4o C por 15 min a 13000 χ g.

Os sobrenadantes dos 40 I da misturas de reação são reunidos e extraídos duas vezes com metila terc-butila éter (0,5 vol. eq., 0,4 vol. eq.). As fases de metila terc-butila éter reunidas são então retroextraídas três ve- zes com 0,185 vol. eq. de água destilada. A fase de metila terc-butila éter é concentrada a vácuo no evaporador rotatótio. Secagem do resíduo rendem10-12 g de extrato S. As fases aquosas são descartadas.

As células centrifugadas de 120 a 132 frascos de centrífuga são extraídas como segue:

Células de 24 frascos de centrífuga são transferidas a um Er- Ienmeyer de 2L. Para cada frasco de Erlenmeyer são adicionados 80 g de diatomácia terrestre (Hyflo Supercell, purificada)e 1,2 L de acetona. Após mistura manual, a mistura é homogeneizada por meios de uma barra de agitação magnética grande. A polpa resultante é filtrada a vácuo através de papel a funila de Büchner de 20 cm 0 e lavado com acetona até eluição in- color. Assim filtrado C1 e torta de filtro C1 são obtidos.

Filtrado C1 é concentrado a vácuo em um evaporador rotatório para remover a acetona. A fase aquosa resultante é então extraída três ve- zes com 0,7 L de tolueno. As fases de tolueno combinadas são secas sobre sulfato de sódio anidro. Filtração e evaporação no evaporador rotatório a vácuo rende extrato C1.

Torta de filtro C1 é transferida a um frasco de Erlenmeyer de 2L e manualmente misturado com 1,5 L de tolueno. A mistura é homogeneizada por meios de uma grande barra de agitação magnética. A polpa resultante é filtrada a vácuo através de papel em um funila de Büchner de 20 cm 0 e la- vada com tolueno até eluição incolor. Filtrado C2 e bolo de filtro C2 são obti- dos. Torta de filtro C2 é descartada.

Filtrado C2 é concentrado a vácuo em um evaporador rotatório para render extrato C2 o qual é seco em alto vácuo.

Os extratos combinados C1 e C2 da mistura de reação de 40 L são secos am alto vácuo para render 30-35 g de extrato C.

.45 g de combined extracts S & C são cromatografados flash analogamente a descrição de Clark-Still e outros, em uma coluna arrumada com 1,5 kg de sílica-gel (Merck 60, 0,040-0,063 mm) por eluição com etila acetato:hexano 3:2 a 0,5 bar pressão de N2 e monitorando com cromatogra- fia de camada fina. O rendimento de 4"-oxo-avermectina- é 5,6g.2.2 - Culturas Proliferativas2.2.1 - Condições de Reação1 g de avermectina (tecn.) é dissolvida em 50 ml de dimetila sulfóxido/Tween40 1:1. Esta solução é distribuída adicionando alíquotas de2,5 ml a 20 frascos de Erlenmeyer com defletor de 500 ml cada um contendo100 ml de meio 4. Estas soluções são esterilizadas a 121° C por 20 min. Após resfriamento à temperatura ambiente, 5 ml de pré-cultura, como prepa- rado em Exemplo 1.1 e 1.2, respectivamente, são adicionadas. Subseqüen- temente estas culturas inoculadas foram incubadas a 28° C por 7 dias com agitação orbital a 120 RPM.

.2.2 - Trabalho

As misturas de reação são centrifugadas em frascos de centrífu- ga de polipropileno de 500ml a 4o C por 15 min a 13000 χ g e analogamente processadas como descrito em Exemplo 3. 252 mg de 4"-oxo-avermectina pura são obtidas.

.2.3 - Biocatálise Sem Célula

.2.3.1 - Preparação de extrato sem célula Soluções de Matéria-prima·.

Tampão PP: 50mM de K2HPO4ZKH2PO4 (pH 7,0) Tampão de ruptura: 50mM de K2HPO4ZKH2PO4 (pH 7,0), 5mM de benzamidina,2mM de ditiotreitol,0,5mM de Pefabloc (de Roche Diagnostics)

Substrato: 10mg de avermectina são dissolvidas em 1ml de iso-

propanol.

.6g de células molhadas, lavadas em compensador PP, são re- suspensas em 35ml de compensador de disrupção e rompidas em um pren- sa Francesa a 4°C. A suspensão resultante é centrifugada por 1 h a 35000 χ g. O extrato sem célula sobrenadante é coletado.

.2.3.2 - Desenvolvimento de um ensaio para atividade de enzima

Soluções de Matéria-prima:

Ferredoxina: solução de 5mg de ferredoxina (de espinafre) 1-3mg/ml em compensador Tris/HCI (de Fluka) ou solução de 5mg de ferredoxina (de Clostridium pas-

teurianum) 1-3mg/ml em compensador Tris/HCI. ou solução de 5mg de ferredoxina (de Porphyra umbilica- Iis) 1-3mg/ml em compensador Tris/HCI (de Fluka) FerrodixinaReductase: solução de 1mg ferredoxina reductase (de espi- nafre) 3,9U/mg em 1 ml de H2O (de Sigma) NADPH: 10OmM de NADPH em H2O (de Roche Diagnostics)

(todas soluções de matéria-prima foram armazenadas a -20°C, e quando em uso elas foram mantidas em gelo) Condições de HPLC: Instrumento de HPLC: Merck-Hitachi

Coluna de HPLC: 70x4mm, Kromasila 100 C18, 3,5μ (de Macherey-

Nagel), Suíça)

Solvente A: acetonitrila, contendo 0,0075% de ácido trifluoroacéti-

CO Solvente B: água, contendo 0,01% de ácido trifluoroacético fluxo: 1,5ml/min detecção: UV 243nm amostra: 30μΙ Tempos de retenção: avermectina B1a 3,18 min 4"-oxo-avermectina B1 a 4,74 min Tabela de bomba: 0,0 min 75% A 25% B gradiente linear a 7,0 min 100% A 0% B 9,0 min 100% A 0% B etapa a 9,1 min 75% A 25% B 12,0 min 75% A 25% B

Para 475 μΙ de extrato sem célula as soluções seguintes são adicionadas: 10μΙ de ferredoxina, 10μΙ de ferredoxina reductase e 1μΙ de substrato. Após a adição de substrato a mistura é imediatamente e cuidado- samente misturada e aerada. Então 5μΙ de NADPH são adicionados e a mistura incubada a 30°C por 30 min. Então 1 ml de metila-t-butila éter é adi- cionado a mistura de reação e cuidadosamente misturado. A mistura é cen- trifugada por 2 min a 14000 rpm, e a fase de metila-t-butila éter é transferida em um frasco de 10 ml e evaporada a vácuo por meios de um evaporador rotatório. O resíduo é dissolvido a 200 μΙ de acetonitrila e transferido em um frasco de vidro de amostra de HPLC. Em injeção de uma amostra de 30μΙ um pico apareceu a 4,74 min, indicando a presença de 4"-oxo-avermectina B1a. Uma massa de 870 Da pode ser verificada a este pico por espectrome- tria de massa de HPLC a qual corresponde ao peso molecular de 4"- oxo=avermectina B1a.

Quando analisando formação de produto por HPLC e espectro- metria de massa de HPLC, um segundo pico apareceu a 2,01 min corres- pondendo a cetohidrato de 4"-hidróxi-avermectina. Isto é uma indicação de o extrato sem célula converte avermectina por hidroxilação a 4"-hidróxi- avermectina da qual 4"-oxo-avermecitna é formada por desidratação.

A ferredoxina de espinafre pode ser substituída por, por exem- plo, ferredoxina da bactéria Clostridium pasteurianum ou da alga vermelha Porphyra umbilicalis, a qual também resulta na conversão biocatalítica de avermectina a 4"-oxo-avermectina. Exemplo 3: Cepas de Streptomvces

Cepas do gênero Streptomyces que podem ser usadas no pro- cesso de acordo com a invenção e seu relacionamento a cepas de S tuber- cidicus 1-1529 e R-922 baseado em uma análise de 16s rDNA pode ser vista da tabela seguinte: <table>table see original document page 43</column></row><table> Exemolo 4: Preoaração de 4"-Desóxi-4"-eD/'-ímetilamino)-avermectina B1 da

fórmula <formula>formula see original document page 43</formula>

onde R é metila e etila; .3 ml ácido acético em 30 ml de metanol são resfriados de 0 a5°C. Metilamina gasosa é adicionada até o pH da solução ser 9.

A 8,25 ml desta solução de metilamina é adicionado 0°C uma solução a 0°C de 1,0 g de 4"-Oxo-avermectina B1 em 6 ml de metanol. A mistura é permitida aquecer à temperatura ambiente e então agitada por um adicional de 50 minutos à temperatura ambiente. Então, 90 mg de hidreto de sódioboro em 2,5 ml de etanol são adicionados e a mistura resultante agita- da por outros 45 minutos. 10 ml de etilacetato são adicionados a mistura de reação, a fase orgânica extraída três vezes com solução de hidrogenocarbo- nato de sódio aquoso saturado, a fase orgânica separada e seca sobre sul- fato de sódio. O solvente é destilado rendendo 4"-Desoxi'4"-ep/-(metilamino)- avermectina B1. A pureza é sobre 90%. Literatura

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Literatura de Patente Citada" US-P-5.288.710 E P-A-736.252 EP-301.806 EP-401.029

DE-2.717.040

Claims (9)

1. Processo para preparação de um composto da fórmula (I) <formula>formula see original document page 50</formula> "nvO^rs (I) R7 no qual R1-R9 representam, independentemente um do outro hidrogênio ou um substituinte; m é 1; η é 0, 1, 2 ou 3; e as ligações marcadas com A, B1 C, D, E e F indicam, independentemente uma da outra, que dois átomos de carbono adjacentes estão conectados por uma ligação dupla, uma ligação simples, uma ligação simples e uma ponte de epóxido da fórmula <formula>formula see original document page 50</formula> da fórmula X0V H H2 H. C H , ou uma ligação dupla e uma ponte de metileno , incluindo, onde aplicável, um isômero E/Z, uma mistura de isômeros E/Z, e/ou um tautômero do mesmo, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que com- preende: (1) colocar em contato um composto da fórmula (II) <formula>formula see original document page 51</formula> R7 na qual Ri-R7, m, η, A, B, C, D, E e F têm os mesmos significados como dados para fórmula (I) acima, com um biocatalisador, que é capaz de especificamente oxidar o álcool na posição 4", a fim de formar um composto da fórmula (III) na qual Ri, R2>R3, R4, R5, R6>R7, m, η, A, B, C1 D, E e F têm os significa- dos dados para fórmula (I); e (2) reagir o composto da fórmula (III) com uma amina da fórmula HN(R8)Rg1 na qual R8 e R9 têm os mesmos significados como dado para fórmula (I), e o qual é conhecido, na presença de um agente redutor; e, em cada caso, se desejado, convertendo um composto de fórmula (I) obtenível de acordo com o processo ou por outro método, ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, em um composto diferente de fórmula (I) ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo, em cada caso em forma livre ou em forma de sal, se- parando uma mistura de isômeros E/Z obteníveis de acordo com o processo e isolando o isômero desejado, e/ou convertendo um composto livre de fór- mula (I) obtenível de acordo com o processo ou por outro método conhecido, ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo, em um sal ou convertendo um sal, obtenível de acordo com o processo ou por outro método, de um com- posto de fórmula (I) ou de um isômero E/Z ou tautômero do mesmo no com- posto livre de fórmula (I) ou um ou um isômero E/Z ou tautômero do mesmo ou em um sal diferente, sentativo do gênero Streptomyces selecionado do grupo consistindo na cepa de Streptomyces R-922, depositada sob número de acesso DSM-13136, e na cepa de Streptomyces 1-1529, depositada sob o número de acesso DSM- sendo que o referido biocatalisador é um microorganismo repre- .13135.

2. Processo para preparação de um composto da fórmula (III) <formula>formula see original document page 52</formula> na qual R-i, R2,R3, R4, Rs, Re,R7, m, η, A, B, C, D, E e F têm os significa- dos dados para fórmula (I), como definida na reivindicação 1; o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que com- preende: (1) colocar em contato um composto da fórmula (II) <formula>formula see original document page 53</formula> na qual Ri-R7, m, n, A, B1 C, D, E e F têm os mesmos significados como dados para fórmula (I) acima, com um biocatalisador, que é capaz de especificamente oxidar o álcool na posição 4", mantendo o dito contato por um tempo suficiente à rea- ção de oxidação ocorrer, e isolar e purificar o composto de fórmula (II), sendo que o referido biocatalisador é um microorganismo repre- sentativo do gênero Streptomyces selecionado do grupo consistindo na cepa de Streptomyces R-922, depositada sob número de acesso DSM-13136, e na cepa de Streptomyces 1-1529, depositada sob o número de acesso DSM- .13135.

3. Processo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um composto da fórmula (I), na qual η é 1; m é 1; A é uma ligação dupla; B é ligação simples ou uma ligação dupla; C é uma ligação dupla; D é uma ligação simples; E é uma ligação dupla; F é uma ligação dupla; ou uma ligação simples e uma ponte e- póxi; ou uma ligação simples e uma ponte de metileno; R1, R2 e R3 são H; R4 é metila; R5 é alquila C1-C10, cicloalquila C3-C8 ou alquenila C2-Ci0; R6 éH; RréOH; R8 e R9 são independentemente um do outro H; alquila C1-C10 ou acila C1-C10; ou juntos formam -(CH2)q-; e q é 4, 5 ou 6.

4. Processo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um composto da fórmula (I), na qual η é 1; m é 1; A, B1 C, E e F são ligações duplas; D é uma ligação simples; R1lR2 e R3 são H; R4 é metila; R5 é s-butila ou isopropila; R6 éH; R7 é OH; R8 é metil R9 é H.

5. Processo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para preparação de sal de benzoato de 4"-desóxi-4"-N- metilamino avermectina B1a/B1b.

6. Processo de acordo com reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o biocatalisador é selecionado do grupo consistindo em: a) um microorganismo vivo na forma de células vegetativas, cé- lulas em repouso ou células secas congeladas; b) os esporos do dito microorganismo; c) um microorganismo morto, preferivelmente em uma forma parcialmente desintegrada, isto é, com parede celular/membrana celular me- canicamente ou quimicamente ou por atomização permeabilizada; d) extratos brutos dos conteúdos de célula do dito microorga- nismo; e e) uma enzima que converte os compostos da fórmula (II) em compostos de fórmula (III).

7. Processo para produzir um composto de fórmula (III), caracte- rizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (1) produzir células por inoculação de um meio de nutriente pro- movendo crescimento celular com pré-culturas de um microorganismo capaz de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fórmula (III); (2) colher as células após crescimento; (3) dissolver um composto de fórmula (II) em um solvente apro- priado; (4) adicionar a solução da etapa (3) a um meio de reação o qual não promove proliferação celular; (5) adicionar células da etapa (2) ao meio de reação da etapa (4); (6) sacudir ou agitar a mistura de reação da etapa (5) na presen- ça de ar; (7) separar as células do meio; (8) extrair o sobrenadante e as células com solventes apropria- dos; (9) concentrar as fases de solvente orgânico da etapa (8); e (10) purificar um composto de fórmula (III) contido no extrato (9) por cromatografia ou cristalização; sendo que o referido microorganismo é representativo do gênero Streptomyces selecionado do grupo consistindo na cepa de Streptomyces R-922, depositada sob número de acesso DSM-13136, e na cepa de Strep- tomyces 1-1529, depositada sob o número de acesso DSM-13135.

8. Processo para produzir um composto de fórmula (III), caracte- rizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (1) dissolver um composto de fórmula (II) em um solvente apro- priado; (2) adicionar a solução da etapa (1) a um meio de reação o qual não promove proliferação celular; (3) inocular o meio de nutriente da etapa (2) com pré-culturas de um microorganismo capaz de converter um composto de fórmula (II), a um composto de fórmula (III); (4) cultivar um microorganismo capaz de converter um composto de fórmula (II) a um composto de fórmula (III); (5) separar as células do meio; (6) extrair o sobrenadante e as células com solventes apropria- dos; (7) concentrar as fases de solvente orgânico da etapa (6) a vá- cuo; e (8) purificar um composto de fórmula (III) contido no extrato (7) por cromatografia ou cristalização; sendo que o referido microorganismo é representativo do gênero Streptomyces selecionado do grupo consistindo na cepa de Streptomyces R-922, depositada sob número de acesso DSM-13136, e na cepa de Strep- tomyces 1-1529, depositada sob o número de acesso DSM-13135.

9. Processo de acordo com reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (II) é avermectina, e o composto de fórmula (III) é 4"-oxo-avermectina.