CZ20021616A3 - Příprava makrocyklického laktonu - Google Patents

Příprava makrocyklického laktonu Download PDF

Info

Publication number
CZ20021616A3
CZ20021616A3 CZ20021616A CZ20021616A CZ20021616A3 CZ 20021616 A3 CZ20021616 A3 CZ 20021616A3 CZ 20021616 A CZ20021616 A CZ 20021616A CZ 20021616 A CZ20021616 A CZ 20021616A CZ 20021616 A3 CZ20021616 A3 CZ 20021616A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
formula
compound
cells
streptomyces
formula iii
Prior art date
Application number
CZ20021616A
Other languages
English (en)
Inventor
Johannes Paul Pachlatko
Thomas Pitterna
Volker Jungmann
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of CZ20021616A3 publication Critical patent/CZ20021616A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy makrocyklického laktonu, způsobu přípravy meziproduktů a meziproduktů používaných při tomto způsobu.
Podstata vynálezu
Vynález se týká zvláště způsobu přípravy sloučeniny vzorce I
kde
Ri až Rg představují nezávisle na sobě atom vodíku nebo substituent;
m je 0, 1 nebo 2;
n je 0, 1, 2 nebo 3; a vazby označené písmeny A, B, C, D, E a F označují nezávisle na sobě, že dva sousední atomy uhlíku jsou spojeny dvojnou vazbou,
99
9 • · 9 9 9 9 • 99 · · · ·
9··· ·· * • · · · · · · • 9 · · · 9 ·· 999 99 999· jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou a epoxidovým můstkem vzorce nebo jednoduchou vazbou a methylenovým můstkem vzorce h2
H A H což zahrnuje ve vhodných případech i E/Z izomer, směs E/Z izomerů a/nebo jejich tautomery, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, kdy tento způsob zahrnuje
1) uvedení sloučeniny vzorce II kde
«» ·· • · * · • · · • 9 · • · · • · € · · ·
Ri až R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají tentýž význam jako ve výše uvedeném vzorci I, do kontaktu s biokatalyzátorem, který je schopen specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' tak, aby vznikla sloučenina vzorce III
R7 kde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7< m, n, A, B, C, D, E a F mají tentýž význam jako ve vzorci I; a
2) reakci sloučeniny vzorce III za přítomnosti redukčního činidla s aminem vzorce HN(Rg)R9, kde Rs a Rg mají tentýž význam jako ve vzorci I;
a ve všech případech, kdy je se to požaduje, přeměnu sloučeniny vzorce I získané tímto způsobem nebo jinou metodou nebo jejího E/Z izomeru nebo tautomeru, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli na odlišnou sloučeninu vzorce I nebo její E/Z izomer nebo tautomer, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, oddělení směsi E/Z izomerů získaných tímto způsobem a izolaci požadovaného izomeru a/nebo přeměnu volné sloučeniny vzorce I získané tímto způsobem nebo jinou metodou nebo jejího E/Z izomeru nebo tautomeru na sůl nebo přeměnu soli sloučeniny vzorce I nebo jejího E/Z izomeru nebo tautomeru získaného tímto způsobem, na volnou sloučeninu vzorce I nebo její E/Z izomer nebo tautomer nebo na jinou sůl.
Způsoby syntézy sloučeniny vzorce I jsou popsány v literatuře. Zjistilo se ale, že způsoby známé z literatury způsobují značné problémy během výroby, a to především proto, že se používají zdlouhavé postupy a dosahuje se nízkých výtěžků. Z tohoto pohledu známé způsoby nevyhovují, a proto bylo třeba vytvořit vhodný zlepšený způsob přípravy těchto sloučenin. Například v EP-A 0 465 121 se popisují 4''-keto- a 4''-amino-4''-deoxyavermectinové sloučeniny a jejich substituované aminoderiváty. 4''-hydroxylová skupina na avermectinových sloučeninách se oxiduje na ketoskupinu nebo se nahradí (substituovanou) aminoskupinou. Hydroxylové skupiny v polohách 5 a 23 je třeba chránit, aby se zabránilo nežádoucím oxidacím. 4''-ketosloučenina se aminuje za získání sloučeniny odpovídající vzorci I výše. Známé způsoby nejsou tedy uspokojivé v tom smyslu, že je potřeba vyvinout zlepšené způsoby přípravy těchto sloučenin.
Sloučeniny I, II a III se mohou vyskytovat ve formě tautomerů. Proto je třeba brát v úvahu, ačkoli to třeba později nebude v každém případě vyskytujícím se v textu výslovně uvedeno, že tam, kde je to vhodné, obsahují sloučeniny I, II a III i odpovídající tautomery.
Sloučeniny I, II a III jsou schopné tvořit adiční soli kyselin. Tyto soli se tvoří například se silnými anorganickými kyselinami, jako třeba minerálními kyselinami, například kyselinou chloristou, kyselinou sírovou, kyselinou dusičnou, kyselinou dusitou, kyselinou fosforečnou nebo kyselinou halogenovodíkovou, se silnými organickými karboxylovými kyselinami, jak nesubstituovanými tak substituovanými, například s alkánovými karboxylovými kyselinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku, které jsou substituované halogenem, například s kyselinou octovou, s nasycenými nebo nenasycenými dikarboxylovými kyselinami, například kyselí* « • · • · · · ·« ·· • · ♦ • · · · · · · · · ·· · • ···©·« © ♦·· · ·
5·· · ♦ · · · · · «· ·· ·· «♦· ·· ···♦ nou oxalovou, malonovou, jantarovou, maleinovou, mravenčí nebo ftalovou, s hydroxykarboxylovými kyselinami, například kyselinou askorbovou, mléčnou, jablečnou, vinnou nebo citrónovou nebo s benzoovými kyselinami nebo s organickými sulfokyselinami, buď nesubstituovanými nebo substituovanými, například s halogenovanými alkansulfonovými nebo arylsulfonovými kyselinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku, například methansulfonovou nebo p-toluensulfonovou kyselinou. Kromě toho jsou sloučeniny vzorců I, II a III obsahující alespoň jednu kyselou skupinu schopnou tvořit soli se zásadami. Vhodnými solemi vytvořenými se zásadami jsou například soli kovů, jako třeba soli alkalických kovů, soli kovů žíravých zemin, například sodné, draselné nebo hořečnaté soli nebo soli s amoniakem nebo organickým aminem, jako třeba morfolinem, piperidinem, pyrolidinem, mono-, di- nebo tri-alkylaminem obsahujícím nižší alkylové skupiny, například ethylpropylaminem, diethylpropylaminem, triethylpropylaminem nebo dimethylpropylaminem nebo mono-, di- nebo trihydroxyalkylaminem obsahujícím nižší alkylové skupiny, například monoethanolaminem, diethanolaminem nebo triethanolaminem. Kromě toho se mohou tvořit také odpovídající vnitřní soli. V rámci předkládaného vynálezu se dává přednost agrochemicky výhodným solím. Protože mezi sloučeninami vzorců I, II a III existuje úzká vazba, je třeba veškeré odkazy v textu, týkající se volných sloučenin vzorců I, II a III nebo jejich příslušných solí, chápat tak, že tam, kde je to vhodné a účelné, zahrnují také příslušné soli nebo volné sloučeniny vzorců I, II a III. Totéž platí i pro tautomery a soli sloučenin vzorců I, II a III. V každém případě je obecně výhodnější volná forma.
V rámci tohoto vynálezu je výhodný způsob přípravy sloučenin vzorce I, kde n je 1; m je 1;
A je dvojná vazba;
B je jednoduchá nebo dvojná vazba;
• 0
• 0 ·· 0 0 0 0 · 0 · · • · 0 * # · · 0 0 • · ····» 00 ♦
00000 0 »00 0 ·
0 0 0 «·0
00 «»· *· 00··
C je dvojná vazba;
D je jednoduchá vazba;
E je dvojná vazba;
F je dvojná vazba; nebo jednoduchá vazba a epoxidový můstek; nebo jednoduchá vazba a methylenový můstek;
Ri, R2 a R3 jsou atomy vodíku;
R4 je methyl;
R5 je alkyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, cykloalkyl obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo alkenyl obsahující 2 až 10 atomů uhlíku;
R6 je atom vodíku;
R7 je skupina -OH;
Rg a Rg jsou nezávisle na sobě buď atom vodíku; alkyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku nebo acyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku; nebo tvoří dohromady skupinu -(CH2)q-; a q je 4, 5 nebo 6.
Podle předkládaného vynálezu je zvláště výhodný způsob přípravy sloučeniny vzorce I, kde n je 1;
m je 1;
A, B, C, E a F jsou dvojné vazby;
D je jednoduchá vazba;
Ri, R2 a R3 jsou atomy vodíku;
R4 je methyl;
Rs je butyl nebo isopropyl;
R6 je atom vodíku;
R7 je skupina -OH;
Rg je methyl;
Rg je atom vodíku.
Nejvýhodnější je způsob přípravy emamectinu, obzvláště benzoanové soli emamectinu. Emamectin je směs 4''-deoxy-4''-N-methylaminavermectinu Bia/Bib a popisuje se v US-P-4, 4874, 749 a jako MK-244 v Journal of Organic Chemistry, Vol. 59 (1994), 7704—
7708. Agrochemicky zvláště významné soli emamectinu se popisují ·· · · · · · · · · ♦ * ·»·♦ • · · · ····· ·· *
7t 999999 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 «··
9 9 9 ·· « · O 9··» 99 9 9 v US-P-5, 288, 710. Sloučeniny vzorce I jsou významnými pesticidy, vhodnými zejména k hubení hmyzu a zástupců řádu Acarina. Zmiňovaní škůdci zahrnují například ty, kteří jsou uvedeni v Evropské patentové přihlášce EP-A 736, 252 na straně 5 v řádcích 55 až 58, na stranách 6 a 7 v řádcích 1 až 21. Škůdci, kteří jsou zde uvedení, tvoří součást předkládaného vynálezu.
Obecné termíny užívané v textu, mají, pokud není definováno jinak, následující významy:
Skupiny a sloučeniny obsahují 1 až 8 atomů uhlíku, s výhodou 1 až 6 atomů uhlíku, výhodněji 1 až 4 atomy uhlíku a nejlépe 1 nebo 2 atomy uhlíku.
Alkyl má buď přímý řetězec, jako například methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl nebo hexyl nebo rozvětvený řetězec jako například isopropyl, isobutyl, sekundární butyl, terciální butyl, isopentyl, neopentyl nebo isohexyl.
Alkenyl, ať jako skupina sama o sobě nebo jako strukturální část jiných skupin a sloučenin, například halogenalkenylu a arylalkenylu, má buď přímý řetězec, jako například vinyl, 1-methylvinyl, allyl, 1-butenyl nebo 2-hexenyl nebo je rozvětvený jako například isopropenyl, v každém případě se bere v úvahu počet atomů uhlíku obsažených v dotyčné skupině nebo sloučenině.
Cykloalkyl obsahující 3 až 6 atomů uhlíku je cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl nebo cyklohexyl, zejména cyklohexyl.
Další aspekty předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce III tak, jak byly definovány výše;
nebo způsob přípravy sloučeniny vzorce III ze sloučeniny vzorce II podle výše zmíněného kroku 1; nebo • 4
způsob přípravy sloučeniny vzorce I ze sloučeniny vzorce III podle výše zmíněného kroku 2.
Podle předkládaného vynálezu zahrnuje termín „biokatalyzátor:
a) živé mikroorganismy, například ve formě vegetativních buněk, klidových buněk nebo lyofilizovaných buněk,
b) spory zmíněných mikroorganismů,
c) mrtvé mikroorganismy, s výhodou v částečně desintegrované formě, tj. s buněčnou stěnou nebo buněčnou membránou, která je mechanicky, chemicky nebo vlivem sušení rozprašováním permeabilizována,
d) surové extrakty buněčného obsahu zmíněných mikroorganismů a
e) enzymy, které přeměňují sloučeniny vzorce II na sloučeniny vzorce III.
Pro způsob podle předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné bakterie a plísně. Vhodnými bakteriemi jsou zvláště zástupci kmene Actinomycetes, zvláště rodu Streptomyces. Výhodné jsou kmeny rodu Streptomyes vybrané ze skupiny skládající se ze skupiny tvořené mikroorganismy Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis; Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus a Streptomyces kasugaensis. Kmeny Streptomyces R-922 [Streptomyces tubercidicus) a obzvláště Streptomyces 1-1529 [Streptomyces tubercidicus) se osvědčily jako zvláště vhodné pro oblastně specifickou oxidaci hydroxydové skupiny nacházející se v pozici 4ZZ sloučeniny vzorce II.
Mikroorganismy Streptomycetes kmenů Streptomyces 1-1529 a Streptomyces R-922 byly uloženy 5. listopadu 1999 podle opatření Budapešťské dohody v DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheorder Weg 1 b, D - 38124 Braunschweig - Germany pod přírůstkovými čísly DSM-13135 a DSM-13136.
• «
Byly identifikovány i další kmeny, které se mohou vhodně využít k provádění oblastně specifické oxidace podle předkládaného vynálezu a které zahrnují například mikroorganismy Streptomycetes kmene MAAG-7027 (Streptomyces tubercidicus), Streptomycetes kmene DSM-40241 (Streptomyces saraceticus také určený jako Streptomyces chattanoogensis), Streptomycetes kmene NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp. lydicus) a Streptomycetes kmene A/961208710 (Streptomyces kasugaensis). Všechny výše uvedené kmeny jsou úzce příbuzné s mikroorganismy Streptomycetes kmenů Streptomyces 1-1529 a Streptomyces R-922, což lze dokázat 16s analýzou rDNA, jež vykazuje podobnost mezi 99,4% a 100%.
Sloučeniny vzorce I jsou známé jako vysoce aktivní prostředky pro hubení rostlinných škůdců. Sloučeniny vzorce II se používají jako výchozí látky při známých způsobech přípravy sloučenin vzorce I, jak se například popisuje v EP 301 806 a též v mikrobiálním způsobu přípravy podle předkládaného vynálezu.
Při známých způsobech se v prvním kroku chrání sloučeniny vzorce II před kyslíkem v pozici 5, pak se oxidují na 4''-keton, následně se přemění na amin a odstraní se chránící skupiny z chráněné hydroxylové skupiny v pozici 5, k tomu se využije obvyklých postupů zavádění a odstraňování chránících skupin, které jsou popsány Greenem a Wutsem, 1999 (Protective Groups in Organic Synthesis).
Výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je to, že se skládá jen ze dvou kroků, přičemž známé způsoby zahrnují kroky čtyři. Kromě toho se při něm nepoužívají chránící skupiny a díky menšímu množství použitých chemikálií je i ekologičtější. Sloučenina vzorce III, která vzniká, při biokatalytickém kroku podle tohoto vynálezu je známá například z EP 401 029.
Konkrétní provedení způsobu podle předkládaného vynálezu se může podrobně provádět následujícím způsobem:
V prvním kroku se připraví sloučeniny vzorce III. To se může provádět přímým kontaktem sloučeniny vzorce II s biokatalyzátorem, který je schopen specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' na keton vzorce III, tento kontakt se udržuje po dobu, která je dostatečná k tomu, aby se uskutečnila oxidační reakce.
Nejvýhodněji se způsob provádí tak, že se jako biokatalyzátor použije mikroorganismus, který je schopen provést oxidační reakci podle předkládaného vynálezu. Dotyčný mikroorganismus se s výhodou kultivuje ve vhodném kultivačním médiu, které podporuje množení mikroorganismů, při regulovaných podmínkách v přítomnosti sloučeniny vzorce II, doba společné kultivace dotyčného mikroorganismu a jeho substrátu musí být dostatečná k tomu, aby došlo k oxidační reakci, při níž by bylo s výhodou 25 až 99,9% přidané sloučeniny vzorce II přeměněno na sloučeniny vzorce III, výhodněji pak 50 až 99,9% a nejvýhodnšji 80 až 99,9%.
Způsob se může alternativně a výhodněji provádět tak, že se nejdříve ve vhodném kultivačnm médiu, které podporuje množení mikroorganismů a při regulovaných podmínkách vypěstuje mikroorganismus, který je schopen provádět oxidační reakci podle tohoto vynálezu a poté se pomocí vhodných metod, například pomocí filtrace nebo odstředění, získá biomasa tohoto mikroorganismu. Biomasa tohoto mikroorganismu se buď ihned použije jako biokatalyzátor přeměny sloučenin vzorce II na sloučeniny vzorce III nebo se může před použitím uchovat v chladu nebo se může zmrazit nebo vysušit rozprašováním. Tento mikroorganismus, buď čerstvé získaný a nebo uchovaný tak, jak bylo popsáno, a sloučenina vzorce II se pak společně inkubují v reakčním médiu, které nepodporuje množení mikroorganismů, po dobu dostatečnou k tomu, aby došlo k oxidační reakci, při níž by bylo s výhodou 25 až 99,9% přidané sloučeniny vzorce II přeměněno na sloučeniny vzorce III, výhodněji pak 50 až 99,9% a nejvýhodněji 80 až 99,9%.
•· ·« ·» ··*· ······* « · · · · · · · · · ♦ * ií * * ‘*ϊ ‘ * ΐ · · j J ,·
A 1 ·· · · * ·· ····«♦
Tímto způsobem získaný reakční produkt vzorce III se může od výchozí látky vzorce II oddělit bez velkých technických nákladů pomocí běžných separačních postupů, například frakční krystalizací nebo chromatografií. Chromatografie zahrnuje například sloupcovou chromatografií, chromatografií na silné vrstvě nebo chromatografií tenké vrstvě na minerálních nosičích jako třeba silikagelu nebo organických měničových pryskyřicích.
Místo vegetativních buněk se mohou použít mikrobiální spory, které se získají z mikroorganismů, jež jsou schopné specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' na keton vzorce III, a poté se inkubují se sloučeninou vzorce II po dobu dostatečnou k tomu, aby proběhla odpovídající oxidační reakce. Inkubace spor a substrátu se s výhodou provádí v nepřítomnosti kultivačního média, aby se předešlo pučení spor.
Podle tohoto vynálezu se jako substrát pro oxidační reakci používají sloučeniny vzorce II. Tyto sloučeniny jsou buď známé (viz DE 2717040) nebo se mohou připravit ze známých sloučenin obvyklými způsoby. Jsou vhodné k hubení škůdců zvířat a rostlin a kromě toho jsou cennými výchozími látkami nebo meziprodukty při přípravě sloučenin vzorce I. Příprava sloučenin vzorce III se může provádět i tak, že se k oxidaci sloučenin vzorce II použijí místo samotných mikroorganismů aktivní složky pocházející z těchto mikroorganismů (podle výše uvedených definic b až e), které jsou schopné specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' na keton vzorce III.
Podle dalšího aspektu se předkládaný vynález týká využití zmobilizované formy vegetativních buněk mikroorganismu, bezbuněčných extraktů, spor, enzymů a směsí enzymů těchto mikroorganismů, které jsou schopné specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' na keton vzorce III.
Imobilizace dotyčných biokatalyzátorů se může provádět známými způsoby. Podle předkládaného vynálezu se mohou uvést zvláště způsoby založené na adsorbční vazbě nebo iontové nebo kovalentní ·* ·· · · * 4 4 4 4 ♦ 1 * « · · · 4 · · · · vazbě dotyčných biokatalyzátorů na pevné, zpravidla ve vodě nerozpustné nosiče, na příčné vazbě biokatalyzátorů na bifunkční nebo polyfunkční činidla, na matriční enkapsulaci, membránové separaci nebo kombinaci dvou nebo více výše zmíněných způsobů.
Adsorbční vazba na nosiče, které nejsou rozpustné ve vodě (adsorbenty), se uskutečňuje především van der Waalsovými silami. Jako adsorbenty jsou vhodné mnohé anorganické a organické sloučeniny a také syntetické polymery.
Metody imobilizace mikroorganismů jsou popsány Bickerstaffem (Ed.), 1997 (imobilizace enzymů a buněk), van Haechtem a kol., 1985 (kvasinkové buňky/sklo), Blackem a kol., 1984 (kvasinkové buňky/ušlechtilá ocel, polyester), Wiegelem a Dykstrou, 1984 (klostridia/celulosa, hemicelulosa), Fórbergem a Hággstrómem, 1984 (klostridia/dřevěné hobliny) a Ehrhardtem a Rehmem, 1985 (Pseudomonas/aktivní uhlík).
Příslušné detaily pro použití enzymů imobilizovaných adsorbční vazbou se mohou najít mimo jiné i v publikacích Krakowiak a kol., 1984 (glukoamylasa/oxid hlinitý), Cabral a kol., 1984 (glukoamylasa/sklo aktivované titanem), Miyawaki a Wingard, 1984 (glukosaoxidasa/aktivní uhlík), Kato a Horikoshi, 1984 (glukosatransferasa/syntetická pryskyřice). Iontové vazby jsou založené na elektrostatické přitažlivosti mezi opačně nabitými skupinami nosiče (třeba komerčně dostupnými měniči iontů, založenými například na polysacharidech nebo syntetických pryskyřicích) a vázaným biokatalyzátorem.
Metody imobilizace založené na iontové vazbě jsou popsány DiLucciem a Kirwanem, 1984 (rod Azobacter/Cellex E (celulosa))a Giardem a kol., 1977(zvířecí buňky/DEAE-Sephadex). Odpovídající imobilizace enzymů se může provádět podle Angelina a kol., 1985 (aldehydoxidasa/oktylamino-Sepharosa 4B), Hofstee, 1973 (laktátdehydrogenasa/oktylamino-Sephadex), Kúhna a kol., 1980 (glukosaoxidasa/DEAE-Sephadex, DEAE-celulosa) a dalších.
φ-φ ** ·«··♦· φφ ·'· ♦ φ φ φ φφφ «φφφ
ΦΦΦΦ ΦΦΦ·· φφ * ο Φ Φ ·ΦΦ ·♦· * » · < *
Φ··##»*·· •φ ·· φ· Φ·· ·* φφφ*
Další metody imobilizace jsou založené na využití kovalentních vazebných sil, které zpravidla způsobují pevné spojení mezi biokatalyzátory navzájem nebo mezi biokatalyzátorem a nosičem. Vhodnými nosiči jsou porézní materiály, jako například sklo, oxid křemičitý nebo další nerozpustné anorganické materiály.
Podle způsobu podle předkládaného vynálezu mohou být mikroorganismy imobilizovány, například podobně jako u Messinga a Oppermanna, 1979 (Enterobactera/borokřemičitanové sklo; kvasikové buňky/oxid zirkoničitý), Romanovskeho a kol., 1981 (methanové bakterie/Silochrom), Navarry a Duranda, 1977 (kvasinkové buňky/porézní křemen).
Imobilizace enzymů se může provádět způsobem popsaným Weetallem a Masonem, 1973 (papain/porézní sklo) a Monsanem a kol., 1984 (invertasa/porézní křemen).
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou jako nosiče vhodné nejen již zmiňované nosiče, ale také i celá řada přírodních nebo syntetických polymerů jako například celulosa, dextran, škrob, agarosa a další nebo polymery, například polymery založené na akrylových nebo metakrylových derivátech kyselin, které se obvykle používají při výrobě reaktivních kopolymerů. Vhodnými reaktivními skupinami, jejichž prostřednictvím se tvoří vazba biokatalyzátoru, jsou reaktivní dinitrofluorofenylové nebo isothiokyanatanové skupiny nebo především oxiranové skupiny a skupiny anhydridů kyselin. Další možnost představuje chloridová aktivace pryskyřic, které nesou karboxylové skupiny a které jsou komerčně dostupné, například pod obchodním názvem Amberlite®XE64 a Amberlite®IRC-50.
Imobilizace mikroorganismů pomocí přírodních nebo syntetických nosičů se může provádět stejným způsobem jak popsal Chipley, 1974 (Bacillus subtilis/agarosa), Gainer a kol., 1980 (rod Azobacter/celulosa), Jack a Zajic, 1977 (Micrococcus/karboxymethylcelulosa), Jirku a kol., 1980 (kvasinkové buňky/hydroxyalφφ φφ • φ φ φ • φ * kylmetakrylát) a Shimizu a kol., 1975 (bakteriální buňky/kopolymer ethylenu a anhydridu maleinu). Imobilizace enzymů se může provádět například podle Cannona a kol., 1984 (laktátoxidasa/celulosa), Dennise a kol., 1984 (chymotrypsin/Sepharosa), Ibrahima a kol., 1985 (epoxyhydrolasa/dextran), Beddowse a kol., 1981 (agalaktosidasa/kopolymer nylonu a akrylátu), Raghunatha a kol., 1984 (ureasa/methylakrylakrylát).
V procesu tvorby příčných vazeb jsou biokatalyzátory navzájem vázány bifunčními nebo polyfunkčními činidly, mezi jinými například glutardialdehydem nebo diisokyanáty, a tvoří charakteristické, nerozpustné, obvykle želatinové vysokomolekulární agregáty.
Takové imobilizace mikroorganismů se mohou provádět podle De Rosy a kol., 1981 (bakteriální buňky/zesítění vaječného albuminu pomocí glutardialdehydu). Způsoby imobilizace enzymů, které se mohou použít podle předkládaného vynálezu, jsou popsány Barbaricem a kol. 1984 (invertáza/zesítění kyselinou adipovou a dihydrazinem), Talskym a Gianitsopoulosem, 1984 (chymotrypsin/ peptidová vazba mezi molekulami enzymu bez síťovacího činidla), Workmanem a Dayem, 1984 (inulinasa/zesítění buněk obsahujících enzymy glutardialdehydem), Khanem a Siddiqim, 1985 (pepsin/zesítění glutaraldehydem), Bachmannem a kol., 1981 (glukosaisomerasa/zesítění želatiny pomocí glutardialdehydu), Kaulem a kol., 984 (a-galaktosidasa/zesítění s vaječným albuminem pomocí glutardialdehydu).
Matriční enkapsulace zahrnuje uzavření biokatalyzátoru do přírodních nebo syntetických polymerů, které mají většinou želatinovou strukturu. Obzvláště vhodnými matričními materiály pro uzavření buněk, organel a spor jsou přírodní polymery jako třeba alginát, carrageenan, pektin, agar, agarosa nebo želatina, a to proto, že tyto sloučeniny nejsou toxické a chrání buňky během manipulace. Vhodné jsou též syntetické polymery, mezi jinými třeba polyakrylamidy nebo fotozesítěné pryskyřice.
Uspořádání matriční enkapsulace je proměnné v široké škále a může obsahovat například sférické, cylindrické, vláknité nebo pruhové uspořádání. Imobilizace mikroorganismů pomocí přírodních nebo syntetických matričních materiálů se může provádět tak, jak popsal Mazumder a kol., 1985 (bakteriální buňky/světelně zesítěné pryskyřice), Bettmann a Rehm, 1984 (bakteriální buňky/hydrazin polyakrylamidu), Umemura a kol., 1984 (bakteriální buňky/carrageenan), Karube a kol., 1985 (bakteriální protoplasty/ agar-acetylcelulosa), Cantarella a kol., 1984 (kvasinkové buňky/ hydroxyethylmetakrylát), Qureshi a Tamhane, 1985 (kvasinkové buňky/alginát), Deo a Gaucher, 1984 (Hyphomycetes/carrageenan), Eikmeier a Rehm, 1984 (Hyphomycetes/
Alginát), Bihari a kol., 1984 (konidie Hyphomycetes/polyakrylamid), Vogel a Brodelius, 1984 (rostlinné buňky/alginát, agarosa), Nakajima a kol., 1985 (rostlinné buňky/agar, alginát, carrageenan).
Imobilizace enzymů se může provádět obdobně jako u Moriho a kol., 1972 (aminoacylasa/polyakrylamid).
Membránová separace zahrnuje vytvoření specificky definovaných oblastí, v nichž probíhá reakce. Základní způsoby membránové separace se rozlišují následujícím způsobem:
a) mikroenkapsulace
b) lipozomální techniky
c) použití biokatalyzátorů v membránových reaktorech.
Výše popsané způsoby imobilizace lze navzájem kombinovat, jako například adsorbci a zesítění. V tomto případě se nejdříve enzymy adsorbují na nosič a pak se navzájem zesítí pomocí bifunkčního činidla.
Inkubace mikroorganismů, použitých podle předkládaného vynálezu, se sloučeninami vzorce II, při níž probíhá specifická oxidace alkoholu v pozici 4'' na keton vzorce III, se může provádět
• · · · · ·· ♦
běžnými způsoby používanými mikrobiologii. Kromě třepaných kultur lze jmenovat zvláště různé fermentační metody, které se již dlouhou dobu používají v mikrobiálních výzkumech a průmyslové výrobě.
V bioreaktorech je hlavním úkolem vytvoření optimálních hydrodynamických podmínek, aby došlo ke snížení Michaelisovy konstanty a zvýšení reakční rychlosti.
Toho se dosáhne udržováním přiměřeného relativního pohybu biokatalyzátoru a okolního média, což zvyšuje externí převod hmoty do takové výše, že se ve skutečnosti neuplatňují už žádné překážky.
Mezi typy reaktorů, které jsou vhodné pro tento proces, patří například míchané nádoby, cyklické reaktory, reaktory typu lože a fluidního lože, membránové reaktory a množství speciálních typů reaktorů, mezi jinými například sítové míchané reaktory, kosodélníkové reaktory a trubkové reaktory (W. Hartmeier, ImmobilisierteBiokatalysatoren, 1986; W. Crueger a A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Pravé a kol., Handbuch der Biotechnologie, 1984). Podle předkládaného vynálezu mají přednost míchané nádoby.
Reaktory typu míchaných nádob jsou při biotechnologickém způsobu fermentace nejpoužívanějším typem reaktorů. Tento typ reaktoru má vysokou míchací kapacitu a vysokou kapacitu přenosu kyslíku, proto zaručuje rychlé a dokonalé promíchávání substrátu a biokatalyzátoru.
Výhodou míchaných nádob je jejich jednoduchá a tudíž ekonomická konstrukce a dobře prozkoumané vlastnosti.
Pokud se používají míchané nádoby, jsou v podstatě možné dva způsoby provozu: první je způsob provozovaný „batch (vsádkovým) způsobem, takzvaný „batch proces a druhý je kontinuální proces.
*♦ • · · · · 4 · • 9 · ♦ · · 9 * • 9 · · 9 9 9 ·· ··* *· ····
Při „batch procesu se po ukončení procesu biokalalyzátor odstraní separací nebo filtrací a buď se zlikviduje (vegetativní buňky) nebo se znovu použije v dalším „batch procesu (imobilizované biokatalyzátory).
Pokud se používá kontinuální proces, dochází k ustavičné nepřetržité výměně nového substrátu za konečný reakční produkt. Pomocí vhodných opatření se musí zabránit úniku biokatalyzátorů z reaktoru (sítka, filtry, zpětná zařízení).
Podle předkládaného vynálezu se kultivace vegetativních mikroorganismů provádí podle obecně známých obvyklých metod, z důvodu přístupnosti se přednostně užívají kapalná živná média.
Složení živného média se liší v závislosti na použitém mikroorganismu.
Obecně mají přednost komplexní média obsahující obtížně definované a snadno využitelné zdroje uhlíku (C) a dusíku (N), taková, jaká se obvykle používají i pro výrobu antibiotik.
Kromě toho jsou nezbytné vitamíny a esenciální kovové ionty, které jsou zpravidla obsaženy v odpovídající koncentraci v použitém komplexním živném médiu jako jeho součásti nebo jako nečistoty. Pokud je to žádoucí, mohou se tyto součásti, například esenciální vitamíny a také ionty Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4+, (SO4)2-, Cl”, (CO3)2” a stopové prvky, mezi jinými kobalt, mangan a zinek, přidat ve formě jejich solí. Kromě kvasinkových extraktů, kvasinkových hydrolyzátů, kvasinkových autolyzátů a kvasinkových buněk jsou zvláště výhodnými zdroji dusíku zejména sojová mouka, kukuřičná mouka, ovesná mouka, edamin (enzymaticky odbouraný laktalbumin), pepton, hydrolyzát kaseinu, kukuřičné vyluhovací kapaliny a masové extrakty.
Výhodná koncentrace uvedených zdrojů dusíku je 0,1 až 6 g/1. Vhodnými zdroji uhlíku jsou zvláště glukosa, laktosa, sacharosa, dextrosa, maltosa, škrob, cerelosa, celulosa, mannitol, sladový
4 4 4 4*4 4 * « 4 • «· « «4 4 ί ! ·*ί · ί ί ί * J !
44 44 ··* 4* extrakt a melasa. Výhodné koncentrační rozpětí uvedených zdrojů uhlíku se pohybuje od 1,0 do 25 g/1. Z důvodu oxidačního procesu, který je popsán dále, je výhodné použít jako zdroj uhlíku D-glukosu, rozpustný škrob nebo sladový extrakt a také cerelosu, a to zvláště tehdy, když jsou použité mikroorganismy zástupci rodu Streptomyces. Pro zástupce rodu Streptomyces jsou proto příkladně vhodná následující kultivační média:
Médium 1
1,0 g rozpustného škrobu
0,2 g peptonu
0,2 g kvasinkového exraktu se doplní do 1 litru destilovanou vodou, pH se upraví pomocí NaOH na hodnotu 7 a steriluje se v autoklávu.
Médium 2
4,0 g D-glukosy
10,0 g sladového extraktu
4,0 g kvasinkového extraktu se doplní do 1 litru vodou, pH se upraví pomocí NaOH na hodnotu 7 a steriluje se v autoklávu.
Médium 3
20,0 g dextrinu
10,0 g soytonu (Difco Manual, 9th ed., Deitroit, Difco Laboratories, 1969)
2,0 g (NH4)2SO4 2,0 g CaCO3 se doplní do 1 litru vodou, pH se upraví pomocí NaOH na hodnotu 7 a steriluje se v autoklávu.
♦ · · 0 · 0 » • · · 0 0 * ♦ 0 0 • 000000 0 *
0 0 0 0 ·
0 0 0 0 0 0 · « • 0
Médium 4
10,0 g D-glukosy
10,0 g skladového extraktu
3,0 g kvasinkového extraktu
10,0 g Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton Oil Co., Memphis TN, USA)
1,0 g masového extraktu se doplní do 1 litru vodou, pH se 7 a steriluje se v autoklávu.
upraví pomocí NaOH na hodnotu
Médium 5 (ISP-2 agar) kvasinkový extrakt Hampshire, England)
D- ( + )-glukosa bakteriálně-sladový extrakt agar g (Oxoid Ltd, Basingstoke, g
g (Difco No. 0186-17-7) g (Difco No. 0140-01) se rozpustí vil demineralizované vody a pH se upraví na 7,0. Roztok se steriluje 20 minut při 121 °C, ochladí se a po krátkou dobu, která je potřebná k bezprostřední přípravě agarových ploten, se uchovává při 55 °C.
Médium 6 (PHG médium) pepton 10 g kvasinkový extrakt 10 g
D-( + )-glukosa 10 g
NaCl 2 g
MgSO4-7H2O 0,15 g
NaH2PO4-H2O 1,3 g
K2HPO4 4,4 g se rozpustí v 1 litru demineralizované vody a pH se upraví na 7,0.
>« α· ·· ···· ·· ·*
9 9 9 9 9 9 ·♦·· ···« · 9 9 99 9 9 9 9 · 999 999 9999 · • · 9 9 9 9 9 9 9 99 99 99 999 99 9999
Výše zmiňovaná média se také výborně hodí pro kultivaci zástupců rodu Streptomyces a pro provádění oxidační reakce. Jak obecné údaje o složení médií, tak i média, která jsou na tomto místě podrobně uvedena, slouží pouze pro ilustraci předkládaného vynálezu a nejsou nijak omezující.
Nezávisle na složení média hraje důležitou roli i způsob přípravy média, mezi jinými například postup rozpouštění nebo suspendace, sterilace živného roztoku jako celku nebo sterilace jednotlivých složek, ochrana před kontaminací, a je třeba jej optimalizovat v souladu ke způsobu produkce.
Zároveň by se mělo počítat s tím, že sterilace může způsobit změnu hodnoty pH živného média a také vysrážení.
Zbývající způsoby kultivace také odpovídají způsobům běžně užívaným pro kultivaci mikroorganismů.
V malém měřítku jsou fermentace i předkultivace, prováděné v rámci předkládaného vynálezu, obvykle ve formě třepaných kultur, v tomto případě je výhodné použít skleněné baňky o objemu 0,1 až 5 litrů, s výhodou o objemu 0,5 až 5 litrů, které obsahují 0,05 až 2 litry, s výhodou 0,1 až 2 litry živného média. Baňky jsou s výhodou opatřené vatovým uzávěrem. Po sterilaci v autoklávu a úpravě pH na hodnoty od 4 do 8 stupňů pH, především na pH od 7,0 až 7,5 (bakterie) nebo na hodnoty od pH 6 do pH 7,5 (plísně), jsou baňky za sterilních podmínek naočkovány odpovídající mikrobiální kulturou. Použitým očkovacím materiálem je zpravidla předpěstovaná kultura, která byla vypěstována ze zmrazeného očkovacího materiálu v souladu s údaji uvedenými níže.
Kultury, včetně předpěstovaných kultur, se s výhodou pěstují za aerobních podmínek při teplotě od 25 °C do 37 °C, výhodněji od 26 °C do 30 °C, ale zvláště při 28 °C, za pravidelného protřepávání mezi 80 až 300 rpm, s výhodou mezi 100 až 250 rpm, ale zvláště při 120 rpm (otáčky za minutu) na rotační třepace. Optimální • 4 ·«·· · * · · • · « » · · * « « ♦·· · « 4 ·«« ···· · • · · » · · ·· ··· *♦ ··♦· oxidační aktivity se za výše uvedených podmínek pro rod Streptomyces obecně dosáhne při kultivaci trvající 1,5 až 7 dní.
Jakmile je katalytická kapacita buněk dostatečně vysoká k tomu, aby mohla proběhnout požadovaná oxidační reakce, s výhodou po 40 hodinách, přidá se substrát (sloučenina vzorce II), tím se mikroorganismy a látky, které mají být oxidovány, dostanou navzájem do kontaktu. Z praktických důvodů se ukázalo, že je výhodné přidávat substrát, tj. sloučeninu vzorce II, k mikroorganismům v živném médiu.
Látky, které se mají oxidovat, se mohou použít například ve formě prášku nebo ve formě roztoku buď ve vhodném rozpouštědle jako například dimethylformamidu, acetonu, dimethylsulfoxidu, Nmethyl-2-pyrrolidonu nebo v alkoholovém rozpouštědle jako třeba v methanolu, ethanolu, isopropanolu nebo terciálním butanolu nebo etherových rozpouštědlech jako například tetrahydrofuranu nebo 1,4 dioxanu (od 0,5 do 15 % obj., s výhodou 2 % obj.) nebo esterových rozpouštědlech jako třeba ethylacetátu nebo uhlovodíkových rozpouštědlech jako třeba oktanu nebo cyklohexanu nebo toluenu nebo xylenu nebo ve směsi vhodných rozpouštědel a vhodných povrchově aktivních látek. Termín „povrchově aktivní látka zahrnuje iontové, neiontové a ionové povrchově aktivní látky a chápe se tak, že zahrnuje i směsi povrchově aktivních látek.
Vhodnými aniontovými povrchově aktivními látkami jsou jak ve vodě rozpustná mýdla tak i ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní látky. Vhodnými mýdly jsou soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo nesubstituované nebo substituované amonné soli vyšších mastných kyselin (obsahujících 10 až 22 atomů uhlíku), například sodná nebo draselná sůl kyseliny olejové nebo stearové nebo směsi přirozených mastných kyselin, které se mohou získat například z kokosového oleje nebo lojového oleje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními látkami jsou také methyltaurinové soli mastných kyselin. Častěji se však používají ·· 44 4» 9 44* ** ··
444» »44 4 4 4 4 • 44 4 4 4444 >4 4 · · ··· 444 4*44 4
XX 44 4 44 * 444
44 44 444 ·♦ 4444 takzvané syntetické povrchově aktivní látky, zvláště mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfonované deriváty benzimidazolu nebo akrylarylsulfonáty. Mastné sulfonáty nebo sulfáty jsou obvykle ve formě solí kovů alkalických zemin nebo nesubstituovaných nebo substituovaných amonných solí a obsahují alkylovou skupinu obsahující 10 až 22 atomů uhlíku, což také zahrnuje alkylovou polovinu acylových skupin, např. sodnou nebo vápennou sůl kyseliny ligninsulfonové, dodecylsulfátu nebo směsi sulfátů mastných alkoholů a adičních sloučenin sulfonovaných mastných kyselin a ethylenoxidu. Sulfonované deriváty benzimidazolu s výhodou obsahují 2 sulfonové kyselé skupiny a jednu skupinu mastné kyseliny obsahující 8 až 22 atomů uhlíku. Příkladem alkylarylsulfonátů jsou sodné, vápenné nebo triethanolaminové soli kyseliny dodecybenzensulfonové, kyseliny dibutylnaftalensulfonové nebo kondenzátu naftalensulfonové kyseliny a formaldehydu. Dalšími vhodnými aniontovými povrchově aktivními látkami jsou soli žlučové kyseliny, např. sodná sůl kyseliny cholové nebo deoxycholové. Vhodné jsou také odpovídající fosforečnany, např. soli fosforečného esteru adiční sloučeniny p-nonyfenolu se 4 až 14 moly ethylenoxidu; nebo fosfolipidy.
Vhodnými kationtovými povrchově aktivními látkami jsou tetraalkylamonné soli, např. bromid cetyltrimethylamonný.
Vhodnými neutrálními povrchově aktivními látkami jsou alkylglykosidy, např. alkyl-E-D-glukopyranosa, alkyl-E-D-maltosidy obsahující alkylovou skupinu, která obsahuje 6 až 12 atomů uhlíku. Dalšími vhodnými neutrálními povrchově aktivními látkami jsou glukamidy, např. N,N-di(3-D-glukonaminopropyl)chloramid, Ν,Νdi (3-D-glukonamidopropyl) deoxycholamin, mastné kyseliny N-methylglukamidů obsahující acylový radikál, který obsahuje 7 až 12 atomů uhlíku. Dalšími vhodnými neutrálními povrchově aktivními látkami jsou mono- a polydisperzní polyoxyethyleny, např. BRIJ®, GENAPOL®, LUBROL®, PLURONIC®, THESIT®, TRITON®, TWEEN®.
4» 44 ·4>» ·· ··
4 0 « · 4 V 4 « 4 4 • 444 4444« 4 < *
4 444 · 4 4 <··· 4
4 44 4 440 ·· 44 44 04· 44 0 0 4 4
Vhodnými ionovými povrchově ativními látkami jsou N,N,N-trialkyl glyciny, např. N-N-dodecyl-N,N,-dimethylglycin. Dalšími vhodnými ionovými povrchově aktivními látkami jsou ω-Ν,N,N-trialkylamonium alkylsulfonáty, např. 3-(N-alkyl-N,N-dimethyl)-1-propansulfonát obsahující alkylovou skupinu, která obsahuje 8 až 16 atomů uhlíku. Dalšími vhodnými ionovými povrchově aktivními látkami jsou 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamonio]-1-propansulfonát a 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamonio]-2-hydroxy-l-propansulfonát.
Povrchově aktivní látky, které se obvykle používají při způsobech rozpouštění a přípravy jsou mezi jinými popsány i v následujících publikacích: Bhairi S.M. (1997) „A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA; „1999 Inernational McCutcheon's Emulsifiers and Detergents The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, USA.
Průběh reakce se nepřetržitě monitoruje pomocí chromatografických metod, které se obvykle používají při mikrobiologickém výzkumu.
Předkládaný vynález se týká také kultivace mikroorganismů, které jsou schopné specificky oxidovat alkohol v pozici 4' ' na keton vzorce III, a jejich inkubace s danými sloučeninami v bioreaktorech, především v bioreaktorech typu míchané nádoby. K zajištění optimální rychlosti tvorby produktu v reálném produkčním fermentoru se doporučuje nejdříve mikroorganismy pomnožit v předpěstovaných kulturách. Množství předpěstovaných kultur fermentoru závisí na koncentraci inokulačního materiálu, která je v každém jednotlivém případě optimální. V závislosti na použitých mikroorganismech je výhodné, jsou-li pro fermentační stádium použity následující koncentrace inokulačního materiálu: bakterie 0,1 až 3%, plísně 5 až 10%, Actinomycetales 5 až 10%.
Inolukace malých fermentoru (do 20 litrů) se obvykle provádí pomocí kultur předpěstovaných v třepaných baňkách. V tomto pří44 44 • · · ·· 4« ·»»» • · 4 · 4 4 4 • 4 4 4 C 4 »« 44 ·
4 4 4 4 4 4 4 444 4 4
4 4 · 4 444
44 44 444 44 4444 pádě se k inokulaci fermentoru použije celý objem baňky. Výchozím materiálem, který se používá pro výrobu předpěstovaných kultur, je obvykle konzervovaný inokulační materiál, který může být například ve formě lyofilizátů nebo zmrazeného materiálu nebo materiálu, který je uchováván v chladu. V rámci předkládaného vynálezu se výhodně využívá materiál skladovaný při -80 °C.
Pomnožení inokulačního materiálu se výhodně provádí v kapalných médiích ve skleněných baňkách na rotační třepačce nebo pokud se používají spory, tak na pevných živných substrátech. Podmínky, které se týkají živných substrátů a kultivačních parametrů, mezi jinými třeba teploty, pH, přívodu kyslíku, se musí optimalizovat podle použitého mikroorganismu nebo způsobu. Doba růstu konzervovaného inokulačního materiálu se v závislosti na použitém výchozím materiálu pohybuje od několika hodin do několika dní.
lyofilizáty zmrazením zakonzervované 3 až 10 dní
bakterie 4 až 18 hodin
Actinomycetales 1 až 5 dní
plísně kultury uchovávané v chladu 1 až 7 dní
bakterie 4 až 24 hodin
Actinomycetales 1 až 3 dny
plísně 15 ' dní
Pokud se jako inokulační materiál používají spory, musí se spory z konzervovaného inokulačního materiálu nejdříve namnožit na pevných živných substrátech za ustálených podmínek (sterilní provzdušňování, klimatická komora). Pokud se používají porézní živné substráty založené na rašelině, otrubách, rýži nebo krupici, musí se kultury denně důkladně protřepat, aby se dosáhlo vysoké hustoty spor. Další možností je kultivace konzervovaného inokulačního materiálu na živném médiu zpevněném agarem nebo jinými běžnými želírovacími činidly, je lepší používat živná média, která spouštějí tvorbu spor.
4« ·· ·· ··>· • * · 4 4 4 4
Doba sporulace se pohybuje od 7 do 30 dní v závislosti na použitém mikroorganismu a živném médiu.
Pro inokulaci předkultivačních nebo produkčních fermentorů se spory buď suspendují pomocí povrchově aktivních činidel, například roztoku Tweenu80 (povrchově aktivní látka od SigmaAldrich Co., St. Louis, MO USA) a převedou se společně s jejich živným médiem do fermentorů nebo se v případě, jsou-li použita pevná živná média, vymyjí z pevných živných médií pomocí daných povrchově aktivních činidel. K inokulaci fermentorů se pak použije takto získaný roztok, který obsahuje spory. Jak regenerace spor, tak i inokulace fermentorů, se provádějí pokud možno za sterilních podmínek.
Podle předkládaného vynálezu se k výrobě sloučenin obecného vzorce III mohou použít bioreaktory různých velikostí, jejich objem se může v závislosti na požadovaném množství produktu pohybovat od 0,001 m2 3 do 450 m3.
Pokud se používají bioreaktory typu míchaných nádob, pak se považují následující parametry fermentace ve vztahu k optimálnímu průběhu reakce za kritické:
1. Teplota: Podle předkládaného vynálezu se biokatalytická oxidační reakce s výhodou provádí v rozsahu mesofilních teplot (rozsah teplot pohybující se od 20 °C do 45 °C). Optimální teplotní rozsah pro růst a tvorbu produktu se pohybuje od 20 °C do 32 °C, zvláště pak od 24 °C do 30 °C.
2. Provzdušňování: Rychlost provzdušňování se pohybuje od 0,1 do 2,5 vvm (objem vzduchu na objem kapaliny za minutu), s výhodou od 0,3 do 1,75 vvm. Pokud je to třeba, musí se rychlost provzdušňování přizpůsobit spotřebě kyslíku dosažené během fermentace .
3. Tlak: Aby bylo sníženo riziko kontaminace, pracují obvykle reaktory typu míchaných nádob za mírného přetlaku od 20 až 100
9 99 99 9999 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99999 99 9 i ·: ί .* «· ». ·· ... ·· ···· kPa (0,2 do 1,0 baru), s výhodou od 50 až 70 kPa (0,5 do 0,7 baru).
4. Hodnota pH: Hodnota pH se může v závislosti na použitém mikroorganismu lišit v rámci určitých mezi. Pokud se používají mikroorganismy skupiny Actinomycetes, pohybuje se počáteční hodnota pH od pH 6 do pH 8, s výhodou od pH 6,5 do pH 7,5.
5. Míchání: Rychlost míchání závisí na použitém typu míchadla a velikosti fermentoru. Podle předkládaného vynálezu jsou výhodná míchadla s lopatkami diskového typu, která se v reaktoru typu míchané nádoby velikosti 0,002 m3 provozují při rychlosti 150 až 550 otáček za minutu, především 200 až 500 otáček za minutu.
Podle předkládaného vynálezu se doba trvání fermentace pohybuje od 20 hodin do 10 dní v závislosti na použitém mikroorganismu. Biokatalytická reakce se ukončí, když je asi 25% až 99,9%, výhodněji asi 50% až 99,9% a nejvýhodněji asi 80% až 90% na počátku přidaného substrátu (sloučenin vzorce II) přeměněno na sloučeniny obecného vzorce III.
Aby se zjistil optimální čas pro ukončení oxidační reakce, je po celou dobu fermentace monitorován průběh reakce pomocí běžných analytických způsobů, zvláště pomocí chromatografických způsobů, jako například HPLC nebo chromatografie na tenké vrstvě.
Výše navrhované způsoby se mohou pozměnit tak, že bioreaktor slouží jen pro výrobu biomasy, která se pak získá filtrací nebo odstředěním. Biomasa mikroorganismů se pak buď ihned použije jako biokatalyzátor přeměny sloučenin obecného vzorce II na sloučeniny obecného vzorce III nebo se skladuje v chladu jako taková nebo po vysušení sublimací za zmrazeného stavu nebo po vysušení rozprašováním. Daný mikroorganismus, buď čerstvé získaný nebo skladovaný popsaným způsobem, se pak rozdělí do dalších nádob, jako například do baněk s výhodou opatřených vatovými zátkami nebo do bioreaktorů typu míchaných nádob, ve kterých se provádí biokonverze. Přidá se substrát (sloučeniny vzorce II), ···· · · ·· • · · · · · •··« · · · • · · · · φ φ · φ φ · φφφφ • · • · · φ • · · · • · · · · • · · • · · φ tím se mikroorganismus a substrát, který se má oxidovat, dostanou do navzájem do kontaktu. Z praktických důvodů se osvědčilo přidávat substrát, což je sloučenina vzorce II, k mikroorganismu v pufrovaném roztoku, který nepodporuje množení. Substrát (sloučeniny vzorce II), který se má oxidovat, se může použít například ve formě prášku nebo ve formě roztoku ve vhodných rozpouštědlech, jako jsou například ta, která už zde byla dříve popsána.
Podle výhodného provedení podle předkládaného vynálezu se substrát (sloučeniny vzorce II) nejdříve rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako například dimethylsulfoxidu nebo Tweenu40 (povrchově aktivní látka, od Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO USA) nebo v kombinaci obou a přidá se do zazátkovaných baněk obsahujících roztok pufru, nejvýhodněji 0,7M fosforečný pufr, který má pH 7,0. Výsledný roztok se před přidáním biokatalyzárotu (biomasy mikroorganismu) steriluje. Reakční směs se pak v závislosti na mikrobiálním kmeni inkubuje po dobu 2 až 7 dní při teplotě místnosti a třepe se rychlostí pohybující se od 100 otáček za minutudo 150 otáček za minutu, s výhodou kolem 120 otáček za minutu.
Podle dalšího výhodného provedení podle předkládaného vynálezu, se substrát (sloučeniny vzorce II) nejdříve rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako například dimethylsulfoxidu nebo Tweenu40 (povrchově aktivní látka od Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO USA) nebo kombinaci obou, a přidá se do zazátkovaných baněk obsahujících kultivační médium podporující růst mikroorganismu, který provádí oxidační reakci. Výsledný roztok se před přidáním biokatalyzátoru (biomasy mikroorganismu) steriluje. Reakční směs se pak inkubuje v závislosti na mikrobiálním kmeni po dobu 2 až 9 dnů při teplotě místnosti a třepe se rychlostí 100 otáček za minutuaž 150 otáček za minutu, s výhodou 120 otáček za minutu.
Podle dalšího charakteristického provedení podle předkládaného vynálezu se připraví bezbuněčný extrakt z čerstvých buněk, které • · • · se promyjí ve vhodném roztoku pufru, resuspendují v disrupčním pufru a rozruší například mechanickými prostředky při teplotě mezi 2 °C až 15 °C, s výhodou při teplotě mezi 3 °C až 6 °C, nejvýhodněji při 4 °C. Výsledná suspenze se odstředí a odebere se supernatant bezbuněčného extraktu.
K takto získaným roztokům bezbuněčného extraktu se přidá směs obsahující vhodný podíl cizího systému dodávání elektronů, jako je například ferredoxin a ferredoxin reduktasa a substrátu. Po přidání substrátu se směs s výhodou bezprostředně a důkladně promíchá a provzdušní. Pak se přidá vhodný podíl NADPH a směs se inkubuje při teplotě mezi 15 °C až 40 °C, výhodněji při teplotě mezi 20 °C a 35 °C a nejvýhodněji při 30 °C.
Zpracování fermentační živné půdy za účelem získání oxidačního produktu (sloučenin vzorce III) se může provádět způsoby obvykle používanými při fermentacích (W. Crueger a A. Crueger, 1984; P. Právě, 1984).
Nejdříve ze všeho se z reakční živné půdy pomocí filtrů, odstředivek nebo odlučovačů odstraní rozkouskované složky, aby se mohly extrahovat odděleně od filtrátu.
Pokud se jako biokatalyzátor používají vegetativní nebo mrtvé buňky a pokud je část reakčního produktu (sloučenin vzorce III) obsažena uvnitř buněk, musí se buňky dezintegrovat před extrakcí. Pro tento účel je k dispozici množství způsobů dezintegrace buněk, které jsou založené na mechanických, tepelných, chemických nebo enzymatických způsobech.
Z mechanických způsobů je podle způsobu předkládaného vynálezu vhodné použít například obrušování v míchaných kulových mlýnech nebo koloidních mlýnech, tlak a uvolnění v homogenizérech a buněčnou dezintegraci pomocí ultrazvuku. Mezi nemechanické způsoby patří buněčná dezintegrace sušením, lyže buněk působením osmotického šoku, chemická autolýza a enzymatická lyže buněk.
• · « ·
Jakmile se odstraní rozkouskované složky, koncentrují se reakční produkty tak, že se kultivační roztok a odělené buněčné složky extrahují vhodnými rozpouštědly. Pro extrakci je k dispozici množství pomůcek, které se běžně používají při fermentacích, mezi jinými například usazováky, protiproudé kolony, extrakční odstředivky.
Reakční produkty lze také koncentrovat mezi jinými například i membránovou filtrací, ultrafiltrací, mrazovou koncentrací, výměnou iontů.
Další zpracování surového produktu získaného extrakcí se může provádět pomocí způsobů, které jsou běžné v mikrobiologickém a chemickém výzkumu a průmyslovém využití.
Tyto způsoby zahrnují například chromatografické metody, jako třeba adsorbční chromatografii, iontoměničovou chromatografii, chromatografii na molekulárních sítkách, afinitní chromatografii, hydrofobní chromatografii, rozdělovači chromatografii, kovalentní chromatografii a další, ale navíc také různé způsoby krystalizace.
Mezi rozpouštědla, která jsou vhodná pro extrakci buď jako taková nebo ve směsích patří: aromatické uhlovodíky jako třeba toluen, xylenové směsi nebo substituované naftaleny, ftaláty jako třeba dibutylftalát nebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky jako třeba isomery hexanu, heptanu, oktanu nebo parafinů nebo cyklohexanu, alkoholy a glykoly a jejich ethery a estery, jako třeba methanol, ethanol, 2-propanol, 1-butanol, terciální butanol, ethylenglykol, methylovaný terciální buthylether, ethylacetát, monomethyl ethylenglykolu nebo menoethylether, ketony jako třeba aceton nebo 2-butanon nebo cyklohexanon, chlorované uhlovodíky jako třeba dichlormethan nebo chloroform nebo tetrachlormethan.
Pojem „povrchově aktivní látka se může chápat tak, že zahrnuje i směsi povrchově aktivních látek. Vhodnými aniontovými povrcho30 vě aktivními látkami jsou jak ve vodě rozpustná mýdla, tak i ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní sloučeniny. Vhodnými mýdly jsou soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo nesubstituované nebo substituované amonné soli vyšších mastných kyselin obsahujících 10 až 22 atomů uhlíku, např. sodné nebo draselné soli kyseliny olejové nebo stearové nebo směsi přirozených mastných kyselin, např. z kokosového nebo lojového oleje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními látkami jsou také methyltaurinové soli mastných kyselin. Častěji se však využívají takzvané syntetické povrchové aktivní látky, zvláště mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfonované deriváty benzimidazolu nebo alkylarylsulfáty. Mastné sulfonáty nebo sulfáty jsou obvykle ve formě solí alkalických kovů, solí kovů alkalických zemin nebo nesubstituovaných nebo substituovaných amonných solí a obsahují alkylovou skupinu obsahující 10 až 22 atomů uhlíku, který také zahrnuje alkylovou polovinu acylových skupin, např. sodnou nebo vápennou sůl ligrosulfonové kyseliny nebo dodecylsulfátu nebo směsi sulfátů mastných alkoholů získaných z přirozených mastných kyselin. Tyto sloučeniny zahrnují také soli sulfonátové nebo sulfátové adiční směsi mastných alkoholů a ethylenoxidu. Sulfonované deriváty benzimidazolu s výhodou obsahují dvě skupiny kyseliny sulfonové a jednu skupinu mastné kyseliny obsahující 8 až 22 atomů uhlíku. Příkladem alkylarylsulfonátů jsou sodné, vápenné nebo triethanolaminové soli dodecylbenzensulfonové kyseliny, dibutylnaftalensulfonové kyseliny nebo kondenzátu naftalensulfonové kyseliny a formaldehydu. Vhodné jsou též odpovídající fosforečnany, např. soli esteru kyseliny fosforečné, adiční sloučeniny p-nonylfenolu se 4 až 14 moly ethylenoxidu; nebo fosfolipidy. Povrchově aktivní látky běžně používané v preparačních technikách jsou mezi jinými popsány i v následující publikaci: „1986 International McCuscheon's Emulsifiers and Detergents The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, USA.
• 444
Výhodné provedení podle předkládaného vynálezu je způsob výroby 4''-oxoavermectinu, který se provádí tak, že se uvede do kontaktu avermectin a biokatalyzátor, což je mikroorganismus schopný přeměnit avermectin na 4''-oxoavermectin a z reakční směsi se izoluje vzniklý 4''-oxoavermectin.
Provedení podle předkládaného vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4-oxoavermectin, který sestává z následujících kroků:
1. produkce buněk: živné médium, které podporuje buněčný růst, se inokuluje předpěstovanou kulturou mikroorganismu, který je schopen přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III, s výhodou avermectin na 4''-oxoavermectin;
2. získání buněk po ukončení růstu
3. rozpuštění sloučeniny vzorce II, s výhodou avermectinu, ve vhodném rozpouštědle
4. přidání roztoku vzniklého v kroku 3 k reakčnímu médiu, které nepodporuje množení buněk
5. přidání buněk z kroku 2 k reakčnímu médiu z kroku 4
6. třepání nebo míchání reakční směsi z kroku 5 za přítomnosti vzduchu
7. oddělení buněk od média
8. extrakce supernatantu a buněk vhodnými rozpouštědly
9. zakoncentrování fází organického rozpouštědla z kroku 8
10. čistění sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''-oxoavermectin, obsažené v extraktu z kroku 9 pomocí chromatografie nebo krystalizace • · · * • * 4 · 4 • 4 · · 4
9 4 4 4 4 4
4 4
Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''oxoavermectin, který sestává z následujících kroků:
1. produkce buněk: živné médium, které podporuje buněčný růst, se inokuluje předpěstovanou kulturou mikroorganismu, který je schopen přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III, s výhodou avermectin na 4''-oxoavermectin;
2. získání buněk po ukončení růstu
3. rozpuštění sloučeniny vzorce II, s výhodou avermectinu, ve vhodném rozpouštědle
4. přidání roztoku vzniklého v kroku 3 k reakčnímu médiu, které nepodporuje množení buněk
5. přidání buněk z kroku 2 k reakčnímu médiu z kroku 4
6. třepání nebo míchání reakční směsi z kroku 5 za přítomnosti vzduchu
7. extrakce celého živného média pomocí vhodného rozpouštědla
8. oddělení fází
9. zakoncentrování fáze rozpouštědla z kroku 8 ve vakuu
10. čistění sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''oxoavermectin, obsažené v extraktu z kroku 9 pomocí chromatografie nebo krystalizace
Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''-oxoavermectin, který sestává z následujících kroků:
1. rozpuštění sloučeniny vzorce II, což je s výhodou avermectin, ve vhodném rozpouštědle
2. přidání roztoku vzniklého v kroku 1 k živnému médiu, které podporuje buněčný růst
3. inokulace živného média z kroku 2 předpěstovanou kulturou mikroorganismu, který je schopen přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III, s výhodou avermectin na 4''oxoavermectin;
4. kultivace mikroorganismu schopného přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III, s výhodou avermectin na 4ZZoxoavermectin;
5. oddělení buněk od média
6. extrakce supernatantu a buněk pomocí vhodných rozpouštědel
7. zakoncentrování fází organického rozpouštědla z kroku 6 ve vakuu
8. čistění sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4ZZoxoavermectin, obsažené v extraktu z kroku 7 pomocí chromatografie nebo krystalizace.
Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''oxoavermectin, který sestává z následujících kroků:
1. rozpuštění sloučeniny vzorce II, s výhodou avermectinu, ve vhodném rozpouštědle
2. přidání roztoku vzniklého v kroku 1 k živnému médiu, které podporuje buněčný růst
3. inokulace živného média z kroku 2 předpěstovanou kulturou mikroorganismu, který je schopen přeměnit avermectin na 4'' oxoavermectin;
9 99
9 9 9 9
99
4. kultivace mikroorganismu schopného přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III, s výhodou avermectin na 4''oxoavermectin;
5. extrakce celého živného média vhodným rozpouštědlem
6. oddělení fází
7. zakoncentrování fáze rozpouštědla z kroku 6 ve vakuu
8. čistění sloučeniny vzorce III, což je s výhodou 4''-oxoavermectin, obsažené v extraktu z kroku 7 pomocí chromatografie nebo krystalizace.
Ve druhém čistě chemickém kroku takto získaná sloučenina vzorce III reaguje za přítomnosti redukčního činidla s aminem vzorce HN(Rg)R9, kde Rs a Rg mají tentýž význam jako ve vzorci I. Je výhodné, když reakční složky reagují v nepřítomnosti rozpouštědla, ale mohou reagovat i v jeho přítomnosti. Další možnost spočívá v provedení reakce v přebytku jedné z reakčních složek, zejména v kapalném aminu. Obvykle je ale výhodné přidat inertní kapalné rozpouštědlo nebo ředidlo. Příkladem takových rozpouštědel nebo ředidel jsou aromatické, alifatické a alicyklické uhlovodíky a halogenované uhlovodíky, jako třeba benzen, toluen, xylen, mesitylen, tetrahydronaftalen, chlorbenzen, dichlorbenzen, brombenzen, petrolether, hexan, cyklohexan, dichlormethan, trichlormethan, tetrachlormethan, dichlorethan, trichlorethen nebo tetrachlorethen; estery jako třeba ethylester kyseliny octové; ethery jako třeba diethylether, dipropylether, diisopropylether, dibutylether, terciální butylmethylether, ethylenglykolmonomethylether, ethylenglykolmonoethylether, ethylenglykoldimethylether, dimetoxydiethylether, tetrahydrofuran nebo dioxan; ketony jako třeba aceton, methylethylketon nebo methylisobutylketon; alkoholy jako třeba methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, ethylenglykol nebo glycerin; amidy jako třeba Ν,Νdimethylformamid, N,N-diethylformamid, N,N-dimethylacetamid, Nmethylpyrrolidon nebo triamid hexamethylfosforečné kyseliny;
·· ··♦· ·· ·♦ • · 9 9 9 9 9 « · ··· 9 9 · • · · 9 · · · nitrily, jako třeba acetonitril nebo propionitril; a sulfoxidy jako třeba dimethylsulfoxid; organické kyseliny jako třeba kyselina octová; a voda.
Výhodnými rozpouštědly jsou ethery jako třeba tetrahydrofuran a ethylenglykoldimethylether; zvláště tetrahydrofuran; alkoholy jako methanol, ethanol nebo isopropanol; halogenovaná rozpouštědla jako dichlomethan nebo dichlorethan; aromatická rozpouštědla jako benzen nebo toluen; nitrily jako acetonitril; amidy jako Ν,Ν-dimethylformamid, uhlíkaté kyseliny jako třeba kyselina octová; voda; a jejich směsi.
Zvláště výhodnými rozpouštědly jsou methanol nebo ethanol nebo jejich směsi.
Reakce se s výhodou provádí v rozsahu pH mezi 0 až 14, zvláště mezi 2 až 10, v mnoha případech mezi 6 až 9, obzvláště při pH 9.
Reakce se s výhodou provádí v rozsahu teplot mezi -80 °C až +140 °C, výhodně mezi -30 °C až +100 °C, v mnoha případech mezi -10 °C až +80 °C, zvláště mezi 0 °C až +50 °C.
Výhodnými redukčními činidly jsou hydridy jako třeba hydroboritany; borany; kyselina mravenčí; formiáty; nebo vodík. Zvláště výhodné jsou hydridy jako tetrahydridoboritan sodný, hydrid zinečnato-boritý; hydrid lithno-boritý; kyanoborohydrid sodný; hydrid sodno-triacetoxyboritý nebo tetramethylamoniumtriacetoxyborohydrid. Zvláště výhodný je hydrid tetrahydridoboritan sodný.
Reakce se může ve vhodných případech provádět za přítomnosti určitých dalších chemikálií jako třeba homogenních nebo heterogenních katalyzátorů nebo kyselin. Zvláště vhodné jsou kyseliny jako kyselina chlorovodíková, kyselina p-toluensulfonová, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina vinná nebo kyselina ftalová; Lewisovy kyseliny jako například chlorid titaničitý, isopropylát titaničitý nebo chlorid zinečnatý; soli jako například chloristan horečnatý, acetát sodný,
ΦΦ φφ ·Φ ΦΦΦΦ • · · · φ · * • · · · φ ···· • φ φφφ · φ · φ • · · · · · φφ φφ • · · φ φ φ φ φφφ vínan sodno-draselný, chlorid ytterbnatý nebo pyridinium-ptoluensulfonát; činidla absorbující vodu jako například sulfát sodný, molekulární síto nebo silikagel; nebo jejich směsi. Dalšími výhodnými činidly jsou kyseliny jako kyselina octová, kyselina propionová nebo kyselina vinná; výhodná je kyselina octová. Pokud se redukce provádí vodíkem, je výhodné přidat jeden z mnoha vhodných homogenních nebo heterogenních katalyzátorů. Z těchto katalyzátorů jsou výhodné heterogenní kovové katalyzátory, s výhodou Ni-, Pt- nebo Pd-katalyzátory, zvláště Raneyův niklový a Lindlarův katalyzátor (Pd-CaCO3~PbO) . Vhodnými homogenními katalyzátory jsou zvláště komplexy rhodia jako třeba Wilkinsonovy katalyzátory (chlorotristrifenyl rhodia).
Sloučeniny vzorce I, ve všech případech volné nebo ve formě soli, se mohou vyskytovat ve formě jednoho z možných isomerů nebo ve formě jejich směsi, například v závislosti na počtu asymetrických atomů uhlíku v molekule a jejich absolutní a relativní konfiguraci a/nebo v závislosti na konfiguraci nearomatických dvojných vazeb v molekule se mohou vyskytovat ve formě čistých isomerů, jako jsou antipody a/nebo diastereoisomery nebo ve formě směsi isomerů, jako jsou směsi enentiomerů; například racemáty, směsi diastereoisomerů nebo směsi racemátů; je třeba mít na zřeteli, že vynález se týká jak čistých isomerů tak i veškerých možných směsí isomerů, a to i tehdy, když stereochemické detaily nejsou ve všech případech v textu přesně uvedeny.
Směsi diastereoisomerů a směsi racemátů sloučenin obecného vzorce I nebo jejich soli, které se získají způsobem závisejícím na výchozích látkách a vybraných postupech nebo jinými způsoby, se mohou na základě fyzikálně-chemických rozdílů mezi složkami rozdělit pomocí známých způsobů, například frakční krystalizací, destilací a/nebo chromatografií, na čisté diastereoisomery nebo racemáty.
Takto získané směsi enentiomerů, jako třeba racemátů, se mohou rozdělit na optické antipody pomocí známých postupů, například t« ··♦· 99 99
9 9 9 9 9 9 9
9 9 999 9 9 ·
999999 9 999 9 9
9 ··· · · · 9
99 99 999 99 9999 rekrystalizací z opticky aktivního rozpouštědla, chromatograficky na chirálních adsorbentech, např. vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na acetylcelulose, pomocí vhodných mikroorganismů, rozštěpením pomocí specifických imobilizovaných enzymů, pomocí vzniku uzavřených sloučenin, např. chirálních crownetherů, v tomto případě se vytvoří komplex jen jednoho enatiomeru, nebo převedením na diastereoisomerické soli, např. reakcí racemátu hlavního konečného produktu s opticky aktivní kyselinou, třeba karboxylovou kyselinou, např. kyselinou kafrovou, vinnou nebo jablečnou nebo sulfonovou kyselinou, např. kyselinou sulfokafrovou a separací výsledné směsi diastereoisomerů, např. na základě jejich rozdílné rozpustnosti pomocí frakční krystalizace na diasteroisomery, z nichž se může uvolnit požadovaný enatiomer vhodným působením, např. zásadami, činidly.
Pomineme-li oddělení odpovídajících směsí isomerů, je možné podle vynálezu získat čisté diastereoisomery nebo enantiomery také obecně známými způsoby diastereoselektivní nebo enantioseletivní syntézy, např. prováděním způsobu podle vynálezu za použití výchozího materiálu, který má odpovídající vhodnou stereochemii.
Sloučeniny vzorců I a II, produkty přídavku kyselin a jejich soli se mohou také získat ve formě jejich hydrátů a/nebo mohou obsahovat další rozpouštědla, např. rozpuštědla, která se mohou použít pro krystalizaci sloučenin vyskytujících se v pevném stavu.
Vynález se týká všech těchto forem způsobu, podle kterého se sloučenina, která se získá jako výchozí materiál nebo meziprodukt v jakémkoli stádiu způsobu, použije jako výchozí materiál a provádějí se všechny nebo některé ze zbývajících kroků nebo se výchozí materiál použije ve formě derivátů nebo solí a/nebo jejich racemátů nebo antipodů nebo se tvoří za podmínek reakce.
Sloučeniny vzorců I a II, které lze získat podle tohoto způsobu nebo jinými způsoby, se mohou známým způsobem převést na rozdílné sloučeniny vzorců I a II.
99
9« 999* ·· ·9 • · · · · · • 999 9 9 · • 9 9 · · 9
9 9 9 9
9 · 99 9999
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu se s výhodou používají ty výchozí látky a meziprodukty, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, které produkují ty sloučeniny vzorců I a III nebo jejich soli, jež byly na začátku popsány jako zvláště hodnotné.
V případě, kdy R9 je vodík, může být reakční krok 2 rozložen na dva oddělené kroky, kdy se v prvním kroku vytvoří reakcí sloučeniny vzorce III se sloučeninou vzorce H2N(R8), kde R8 má tentýž význam jako ve vzorci I, produkt vzorce IV
R7 kde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, m, n, A, B,C, D, E a F mají tentýž význam jako u výše uvedeného vzorce I a ve druhém kroku se uvedená sloučenina vzorce IV redukuje podle způsobu, který byl uveden v kroku 2. Tyto dva jednotlivé kroky se mohou provádět syntézou v jedné nádobě bez toho, aby se izolovala sloučenina vzorce IV; izolace sloučeniny vzorce IV může být nicméně užitečná, například pro účely čistění. Sloučeniny vzorce IV jsou nové sloučeniny a představují také jedno z hledisek předkládaného vynálezu.
• 4 44 44 444« 44 44 • 444 444 4444
44 4 « 4444 4 4 4
44444· 4 444 · ·
4 »4 4 444 • 4 44 4· 444 44 44*4
Příklady provedení vynálezu
Vynález se bude dále popisovat pomocí následujících podrobných příkladů. Tyto příklady jsou uvedeny jen pro účely ilustrace a, pokud není uvedeno jinak, nijak neomezují rozsah vynálezu. Vynález se týká zvláště způsobů přípravy, které jsou popsané v příkladech.
Příklad 1
Produkce buněk
1.1. Streptomyces tubercidicus kmen 1-1529
Předpěstovné kultury kmene 1-1529 {Streptomyces tubercidicus.; DSM-13135) se pěstují v uzavřených Erlenmayerových baňkách o objemu 20 500 ml, z nichž každá obsahuje 100 ml média 2, po dobu dní při 28 °C a třepe se rychlostí 120 otáček za minutu.
Tyto kultury se použijí k inokulaci 50 litrového fermentoru, který obsahuje 40 1 média 4. Buňky rostou při 28 °C, provzdušňuje se rychlostí 0,7 vvm (tj. 30 litrů/min). Rychlost míchání se udržuje mezi 200 otáčami za minutu a 300 otáčkami za minutu, řídí se čidlem snímajícím pO2, aby se předešlo poklesu pO2 pod 25 %. Po 2 dnech růstu se buňky odstředí pomocí průtokové odstředivky. Získá se 4,2 kg čerstvých buněk.
1.2. Streptomyces tubercidicus kmen R-922
Streptomyces tubercidicus kmen R-922 (DSM-13136) se pěstuje na
Petriho miskách na ISP-5 agaru (médium 5) . Tato kultura se použije k inokulaci třepacích baněk s vatovou zátkou o objemu
500 ml, z nichž každá obsahuje 100 ml PHG média (médium 6) . Tyto předkultury rostou na orbitální třepačce při 120 otáčkách za minutu a při 28 °C po dobu 96 h a pak se použijí pro inokulaci 10 litrového fermentoru, který je vybavený mechanickým míchadlem a který obsahuje 8 litrů PGM média. Tato základní kultura roste při 28 °C, míchání 500 otáček za minutu a provzdušňování 1,75 «4 ·» • · * « • » · · • · ·»· • » ·
99
9999 99 99
9 9 9 9 9 • 999 99 9
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
999 99 9999 vvm (14 1/min) a tlaku 70 kPa (0,7 baru). Zhruba po 20 hodinách, na konci exponenciální fáze růstu, se buňky odstředí. Výtěžek čerstvých buněk je 70 až 80 g/1 kultury. Pro další použití se mohou buňky uchovávat při 4 °C, pokud možno nejdéle týden.
Příklad 2
Reakční postup
2.1. Klidová kultura
2.1.1. Reakční podmínky
35,5 g avermectinu (techn.) se rozpustí v 1,05 1 směsi dimethylsulfoxid/Tween40 1:1. Tento roztok se rozdělí po 25 ml do 42 třílitrových Erlenmayerových baněk, z nichž každá je opatřena vatovým uzávěrem a obsahuje 1 1 reakčního média. Tyto roztoky se sterilují 20 min při 121 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidá 100 g buněk (čerstvých nebo uchovaných při 4°C nejvýše 4 dny), připravených podle příkladů 1.1. a 1.2. Tyto reakční směsi se pak třepou při 120 otáčkách za minutu a teplotě místnosti po dobu 4 až 5 dní.
Reakční médium:
0,5 g melasy
0,5 g MgCl2
12,5 mg ZnCl2
12,5 mg MnCl2-4H2O mg CoC12-6H20
12.5 mg NiCl2-6H2O
2.5 mg CuCl2’2H2O
6,3 mg NaMo04*2H20
0,15 ml 1M HCl se doplní do 1 litu 70 mM fosfátovým pufrem o pH 6,0 a steriluje se v autoklávu.
• · ··· 9 ·
·· ··>** * > · • · ··»· • · · • < » • · ··«·
2.1.2 Zpracování
Reakční směsi se odstředí v polypropylenových centrifugačních baňkách o objemu 500 ml při 4 °C po dobu 15 minut rychlostí 13000xg.
Supernatanty ze 40 1 reakční směsi se slijí dohromady a dvakrát se extrahují methylovaným terciálním butyletherem (0,5 objemový ekvivalent, 0,4 objemový ekvivalent). Spojené fáze methylovaného terciálního butyltetheru se pak třikrát zpětně extrahují 0,185 objemovými ekvivalenty destilované vody. Fáze methylovaného terciárního butylu se zakoncentruje ve vakuu na rotačním odpalovacím přístroji. Vysušením zbytku se získá výtěžek 10 až 12 g extraktu S. Vodná fáze se zlikviduje.
Odstředěné buňky ze 120 až 132 centrifugačních baněk se extrahují následujícím způsobem: Buňky z 24 centrifugačních baněk se převedou do dvoulitrové Erlenmayerovy baňky. Ke každé Erlenmayerově baňce se přidá 80 g křemeliny (Hyflo Supercell®, čištěná) a 1,2 1 acetonu. Nejdříve se ručně protřepe a poté homogenizuje velkým magnetickým míchadlem. Výsledná kaše se vakuově filtruje přes papírový filtr Bůchnerovy nálevky o průměru 20 cm a promývá se acetonem dokud není eluent bez barvy. Tak se získá filtrát Cl a filtrační koláč Cl.
Filtrát Cl se koncentruje ve vakuu na rotačním odpalovacím přístroji, aby došlo k odstranění acetonu. Výsledná vodná fáze se pak třikrát extrahuje 0,7 1 toluenu. Spojené toluenové fáze se suší nad bezvodým sulfátem sodným. Filtrací a odpařením v rotačním odpařovacím přístroji se získá extrakt Cl.
Filtrační koláč Cl se převede do dvoulitrových Erlenmayerových baněk a ručně se promíchá s 1,5 1 toluenu. Směs se homogenizuje pomocí velkého magnetického míchadla. Výsledná kaše se vakuově filtruje přes papírový filtr Bůchnerovy nálevky o průměru 20 cm a promývá se acetonem dokud není eluent bez barvy. Tak se získá • 9 · 9 9 • 9 9 9 • 9 · 9 « * · · · · filtrát C2 a filtrační koláč C2. Filtrační koláč C2 se zlikviduje.
Filtrát C2 se zakoncentruje ve vakuu na rotačním odpařovacím přístroji, tím se získá extrakt C2, který se suší za vysokého vakua.
Spojené extrakty Cl a C2 ze 40 1 reakční směsi se suší za vysokého vakua a tím se získá 30 až 35 g extraktu C.
g spojeného extraktu S a C je zpracováno plamenovou chromátografií tak, jak popisuje Clark-Still a kol., na koloně naplněné 1,5 kg silikagelu (Merc 60, 0,040-0,063 mm),při tlaku N2 50 kPa (0,5 baru), elučním činidlem je směs ethylacetát:hexan v poměru 3:2, sleduje se pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Výtěžek čistého 4''-oxoavermectinu je 5,6 g.
2.2. Množící se kultura
2.2.1. Reakční podmínky g technického avermectinu se rozpustí v 50 ml směsi dimethylsulfoxidu/Tweenu40 v poměru 1:1. Tento roztok se rozdělí po
2,5 ml do uzavřených Erlenmayerových baněk o objemu 20 500 ml, z nichž každá obsahuje 100 ml média 4. Tyto roztoky se sterilují 20 minut při 121 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidá 5 ml předpěstované kultury připravené podle příkladů 1.1. a 1.2. Tyto reakční směsi se pak inkubují 7 dní při 28 °C a třepou se rychlostí 120 otáček za minutu.
2.2.2. Zpracování
Reakční směsi se odstředí v polypropylenových centrifugačních baňkách o objemu 500 ml při 4 °C po dobu 15 minut rychlostí 13000xg, dále se postupuje stejně jako je popsáno v příkladu 3. Získá se 252 mg čistého 4''-oxoavermectinu.
2.3. Bezbuněčné biokatalyzátory • · • · • » • · · · · · • · · · · · • * · · · · · · • · · · · • 9 · · · · • ·· ·· • · · · ♦ · · • · · · * • · · · ··· ·· ··· ·
2.3.1.
Příprava bezbuněčného extraktu
Zásobní roztoky:
PP-pufr: 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,0)
Disrupční pufr: 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,0) mM benzamidinu, mM dithiothreitolu
0,5 mM Pefablocu (od Roche Diagnostics)
Substrát: 10 mg avermectinu se rozpustí v 1 ml isopropanolu.
g čerstvých buněk promytých PP-pufrem se resuspenduje ve 35 ml disrupčního pufru a rozruší se v šelakovém lisu při 4 °C. Výsledná suspenze se odstředí po dobu 1 hodiny rychlostí 35000xg. Odebere se supernatant bezbuněčného extraktu.
2.3.2. Příprava vzorku pro enzymatickou aktivitu
Zásobní roztoky:
Ferredoxin: roztok 5 mg ferredoxinu (ze špenátu) 1 až 3 mg/ml v Tris/HCl pufru (od Fluky) nebo roztok 5 mg ferredoxinu (z Clostridium pasterurianum) 1 až 3 mg/ml v Tris/HCl pufru (od Fluky) nebo roztok 5 mg ferredoxinu (z Porphyra umbilicalis) 1 až 3 mg/ml v Tris/HCl pufru (od Fluky)
Ferredoxinreduktasa: roztok 1 mg lyofilizované ferredoxinreduktasy (ze špenátu) 3,9 U/mg v 1 ml vody (od Sigmy)
NADPH: 100 mM NADPH ve vodě (od Roche Diagnostic) (všechny zásobní roztoky byly skladovány při -20 °C a když se s nimi pracovalo, byly uloženy na ledu).
44 • * · · · · • · · · · · • · · · · · • · ····· · ó · · · · • · «· · · ··· · ·· ·· • · · · · • · · · · · • · · · · • · · · • · · · · ····
Podmínky HPLC
HPLC přístroj Merck-Hitachi
HPLC kolona 70x4 mm, Kromasil 100 C18, 3,5μ (od Macherey-
Nagel, Švýcarsko)
Rozpouštědlo A: acetonitril obsahující 0,0075 % kyseliny
trifluoroctové
Rozpouštědlo B: voda obsahující 0 ,01 % kyseliny
trifluoroctové
Průtok: 1,5 ml/min
Detekce: UV 243 nm
Vzorek: 30 μΐ
Retenční časy: avermectin Bia 3,18 min
4''-oxoavermectin Bia 4,74 min
Tabulka čerpání: 0,0 min 75% A 25% B
Lineární gradient na 7,0 min 100% A 0% B
9,0 min 100% A 0% B
Skok na 9,1 min 75% A 25% B
12,0 min 75% A 25% B
Κ 475 μΐ bezbunščného extraktu se přidají následující roztoky: 10 μΐ ferredoxinu, 10 μΐ ferredoxinreduktasy a 1 μΐ substrátu. Ihned po přidání substrátu se směs důkladmě zamíchá a provzdušní. Pak se přidá 5 μΐ NADPH a směs se inkubuje 30 minut při 30 °C. Pak se k reakční směsi přidá 1 ml methylovaného terciárního butyletheru a důkladně se promíchá. Směs se 2 minuty odstředí rychlostí 1400 otáček za minutu a fáze methylovaného terciálního butyletheru se převede do 10 ml baňky a odpaří se ve vakuu pomocí rotačního odpařovacího přístroje. Zbytek se rozpustí v 200 μΐ acetonitrilu a převede do HPLC vzorkové lahvičky. Po injektáži 30 μΐ vzorku se ve 4,74 minutě objeví vrcholek, který naznačuje přítomnost 4''-oxoavermectinu Bia. HPLC hmotnostní spektrometrií se pro tento vrcholek stanoví hmotnost 870 Da, což odpovídá molekulární hmotnosti 4''-oxoavermectinu Bia.
• 44» • · · 4 4 · · • 4* 4 · 4444
4444·· ·
4 4 4 4 «· 4 4 444
4* <4 t 4 4
4 ·
4444
Když se pomocí HPLC a HPLC hmotnostní spektrometrie analyzuje tvorba produktu, objeví se ve 2,01 minutě druhý vrcholek, který odpovídá ketohydrátu 4''-hydroxyavermectinu. To je znamení, že bezbuněčný extrakt přeměňuje avermectin hydroxylací na 4''-hydroxyavermectin, z něhož se dehydratací tvoří 4''-oxoavermectin.
Špenátový ferredoxin se může nahradit například ferredoxinem z bakterie Clostridium pasteurianum nebo z červené řasy Porphyra umbilicalis, který také přeměňuje avermectin na 4''-oxoavermectin.
Příklad 3
Kmeny Streptomyces
Kmeny rodu Streptomyces se mohou použít ve způsobu podle předkládaného vynálezu a z následující tabulky je vidět jejich vztah ke kmenům S. tubercidius 1-1529 a R-922 založený na 16s analýze rDNA.
Číslo kmene Nejbližší shoda s GenBankou % 16s rDNA shoda
1-1529 vzorový kmen Streptomyces tubercidi- cus DSM 40261 100
R-922 vzorový kmen Streptomyces tubercidi- cus DSM 40261 100
MAAG-7027 vzorový kmen Streptomyces tubercidi- cus DSM 40261 100
DSM-40241 (uvedený jako Streptomyces saraceti- cus = ATCC-25496) 100
Streptomyces chattanoogensis Streptomyces lydicus ATCC 25470=NRRL-2433 99,8
A/96-1208710 vzorový kmen Streptomyces kasugaensis DSM 40819 99,5
Streptomyces kasugaensis M338-M1 99,4
·· · · · · · · · · · 4 • · » 4 · · · · • ····· ·· *
9 9 ·· 9 · · · · · • · 4 4 · 9 9 • · 9 9 9 9 9 44 ····
Číslo kmene Nejbližší shoda s GenBankou % 16s rDNA shoda
NRRL-2433 (uvedený jako vzorový kmen Streptomyces lydicus ssp lydicus=?iTCC 25470=CBS 703.69=DSM 40461)
Příklad 4
Příprava 4''-deoxy-4''-epi(methylamino)avermectinu B1 vzorce
OH kde R je methyl a ethyl;
ml kyseliny octové ve 30 ml methanolu se ochladí na 0 °C až 5 °C. Přidává se plynný methylamin, dokud pH roztoku nemá hodnotu
9.
K 8,25 ml tohoto roztoku methylaminu se při 0 °C přidá roztok 1,0 g 4''-oxoavermectinu B1 v 6 ml methanolu. Směs se nechá zahřát na teplotu okolí a pak se míchá dalších 50 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 90 mg tetrahydridoboritanu sodného ve
2,5 ml ethanolu a výsledná směs se míchá dalších 45 minut. K reakční směsi se přidá 10 ml ethylacetátu, organická fáze se třikrát extrahuje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, organická fáze se oddělí a vysuší nad síranem sodným.
fr ·
Rozpouštědlo se oddestiluje a získá se 4''-deoxy-4''-epi-(methylamino)avermectin Bl. Čistota je vyšší než 90%.
Literatura
Angelino S.A.G.F., Muller F., Plas H.C. van der (1985) Purification and immobilization of rabbit liver aldehyde oxidase. Biotechnol. Bioeng. 27: 447-455.
Bachmann S., Gebicka L., Gasyna Z., (1981) Immobilization of glucose isomerase on radiation-modified gelatine gel. Starch/ Stárke 33: 63-66.
Barbaric S., Kozulic B., Leustek I., Pavlovic B., Cesi V., Mildner P. (1984) Crosslinking of glycoenzymes via their carbohydrate chains. In: 3rd Eur. Congr. Biotechnol., Vol. 1. Verlag Chemie, Weinheim, str. 307-312.
Beddows C.G., Guthrie J.T., Abdel-Hay F.I. (1981) The use of graft copolymers as enzyme supports immobilization of proteins and enzymes on a hydrolyzed nylon-coacrylonitrile systém. Biotechnol. Bioeng. 23: 2885-2889.
Bettmann H., Rehm H.J. (1984) Degradation of phenol by polymer entrapped microorganisms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 285290.
Bhairi S.M. (1997) A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA, 1997.
Bickerstaff G.F. (Ed.) (1997) Immobilisation of Enzymes and Cells (Methods in Biotechnology Series), Humana Press, Totowa NJ USA, 1997.
Bihari V., Goswami P.P., Rizvi S.H.M., Kahn A.W., Basu S.K., Vora V.C. (1984) Studies on immobilized fungal spores of microbial transformation of steroids: lla-hydroxylation of progesterone with immobilized spores of Aspergillus ochraceus G8 on polyacrylamide gel and other matrices. Biotechnol. Bioeng. 26: 1403-1408.
91 · » ♦
Black G.M., Webb C., Matthews T.M., Atkinson B. (1984) Practical reactor systems for yeast cell immobilization using biomass support particles. Biotechnol. Bioeng. 26: 134-141.
Cabral J.M.S., Novais J.M., Cardoso J.P. (1984) Coupling of glucoamylase on alkylamine derivative of titanium(IV) activated controlled póre glass with tannic acid. Biotechnol. Bioeng. 26: 386-388.
Cannon J.J., Chen L.-F., Flickinger M.C., Tsao G.T. (1984) The development of an immobilized lactate oxidase systém for lactic acid analysis. Biotechnol. Bioeng. 26: 167-173.
Cantarella M., Migliaresi C., Tafuri M.G., Afani F. (1984) Immobilization of yeast cells in hydroxymethacrylate gels. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 233-237.
Chipley J.R. (1974) Effects of 2,4-dinitrophenol and N,N'dicyclo-hexylcarbodiimide on cell envelope-associated enzymes of Escherichia coli and Salmonella enteritidis. Microbios. 10: 115120.
Clark-Still W., Kahn M., Mitra A. (1978) Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution.
J. Org. Chem. 43: 2923-2925.
Crueger W., Crueger A. (1984) Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 2nd edition, R. Oldenbourg Verlag Munich, Vienna, 1984.
Dennis, K. E.; Clark, D. S.; Bailey, J. E.; Cho, Y. K.; Park, Y. H. (1984) Immobilization of enzymes in porous supports: Biotechnol. Bioeng. 26: 892-900.
Deo Y.M., Gaucher G.M. (1984) Semicontinuous and continuous production of penicillin-G by Penicillium chrysogenum cells immobilized in k-carrageenan beads. Biotechnol. Bioeng. 26: 285-295. De Rosa M., Gambacorta A., Lama L., Nicolaus B. (1981) Immobilization of thermophilic microbial cells in crude egg white. Biotechnol. Lett 3: 183-188.
DiLuccio R.C., Kirwan D.J. (1984) Effect of dissolved oxygen on nitrogen fixation by A. Vinelandii. II. Ionically adsorbed cells. Biotechnol. Bioeng. 26: 87-91.
• · ·· · ·
Erhardt Η.M., Rehm H.J. (1985) Phenol degradation by microorganisms adsorbed on activated carbon. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21: 32-36.
Eikmeier H., Rehm H.J. (1984) Production of citric acid with immobilized Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 365-370.
Fórberg C., Hággstróm L. (1984) Adsorbed cell systems controlled by the nutrient dosing technique. In: 3rd Eur. Congr.
Biotechnol. Vol. 2. Verlag Chemie, Weinheim, str. 115-120.
Gainer J.L., Kirwan D.J., Foster J.A., Seylan E. (1980) Use of adsorbed and covalently bound microbes in reactors. Biotechnol. Bioeng. Symp. 10: 35-42.
Giard D.J., Loeb D.H., Thilly W.G., Wang D.I.C., Levine D.W. (1979) Human interferon production with diploid fibroblast cells grown on microcarriers. Biotechnol. Bioeng. 21: 433-442.
Greene Th.W., Wuts P.G.M. (1999) Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York NY 1999. Hartmeier W. (1986), Immobilisierte Biokatalysatoren, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 1986.
Hofstee B.H.J. (1973) Immobilization of enzymes through noncovalent binding to substituted agaroses. Biochem. Biophys. Res. Commun. 53: 1137-1144.
Ibrahim M., Hubert P., Dellacherie E., Magadalou J., Muller J., Siest G. (1985) Covalent attachment of epoxide hydrolase to dextran. Enz. Microbiol. Technol. 7: 66-72.
Jack T.R., Zajíc J.E. (1977) The enzymatic conversion of Lhistidine to urocanic acid by whole cells of Micrococcus luteus immobilized on carbodiimide activated carboxymethylcellulose. Biotechnol. Bioeng. 19: 631.
Jirku V., Turkova J., Krumphanzl V. (1980) Immobilization of yeast with retention of cell division and extracellular production of macromolecules. Biotechnol. Lett. 2: 509-513.
Karube, I.; Kawarai, M.; Matsuoka, H.; Suzuki, S. (1985) Production of L-glutamate by immobilized protoplasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21: 270-272.
·· «* · · ·
Kato T., Horikoshi K. (1984) Immobilized cyclomaltodextrin glucano-transferase of an alkalophilic Bacillus sp. no 38-2. Biotechnol. Bioeng. 26: 595-598.
Kaul R., D’Souza S.F., Nadkarni G.B. (1984) Hydrolysis of milk lactose by immobilized (-galactosidase-hen egg white powder. Biotechnol. Bioeng. 26: 901-904.
Khan S.S., Siddiqi A.M. (1985) Studies on chemically aggregated pepsin using glutaraldehyde. Biotechnol. Bioeng. 27: 415-419. Krakowiak W., Jach M., Korona J., Sugier H. (1984) Immobilization of glucoamylase on activated aluminium oxide. Starch/Starke 36: 396-398.
Kíihn W., Kirstein D., Mohr P. (1980) Darstellung und Eigenschaften tragerfixierter Glukoseoxydase. Acta Biol. med. Germ. 39: 1121-1128.
Mazumder T.K., Sonomoto K., Tanaka A., Fukui S. (1985) Sequential conversion of cortexolone to prednisolone by immobilized mycelia of Curvularia lunata and immobilized cells of
Arthrobacter simplex. App. Microbial. Biotechnol. 21: 154-161. Messing R.A., Oppermann R.A. (1979) Póre dimensions for accumulating biomass. I. Microbes that reproduce by fission or budding. Biotechnol. Bioeng. 21: 49-58.
Miyawaki O., Wingard jr L.B. (1984) Electrochemical and enzymatic activity of flavin dinucleotide and glucose oxidase immobilized by adsorption on carbon. Biotechnol. Bioeng. 26: 13641371.
Monsan P,
Combes D., Alemzadeh I. (1984) Invertase covalent grafting onto corn stover. Biotechnol. Bioeng. 26: 658-664.
Moři T., Sáto T., Tosa T., Chibata I. (1972) Studies on immobilised enzymes. X. Preparation and properties of aminoacylase entrapped into acrylamide gel-lattice. Enzymologia 43: 213-226. Nakajima H., Sonomoto K., Usui N., Sáto F., Yamada Y., Tanaka A., Fukui S., (1985) Entrapment of Lavendula Věra and production of pigments by entrapped cells. J. Biotechnol. 2: 107-117.
Navarro J.M., Durand G. (1977) Modification of yeast metabolism by immobilization onto porous glass. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 4: 243-254.
Právě P., Faust U., Sittig W., Sukatsch. D.A. (1984) Handbuch Biotechnologie, 2nd edition, R. Oldenbourg Verlag Munich, Vienna, 1984.
Qureshi N., Tamhane D.V. (1985) Production of mead by immobilized whole cells of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21: 280-281.
Raghunath K., Rao K.P., Joseph U.T. (1984) Preparation and characterization of urease immobilized onto collagen-poly(glycidyl methacrylate) graft copolymer. Biotechnol. Bioeng. 26: 104109.
Romanovskaya V.A., Karpenko V.I., Pantskhava E.S., Greenberg T.A., Malashenko Y.R. (1981) Catalytic properties of immobilized cells of methane-oxidizing and methanogenic bacteria. In: Moo-
Young M. (Ed.) Advances in Biotechnology, Vol. 3 Pergamon,
Toronto, p. 367-372.
Shimizu S., Morioka H., 1 Táni Y., Ogata K. (1975) Synthesis of
coenzyme A by immobilized microbial cells. J. Ferm. Technol. 53:
77-83.
Talsky G., Gianitsopoulos G. (1984 ) Intermolecular crosslinking
of enzymes. In: 3rd Eur . Congr. Biotechnol., Vol . 1, Verlag
Chemie, Weinheim, p. 299-305.
Umemura I., Takamatsu S., Sáto T., Tosa T., Chibata I. (1984) Improvement of production of L-aspartic acid using immobilized microbial cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 291-295.
Van Haecht J.L., Bolipombo M., Rouxhet P.G. (1985) Immobilization of Saccaromyces cerevisiae by adhesion: treatment of the cells by AI ions. Biotechnol. Bioeng. 27: 217-224.
Vogel H.J., Brodelius P. (1984) an in vivo 31P NMR comparison of freely suspended and immobilized Catharanthus roseus plant cells. J. Biotechnol. 1: 159-170.
Weetall H.H., Mason R.D. (1973) Studies on immobilized papain. Biotechnol. Bioeng. 15: 455-466.
• · · « ·
Wiegel J., Dykstra M. (1984) Clostridium thermocellum: adhesion and sporulation while adhered to cellulose and hemicellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 59-65.
Workman W.E., Day D.F. (1984) Enzymatic hydrolysis of inulin to fructose by glutaraldehyde fixed yeast cells. Biotechnol. Bioeng. 26: 905-910.
Citovaná patentová literatura:

Claims (10)

1. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I kde
Ri až Rg představují nezávisle na sobě atom vodíku a substituent;
m je 0, 1 nebo 2;
n je 0, 1, 2 nebo 3; a vazby označené A, B, C, D, E a F označují nezávisle na sobě, že dva sousední atomy jsou spojeny dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou a epoxidovým můstkem vzorce nebo jednoduchou vazbou a methylenovým můstkem vzorce
XX H2
XX což zahrnuje ve vhodných případech i E/Z isomery, a/nebo jejich tautomery, vždy ve volné formě nebo ve formě soli, vyznačující se tím, že zahrnuje
1) uvedení sloučeniny obecného vzorce II kde
Ri až R7, m, n, A, B, C, D, E, výše uvedeném vzorci I,
F mají tentýž význam jako ve do kontaktu s biokatalyzátorem, který je schopen specificky oxidovat alkohol v pozici 4'' za vzniku sloučeniny obecného vzorce III r7 kde Ri, R2, R3, R4, R5, R6r R?, m, n, A, B, C, D, E a F mají tentýž význam jako ve vzorci I; a
2)reakci sloučeniny obecného vzorce III s aminem vzorce HN(R8)Rg, kde R8 a Rg mají tentýž význam jako ve vzorci I, za přítomnosti redukčního činidla;
a v každém případě, pokud se to vyžaduje, přeměnu sloučeniny vzorce I získané podle tohoto způsobu nebo jiným způsobem, nebo jejího E/Z izomeru nebo tautomeru, vždy ve volné formě nebo ve formě soli, na odlišnou sloučeninu vzorce I nebo na její E/Z izomer nebo tautomer, vždy ve volné formě nebo ve formě soli, oddělení směsi E/Z izomerů získaných podle předkládaného způsobu a izolaci požadovaného izomeru, a /nebo přeměnu volné sloučeniny vzorce I získané podle předkládaného způsobu nebo jiným způsobem nebo jejího izomeru nebo tautomeru na sůl nebo přeměnu soli sloučeniny I nebo jejího E/Z izomeru nebo tautomeru získané podle předkládaného způsobu nebo jiným způsobem na jinou sůl.
2. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce III
99 ·· • · · 9
9 9 9 ·
9 9 999 • 9 9 • 9 *> ·
9 · 9 9 9 9
9 9 9
9 9 999
9 9 9
9 9 9 «9 99
9 9 9 9
9 9 ♦
9 9 9
9 9 9
9· 9 9 9 9 kde Rj, R2, R3, R4, Rs, R6, R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají tentýž význam jako ve vzorci I v nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje
1) uvedení sloučeniny obecného vzorce II
R7 'CH2R6
9 9 9 ·« ··#· • · ·
9 9 9 99
9 9 9
9 · ·♦·· kde
Ri až R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají tentýž význam jako ve výše uvedeném vzorci I;
do kontaktu s biokatalyzátorem, který je schopný specificky oxidovat alkohol v pozici 4'', udržování tohoto kontaktu po dobu dostatečnou pro to, aby proběhla oxidační reakce a izolaci a čistění sloučeniny obecného vzorce II.
3. Způsob podle nároku 1 pro přípravu sloučeniny vzorce I, vyznačující se tím, že n je 1;
m je 1;
A je dvojná vazba;
B je jednoduchá nebo dvojná vazba;
C je dvojná vazba;
D je jednoduchá vazba;
E je dvojná vazba;
F je dvojná vazba; nebo jednoduchá vazba a epoxidový můstek; nebo jednoduchá vazba a methylenový můstek;
Ri, R2 a R3 jsou atomy vodíku;
R4 je methylová skupina;
R5 je alkyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, cykloalkyl obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo alkenyl obsahující 2 až 10 atomů uhlíku;
R5 je atom vodíku;
R7 je skupina -OH;
R8 a Rg jsou nezávisle na sobě atom vodíku; alkyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku nebo acyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku; nebo dohromady tvoří -(CH2)q~; a q je 4, 5 nebo 6.
4. Způsob podle nároku 1 pro přípravu sloučeniny vzorce I, vyznačující se tím, že n je 1;
m je 1;
A, B, C, E a F jsou dvojné vazby;
D je jednoduchá vazba;
Ri, R2 a R3 jsou atomy vodíku;
R4 je methyl;
R5 je s-butyl nebo isopropyl;
Rg je atom vodíku;
R7 je skupina -OH;
R8 je methyl;
Rg je atom vodíku.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se připraví benzoátová sůl 4''-deoxy-4''-N-methylaminoavermectinu Bia/Bib.
6. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že biokatalyzátorem je mikroorganismus.
7. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že biokatalyzátor je vybrán ze skupiny složené z:
··» · *· ·· • 9 · · · • · · · · *
9 9 9 · · • ♦ · · ·»· ·· 9999
a) živých mikroorganismů ve formě vegetativních buněk, klidových buněk nebo lyofilizovaných buněk,
b) spor jmenovaných mikroorganismů
c) mrtvých mikroorganismů, s výhodou v částečně degintegrované formě, což znamená s buněčnou stěnou nebo buněčnou membránou, která je mechanicky, chemicky nebo pomocí sušení rozprašováním permeabilizována,
d) surových extraktů buněčného obsahu daných mikroorganismů, a
e) enzymů, které přeměňují sloučeniny vzorce II na sloučeniny vzorce III.
8. Způsob podle nároků 3 nebo 4, vyznačující se tím, že mikroorganismem je zástupce rodu Streptomyces.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že mikroorganismem je kmen Streptomyces vybraný ze skupiny sestávající ze Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis; Streptomyces lydicus; Streptomyces saraceticus a Streptomyces kasugaensis.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že mikroorganismem je kmen Streptomyces R-922 zapsaný pod přírůstkovým číslem DSM-13136.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že mikroorganismem je kmen Streptomyces 1-1529 zapsaný pod přírůstkovým číslem DSM-13135.
12. Způsob výroby sloučeniny obecného vzorce III, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
1) přípravu buněk inokulací živného média, které podporuje buněčný růst, předpěstovanou kulturou mikroorganismu schopného přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III;
»9 9999 » 9 9 » 9 999
I 9 9 »9 «
9« 999
99 »9 » 9 9 ·
I 9 « 9 í 9 9 9 9 »9 9
99 99 «9 9« • 9 · ·
9 « · • · 9 ·
9 · ·
99 9999
2) získání buněk po ukončení růstu
3) rozpuštění sloučeniny vzorce II ve vhodném rozpouštědle
4) přidání roztoku z kroku 3 k reakčnímu médiu, které nepodporuje množení buněk
5) přidání buněk z kroku 2 k reakčnímu médiu z kroku 4
6) třepání nebo míchání reakční směsi z kroku 5 za přítomnosti vzduchu
7) oddělení buněk od média
8) extrakci supernatantu a buněk vhodnými rozpouštědly
9) zakoncentrování organické fáze rozpouštědla z kroku 8
10) čistění sloučeniny vzorce III obsažené v extraktu 9 pomocí chromatografie nebo krystalizace.
13. Způsob výroby sloučeniny vzorce III, vyznačující se t í m , že zahrnuje následující kroky:
1) rozpuštění sloučeniny vzorce II ve vhodném rozpouštědle
2) přidání roztoku z kroku 1 k živnému médiu, které podporuje buněčný růst
3) inokulaci živného média z kroku 2 předpěstovanou kulturou mikroorganismu, který je schopen přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III
4) kultivaci mikroorganismů schopných přeměnit sloučeninu vzorce II na sloučeninu vzorce III
5) oddělení buněk od média
6) extrakci supernatantu a buněk vhodnými rozpouštědly
44 ·* β · · · • 4 4 · « 4 · · · *
4 4 4
4 « 4 4
44 ··»·
4 4 4 • · 4 · 4 • 4 4 4
4 4 ·
44 444 • 4 ·4
4 4 · 4
4 4 ·
4*4 4·4
4« ··4 4
7) zakoncentrování organické fáze rozpouštědla z kroku 6 ve vakuu
8) čištěni sloučeniny vzorce III obsažené v extraktu 7 pomocí chromatografie nebo krystalizace.
14. Způsob podle nároků 12 nebo 13, vyznačující se tím, že sloučenina vzorce II je avermectin a sloučenina vzorce
III je 4''-oxoavermectin.
CZ20021616A 1999-11-12 2000-11-10 Příprava makrocyklického laktonu CZ20021616A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9926887.2A GB9926887D0 (en) 1999-11-12 1999-11-12 Organic compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20021616A3 true CZ20021616A3 (cs) 2002-07-17

Family

ID=10864471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021616A CZ20021616A3 (cs) 1999-11-12 2000-11-10 Příprava makrocyklického laktonu

Country Status (24)

Country Link
US (1) US6808903B1 (cs)
EP (1) EP1228078B1 (cs)
JP (1) JP3671003B2 (cs)
KR (1) KR20020063890A (cs)
CN (2) CN100519574C (cs)
AR (1) AR026411A1 (cs)
AT (1) ATE240340T1 (cs)
AU (1) AU763109B2 (cs)
BR (1) BR0015489B1 (cs)
CA (1) CA2388824A1 (cs)
CZ (1) CZ20021616A3 (cs)
DE (1) DE60002751T2 (cs)
DK (1) DK1228078T3 (cs)
ES (1) ES2199883T3 (cs)
GB (1) GB9926887D0 (cs)
HK (1) HK1051204A1 (cs)
HU (1) HUP0204437A3 (cs)
IL (2) IL149369A0 (cs)
MX (1) MXPA02004512A (cs)
PL (1) PL354894A1 (cs)
PT (1) PT1228078E (cs)
RU (1) RU2234511C2 (cs)
WO (1) WO2001036434A1 (cs)
ZA (1) ZA200203612B (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR034703A1 (es) * 2001-05-16 2004-03-17 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones para preparar emamectina.
NZ548935A (en) * 2006-07-06 2007-03-30 Wyeth Corp Biocatalytic oxidation of LL-F28249-alpha
CN109485683A (zh) * 2018-11-27 2019-03-19 齐鲁晟华制药有限公司 一种含氟系列阿维菌素衍生物及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) * 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4427663A (en) * 1982-03-16 1984-01-24 Merck & Co., Inc. 4"-Keto-and 4"-amino-4"-deoxy avermectin compounds and substituted amino derivatives thereof
US4874749A (en) * 1987-07-31 1989-10-17 Merck & Co., Inc. 4"-Deoxy-4-N-methylamino avermectin Bla/Blb
US5030622A (en) * 1989-06-02 1991-07-09 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
IL98599A (en) 1990-06-28 1995-06-29 Merck & Co Inc Stable salts of "4-deoxy-" 4-epi-methylamino abramectin and insecticides containing them
EP0736252A3 (en) * 1995-04-05 1997-05-02 Ciba Geigy Ag Synergistic compositions with diafanthiuron

Also Published As

Publication number Publication date
DE60002751T2 (de) 2004-02-26
HK1051204A1 (en) 2003-07-25
IL149369A0 (en) 2002-11-10
MXPA02004512A (es) 2002-09-02
IL149369A (en) 2007-07-04
JP2003514542A (ja) 2003-04-22
EP1228078A1 (en) 2002-08-07
AU763109B2 (en) 2003-07-10
DK1228078T3 (da) 2003-09-15
ZA200203612B (en) 2003-02-26
ATE240340T1 (de) 2003-05-15
RU2234511C2 (ru) 2004-08-20
CN100519574C (zh) 2009-07-29
EP1228078B1 (en) 2003-05-14
BR0015489B1 (pt) 2012-11-27
DE60002751D1 (de) 2003-06-18
PT1228078E (pt) 2003-09-30
BR0015489A (pt) 2002-06-25
CN1390226A (zh) 2003-01-08
ES2199883T3 (es) 2004-03-01
HUP0204437A2 (hu) 2003-04-28
CN1165542C (zh) 2004-09-08
US6808903B1 (en) 2004-10-26
HUP0204437A3 (en) 2005-05-30
CA2388824A1 (en) 2001-05-25
RU2002113754A (ru) 2004-01-20
AR026411A1 (es) 2003-02-12
AU1520901A (en) 2001-05-30
JP3671003B2 (ja) 2005-07-13
CN1523116A (zh) 2004-08-25
GB9926887D0 (en) 2000-01-12
KR20020063890A (ko) 2002-08-05
PL354894A1 (en) 2004-03-22
WO2001036434A1 (en) 2001-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101111027B1 (ko) 미생물을 이용한 비타민 ｃ의 제조방법
EP0552894A2 (en) D-tagatose production by enzymatic isomerization of D-galactose
AU2016287537A1 (en) Use of Microbacterium strains for the production of antibacterial agents
US7118882B2 (en) Process for the preparation of gallic acid by co-culture
KR20080018880A (ko) 리보플라빈의 발효 생산 시에 영양 배지로서 용해 처리되는바이오매스의 재활용
RU2196826C2 (ru) Способ биотрансформации соединений колхициноидов в соответствующие 3-гликозилпроизводные
US20080009044A1 (en) Biocatalytic oxidation process useful in the manufacture of moxidectin
CZ20021616A3 (cs) Příprava makrocyklického laktonu
JP2719785B2 (ja) ミルベマイシン誘導体の微生物利用による製造方法
US5183749A (en) Microbial process for the preparation of milbemycin derivatives
RU2218409C2 (ru) Способ биотрансформации колхиконового соединения в соответствующее 3-0-гликозильное производное
JPS62181793A (ja) バリエナミンおよびバリダミンの製造法
IE63088B1 (en) Biocatalysts and processes for the manufacture thereof
JP2000166546A (ja) β−１，３−キシラナーゼの製造方法
Vepritskaya et al. Selection of ergot alkaloid producers by induced mutagenesis
JPH10165195A (ja) （ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリドンの製造法
JPH05207894A (ja) マクロライド系抗生物質の製造法
JPH0627103B2 (ja) 新規物質ｕｃｎ―１０２８ｃ