CZ20014283A3 - Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu - Google Patents
Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20014283A3 CZ20014283A3 CZ20014283A CZ20014283A CZ20014283A3 CZ 20014283 A3 CZ20014283 A3 CZ 20014283A3 CZ 20014283 A CZ20014283 A CZ 20014283A CZ 20014283 A CZ20014283 A CZ 20014283A CZ 20014283 A3 CZ20014283 A3 CZ 20014283A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fermentation
- range
- desglucodesrhamnoruscin
- glycosides
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229930002534 steroid glycoside Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims abstract description 5
- 240000000353 Ruscus aculeatus Species 0.000 claims abstract description 4
- 235000003500 Ruscus aculeatus Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 3
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 241000894007 species Species 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- PKQGPNNFRIIDFC-MTRMYNQZSA-N Ruscoside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)CO[C@H]1O[C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4C[C@H]5[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)[C@H](O)C1)C)[C@@H]([C@@](O5)(O)CCC(=C)CO[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PKQGPNNFRIIDFC-MTRMYNQZSA-N 0.000 description 9
- JWGLJRXUTIFBHW-GKDQWZISSA-N Ruscoside Natural products O(CC(=C)CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@@]5(C)[C@H](O[C@H]6[C@H](O[C@H]7[C@H](O)[C@@H](O[C@H]8[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O8)[C@@H](O)[C@H](C)O7)[C@H](O)[C@H](O)CO6)C[C@H](O)CC5=CC4)CC3)C[C@@H]2O1)[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 JWGLJRXUTIFBHW-GKDQWZISSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QMQIQBOGXYYATH-IDABPMKMSA-N Ruscogenin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)[C@H](O)C[C@H](O)CC4=CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 QMQIQBOGXYYATH-IDABPMKMSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 4
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BSUPFYRQXCQGLJ-UHFFFAOYSA-N Ruscogenin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CC=C6CC(O)CC(O)C6(C)C5CCC4(C)C3C2C BSUPFYRQXCQGLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- QMQIQBOGXYYATH-UHFFFAOYSA-N epiruscogenin Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)C(O)CC(O)CC4=CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 QMQIQBOGXYYATH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940109990 ruscogenin Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RILPIWOPNGRASR-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-2-Hydroxy-3-methylpentanoic acid Natural products CCC(C)C(O)C(O)=O RILPIWOPNGRASR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloroethane Chemical compound CC(Cl)(Cl)Cl UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RILPIWOPNGRASR-WHFBIAKZSA-N L-Isoleucic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](O)C(O)=O RILPIWOPNGRASR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALTRINCJVPIQNK-HWOQDVLDSA-N 3-epineoruscogenin Natural products C[C@H]1[C@H]2[C@H](C[C@@H]3[C@@H]4CC=C5C[C@H](O)C[C@@H](O)[C@]5(C)[C@@H]4CC[C@]23C)O[C@]16CCC(=C)CO6 ALTRINCJVPIQNK-HWOQDVLDSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- ALTRINCJVPIQNK-NHIXJPGBSA-N delta5-convallamarogenin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)[C@H](O)C[C@H](O)CC4=CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CCC(=C)CO1 ALTRINCJVPIQNK-NHIXJPGBSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby derivátů steroidních glykosidů (ruscosaponinů) Ruscus Aculeatus. Vynález se zvláště týká způsobu výroby desglukodesrhamnoruscinu hydrolýzou ruscosidu a/nebo desglukoruscosidu fermentačním způsobem.
Dosavadní stav techniky
Desglukorhamnoruscin a odpovídající volné aglykony, ruscogenin a neoruscogenin, které je možno snadno získat z desglukodesrhamnoruscinu hydrolýzou v kyselém prostředí, jsou cenné látky s farmakologickou účinností, zejména s protizánětlivými účinky a s příznivými účinky na pojivovou tkáň.
Chemická příprava uvedených účinných látek z výchozího ruscosidu nebo desglukoruscosidu je však problematická vzhledem k nutnosti použití poměrně drastických podmínek, jako je hydrolýza působením silných kyselin a další složité postupy, jimiž se přesto získá velmi nesourodá směs meziproduktů a produktů.
Bylo by tedy velmi žádoucí navrhnout způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu, kterým by bylo možno překonat svrchu uvedené nevýhody, které jsou spojeny se známými chemickými postupy.
• · ·
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoři způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu, který spočívá v tom, že se hydrolyzuji steroidni glykosidy (ruscosaponiny) Ruscus aculeatus fermentaci substrátu, obsahujícího tyto glykosidy působením hub z čeledi Aspergillus niger.
Jako živné prostředí se v typických případech užívá živný bujón.
Fermentace se obvykle provádí při teplotě 25 až 30, s výhodou 27 °C za stálého míchání a provzdušňování tak, aby bylo dosaženo pO2, vyššího nebo rovného 50 %.
Koncentrace výchozích steroidnich glykosidů se obvykle pohybuje v rozmezí 5 až 15 g/100 ml, s výhodou v rozmezí 8 až 10 g/100 ml, pH živného roztoku se pohybuje v rozmezí 4 až 6, s výhodou 4,5 až 5,5.
Biotechnologický postup podle vynálezu dovoluje uskutečnit celou reakci v jediném fermentačním stupni vzhledem k tomu, že mikroorganismus, zvolený vhodnými mikrobiologickými technikami, je schopný exprese nezbytných enzymů pro provedení všech po sobě následujících transformačních reakcí od výchozího složitého heteroglykosidu k monoglykosidu nebo k výslednému aglykonu. Tato přeměna pomocí hydroláz spočívá v podstatě v reakcích β-glukosidázy a cc-rhamnosidázy na meziproduktech, které jsou v průběhu postupu postupně uvolňovány. Další reakce s α-arabinosidázou umožňuje získat volný aglykon ruscogenin.
• ·
Svrchu uvedený přístup je zcela nový a v dosud publikované literatuře není možno nalézt žádné příklady takového postupu.
Mikroorganismy, vhodné k provádění svrchu uvedené přeměny, je možno získat selekcí na syntetických nebo polosyntetických živných prostředích, k nimž se přidávají substráty, k jejichž přeměně má dojít. Tyto substráty se přidávají místo běžných zdrojů uhlíku, jako jsou glukóza, sacharóza a podobně, nebo spolu s těmito běžnými zdroji. Zvolené substráty, to znamená ruscosid a desglukoruscosid je možno přidat v koncentraci 90 až 100 g/1. Agarová izolační prostředí mohou být běžná mikrobiologická prostředí, jako agar se sladem nebo Czapkův agar nebo podobná živná prostředí, která obsahují jako zdroje dusíku peptony, močovinu, dusičnan amonný a podobně, kdežto běžné zdroje uhlíku, jako jsou glukóza a sacharóza, jsou nahrazeny nebo jsou doplněny ruscosidem nebo desglukoruscosidem. K živným prostředím je možno dále přidávat anorganické soli draslíku, hořčíku, manganu, zinku a podobně, jako fosfáty, sulfáty a/nebo chloridy. Izolační prostředí může mít pH v rozmezí 4 až 6, s výhodou 4,5 až 5,5.
Mikroorganismy, vhodné k uskutečnění požadované biologické přeměny je možno izolovat postupným ředěním a naočkováváním vodných suspenzí vzorků půdy, humusu, rostlinných extraktů a dalších podobných organických zdrojů na kultivační plotny.
Mikrobiální kultury, podrobené selekci svrchu uvedeným způsobem se pak izolují do mikrobiologických • · zkumavek, které obsahují totéž živné prostředí a použijí se k biologické přeměně ruscosidu a desglukorusoosidu, tyto látky je možno přidávat v poměrně vysokých koncentracích až 100 g/1 ke kapalné kultuře v živném prostředí, které obsahuje stejné zdroje dusíku jako izolační prostředí, například močovinu nebo pepton a mimo to fosfáty nebo jiné anorganické soli, tak jak bylo popsáno svrchu, živné prostředí má pH 4 až 6, s výhodou 4,5 až 5,5.
Svrchu popsaným způsobem bylo prokázáno, že vybrané kultury Aspergillus niger jsou schopné přeměnit ruscosid a desglukoruscosid na desglukodesrhamnoruscin, který je přímým prekursorem ruscogeninu, přeměna se uskuteční postupnými reakcemi enzymů β-glukosidázy a arhamnosidázy.
Následnou reakcí s ct-arabinosidázou je možno získat saponin v aglykonové formě (ruscogenin-neoruscogenin) .
Vybraná kultura je schopná uskutečnit svrchu popsanou přeměnu při svém růstu za řízených podmínek při použití thermostatu při optimálních teplotách v rozmezí 25 až 30 °C za stálého protřepávání na rotačním třepacím zařízení při rychlosti 200 + 300 otáček/minutu.
Fermentaci je rovněž možno uskutečnit ve vhodném biologickém reaktoru v různém měřítku včetně průmyslové produkce požadovaných saponinových derivátů.
Mikroorganismy, použité pro tuto biologickou přeměnu, jsou schopné trvale udržovat katalytickou účinnost, a to i v případě opakovaných fermentačních • · ·
·· ·· ♦ · · cyklů, prováděných po jednotlivých vsázkách nebo kontinuálním způsobem.
Způsob podle vynálezu má podstatné výhody, je například méně složitý včetně izolačních stupňů pro výsledný produkt a snadno se provádí, mimo to je hospodárnější než známé postupy.
Vybrané mikroorganismy je možno zmrazit i pro dlouhodobé uložení v suspenzích, obohacených látkami, bránícími poškození při zmrazení, jako je glycerol, pepton a podobně, při teplotách -80 až -196 °C v kapalném dusíku, nebo je možno kultury lyofilizovat.
Průběh biologické přeměny je možno sledovat pomocí analýzy TLC a HPLC živného prostředí při použití následujících analytických postupů:
TLC analýza
- silikagelové desky 60 F250 Merck
- eluční činidla:
A) ethylacetát a methanol 9:1,
B) ethylacetát, methanol a voda 100:15:10.
- detekce reakcí s 10% kyselinou sírovou a zahřátím na 5 minut na teplotu 120 °C, pak je možno detekci uskutečnit ve viditelném světle nebo v UV oblasti.
HPLC analýza
- sloupec Supelcosil LC18, 250 x 4,6 mm, 5 pm
- eluční činidlo: acetonitril a voda 60:40
- vlnová délka: 200 nm
- vstřikovaný objem 10 μΐ
- rychlost průtoku 1 ml/min.
• · · • ·
Výsledné produkty biologické přeměny, jako desglukodesrhamnoruscin je možno izolovat extrakcí živného prostředí n-butanolem s následným čištěním produktů pomocí chlorovaných rozpouštědel, jako trichlorethanu a chromatografii na silikagelu. Na konec je možno produkt nechat krystalizovat z různých rozpouštědel, například z isopropanolu, ethylacetátu, chloroformu, acetonu nebo methanolu. Kromě hlavního požadovaného produktu je tímto způsobem možno získat také desglukodesrhamnorusciny, esterifikované v poloze C-2', například kyselinou 2-hydroxy-3-methylpentanovou.
Saponiny v aglykonové formě (ruscogeniny) je možno připravit hydrolýzou fermentačních produktů v kyselém prostředí, tak jak bylo popsáno svrchu.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 lahve živného prostředí (bujón se sladem, 250 ml v lahvi) se naočkují sporami kultury Aspergillus niger na sladovém agaru, získanými selekcí na modifikovaném agarovém prostředí se sladem s přidáním 2 % ruscosidu. Lahve se inkubují 48 hodin při teplotě +27 °C na orbitálním míchacím zařízení při 250 otáčkách za minutu. Po inkubaci se předběžná kultura přenese do biologického reaktoru, který obsahuje přibližně 7 litrů sterilního produkčního bujónu RO90 s následujícím složením, v němž jsou uvedené hodnoty vztaženy na 1 litr deíonizované
vody: suchý extrakt ruscosidu 90 g, močovina 1 g, pepton 1 g, MgSO4.7H2O 5 g, KC1 1,5 g, KH2PO4 1 g, MnSO4.H2O 0,2 g, ZnSO4.7H2O 0,1 g, protipěnivý prostředek P2000 1,5 ml, pH přibližně 5.
Fermentace se provádí při vhodné hodnotě rozpuštěného kyslíku pO2, přičemž se postupně zvyšuje rychlost míchání a probublávání vzduchu tak, aby bylo dosaženo hodnoty pO2 vyšší než 50 %. Postup biologické přeměny se sleduje analýzou HPLC a TLC. Po inkubaci 5 dnů při teplotě +27 °C je fermentace ukončena. Analýza TLC a HPLC živného bujónu prokazuje, že došlo k vymizení ruscosidu, kdežto jako hlavní produkt je přítomen desglukodesrhamnoruscin a stopy ruscogeninů.
Živné prostředí se důkladně extrahuje n-butanolem. Butanolový extrakt se odpaří ve vakuu při teplotě +60 °C, načež se znovu rozpustí v 70% methanolu a zpětně se extrahuje trichlorethanem. Chlorovaný roztok se odpaří ve vakuu na pevný odparek. Po opětném rozpuštění odparku ve směsi chloroformu a methanolu se produkt čistí chromatografií na sloupci silikagelu (Kieselgel, Merck), při použití směsi ethylacetátu a chloroformu 9:1 jako elučního činidla. Frakce se ověří analýzou TLC a HPLC. Frakce s obsahem čištěného produktu se koncentrují ve vakuu a odparek se znovu rozpustí v acetonu a nechá se krystalizovat. Další krystalizací z metanolu se získá přibližně 7 g výsledného produktu, který se identifikuje spektroskopickou analýzou jako desglukodesrhamnoruscin. Kromě tohoto hlavního produktu obsahuje směs ještě desglukodesrhamnoruscin, esterifikovaný v poloze C-2' kyselinou 2-hydroxy-3-methylpentanovou, tento ester se získá v nižším množství přibližně 800 mg.
•.i«« • · • ·· ·· · ♦ · ·· • · • · • · 4 4 ·
Hydrolýzou svrchu popsaných fermentačních produktů v kyselém prostředí, se získají saponiny v aglykonové formě (ruscogeniny).
Příklad 2
Ve fermentoru, popsaném v příkladu 1 se provede první biotransformační cyklus, po němž se 90 % živného prostředí extrahuje k izolaci výsledného produktu. Zbývajících 10 % fermentačního prostředí se vloží do fermentoru s čerstvým prostředím RO90 do konečného objemu 7 litrů. Tento druhý fermentační cyklus se provádí za týchž podmínek a s analytickými kontrolami tak, jak bylo popsáno svrchu. Po inkubaci 5 dnů při teplotě +27 °C je fermentace ukončena.
Živné prostředí z obou fermentačních cyklů se zpracuje způsobem, uvedeným v příkladu 1 pro extrakci a izolaci výsledného produktu. Po ukončení celého postupu se získá přibližně 14 g desglukodesrhamnoruscinu.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu, vyznačující se tím, že se hydrolyzují steroidní glykosidy (ruscosaponiny) Ruscus aculeatus fermentací substrátu, obsahujícího tyto glykosidy působením hub z čeledi Aspergillus niger.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako substrát užije kapalné živné prostředí.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se fermentace provádí při teplotě 25 až 30 °C za míchání a probublávání vzduchem až do dosažení hodnoty p02 vyšší nebo rovné 50 %.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se postup provádí při teplotě 27 °C.
- 5. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se výchozí koncentrace steroidních glykosidů pohybuje v rozmezí 5 až 15 g/100 ml.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se výchozí koncentrace steroidních glykosidů pohybuje v rozmezí 8 až 10 g/100 ml.• 0 • 0 • · • · ·· ΦΙΜ
- 7. Způsob podle některého z nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že se pH živného prostředí pohybuje v rozmezí 4 až 6.
- 8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že se pH živného prostředí pohybuje v rozmezí 4,5 až 5,5.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT1999MI001223A ITMI991223A1 (it) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Processo per la preparazione di derivati di glicosidi steroidei di ruscus aculeatus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20014283A3 true CZ20014283A3 (cs) | 2002-04-17 |
| CZ301224B6 CZ301224B6 (cs) | 2009-12-16 |
Family
ID=11383097
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20014283A CZ301224B6 (cs) | 1999-06-01 | 2000-05-26 | Zpusob výroby desglukodesrhamnoruscinu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6528280B1 (cs) |
| EP (1) | EP1181384B1 (cs) |
| JP (1) | JP4699661B2 (cs) |
| KR (1) | KR100670413B1 (cs) |
| CN (1) | CN1261587C (cs) |
| AT (1) | ATE290603T1 (cs) |
| AU (1) | AU773234B2 (cs) |
| CA (1) | CA2375087C (cs) |
| CZ (1) | CZ301224B6 (cs) |
| DE (1) | DE60018560T2 (cs) |
| ES (1) | ES2237436T3 (cs) |
| HK (1) | HK1046432B (cs) |
| HU (1) | HUP0201380A3 (cs) |
| IL (1) | IL146827A0 (cs) |
| IT (1) | ITMI991223A1 (cs) |
| NO (1) | NO326848B1 (cs) |
| PL (1) | PL200908B1 (cs) |
| PT (1) | PT1181384E (cs) |
| RU (1) | RU2249043C2 (cs) |
| SK (1) | SK286195B6 (cs) |
| WO (1) | WO2000073489A1 (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009138994A1 (en) * | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Biocon Limited | A fermentation process for the production of secondary metabolites |
| CN102504007B (zh) * | 2011-12-15 | 2013-09-25 | 成都普思生物科技有限公司 | 一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法 |
| CN103588852B (zh) * | 2013-11-26 | 2016-03-30 | 陕西嘉禾生物科技股份有限公司 | 从假叶树中提取分离鲁斯可皂苷元的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2104911A1 (en) | 1970-09-03 | 1972-04-28 | Investigations Sci Pharm | Heterosides from ruscus aculeatus l - useful as antiinflammatories vasconstructors and fibrinolytics |
| GB1380253A (en) * | 1971-01-21 | 1975-01-08 | Inverni Della Beffa Spa | Prosapogenins |
| JPS59192075A (ja) * | 1983-04-12 | 1984-10-31 | Dainippon Ink & Chem Inc | アロエ抽出物の苦味改良法 |
-
1999
- 1999-06-01 IT IT1999MI001223A patent/ITMI991223A1/it unknown
-
2000
- 2000-05-16 US US09/979,141 patent/US6528280B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-26 DE DE60018560T patent/DE60018560T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 WO PCT/EP2000/004794 patent/WO2000073489A1/en active IP Right Grant
- 2000-05-26 SK SK1745-2001A patent/SK286195B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 JP JP2001500799A patent/JP4699661B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-26 HU HU0201380A patent/HUP0201380A3/hu unknown
- 2000-05-26 RU RU2001132333/13A patent/RU2249043C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 EP EP00943740A patent/EP1181384B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 IL IL14682700A patent/IL146827A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 PL PL352016A patent/PL200908B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 AT AT00943740T patent/ATE290603T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 KR KR1020017015394A patent/KR100670413B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 ES ES00943740T patent/ES2237436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 CN CNB00808243XA patent/CN1261587C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-26 PT PT00943740T patent/PT1181384E/pt unknown
- 2000-05-26 AU AU58099/00A patent/AU773234B2/en not_active Ceased
- 2000-05-26 CZ CZ20014283A patent/CZ301224B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 CA CA2375087A patent/CA2375087C/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-11-29 NO NO20015824A patent/NO326848B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-10-30 HK HK02107852.0A patent/HK1046432B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ENDO et al. | Specific inhibition of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by koningic acid (heptelidic acid) | |
| CA1161380A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation | |
| JPS6312300A (ja) | ジンセノサイド−Ｒｄの製造法 | |
| AU2006100665B4 (en) | Biocatalytic oxidation process and use thereof | |
| CS228517B2 (en) | Method for the production of macrolide | |
| CZ20014283A3 (cs) | Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu | |
| PL200909B1 (pl) | Sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny | |
| JP2003501045A6 (ja) | Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓステロイド配糖体の誘導体の製造方法 | |
| EP0478064B1 (en) | Microbial preparation of 13beta-13-deoxy-22,23-dihydro avermectin-B1a/B1b aglycone | |
| EP0922770B1 (en) | A microbiological process for the transformation of 17beta-carboxy substituted 3-oxo-4-azasteroids and the use of such products as inhibitors of the enzyme 5alpha-reductase | |
| USRE29163E (en) | 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-oic acid | |
| US4923403A (en) | Microbiological process for degradation of steroids | |
| US5773264A (en) | Process for the production of 17 α-hydroxy-3-methoxy-8,14-seco-1,3,5(10),9(11)estratetraen-14-one by reduction of the corresponding 17-one compound | |
| KR970001001B1 (ko) | I-디옥시만노딜리마이신의 제법 | |
| JPH08149986A (ja) | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 | |
| HU204575B (en) | Process for producing 1-methyl-1,4-androstadiene-3,17-dion | |
| NO863077L (no) | Fremgangsmaate til mikrobiell hydroksylering av forskolin og dens derivater ved neurospora crassa. | |
| JP2002017386A (ja) | インドール−３−カルボン酸誘導体の製造法 | |
| EP0045205A1 (en) | Macrolides | |
| JPH0889277A (ja) | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 | |
| JPS62118897A (ja) | ステロイド類の１１β位の水酸化法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110526 |