ES2199883T3

ES2199883T3 - Preparacion de una lactona macrociclica.

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Publication number: ES2199883T3
Application number: ES00977526T
Authority: ES
Inventors: Johannes Paul Pachlatko; Thomas Pitterna; Volker Jungmann
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2020-11-10
Also published as: HK1051204A1; PT1228078E; BR0015489A; HUP0204437A2; EP1228078B1; CN1165542C; BR0015489B1; WO2001036434A1; CN1390226A; CA2388824A1; US6808903B1; GB9926887D0; CN1523116A; AU763109B2; EP1228078A1; ZA200203612B; CN100519574C; AU1520901A; RU2234511C2; ATE240340T1

Abstract

Procedimiento para la preparación de un compuesto de **fórmula** en donde R1-R9 representan, independientemente entre sí, hidrógeno o un substituyente; m es 0, 1 o 2; n es 0, 1, 2 o 3; y los enlaces marcados con A, B, C, D, E y F indican, independientemente entre sí, que dos átomos de carbono adyacentes están conectados por un doble enlace, por un enlace sencillo, por un enlace sencillo y por un puente epóxido de fórmula, o por un enlace sencillo y por un puente metileno de fórmula incluyendo, cuando sea aplicable, un isómero E/Z, una mezcla de isómeros E/Z y/o un tautómero de dicho compuesto, en cada caso en forma libre o en forma de sal.

Description

Preparación de una lactona macrocíclica.

La presente invención se relaciona con un procedimiento para la preparación de una lactona macrocíclica, con un procedimiento para la preparación de los compuestos intermedios y con los compuestos intermedios usados en dicho procedimiento. Más particularmente, la invención se relaciona con un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula

1

en donde

R_{1}-R_{9} representan, independientemente entre sí, hidrógeno o un substituyente;

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1, 2 ó 3; y

los enlaces marcados con A, B, C, D, E y F indican, independientemente entre sí, que dos átomos de carbono adyacentes están conectados por un doble enlace, por un enlace sencillo, por un enlace sencillo y por un puente epóxido de fórmula

2, o por un enlace sencillo y por un puente metileno de fórmula

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incluyendo, cuando sea aplicable, un isómero E/Z, una mezcla de isómeros E/Z y/o un tautómero de dicho compuesto, en cada caso en forma libre o en forma de sal,

cuyo procedimiento comprende

1) poner en contacto un compuesto de fórmula

4

en donde

R_{1}-R_{7}, m, n, A, B, C, D, E y F se definen como en la fórmula (I) anteriormente, con un biocatalizador que es capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4'' con el fin de formar un compuesto de fórmula

5

en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, m, n, A, B, C, D, E y F se definen como en la fórmula (I) anteriormente; y

2) reaccionar el compuesto de fórmula (III) con una amina de fórmula HN(R_{8})R_{9} en donde R_{8} y R_{9} tienen los significados dados para la fórmula (I), y como es conocido, en presencia de un agente reductor;

y, en cada caso, si se desea, convertir un compuesto de fórmula (I) obtenible según el procedimiento o por cualquier otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, a un compuesto diferente de fórmula (I) o a un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal; separar una mezcla de isómeros E/Z obtenible según el procedimiento y aislar el isómero deseado; y/o convertir un compuesto libre de fórmula (I) obtenible según el procedimiento o por cualquier otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, a una sal o convertir una sal, obtenible según el procedimiento o por cualquier otro método, de un compuesto de fórmula (I) o de un isómero E/Z o tautómero del mismo, al compuesto libre de fórmula (I) o a un isómero E/Z o tautómero del mismo, o bien a una sal diferente.

En la bibliografía al respecto se describen métodos de síntesis de los compuestos de fórmula (I). Sin embargo, se ha comprobado que los procedimientos conocidos por la bibliografía al respecto causan problemas considerables durante la producción, a la vista básicamente de los bajos rendimientos y de los procedimientos tediosos que han de ser utilizados. Por ejemplo, la EP-A 0 465 121 describe compuestos de 4''- ceto- y 4''-amino-4''-deoxi avermectina y amino derivados substituidos de los mismos. El grupo 4''-hidroxi de los compuestos de avermectina son oxidados a un grupo cetona o reemplazados por un grupo amino (substituido). Los grupos hidroxi en las posiciones 5 y 23 necesitan ser protegidos con el fin de evitar oxidaciones indeseadas. El compuesto 4''-ceto es aminado para proporcionar el compuesto correspondiente al de la fórmula (I) anterior. Por tanto, los procedimientos conocidos no son satisfactorios a este respecto, lo cual se traduce en la necesidad de disponer de un procedimiento de preparación mejorado para dichos compuestos.

Los compuestos (I), (II) y (III) pueden estar en forma de tautómeros. En consecuencia, tanto anteriormente como de aquí en adelante, y cuando resulte adecuado, los compuestos (I), (II) y (III) han de ser considerados como incluyendo los correspondientes tautómeros, incluso si estos últimos no se mencionan concretamente en cada caso.

Los compuestos (I), (II) y (III) son capaces de formar sales de adición de ácido. Dichas sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales como ácidos minerales, por ejemplo, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido nitroso, un ácido fosfórico o un ácido hidrohálico, con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcano(C_{1}-C_{4})carboxílicos insubstituidos o substituidos, por ejemplo halo-substituidos, por ejemplo ácido acético, ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo ácidos oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico o ftálico, ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácidos ascórbico, láctico, málico, tartárico o cítrico, o ácido benzoico, o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos alcano(C_{1}-C_{4})- o aril-sulfónicos insubstituidos o substituidos, por ejemplo halo-substituidos, por ejemplo ácido metano- o p-toluenosulfónico. Además, los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) que tienen al menos un grupo ácido son capaces de formar sales con bases. Sales adecuadas con bases son, por ejemplo, sales metálicas, tales como sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, por ejemplo, sales de sodio, potasio o magnesio, o bien sales con amoniaco o con una amina orgánica, tal como morfolina, piperidina, pirrolidina, una mono-, di- o tri-alquil(inferior)amina, por ejemplo etil-, dietil-, trietil- o dimetil-propil-amina, o una mono-, di- o tri-hidroxialquil(inferior)amina, por ejemplo mono-, di- o tri- etanolamina. Además, también se pueden formar las correspondientes sales internas. Dentro del alcance de la invención se da preferencia a las sales agroquímicamente convenientes. A la vista de la estrecha relación existente entre los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) en forma libre y en forma de sus sales, cualquier referencia tanto antes como a continuación a los compuestos libres de fórmula (I), (II) y (III) o a sus respectivas sales ha de entenderse como incluyendo también las correspondientes sales o los compuestos libres de fórmula (I), (II) y (III), cuando resulte adecuado y conveniente. Lo mismo se puede decir en el caso de tautómeros de compuestos de fórmula (I), (II) y (III) y de sus sales. En cada caso, se prefiere generalmente la forma libre.

Dentro del alcance de esta invención se prefiere un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula (I), en donde

n es 1;

m es 1;

A es un doble enlace;

B es un enlace sencillo o un doble enlace;

C es un doble enlace;

D es un enlace sencillo;

E es un doble enlace;

F es un doble enlace; o un enlace sencillo y un puente epoxi; o un enlace sencillo y un puente metileno;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son H;

R_{4} es metilo;

R_{5} es alquilo C_{1}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{8} o alquenilo C_{2}-C_{10};

R_{6} es H;

R_{7} es OH;

R_{8} y R_{9} son independientemente entre sí H; alquilo C_{1}-C_{1} o acilo C_{1}-C_{10}; o juntos forman -(CH_{2})_{q}-; y

q es 4, 5 ó 6.

Especialmente preferido dentro del alcance de esta invención es un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) en donde

n es 1

m es 1;

A, B, C, E y F son enlaces dobles;

D es un enlace sencillo;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son H;

R_{4} es metilo;

R_{5} es s-butilo o isopropilo;

R_{6} es H;

R_{7} es OH;

R_{8} es metilo;

R_{9} es H.

Muy especialmente preferido es un procedimiento para la preparación de emamectina, más particularmente la sal benzoato de emamectina. La emamectina es una mezcla de 4''-deoxi-4''-N-metilamino avermectina B_{1a}/B_{1b} y se describe en US-P-4.4874.749 y como MK-244 en el Journal of Organic Chemistry, Vol. 59 (1994), 7704-7708. Sales de emamectina que son especialmente valiosas como compuestos agroquímicos se describen en US-P-5.288.710. Los compuestos de fórmula (I) son pesticidas valiosos, especialmente para combatir insectos y representantes del género de los ácaros. Las plagas mencionadas incluyen, por ejemplo, aquellas citadas en la página 5, líneas 55 a 58, página 6 y página 7, líneas 1 a 21 en la solicitud de patente europea EP-A 736.252. Las plagas allí mencionadas se incluyen en la materia objeto de la presente invención.

Los términos generales usados anteriormente y de aquí en adelante tienen los siguientes significados, salvo que se indique otra cosa:

Los grupos y compuestos que contienen carbono contienen de 1 hasta 8 inclusive, preferentemente de 1 hasta 6 inclusive, en especial de 1 hasta 4 inclusive, y más especialmente 1 ó 2, átomos de carbono.

Alquilo es de cadena lineal, es decir, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, o de cadena ramificada, por ejemplo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo, neopentilo o isohexilo.

Alquenilo, tanto como un grupo per se como en forma de un elemento estructural de otros grupos y compuestos, por ejemplo haloalquenilo y arilalquenilo, es, teniendo en cuenta en cada caso el número de átomos de carbono presentes en el grupo o compuesto en cuestión, de cadena lineal, por ejemplo vinilo, 1-metilvinilo, alilo, 1-butenilo o 2-hexenilo, o de cadena ramificada, por ejemplo isopropenilo.

Cicloalquilo C_{3}-C_{6} es ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, en especial ciclohexilo.

Otros aspectos de la invención son

-: los compuestos de fórmula (III) como se ha definido anteriormente; o

-: un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula (III) a partir del compuesto de fórmula (II) según la etapa 1) anterior; o

-: un procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula (I) a partir del compuesto de fórmula (III) según la etapa 2) anterior.

Dentro del alcance de la presente invención, el término "biocatalizador" ha de ser considerado como incluyendo:

a): un microorganismo vivo, por ejemplo en forma de células vegetativas, células en reposo o células liofilizadas,

b): las esporas de dicho microorganismo,

c): un microorganismo muerto, preferentemente en una forma parcialmente desintegrada, es decir con la pared/membrana de la célula permeabilizada de forma mecánica o química o mediante secado por aspersión,

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d): extractos en bruto del contenido celular de dicho microorganismo y

e): una enzima que convierte los compuestos de fórmula (II) a los compuestos de fórmula (III).

Las bacterias y los hongos son microorganismos especialmente adecuados para el procedimiento según la invención. Bacterias adecuadas son especialmente bacterias representativas de Actinomicetos, en especial del género Streptomyces. Se prefieren las cepas del género Streptomyces seleccionadas del grupo consistente en Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus y Streptomyces kasugaensis. Las cepas Streptomyces R-922 (Streptomyces tubercidicus) y especialmente Streptomyces I-1529 (Streptomyces tubercidicus), han resultado ser particularmente adecuadas para la oxidación regioespecífica del grupo del grupo hidroxi en la posición 4'' de los compuestos de fórmula (II).

Las cepas de Streptomyces: Streptomyces I-1529 y Streptomyces R-922 han sido depositadas de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig-Germany, con el número de registro DSM-13135 y DSM- 13136, respectivamente, el 5 de noviembre de 1999.

Han sido identificadas otras cepas que pueden utilizarse adecuadamente para efectuar la oxidación regioespecífica según la invención, incluyendo, por ejemplo, la cepa Streptomyces MAAG-7027 (Streptomyces tubercidicu), la cepa Streptomyces DSM-40241 (Streptomyces saraceticus, también identificada como Streptomyces chattanoogensis), la cepa Streptomyces NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp. lydicus) y la cepa Streptomyces A/96-1208710 (Streptomyces kasugaensis). Todas las cepas anteriores están estrechamente relacionadas con las cepas Streptomyces: Streptomyces I- 1529 y Streptomyces R-922, respectivamente, lo cual puede ser demostrado mediante un análisis 16s rDNA que revela identidades comprendidas entre 99,4% y 100%.

Los compuestos de fórmula (I) son conocidos por ser agentes altamente activos para el control de plagas en plantas. En el procedimiento conocido para la preparación de los compuestos de fórmula (I), por ejemplo, como el descrito en EP 301 806 y también en el procedimiento microbiano según la invención, los compuestos de fórmula (II) se emplean como materiales de partida.

En los procedimientos conocidos, en una primera etapa, los compuestos de fórmula (II) se protegen en el oxígeno de la posición 5, luego se oxidan a la 4''-cetona, seguido por conversión a la amina y desprotección del grupo hidroxi enmascarado en la posición 5, empleando para ello la tecnología convencional de grupos protectores tal como es descrita por Greene y Wuts, 1999 (Protective Groups in Organic Shyntesis).

El procedimiento según la presente invención tiene la ventaja de que solo comprende dos etapas en comparación con las cuatro etapas de los procedimientos conocidos. Además, evita el uso de grupos protectores y resulta ecológicamente más seguro puesto que han de utilizarse menos compuestos químicos. El compuesto de fórmula (III) resultante de la etapa biocatalítica según la invención ha sido dado a conocer, por ejemplo, en EP 401 029.

En una modalidad específica, el procedimiento según la invención puede realizarse, de forma detallada, como sigue:

En una primera etapa, se preparan los compuestos de fórmula (III). Esto se puede realizar poniendo en contacto directamente un compuesto de fórmula (II) con un catalizador que es capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4'' a una cetona de fórmula (III) y manteniendo este contacto durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar la reacción de oxidación.

Más concretamente, el procedimiento se efectúa usando un microorganismo como biocatalizador, cuyo microorganismo es capaz de efectuar la reacción de oxidación según la invención. Con preferencia, dicho microorganismo es cultivado en un medio de cultivo adecuado que promueve la proliferación microbiana y bajo condiciones controladas en presencia de un compuesto de fórmula (II), y manteniendo la incubación conjunta de dicho microorganismo y de su substrato durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de oxidación, preferentemente hasta que el 25 a 99%, más preferentemente el 50 a 99,9% y muy particularmente el 80 a 99,9% del compuesto añadido de fórmula (II) se ha convertido a los compuestos de fórmula (III).

Alternativamente y de forma más preferente, el procedimiento se efectúa cultivando en primer lugar un microorganismo capaz de llevar a cabo la reacción de oxidación según la invención en un medio de cultivo adecuado que promueve la proliferación microbiana y bajo condiciones controladas, y recogiendo entonces la biomasa del microorganismo aplicando métodos adecuados tales como, por ejemplo, por filtración o centrifugado. La biomasa del microorganismo se emplea entonces de forma inmediata como un catalizador para la conversión de compuestos de fórmula (II) a compuestos de fórmula (III), o bien se puede guardar en frío como tal o después de la liofilización o secado por aspersión, antes de utilizarse en la reacción. Dicho microorganismo, bien recogido recientemente o guardado como antes se ha descrito, y un compuesto de fórmula (II) son incubados entonces juntos en un medio de reacción que no favorece la proliferación microbiana, durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de oxidación, con preferencia hasta que el 25 a 99,9%, más preferentemente el 50 a 99,9% y muy particularmente el 80 a 99,9% del compuesto añadido de fórmula (II) se ha convertido a los compuestos de fórmula (III).

El producto de reacción de fórmula (III) obtenido de este modo se puede separar del material de partida de fórmula (II) sin grandes medidas técnicas, por medio de los métodos de separación usuales, por ejemplo mediante cristalización fraccionada o mediante cromatografía. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía en columna, cromatografía en capa gruesa o cromatografía en capa delgada sobre materiales de soporte minerales tales como gel de sílice o sobre resinas intercambiadoras orgánicas.

En lugar de estructuras de células vegetativas, se pueden emplear esporas microbianas cuyas esporas son recogidas de los microorganismos que son capaces de oxidar específicamente el alcohol de la posición 4'' a una cetona de fórmula (III) siendo incubadas entonces con un compuesto de fórmula (II) durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar la correspondiente reacción de oxidación. La incubación de las esporas y del substrato se efectúa preferentemente en ausencia de medio de cultivo con el fin de evitar que las esporas germinen.

Los compuestos de fórmula (II) se emplean como substrato para la reacción de oxidación según la invención. Estos compuestos son conocidos (véase DE 2717040) o pueden ser preparados a partir de compuestos conocidos de forma análoga a procedimientos ya conocidos. Los mismos son adecuados para controlar plagas en animales y plantas y además son materiales de partida o compuestos intermedios valiosos en la preparación de compuestos de fórmula (I). La preparación de compuestos de fórmula (III) se puede realizar también usando, para la oxidación de los compuestos de fórmula (II), no el microorganismo propiamente dicho sino constituyentes activos procedentes de este microorganismos (según las definiciones b) a e) dadas anteriormente) que son capaces de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4'' a una cetona de fórmula (III).

En consecuencia, otro aspecto de la presente invención consiste en el uso, en forma inmovilizada, de células de microorganismos vegetativos, extractos libres de células, esporas, enzimas y mezclas de enzimas de los citados microorganismos que son capaces de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4'' a una cetona de fórmula (III).

La inmovilización de dichos biocatalizadores se puede efectuar de forma análoga a procedimientos conocidos per se. Dentro del alcance de la presente invención se pueden mencionar especialmente los procedimientos basados en la unión adsortiva o el enlace iónico o covalente de dichos biocatalizadores a materiales de soporte sólidos, por regla general insolubles en agua, o en la reticulación de biocatalizadores mediante reactivos bi- o poli-funcionales, en la encapsulación en matrices, en la separación por membranas o en una combinación de dos o más de los procedimientos antes mencionados.

La unión adsortiva a soportes insolubles en agua (adsorbentes) se efectúa especialmente mediante fuerzas de van der Waals. Como adsorbentes son adecuados numerosos compuestos inorgánicos y orgánicos y también polímeros sintéticos.

Métodos para realizar dicha inmovilización de microorganismos son descritos por Bickerstaff (Ed.), 1997 (Inmovilización de enzimas y células), van Haecht et al., 1985 (células de levadura/vidrio), Black et al., 1984 (células de levadura/acero refinado, poliéster), Wiegel y Dykstra, 1984 (clostridios/celulosa, hemicelulosa), Förberg y Häggström, 19984 (clostridios/trozos de madera) y también por Ehrhardt y Rehm, 1985 (Psedudomonas/carbón activo). Los correspondientes detalles respecto al uso de enzimas inmovilizadas por unión adsortiva pueden encontrarse en Krakowiak et al., 1984 (glucoamilasa/óxido de aluminio), Cabral et al., 1984 (glucoamilasa/vidrio activado con titanio), Miyawaky y Wingard, 1984 (glucosa/oxidasa/carbón activo), Kato y Horikoshi, 1984 (glucosa transferasa/resina sintética) inter alia. Los enlaces iónicos están basados en atracciones electrostáticas entre grupos del material de soporte cargados de forma opuesta (tales como, por ejemplo, intercambiadores de iones comercialmente disponibles, por ejemplo aquellos basados en polisacáridos o en resinas sintéticas) y del biocatalizador que ha de ser enlazado.

Métodos de inmovilización de microorganismos, basados en el enlace iónico, son descritos por DiLuccio y Kirwan, 1984 (especies de Azotobacter/Cellex E (celulosa)) y por Girad et al., 1977 (células animales/DEAE-Sephadex). La correspondiente inmovilización de enzimas se puede efectuar de acuerdo con los detalles ofrecidos por Angelino et al., 1985 (aldehído oxidasa/octilamino- Sepharose 4B), Hofstee, 1973 (lactato dehidrogenasa/octilamino-Sephadex), Kühn et al., 1980 (glucosa oxidasa/DEAE-Sephadex, DEAE-celulosa) y otros.

Otro método de inmovilización está basado en el uso de fuerzas de enlace covalente, las cuales dan lugar generalmente a una conexión fija entre sí de los biocatalizadores o entre el biocatalizador y el material de soporte. Materiales de soporte adecuados son materiales porosos, tales como vidrios, sílice u otros materiales inorgánicos insolubles.

Dentro del alcance del procedimiento según la invención, los microorganismos pueden ser inmovilizados, por ejemplo, de forma análoga a la descrita por Messing y Oppermann, 1979 (Enterobacteria/vidrio de borosilicato; células de levadura/óxido de zirconio), Romanovskaya et al., 1981 (bacterias de metano/silocromo), Navarro y Durand, 1977 (células de levadura/sílice porosa).

La inmovilización de enzimas se puede efectuar según el método descrito por Weetall y Mason, 1973 (papaína/vidrio poroso) y Monsan et al., 1984 (invertasa/sílice porosa).

En el procedimiento según la invención no solo son adecuados para la inmovilización los materiales de soporte ya mencionados sino también toda una serie de polímeros naturales o sintéticos tales como, por ejemplo, celulosa, dextrano, almidón, agarosa, etc, o polímeros, por ejemplo, basados en derivados de ácidos acrílico y metacrílico, que normalmente se emplean en la preparación de copolímeros reactivos. Grupos reactivos adecuados, por medio de los cuales se forma un enlace al biocatalizador, son grupos dinitrofluorfenilo o isotiocianato reactivos o especialmente grupos oxirano y anhídrido de ácido. Otra posibilidad reside en la activación por cloruro de resinas que portan grupos carboxi, las cuales son comercialmente disponibles, por ejemplo, con los nombres comerciales Amberlite® XE-64 y Amberlite® IRC-50.

La inmovilización de microorganismos con ayuda de materiales de soporte naturales o sintéticos se puede efectuar en la forma descrita por Chipley, 1974 (Bacillus subtilis/agarosa), Gainer et al., 1980 (especies de azotobacter/celulosa), Jack y Zajic, 1977 (Micrococcus/carboximetilcelulosa), Jirku et al., 1980 (células de levadura/metacrilato de hidroxialquilo) y también por Shimizu et al., 1975 (células bacterianas/copolímero de etileno-anhídrido maleico). La inmovilización de enzimas se puede efectuar de forma análoga a la descrita por Cannon et al., 1984 (lactato oxidasa/celulosa), Dennis et al., 1984 (quimotripsina/Sepharose), Ibrahim et al., 1985 (epoxi hidrolasa/dextrano), Beddows et al., 1981 (\alpha-galactosidasa/copolímero de nylon-acrilato), Raghunath et al., 1984 (ureasa/metacrilato-acrilato), inter alia.

En el procedimiento de reticulación, los biocatalizadores se enlazan entre sí mediante reactivos bi- o poli-funcionales, tales como glutardialdehído, diisocianatos, inter alia, y forman agregados característicamente insolubles, normalmente gelatinosos, de alto peso molecular.

Dichas inmovilizaciones de microorganismos se pueden efectuar de forma análoga a la descrita por De Rosa et al., 1981 (células bacterianas/co-reticulación con albúmina de huevo por medio de glutardialdehíco). Procedimientos para la inmovilización de enzimas que pueden ser usados dentro del alcance de la presente invención son los descritos por Barbaric et al., 1984 (invertasa/reticulación con dihidrazida de ácido adípico), Talsky y Gianitsopoulos, 1984 (quimotripsina/enlace peptídico entre las moléculas enzimáticas sin agente de reticulación), Workman y Day, 1984 (inulinasa/reticulación de las células que contienen enzimas con glutardialdehído), Khan y Siddiqi, 1985 (pepsina/reticulación con glutardialdehído), Bachmann et al., 1981 (glucosa isomerasa/co-reticulación con gelatina por medio de glutardialdehído), Kaul et al., 1984 (\alpha-galactosidasa/co- reticulación con albúmina de huevo por medio de glutardialdehído).

La encapsulación en matrices comprende la inclusión de los biocatalizadores en polímeros naturales o sintéticos, los cuales son normalmente de estructura gelatinosa. Materiales de matriz que son especialmente adecuados para la inclusión de células, organelas y esporas son polímeros naturales tales como alginato, carragenano, peptina, agar, agarosa o gelatina, dado que estos compuestos no son tóxicos y protegen a las células durante su manipulación. También son adecuados los polímeros sintéticos tales como, por ejemplo, poliacrilamidas, resinas foto-reticuladas, inter alia. La forma de la encapsulación en la matriz es variable dentro de amplios límites y puede incluir, por ejemplo, formas esférica, cilíndrica, fibrosa y laminar. La inmovilización de microorganismos con ayuda de materiales de matriz naturales o sintéticos puede efectuarse en la forma descrita por Mazumder et al., 1985 (células bacterianas/resinas foto-reticuladas), Bettmann y Rehm, 1984 (células bacterianas/hidrazida de poliacrilamida), Umemura et al., 1984 (células bacterianas/carragenano), Karube et al., 1985 (protoplastos bacterianos/agar- acetilcelulosa), Cantarella et al., 1984 (células de levadura/metacrilato de hidroxietilo), Qureshi y Tamhane, 1985 (células de levadura/alginato), Deo y Gaucher, 1984 (Hyphomycetes/carragenano), Eikmeier y Rehm, 1984 (Hyphomycetes/alginato), Bihari et al., 1984 (conidios de Hyphomycetes/poliacrilamida), Vogel y Brodelius, 1984 (células de plantas/alginato, agarosa), Nakajima et al., 1985 (células de plantas/agar, alginato, carragenano).

La inmovilización de enzimas se puede efectuar de forma análoga a la descrita por Mori et al., 1972 (aminoacilasa/poliacrilamida).

La separación con membrana implica la creación de áreas definidas específicas en donde procede la reacción. Las variantes básicas de la separación con membrana se diferencian como sigue:

: a) microencapsulación

: b) técnica de liposomas

: c) el uso de biocatalizador en reactores de membrana.

Los métodos de inmovilización antes descritos se pueden combinar entre sí tal como, por ejemplo, adsorción y reticulación. En ese caso, las enzimas son en primer lugar adsorbidas sobre un soporte y luego reticuladas entre sí mediante un reactivo bifuncional.

La incubación de los biocatalizadores usados dentro del alcance de la presente invención con los compuestos de fórmula (II) para la oxidación específica del alcohol en la posición 4'' a una cetona de fórmula (III) se puede efectuar con ayuda de procedimientos tales como aquellos que son usuales en microbiología aplicada. Además del uso de cultivos sacudidos, se pueden mencionar especialmente varios sistemas fermentadores que han sido establecidos desde hace bastante tiempo en investigación microbiológica y en producción industrial.

La principal tarea de los birreactores es la creación de condiciones hidrodinámicas óptimas con el fin de reducir las constantes aparentes de Michaelis y aumentar la velocidad de reacción.

Esto se consigue esencialmente manteniendo un movimiento relativo adecuado entre el biocatalizador y el medio circundante, lo cual aumenta la transferencia de masa externa en un grado tal que en la práctica su impedimento deja ya de aplicarse.

Tipos de reactores que son adecuados para el procedimiento implicado incluyen, por ejemplo, reactores de recipiente agitado, reactores de tipo circuito, reactores de lecho, reactores de lecho fluidificado, reactores de membrana y también numerosas formas especiales de reactores, por ejemplo reactores de tamices agitados, reactores rómbicos, reactores tubulares, inter alia (W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger y A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Präve et al., Handbuch der Biotechnologie, 1984). Dentro del alcance de la presente invención se prefiere el uso de reactores de recipiente agitado.

Los reactores de recipiente agitado se encuentran entre los tipos de reactores más utilizados en el campo biotecnológico de la fermentación. Este tipo de reactor asegura un mezclado rápido y a fondo del substrato y del biocatalizador como resultado de las altas capacidades de agitación y de la elevada capacidad de transferencia de oxígeno.

Las ventajas de los reactores de recipiente agitado residen en su construcción simple y de este modo económica y en sus propiedades ya bien investigadas.

En principio, cuando se emplean reactores de recipiente agitado son posibles dos tipos de operación: en primer lugar, el procedimiento realizado "por lotes", el denominado procedimiento "discontinuo", y, en segundo lugar, un procedimiento continuo.

En el procedimiento "discontinuo", los biocatalizadores se retiran por separación o filtración una vez finalizado el procedimiento y son desechados (células vegetativas) o bien son utilizados de nuevo en un segundo lote (biocatalizadores inmovilizados).

Cuando se emplea el procedimiento continuo, existe un intercambio continuo permanente de substrato nuevo por el producto final de la reacción. Ha de evitarse que los biocatalizadores salgan del reactor empleando cualquier medida adecuada (tamices, filtros, dispositivos de retorno).

El cultivo de células vegetativas de microorganismos dentro del alcance de la presente invención se efectúa de acuerdo con los métodos usuales conocidos, empleándose preferentemente medios nutrientes líquidos por motivos prácticos.

La composición de los medios nutrientes varía dependiendo del microorganismo usado. En general, se prefieren medios complejos con fuentes fácilmente asimilables y pobremente definidas de carbono (C) y de nitrógeno (N), tal como se emplean normalmente, por ejemplo, también para la producción de antibióticos.

Por otro lado, es necesario utilizar vitaminas e iones metálicos esenciales que, sin embargo, por regla general están contenidos en una concentración adecuada como constituyentes o impurezas en los medios nutrientes complejos usados. Si se desea, dichos constituyentes tales como, por ejemplo, vitaminas esenciales y también iones Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, NH_{4}^{+}, (SO_{4})^{2-}, Cl^{-}, (CO_{3})^{2-} y las trazas de elementos cobalto y manganeso y zinc, inter alia, se pueden añadir en forma de sus sales. Fuentes de nitrógeno especialmente adecuadas, además de extractos de levadura, hidrolizados de levadura, autolizados de levadura y células de levadura, son especialmente harina de soja, harina de maíz, harina de avena, edamina (lactalbúmina enzimáticamente digerida), peptona, hidrolizado de caseína, licores de maceración de maíz y extractos de carne.

La concentración preferida de dichas fuentes de N es de 0,1 a 6 g/l. Fuentes de carbono adecuadas son, especialmente, glucosa, lactosa, sucrosa, dextrosa, maltosa, almidón, cerelosa, celulosa, manitol, extracto de malta y melazas. La gama de concentración preferida de dichas fuentes de carbono es de 1 a 25 g/l. El uso de D-glucosa, almidón soluble o extracto de malta y también de cerelosa, como fuentes de carbono, constituye una ventaja en el proceso de oxidación descrito a continuación, especialmente si los microorganismos usados son representantes del género Streptomyces. Por tanto, por ejemplo, los siguientes medios de cultivo resultan excelentemente adecuados para representantes del género Streptomyces:

Medio 1

1,0 g de almidón soluble

0,2 g de peptona

0,2 g de extracto de levadura

ajustar a 1 litro con agua destilada, ajustar a pH 7 con NaOH, autoclave.

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Medio 2

4,0 de D-glucosa

10,0 g de extracto de malta

4,0 g de extracto de levadura

ajustar a 1 litro con agua destilada, ajustar a pH 7 con NaOH, autoclave.

Medio 3

10,0 g de glicerol

20,0 g de dextrina

10,0 g de soytone (Difco Manual, 9ª ed., Detroit, Difco Laboratorios, 1969)

2,0 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}

2,0 g de CaCO_{3}

ajustar a 1 litro con agua destilada, ajustar a pH 7 con NaOH, autoclave.

Medio 4

10,0 g de D-glucosa

10,0 g de extracto de malta

3,0 g de extracto de levadura

10,0 g de Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton Oil Co., Memphis TN, USA)

1,0 g de extracto de carne

ajustar a 1 litro con agua destilada, ajustar a pH 7 con NaOH, autoclave.

Medio 5 (agar ISP-2)

extracto de levadura	4 g (Oxoid Ltd, Basingstoke, Hampshire, England)
D(+)-glucosa	4 g
extracto de malta bacto	10 g (Difco No. 0186-17-7)
agar	20 g (Difco No. 0140-01)

se disuelven en 1 litro de agua desmineralizada y se ajusta el pH a 7. La solución se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos, se enfría y se mantiene a 55ºC durante el breve tiempo necesario para la preparación intermedia de las placas de agar.

Medio 6 (medio PHG)

peptona	10 g (Sigma 0521)
extracto de levadura	10 g (Difco)
D-(+)-glucosa	10 g
NaCl	2 g
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	0,15 g
NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O	1,3 g
K_{2}HPO_{4}	4,4 g

se disuelven en 1 litro de agua desmineralizada y se ajusta el pH a 7.

Los medios antes mencionados son también excelentemente adecuados para el cultivo de representantes del género Streptomyces y para llevar a cabo la reacción de oxidación. Tanto los datos generales anteriores sobre la composición del medio como también los medios indicados aquí de forma detallada, sirven meramente para ilustrar la presente invención y de ningún modo para limitarla.

Además de la composición del medio, el procedimiento usado para producir dicho medio, tal como, por ejemplo, la secuencia de disolución o suspensión, la esterilización de la solución nutriente como un conjunto o la esterilización de los constituyentes individuales, la prevención de contaminación, inter alia, juega también un papel importante y deberá ser optimizada en consecuencia para el proceso de producción implicado.

Igualmente, debe apreciarse que la esterilización puede causar alteraciones en el valor pH del medio nutriente y también precipitaciones.

Los restantes métodos de cultivo corresponden también a los procesos normalmente utilizados para el cultivo de microorganismos.

A pequeña escala, las fermentaciones efectuadas dentro del alcance de la presente invención, incluyendo cualquier precultivo, se encuentran normalmente en forma de cultivos sacudidos, en cuyo caso es conveniente utilizar matraces de vidrio de 0,1 a 5 litros, con preferencia de 0,5 a 5 litros de capacidad, que contienen de 0,05 a 2 litros, con preferencia de 0,1 a 2 litros de medio nutriente. Los matraces están provistos preferentemente de un deflector. Después del autoclaveado y del ajuste del pH a valores de pH 4 a pH 8, especialmente de pH 7,0 a pH 7,5 (bacterias) o a valores de pH 6 a pH 7,5 (hongos), los matraces son inoculados con los correspondientes cultivos de microorganismos bajo condiciones estériles. El material de inoculación usado es generalmente un precultivo que ha sido producido a partir del material de inoculación preservado de acuerdo con los datos ofrecidos a continuación.

Los cultivos, incluyendo los precultivos, se hacen crecer convenientemente bajo condiciones aeróbicas a una temperatura de alrededor de 25 a 37ºC, con preferencia de alrededor de 26 a 30ºC, especialmente a 28ºC aproximadamente, con agitación continua a 80-300 rpm aproximadamente, con preferencia a 100-250 rpm aproximadamente, especialmente a 120 rpm (revoluciones por minuto) aproximadamente en una máquina sacudidora rotativa. En las condiciones antes mencionadas, con Streptomyces se ha alcanzado generalmente una actividad de oxidación óptima después de 1,5 a 7 días de cultivo.

Una vez que la capacidad catalítica de las células es suficientemente alta para llevar a cabo la reacción de oxidación deseada, preferentemente después de 40 horas, se añade el substrato (compuestos de fórmula (II)), en donde los microorganismos y la substancia a oxidar se pueden poner en contacto entre sí de cualquier forma adecuada. Por motivos prácticos, se ha comprobado que es conveniente añadir el substrato, es decir un compuesto de fórmula (II), al microorganismo en solución nutriente.

La substancia a oxidar se puede emplear, por ejemplo, en forma de polvo o en forma de una solución en un disolvente adecuado tal como, por ejemplo, dimetilformamida, acetona, dimetilsulfóxido, N-metil-2-pirrolidona o un disolvente alcohólico tal como, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol o terc-butanol, o un éter disolvente tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano o 1,4-dioxano (0,5 a 15% en volumen, con preferencia 2% en volumen) o un éster disolvente tal como, por ejemplo, acetato de etilo, o un hidrocarburo disolvente tal como, por ejemplo, octano o ciclohexano o tolueno o xileno, o en una mezcla de un disolvente adecuado y un surfactante adecuado. El término "surfactante" comprende surfactantes iónicos, no iónicos y zwitteriónicos, así como mezclas de tales surfactantes.

Los jabones solubles en agua y los compuestos de superficie activa sintéticos solubles en agua son surfactantes aniónicos adecuados. Jabones adecuados son las sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales amónicas insubstituidas o substituidas de ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}), por ejemplo, las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que se pueden obtener, por ejemplo, a partir de aceite de coco o aceite de sebo. Otros surfactantes adecuados son también las sales de metiltaurina de ácidos grasos. Sin embargo, más frecuentemente se utilizan los llamados surfactantes sintéticos, en especial sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados de bencimidazol sulfonados o alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos o sulfatos grasos se encuentran normalmente en forma de sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales amónicas insubstituidas o substituidas y contienen un radical alquilo C_{10}-C_{22} que también incluye la mitad alquilo de radicales acilo, por ejemplo, la sal de sodio o de calcio de ácido lignosulfónico, de dodecilsulfato o de una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos a partir de ácidos grasos naturales. Estos compuestos comprenden también las sales de aductos de alcoholes grasos/óxido de etileno, sulfatados y sulfonados. Los derivados sulfonados de bencimidazol contienen preferentemente dos grupos ácido sulfónico y un radical ácido graso que contiene de 8 a 22 átomos de carbono. Ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o trietanolamina de ácido dodecilbencenosulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico o de un condensado de ácido naftalenosulfónico y formaldehído. Igualmente, surfactantes aniónicos adecuados son las sales de ácidos biliares, por ejemplo, las sales sódicas de ácido cólico o ácido deoxicólico. También son adecuados los correspondientes fosfatos, por ejemplo, sales del éster de ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con 4 a 14 moles de óxido de etileno; o fosfolípidos.

Surfactantes catiónicos adecuados son las sales de tetraalquilamonio, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio.

Surfactantes neutros adecuados son alquilglicósidos, por ejemplo, alquil-\beta-D glucopiranosidos, alquil-\beta-D tioglucopiranosidos, alquil-\beta-D maltosidos que contienen un radical alquilo C_{6}-C_{12}. Otros surfactantes neutros adecuados son las glucamidas, por ejemplo, N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-colamida, N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)-deoxicolamida, N-metilglucamidas de ácidos grasos que contienen un radical acilo C_{7}-C_{12}. Otros surfactantes neutros adecuados son los polioxietilenos mono- y polidispersos, por ejemplo, BRIJ®, GENAPOL®, LUBROL®, PLURONIC®, THESIT®, TRITON®, TWEEN®.

Surfactantes zwitteriónicos adecuados son N,N,N-trialquilglicinas, por ejemplo, N-n-dodecil-N,N-dimetilglicina. Otros surfactantes zwitteriónicos adecuados son los alquilsulfonatos de \omega-N,N,N-trialquilamonio, por ejemplo, 3-(N-alquil-N,N-dimetil)-1-propanosulfonato que contiene un radical alquilo C_{8}-C_{16}. Como otros surfactantes zwitteriónicos adecuados se pueden citar 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato y 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato.

Los surfactantes normalmente usados en la técnica de la solubilización y formulación se describen, inter alia, en las siguientes publicaciones: Bhairi S.M. (1997) "A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA; "1999 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, USA.

El transcurso de la reacción se controla de forma continua mediante métodos cromatográficos generalmente usados en investigación microbiológica.

La presente invención se relaciona también con el cultivo de microorganismos que son capaces de oxidar específicamente el alcohol de la posición 4'' a una cetona de fórmula (III), así como con la incubación de los mismos con dichos compuestos en biorreactores, especialmente en biorreactores del tipo de reactor de recipiente agitado. Con el fin de asegurar una velocidad óptima de formación de producto en el fermentador de producción real, se recomienda que los microorganismos sean en primer lugar multiplicados en precultivos. El número de precultivos en fermentador depende de la concentración de material de inoculación que resulte óptima en cada caso particular. Convenientemente, dependiendo de los microorganismos usados, se producen las siguientes concentraciones de material de inoculación en una etapa del fermentador: bacterias 0,1-3%, hongos 5-10%, Actinomicetos 5-10%.

La inoculación de pequeños fermentadores (hasta 20 litros) se efectúa normalmente usando precultivos en matraces sacudidos. En este caso, se emplea el contenido total del matraz para inocular el fermentador. El material de partida usado para la producción de precultivos es normalmente material de inoculación preservado el cual puede estar, por ejemplo, en forma de liofilizados o de material congelado o guardado en frío. El material de inoculación preservado usado dentro del alcance de la presente invención es preferentemente material guardado a -80ºC.

La multiplicación del material de inoculación se efectúa preferentemente en medio líquido en matraces de vidrio en una máquina sacudidora rotativa o, cuando se utilizan esporas, en substratos nutrientes sólidos. Las condiciones referentes a los substratos nutrientes y a los parámetros de cultivo, tales como temperatura, pH, introducción de oxígeno, inter alia, han de ser optimizadas de acuerdo con el microorganismo o procedimiento utilizado. Los tiempos de crecimiento para el material de inoculación preservado varían desde unas pocas horas hasta varios días dependiendo del material de partida usado.

Liofilizados conservados

en estado congelado	3-10 días
bacterias	4-18 horas
actinomicetales	1-5 días
hongos	1-7 días
cultivos guardados en frío
bacterias	4-24 horas
actinomicetales	1-3 días
hongos	15 días

Si se emplean esporas como material de inoculación, en primer lugar las esporas son multiplicadas a partir del material de inoculación preservado en substratos nutrientes sólidos bajo condiciones normalizadas (aireación estéril, cámara climática). Si se empelan substratos nutrientes porosos basados en turba, salvado, centeno o cebada, los cultivos se sacuden a fondo diariamente hasta conseguir altas densidades de esporas. Otra posibilidad consiste en cultivar el material de inoculación preservado en medios nutrientes solidificados por agar o por otros agentes gelificantes usuales, siendo preferible el uso de medios nutrientes que disparan la inducción de formación de esporas.

El tiempo de esporulación es de 7 a 30 días dependiendo del microorganismo usado y del medio nutriente usado.

Para inocular los fermentadores de precultivo o de producción, las esporas se suspenden con agentes de superficie activa, por ejemplo una solución de Tween 80 (surfactante, suministrado por Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA), y se transfieren junto con su medio nutriente al interior del fermentador o, si se emplean medios nutrientes sólidos, se separan por lavado de los substratos nutrientes sólidos empleando también dichos agentes de superficie activa. La solución que contiene esporas así obtenida se emplea entonces para inocular los fermentadores. Preferentemente, tanto la recuperación de las esporas como la inoculación de los fermentadores se efectúan bajo condiciones estériles.

Para producir compuestos de fórmula (III) dentro del alcance de la presente invención, se pueden emplear biorreactores de varias dimensiones, abarcando capacidades del orden de 0,001 a 450 m^{3}, dependiendo de la cantidad de producto requerido.

Si se emplean biorreactores de recipiente agitado, los siguientes parámetros de fermentación han de ser considerados entonces como críticos para que el transcurso de la reacción sea el óptimo:

1. Temperatura: la reacción de oxidación biocatalítica dentro del alcance del procedimiento según la invención se efectúa preferentemente en un intervalo de temperaturas mesófilas (intervalo de temperatura de 20 a 40ºC). El intervalo óptimo de temperatura para el crecimiento y formación de producto es de 20 a 32ºC, en especial de 24 a 30ºC.

2. Aireación: la velocidad de aireación es de 0,1 a 2,5 vvm (volumen de aire por volumen de líquido por minuto), preferentemente de 0,3 a 1,75 vvm. Si es necesario, la velocidad de aireación debe adaptarse a las necesidades de oxígeno adquirido en el transcurso de la fermentación.

3. Presión: los reactores de recipiente agitado se hacen funcionar generalmente bajo una ligera presión en exceso de 0,2 a 1 bar, preferentemente de 0,5 a 0,7 bares, con el fin de reducir el riesgo de contaminación.

4. Valor pH: el valor pH puede variar dentro de ciertos límites dependiendo del microorganismo usado. Si se emplean microorganismos del grupo Actinomicetos, el valor pH final es de pH 6 a pH 8, con preferencia de pH 6,5 a pH 7,5.

Si se emplean hongos, el pH inicial de la solución de cultivo es con preferencia de pH 4 a pH 8, especialmente de pH 6 a pH 7,5.

5. Agitación: la velocidad de agitación depende del tipo de agitador usado y del tamaño del fermentador. Dentro del alcance de la presente invención, se prefieren los agitadores con impulsores de tipo disco que, con un tamaño del reactor de recipiente agitado de 0,002 m^{3}, se hacen funcionar a velocidades de 150 a 550 rpm, en especial de 200 a 500 rpm.

Dentro del alcance de la presente invención, la duración de la fermentación varía desde 20 horas a 10 días dependiendo del microorganismo usado. La reacción biocatalítica se interrumpe cuando el 25 a 99,9% aproximadamente, con preferencia el 50 a 99,9% aproximadamente y más particular el 80 a 99,9% aproximadamente del substrato (compuestos de fórmula (II)) añadido al comienzo se ha convertido a los compuestos de fórmula (III).

Para determinar el tiempo óptimo para dar por finalizada la reacción de oxidación, el transcurso de la reacción se controla durante toda la fermentación mediante procesos de análisis convencionales, especialmente procesos cromatográficos, tal como, por ejemplo, HPLC o procesos de cromatografía de capa delgada.

En una modificación del procedimiento anteriormente indicado, el biorreactor se puede utilizar únicamente para la generación de biomasa, la cual se recoge entonces por filtración o centrifugado. La biomasa del microorganismo se emplea entonces inmediatamente como biocatalizador para la conversión de compuestos de fórmula (II) a compuestos de fórmula (III), o bien se guarda en frío como tal o después de un secado por congelación o por aspersión. Dicho microorganismo, recientemente recogido o guardado como se ha descrito, se distribuye entonces adicionalmente en otros recipientes tales como, por ejemplo, matraces equipados preferentemente con deflectores o en biorreactores de recipiente agitado, en donde se efectúa el proceso de bioconversión. Se añade el substrato (compuestos de fórmula (II)) y el microorganismo y la substancia a oxidar se pueden poner en contacto entre sí de cualquier manera. Por motivos prácticos, ha resultado ser conveniente añadir el substrato, es decir un compuesto de fórmula (II) al microorganismo en una solución tamponada que no favorece la proliferación. El substrato (compuestos de fórmula (II)) a oxidar se puede emplear, por ejemplo, en forma de polvo o en forma de una solución en un disolvente adecuado tal como aquellos descritos aquí anteriormente.

En una modalidad preferida de la invención, el substrato (compuestos de fórmula (II)) se disuelve primeramente en un disolvente adecuado tal como, por ejemplo, dimetilsulfóxido o Tween 40 (surfactante, suministrado por Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA) o una combinación de ambos, y luego se añade a matraces provistos de deflectores que contienen una solución tampón, preferentemente tampón fosfato, más preferentemente un tampón fosfato 0,07 M, pH 7. La solución resultante se esteriliza entonces antes de añadir el biocatalizador (biomasa del microorganismo). Esta mezcla de reacción se incuba entonces a temperatura ambiente y se sacude a 100-150 rpm, con preferencia alrededor de 120 rpm, durante 2-7 días aproximadamente, dependiendo de la cepa microbiana.

En otra modalidad preferida de la invención, el substrato (compuestos de fórmula (II)) se disuelve primeramente en un disolvente adecuado tal como, por ejemplo, dimetilsulfóxido o Tween 40 (surfactante, suministrado por Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA) o una combinación de ambos, y luego se añade a matraces provistos de deflectores y que contienen un medio de cultivo promotor del crecimiento del microorganismo a utilizar para llevar a cabo la reacción de oxidación deseada. La solución resultante se esteriliza entonces antes de añadir el biocatalizador (biomasa del microorganismo). Esta mezcla de reacción se incuba luego a temperatura ambiente y se sacude a 100-150 rpm, con preferencia a 120 rpm aproximadamente durante 2-9 días aproximadamente, dependiendo de la cepa microbiana.

Según otra modalidad específica de la invención, se prepara un extracto libre de células usando células húmedas, las cuales son lavadas en una solución tampón adecuada, resuspendidas en tampón de ruptura y rotas, por ejemplo, por medios mecánicos a una temperatura entre 2 y 15ºC, preferentemente a una temperatura entre 3 y 6ºC y más preferentemente a 4ºC. La suspensión resultante se centrifuga y se recoge el extracto sobrenadante libre de células.

Al extracto libre de células así obtenido se añaden soluciones que comprenden una parte alícuota adecuada de un sistema de suministro de electrones foráneo tal como, por ejemplo, ferredoxina y ferredoxina reductasa y substrato. Después de la adición del substrato, la combinación se mezcla y se airea a fondo y preferentemente de forma inmediata. Se añade entonces una parte alícuota adecuada de NADPH y la mezcla se incuba a una temperatura entre 15 y 40ºC, con preferencia a una temperatura entre 20 y 35ºC y más preferentemente a 30ºC.

El tratamiento del caldo de fermentación con el fin de recuperar el producto de oxidación (compuestos de fórmula (III)) se puede realizar mediante procedimientos normalmente empleados en la técnica de la fermentación (W. Crueger y A. Crueger, 1984; P. Präve, 1984).

En primer lugar, los constituyentes en forma de partículas se separan del caldo de reacción usando filtros, centrífugas o separadores, para ser extraídos por separado a partir del filtrado.

Si se emplean células vegetativas o muertas como biocatalizador y si una porción de los productos de reacción (compuestos de fórmula (III)) está presente dentro de las células, las células deben ser desintegradas antes de la reacción. Para este fin, son disponibles varios métodos de desintegración de células basados en procesos mecánicos, térmicos, químicos o enzimáticos.

Métodos mecánicos adecuados para utilizarse en el procedimiento según la invención son, por ejemplo, la molienda en molinos de bolas agitadas o molinos coloidales, el uso de presión y relajación en un homogenizador y la desintegración de células mediante la acción de ultrasonidos. Los procesos no mecánicos incluyen la desintegración de células mediante secado, la lisis de las células mediante choque osmótico, autolisis química y lisis enzimática de las células.

Una vez que los constituyentes en forma de partículas han sido separados, los productos de reacción se concentran por extracción de la solución de cultivo y de los constituyentes celulares separados con disolventes adecuados. Para la extracción se dispone también de numerosos dispositivos auxiliares que son normalmente utilizados en la técnica de la fermentación, tales como, por ejemplo, mezcladores-decantadores, columnas en contracorriente, centrífugas de extracción, entre otros dispositivos.

Igualmente, es posible concentrar los productos de reacción, por ejemplo, mediante filtración con membrana, ultrafiltración, concentración por congelación, procesos de intercambio iónico, entre otras técnicas.

El tratamiento adicional del producto en bruto obtenido después de la extracción se puede efectuar mediante métodos ya bien establecidos en investigación microbiológica y química y que son de uso industrial.

Estos procesos incluyen, por ejemplo, métodos cromatográficos, tales como cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamices moleculares, cromatografía de afinidad, cromatografía hidrófoba, cromatografía de repartición, cromatografía covalente y otras, así como, además de estas técnicas, también diversos procesos de cristalización.

Disolventes adecuados para la extracción, bien como tales o bien como mezclas de los mismos son: hidrocarburos aromáticos tales como tolueno, mezclas de xilenos o naftalenos substituidos, ftalatos tal como ftalato de dibutilo o ftalato de dioctilo, hidrocarburos alifáticos tales como isómeros de hexano, heptano, octano o parafinas o ciclohexano, alcoholes y glicoles y sus éteres y ésteres, tales como metanol, etanol, 2-propanol, 1-butanol, terc-butanol, etilenglicol, metil-terc-butiléter, acetato de etilo, monometil- o monoetil-éter de etilenglicol, cetonas tales como acetona o 2-butanona o ciclohexanona, hidrocarburos clorados tales como diclorometano o cloroformo o tetracloruro de carbono.

El término "surfactantes" ha de entenderse también como incluyendo mezclas de surfactantes. Los jabones solubles en agua y los compuestos de superficie activa sintéticos solubles en agua son surfactantes aniónicos adecuados. Jabones adecuados son las sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales amónicas insubstituidas o substituidas de ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}), por ejemplo, las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que se pueden obtener, por ejemplo, a partir de aceite de coco o aceite de sebo. Otros surfactantes adecuados son también las sales de metiltaurina de ácidos grasos. Sin embargo, más frecuentemente se utilizan los llamados surfactantes sintéticos, en especial sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados de bencimidazol sulfonados o alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos o sulfatos grasos se encuentran normalmente en forma de sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales amónicas insubstituidas o substituidas y contienen un radical alquilo C_{10}-C_{22} que también incluye la mitad alquilo de radicales acilo, por ejemplo, la sal de sodio o de calcio de ácido lignosulfónico, de dodecilsulfato o de una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos a partir de ácidos grasos naturales. Estos compuestos comprenden también las sales de aductos de alcoholes grasos/óxido de etileno, sulfatados y sulfonados. Los derivados sulfonados de bencimidazol contienen preferentemente dos grupos ácido sulfónico y un radical ácido graso que contiene de 8 a 22 átomos de carbono. Ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o trietanolamina de ácido dodecilbencenosulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico o de un condensado de ácido naftalenosulfónico y formaldehído. También son adecuados los correspondientes fosfatos, por ejemplo, sales del éster de ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con 4 a 14 moles de óxido de etileno; o fosfolípidos. Los surfactantes normalmente usados en la técnica de las formulaciones se describen, inter alia en la siguiente publicación: "1986 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, USA.

Una modalidad preferida de la invención es un método para producir 4''-oxo-avermectina poniendo en contacto un biocatalizador, tal como un microorganismo capaz de convertir avermectina a 4''-oxo-avermectina, con avermectina y aislando de la mezcla de reacción la 4''-oxo-avermectina producida.

Una modalidad de la invención consiste en un método para producir un compuesto de fórmula (III), el cual es preferentemente 4''-oxo-avermectina, que comprende las siguientes etapas:

(1) producción de células por inoculación de un medio nutriente que promueve el crecimiento celular con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), preferentemente avermectina a 4''-oxo-avermectina;

(2) recogida de las células después del crecimiento;

(3) disolución de un compuesto de fórmula (II), preferentemente avermectina, en un disolvente adecuado;

(4) adición de la solución de la etapa (3) a un medio de reacción que no promueve la proliferación celular;

(5) adición de células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa (4);

(6) sacudida o agitación de la mezcla de reacción de la etapa (5) en presencia de aire;

(7) separación de las células del medio;

(8) extracción del sobrenadante y de las células con disolventes adecuados;

(9) concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (8);

(10) purificación de un compuesto de fórmula (III) que preferentemente es 4''-oxo-avermectina, contenido en el extracto (9) por cromatografía o cristalización.

Otra modalidad preferida de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III) que preferentemente es 4''-oxo-avermectina, que comprende las siguientes etapas:

(2) recogida de las células después del crecimiento;

(5) adición de células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa (4);

(7) extracción de todo el caldo con un disolvente adecuado;

(8) separación de fases;

(9) concentración de la fase disolvente de la etapa (8) en vacío;

Otra modalidad preferida de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III), el cual es preferentemente 4''-oxo-avermectina, que comprende las siguientes etapas:

(1) disolución de un compuesto de fórmula (II), que preferentemente es avermectina, en un disolvente adecuado;

(2) adición de la solución de la etapa (1) a un medio nutriente que promueve el crecimiento celular;

(3) inoculación del medio nutriente de la etapa (2) con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), preferentemente avermectina a 4''-oxo-avermectina;

(4) cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III) preferentemente avermectina a 4''-oxo- avermectina;

(5) separación de las células del medio;

(6) extracción del sobrenadante y de las células con disolventes adecuados;

(7) concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (6) en vacío;

(8) purificación de un compuesto de fórmula (III), que preferentemente es 4''-oxo-avermectina, contenido en el extracto (7) por cromatografía o cristalización.

Otra modalidad preferida de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III), que preferentemente es 4''-oxo-avermectina, que comprende las siguientes etapas:

(4) cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III) preferentemente avermectina a 4''-oxo-avermectina;

(5) extracción de todo el caldo con un disolvente adecuado;

(6) separación de fases;

En una segunda etapa puramente química, el compuesto de fórmula (III) así obtenido se puede hacer reaccionar con una amina de fórmula HN(R_{8})R_{9} en donde R_{8} y R_{9} tienen los mismos significados que los indicados para la fórmula (I), y como es conocido, en presencia de un agente reductor.

Los componentes de reacción se pueden hacer reaccionar en ausencia de un disolvente, pero preferentemente en presencia de un disolvente. Otra posibilidad consiste en llevar a cabo la reacción en un exceso de uno de los asociados de la reacción, especialmente en una amina líquida. Sin embargo, normalmente es conveniente añadir un disolvente o diluyente líquido inerte. Ejemplos de dichos disolventes o diluyentes son hidrocarburos aromáticos, alifáticos y alicíclicos e hidrocarburos halogenados, tales como benceno, tolueno, xileno, mesitileno, tetralina, clorobenceno, diclorobenceno, bromobenceno, éter de petróleo, hexano, ciclohexano, diclorometano, triclorometano, tetraclorometano, dicloroetano, tricloroeteno o tetracloroeteno; ésteres, tal como éster etílico de ácido acético; éteres, tales como dietiléter, dipropiléter, diisopropiléter, dibutiléter, terc-butilmetiléter, monometiléter de etilenglicol, monoetiléter de etilenglicol, dimetiléter de etilenglicol, dimetoxidietiléter, tetrahidrofurano o dioxano; cetonas, tales como acetona, metiletilcetona o metilisobutilcetona; alcoholes, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenglicol o glicerina; amidas, tales como N,N-dimetilformamida, N,N-dietilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metilpirrolidona o hexametilfosfotriamida; nitrilos, tal como acetonitrilo o propionitrilo; y sulfóxidos, tal como dimetilsulfóxido; ácidos orgánicos, tal como ácido acético; y agua.

Los disolventes preferidos son éteres tales como tetrahidrofurano y dimetiléter de etilenglicol; especialmente tetrahidrofurano; alcoholes tales como metanol, etanol o isopropanol; disolventes halogenados tales como diclorometano o dicloroetano; disolventes aromáticos tales como benceno o tolueno; nitrilos tal como acetonitrilo; amidas tal como N,N-dimetilformamida; ácidos carbónicos tal como ácido acético; agua; y mezclas de los anteriores.

Disolventes muy especialmente preferidos son metanol o etanol o mezclas de los mismos.

La reacción se efectúa preferentemente a un pH de 0 a 14, especialmente de 2 a 10, en muchos casos de 6 a 9 y muy especialmente a pH 9.

La reacción se efectúa preferentemente a una temperatura comprendida entre -80ºC y +140ºC, preferentemente entre -30ºC y +100ºC, en muchos casos entre -10ºC y +80ºC y especialmente entre 0ºC y +50ºC.

Agentes reductores preferidos son los hidruros tales como borohidruros; boranos; ácido fórmico; formiatos; o hidrógeno. Especialmente preferidos son los hidruros tales como borohidruro sódico, borohidruro de zinc, borohidruro de litio, cianoborohidruro sódico, triacetoxiborohidruro sódico o triacetoxiborohidruro de tetrametilamonio. Especialmente preferido es el borohidruro sódico.

\newpage

La reacción puede efectuarse, cuando resulte aplicable, en presencia de otros compuestos químicos determinados tales como catalizadores homogéneos o heterogéneos o ácidos. Especialmente adecuados son los ácidos tales como ácido clorhídrico, ácido p-toluenosulfónico, ácido acético, ácido propiónico, ácido tartárico o ácido ftálico; ácidos de Lewis tal como, por ejemplo, tetracloruro de titanio, tetraisopropilato de titanio o cloruro de zinc; sales tal como, por ejemplo, perclorato de magnesio, acetato sódico, tartrato de sodio-potasio, cloruro de iterbio o p-toluenosulfonato de piridinio; agentes absorbentes de agua tales como, por ejemplo, sulfato sódico, tamices moleculares o gel de sílice; o mezclas de los anteriores. Agentes adicionales preferidos son los ácidos tales como ácido acético, ácido propiónico o ácido tartárico; se prefiere el ácido acético. Cuando la reducción se efectúa con hidrógeno, resulta conveniente la adición de uno o más catalizadores homogéneos o heterogéneos adecuados. Catalizadores preferidos son los catalizadores metálicos heterogéneos conocidos en la técnica, preferentemente catalizadores de Ni, Pt o Pd, especialmente níquel Raney y catalizador Lindlar (Pd-CaCO_{3}-PbO). Catalizadores homogéneos adecuados son especialmente los complejos de rodio, tales como los catalizadores de Wilkinsons (cloro-tris-trifenil-rodio).

Los compuestos de fórmula (I) en cada caso en forma libre o en forma de sal, pueden encontrarse en forma de uno de los posibles isómeros o en forma de una mezcla de los mismos, por ejemplo, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos en la molécula y de su configuración absoluta y relativa, y/o dependiendo de la configuración de los dobles enlaces no aromáticos en la molécula, los mismos se pueden encontrar en forma de isómeros puros, tales como antípodas y/o diastereoisómeros, o bien en forma de mezclas de isómeros, tales como mezclas de enantiómeros, por ejemplo, racematos, mezclas de diastereoisómeros o mezclas de racematos; la invención se relaciona con los isómeros puros y también con todas las mezclas posibles de isómeros y ello ha de ser entendido así, tanto anteriormente como de aquí en adelante, incluso aunque en cada caso no se mencionen específicamente detalles estereoquímicos.

Las mezclas de diastereoisómeros y mezclas de racematos de compuestos de fórmula (I), o sales de los mismos, obtenibles de acuerdo con el procedimiento dependiendo de los materiales de partida o de los procedimientos elegidos u obtenibles por otros medios, se pueden separar, en base a las diferencias físico-químicas entre los constituyentes, en los diastereoisómeros o racematos puros de manera conocida, por ejemplo, por cristalización fraccionada, destilación y/o cromatografía.

Las mezclas de enantiómeros, tales como racematos, así obtenibles, se pueden resolver en los antípodas ópticos por métodos conocidos, por ejemplo por recristalización en un disolvente ópticamente activo, por cromatografía en adsorbentes quirales, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en acetilcelulosa, con la ayuda de microorganismos adecuados, por escisión con enzimas inmovilizadas específicas, por medio de la formación de compuestos de inclusión, por ejemplo, usando éteres corona quirales, en cuyo caso solo se compleja un enantiómero, o por conversión a las sales diastereoisoméricas, por ejemplo por reacción de un racemato producto final básico con un ácido ópticamente activo, tal como un ácido carboxílico, por ejemplo ácido camfórico, tartárico o málico, o un ácido sulfónico, por ejemplo ácido camforsulfónico, y separación de la mezcla resultante de diastereoisómeros, por ejemplo en base a sus diferentes solubilidades por cristalización fraccionada, en los diastereoisómeros a partir de los cuales se puede liberar el enantiómero deseado mediante la acción de agentes adecuados, por ejemplo agentes básicos.

Además de la separación de las correspondientes mezclas de isómeros, es posible según la invención obtener también diastereoisómeros o enantiómeros puros mediante métodos en general conocidos de síntesis diastereoselectiva o enantioselectiva, por ejemplo realizando el procedimiento según la invención usando materiales de partida que tienen la correspondiente estereoquímica adecuada.

Los compuestos de fórmulas (I) y (III), los productos de adición de ácido y las sales de los mismos se pueden obtener también en forma de sus hidratos y/o pueden incluir otros disolventes, por ejemplo disolventes que pueden haber sido usados para la cristalización de compuestos que se presentan en forma sólida.

La invención se refiere a todas esas formas del proceso según las cuales un compuesto obtenible como material de partida o material intermedio en cualquier etapa del proceso se emplea como material de partida y se llevan a cabo entonces todas o algunas de las restantes etapas, o bien se emplea un material de partida en forma de un derivado o una sal y/o sus racematos o antípodas o, especialmente, se forma bajo las condiciones de reacción.

Los compuestos de fórmula (I) y (III) obtenibles según el procedimiento o por cualquier otro medio se pueden convertir a diferentes compuestos de fórmula (I) y (III) de manera conocida per se.

En el procedimiento de la presente invención preferentemente se emplean aquellos materiales de partida y compuestos intermedios, en cada caso en forma libre o en forma de sal, que dan lugar a los compuestos de fórmulas (I) y (III) o a sales de los mismos, descritos al principio como especialmente valiosos.

En el caso de que R_{9} sea hidrógeno, la etapa de reacción 2) se puede dividir en dos etapas separadas, en donde, en una primera etapa, un compuesto de fórmula

6

en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, m, n, A, B, C, D, E y F tienen los significados dados para la fórmula (I) anterior, se forma mediante reacción de un compuesto de fórmula (III) con un compuesto de fórmula H_{2}N(R_{8}) en donde R_{8} tiene los mismos significados que en la fórmula (I) anterior y, en una segunda etapa, se reduce dicho compuesto de fórmula (IV) según la etapa 2) del procedimiento anteriormente indicada. Las dos etapas individuales se pueden efectuar según una síntesis en un solo recipiente de reacción sin aislar el compuesto de fórmula (IV); sin embargo, puede ser conveniente aislar el compuesto (IV), por ejemplo para fines de purificación. Los compuestos de fórmula (IV) son nuevos y también constituyen un aspecto de la presente invención.

Ejemplos

La invención será descrita adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos y no han de ser considerados como limitativos, salvo que se indique lo contrario. La invención se refiere especialmente a los procesos de preparación descritos en los ejemplos.

Ejemplo 1 Producción de células 1.1Streptomyces tubercidicus cepa I-1529

Se hacen crecer precultivos de la cepa I-1529 (Streptomyces tubercidicus; DSM-13135) en 20 matraces Erlenmeyer de 500 ml, provistos de deflectores, conteniendo cada uno de ellos 100 ml de medio 2, sacudiendo con movimiento orbital a 120 rpm a 28ºC durante 3 días. Estos cultivos se emplean para inocular un fermentador de 50 litros que contiene 40 litros de medio 4. Las células se hacen crecer a 28ºC con una aireación de 0,7 vvm (= 30 litros/min). La velocidad del agitado se mantiene entre 200 y 300 rpm, guiada por un sensor de pO_{2}, para evitar que la pO_{2} caiga por debajo de 25%. Después de 2 días de crecimiento, las células se recogen por centrifugado, empleando una centrífuga de flujo pasante. Se obtienen 4,2 kg de células (húmedas).

1.2Streptomyces tubercidicus cepa R-922

Se hace crecer Streptomyces tubercidicus cepa R-922 (DSM-13136) en un plato Petri sobre agar ISP-2 (medio 5). Este cultivo se emplea para inocular 4 matraces sacudidos de 500 ml provistos de deflector, conteniendo cada uno de ellos 100 ml de medio PHG (medio 6). Estos pre-cultivos se hacen crecer en un sacudidor de movimiento orbital a 120 rpm y 28ºC durante 96 horas y luego se emplean para inocular un fermentador de 10 litros equipado con un agitador mecánico y que contiene 8 litros de medio PHG. Este cultivo principal se hace crecer a 28ºC con agitación a 500 rpm y con una aireación de 1,75 vvm (14 litros/min) y a una presión de 0,7 bares. Al término del crecimiento exponencial, después del alrededor de 20 horas, las células se recogen por centrifugado. El rendimiento en células húmedas es de 70-80 g/litro de cultivo. Para el tratamiento adicional, las células húmedas pueden ser guardadas a 4ºC, preferentemente durante un tiempo no mayor de una semana.

Ejemplo 2 Procedimiento de reacción 2.1 Cultivo en reposo 2.1.1 Condiciones de reacción

Se disuelven 35,5 g de avermectina (calidad técnica) en 1,05 litros de dimetilsulfóxido/Tween 40 1:1. Esta solución se distribuye añadiendo partes alícuotas de 25 ml a 42 matraces Erlenmeyer de 3 litros, provistos de deflector, conteniendo cada uno de ellos 1 litro de medio de reacción. Estas soluciones se esterilizan a 121ºC durante 20 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añaden 100 g de células húmedas (frescas o guardadas a 4ºC durante no más de 4 días), preparadas como en el ejemplo 1.1 y 1.2, respectivamente. A continuación, estas mezclas de reacción se sacuden a temperatura ambiente a 120 rpm durante 4-5 días.

Medio de reacción

0,5 g melazas

0,5 g MgCl_{2}

12,5 ZnCl_{2}

12,5 mg MnCl_{2} \cdot 4H_{2}O

25 mg CoCl_{2} \cdot 6H_{2}O

12,5 mg NiCl_{2} \cdot 6H_{2}O

2,5 mg CuCl_{2} \cdot 2H_{2}O

6,3 mg NaMoO_{4} \cdot 2H_{2}O

0,15 ml 1M HCl

ajustar a 1 litro con tampón fosfato 70 mM pH 6,0, autoclave.

2.1.2 Elaboración

Las mezclas de reacción se centrifugan en matraces de centrífuga de polipropileno de 500 ml a 4ºC durante 15 minutos a 13.000 x g. Se reúnen los sobrenadantes de los 40 litros de mezcla de reacción y se extraen dos veces con metil-terc-butiléter (0,5 eq. vol. , 0,4 eq. vol.). Las fases reunidas de metil-terc-butiléter se extraen de nuevo entonces tres veces con 0,185 eq. vol. de agua destilada. La fase de metil-terc-butiléter se concentra en vacío en un evaporador rotativo. El secado del residuo proporciona 10-12 g de extracto S. Las fases acuosas se desechan.

Las células centrifugadas de 120 a 132 matraces de centrífuga se extraen como sigue:

Se transfieren las células de 24 matraces de centrífuga a un matraz Erlenmeyer de 2 litros. A cada matraz Erlenmeyer se añaden 80 g de tierra de diatomeas (Hyflo Supercell®, purificada) y 1,2 litros de acetona. Después de realizar una mezcla manual, la mezcla resultante se homogeniza por medio de una varilla agitadora magnética grande. La pulpa resultante se filtra en vacío a través de papel en un embudo Büchner de 20 cm de diámetro y se lava con acetona hasta lograr una elución incolora. De este modo se obtiene un filtrado C1 y una torta de filtración C1.

El filtrado C1 se concentra en vacío en un evaporador rotativo para separar la acetona. La fase acuosa resultante se extrae entonces tres veces con 0,7 litros de tolueno. Las fases toluénicas combinadas se secan sobre sulfato sódico anhidro. La filtración y la evaporación en el evaporador rotativo en vacío proporciona el extracto C1.

La torta de filtración C1 se transfiere a un matraz Erlenmeyer de 2 litros y se mezcla manualmente con 1,5 litros de tolueno. La mezcla se homogeniza por medio de una varilla de agitación magnética grande. La pulpa resultante se filtra en vacío a través de un papel en un embudo Büchner de 20 cm de diámetro y se lava con tolueno hasta obtener una elución incolora. De este modo, se obtienen el filtrado C2 y la torta de filtración C2. La torta de filtración C2 se desecha.

El filtrado C2 se concentra en vacío en un evaporador rotativo para proporcionar el extracto C2 el cual se seca en alto vacío.

Los extractos combinados C1 y C2 de los 40 litros de mezcla de reacción se secan en alto vacío para proporcionar 30-35 g de extracto C.

Se someten 45 g de dos extractos combinados S & C a cromatografía instantánea de manera análoga a la descrita por Clark-Still et al. en una columna rellena con 1,5 kg de gel de sílice (Merck 60, 0,040-0,063 mm) mediante elución con acetato de etilo/hexano 3:2 a una presión de N_{2} de 0,5 bares y controlando mediante cromatografía de capa delgada. El rendimiento en 4''-oxo-avermectina pura es de 5,6 g.

2.1 Cultivo proliferativo 2.2.1 Condiciones de reacción

Se disuelve 1 g de avermectina (calidad técnica) en 50 ml de dimetilsulfóxido/Tween 40 1:1. Esta solución se distribuye añadiendo partes alícuotas de 2,5 ml a 20 matraces Erlenmeyer de 500 ml provistos de deflector, cada uno de ellos conteniendo 100 ml de medio 4. Dichas soluciones se esterilizan a 121ºC durante 20 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añaden 5 ml de precultivo, preparado como en el ejemplo 1.1 y ejemplo 1.2, respectivamente. A continuación, estos cultivos inoculados se incuban a 28ºC durante 7 días sacudiendo con movimiento orbital a 120 rpm.

2.2.2 Elaboración

Las mezclas de reacción se centrifugan en matraces de centrífuga de polipropileno de 500 ml a 4ºC durante 15 minutos a 13.000 x g y se elaboran de manera análoga a la descrita en el ejemplo 3. Se obtienen 252 mg de 4''-oxo-avermectina pura.

2.3 Biocatálisis libre de células 2.3.1 Preparación de extracto libre de células

Soluciones madre

Tampón PP:	50 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} (pH 7,0)
Tampón de ruptura:	50 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} (pH 7,0)

: 5 mM benzamidina

: 2 mM ditiotreitol

: 0,5 mM Pefabloc (de Roche Diagnostics)

Substrato:

\hskip2cm

se disuelven 10 mg de avermectina en 1 ml de isopropanol.

Se resuspenden 6 g de células húmedas, lavadas en tampón PP, en 35 ml de tampón de ruptura y se rompen en una prensa French a 4ºC. La suspensión resultante se centrifuga durante 1 hora a 35.000 x g. Se recoge el extracto sobrenadante, libre de células.

2.3.2 Desarrollo de un análisis respecto a la actividad enzimática

Soluciones madre

Ferredoxina:	solución 5 mg ferredoxina (de espinacas) 1-3 mg/ml en tampón
	Tris/HCl (de Fluka)
o	solución 5 mg ferredoxina (de Clostridium pasteurianum) 1-3 mg/ml en
	tampón Tris/HCl (de Fluka)
o	solución 5 mg ferredoxina (de Porphyra umbilicalis) 1-3 mg/ml en tampón
	Tris/HCl(de Fluka)
Ferredoxina reductasa:	solución de 1 mg ferredoxina reductasa liofilizada (de espinacas) 3,9
	U/mg en 1 ml H_{2}O (de Sigma)
NADPH:	100 mM NADPH en H_{2}O (de Roche Diagnostics)

(todas las soluciones madre fueron guardadas a –20ºC y, cuando se utilizaron, las mismas se mantuvieron en hielo)

Condiciones HPLC

Instrumento HPLC:	Merck-Hitachi
Columna HPLC:	70 x 4 mm, Kromasil 100 C18, 3,5\mu (de Macherey-Nagel, Switzerland)
disolvente A:	acetonitrilo, conteniendo 0,0075% de ácido trifluoracético
disolvente B:	agua, conteniendo 0,01% de ácido trifluoracético
flujo: 1,5 ml/min
detección:	UV 243 nm
muestra:	30 \mul

Tiempos de retención:	avermectina B1a	3,18 min
	4''-oxo-avermectina B1a	4,74 min

Tabla de bombeo:	0,0 min	75% A	25% B
gradiente lineal a	7,0 min	100% A	0% B
\hskip1.3cm 9,0 min	100% A	0% B
fase a \hskip4mm 9,1 min	75% A	25% B
\hskip1.1cm 12,0 min	75% A	25% B

A 475 \mul de extracto libre de células se añaden las siguientes soluciones: 10 \mul ferredoxina, 10 \mul ferredoxina reductasa y 1 \mul substrato. Después de la adición de substrato, la mezcla se mezcla de forma inmediata y completa y se airea. Se añaden entonces 5 \mul de NADPH y la mezcla se incuba a 30ºC durante 30 minutos. Se añade luego 1 ml de metil-t-butiléter a la mezcla de reacción y se mezcla a fondo. La mezcla se centrifuga durante 2 minutos a 14 rpm y la fase de metil-t-butiléter se transfiere a un matraz de 10 ml y se evapora en vacío por medio de un evaporador rotativo. El residuo se disuelve en 200 \mul de acetonitrilo y se transfiere a un vial de muestra de HPLC. Tras la inyección de una muestra de 30 \mul aparece un pico a los 4,74 minutos, indicando ello la presencia de 4''-oxo-avermectina B1a. A este pico se puede asignar una masa de 870 Da por HPLC-espectrometría de masas que corresponde al peso molecular de 4''-oxo-avermectina B1a.

Cuando se analiza la formación de producto por HPLC y HPLC-espectrometría de masas, aparece un segundo pico a los 2,01 minutos correspondiente a cetohidrato 4''-hidroxi-avermectina. Esto es una indicación de que el extracto libre de células convierte avermectina por hidroxilación a 4''-hidroxi-avermectina a partir de la cual se forma 4''-oxo-avermectina por deshidratación.

La ferredoxina de espinacas se puede reemplazar, por ejemplo, por ferredoxina de la bacteria Clostridium pasteurianum o de la alga roja Porphyra umbilicalis, la cual da lugar también a la bioconversión biocatalítica de avermectina a 4''-oxo-avermectina.

Ejemplo 3 Cepas de Streptomyces

En la siguiente tabla se pueden apreciar cepas del género Streptomyces que pueden ser usadas en el procedimiento según la invención y su relación con las cepas I-1529 y R-922 de S tubercidicus basado en un análisis 16s rDNA:

Cepa número	Pareja GenBank más próxima	% identidad 16s rDNA
I-1529	Streptomyces tubercidicus cepa tipo DSM 40261	100
R-922	Streptomyces tubercidicus cepa tipo DSM 40261	100
MAAG-7027	Streptomyces tubercidicus cepa tipo DSM 40261	100
DSM-40241	(listada como Streptomyces saraceticus = ATCC-25496	100
	Streptomyces chattanoogensis
	Streptomyces lydicus ATCC 25470 = NRRL-2433	99,8
A/96-1208710	Streptomyces kasugaensis cepa tipo DSM 40819	99,5
	Streptomyces kasugaensis M338-M1	99,4
NRRL-2433	(listada como cepa tipo Streptomyces lydicus ssp
	lydicus = ATCC 25470 = CBS 703.69 = DSM 40461)

Ejemplo 4 Preparación de 4''-deoxi-4''-epi-(metilamino)-avermectina B1 de fórmula

7

en donde R es metilo y etilo.

Se enfrían 3 ml de ácido acético en 30 ml de metanol a 0-5ºC. Se añade metilamina gaseosa hasta que el pH de la solución es 9.

A 8,25 ml de esta solución de metilamina se añade a 0ºC una solución de 1 g de 4''-oxo-avermectina B1 en 6 ml de metanol. La mezcla se deja calentar a temperatura ambiente y luego se agita durante 50 minutos más a temperatura ambiente. Se añaden entonces 90 mg de borohidruro sódico en 2,5 ml de etanol y la mezcla resultante se agita durante otros 45 minutos. Se añaden 10 ml de acetato de etilo a la mezcla de reacción, se extrae la fase orgánica tres veces con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato sódico. El disolvente se separa por destilación para proporcionar 4''-deoxi-4''-epi-(metilamino)- avermectina B1. La pureza es superior al 90%.

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Patentes citadas

US-P-5.288.710

EP-A-736.252

EP-301.806

EP-401.029

DE-2.717.040

17

18

19

20

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula

8

en donde

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1, 2 ó 3; y

9, o por un enlace sencillo y por un puente metileno de fórmula

10

cuyo procedimiento comprende

1) poner en contacto un compuesto de fórmula

11

en donde

12

\newpage

2. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula

13

en donde

R_{1}-R_{7} representan, independientemente entre sí, hidrógeno o un substituyente;

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1, 2 ó 3; y

14, o por un enlace sencillo y por un puente metileno de fórmula

15

cuyo procedimiento comprende

1) poner en contacto un compuesto de fórmula

16

en donde

R_{1}-R_{7}, m, n, A, B, C, D, E y F se definen como en la fórmula (III) anteriormente, con un biocatalizador que es capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4'', mantener dicho contacto durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de oxidación y aislar y purificar el compuesto de fórmula (III).

3. Procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación del compuesto de fórmula (I) en donde

n es 1;

m es 1;

A es un doble enlace;

B es un enlace sencillo o un doble enlace;

C es un doble enlace;

D es un enlace sencillo;

E es un doble enlace;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son H;

R_{4} es metilo;

R_{6} es H;

R_{7} es OH;

q es 4, 5 ó 6.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación del compuesto de fórmula (I), en donde

n es 1

m es 1;

A, B, C, E y F son enlaces dobles;

D es un enlace sencillo;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son H;

R_{4} es metilo;

R_{5} es s-butilo o isopropilo;

R_{6} es H;

R_{7} es OH;

R_{8} es metilo;

R_{9} es H.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación de la sal benzoato de 4''-deoxi-4''-N-metilamino avermectina B_{1a}/B_{1b}.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en donde el biocatalizador es un microorganismo.

7. Procedimiento según 1 ó 2, en donde el biocatalizador se elige del grupo consistente en

a): un microorganismo vivo en forma de células vegetativas, células en reposo o células liofilizadas,

b): las esporas de dicho microorganismo,

d): extractos en bruto del contenido celular de dicho microorganismo y

8. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en donde el microorganismo es un representante del género Streptomyces.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en donde el microorganismo es una cepa de Streptomyces seleccionada del grupo consistente en Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus y Streptomyces kasugaensis.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en donde el microorganismo es la cepa Streptomyces R-922 depositada con el número de registro DSM- 13136.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, en donde el microorganismo es la cepa Streptomyces I-1529 depositada con el número de registro DSM- 13135.

12. Procedimiento para producir un compuesto de fórmula (III) que comprende las siguientes etapas:

(1): producción de células por inoculación de un medio nutriente que promueve el crecimiento celular con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III);

(2): recogida de las células después del crecimiento;

(3): disolución de un compuesto de fórmula (II) en un disolvente adecuado;

(4): adición de la solución de la etapa (3) a un medio de reacción que no promueve la proliferación celular;

(5): adición de células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa (4);

(6): sacudida o agitación de la mezcla de reacción de la etapa (5) en presencia de aire;

(7): separación de las células del medio;

(8): extracción del sobrenadante y de las células con disolventes adecuados;

(9): concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (8);

(10): purificación de un compuesto de fórmula (III) contenido en el extracto (9) por cromatografía o cristalización.

13. Procedimiento para producir un compuesto de fórmula (III) que comprende las siguientes etapas:

(1): disolución de un compuesto de fórmula (II) en un disolvente adecuado;

(2): adición de la solución de la etapa (1) a un medio nutriente que promueve el crecimiento celular;

(3): inoculación del medio nutriente de la etapa (2) con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III);

(4): cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III);

(5): separación de las células del medio;

(6): extracción del sobrenadante y de las células con disolventes adecuados;

(7): concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (6) en vacío;

(8): purificación de un compuesto de fórmula (III) contenido en el extracto (7) por cromatografía o cristalización.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en donde el compuesto de fórmula (II) es avermectina y el compuesto de fórmula (III) es 4''-oxo- avermectina.