PL200909B1 - Sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny - Google Patents

Abstract

Sposób przygotowywania desglukodesramnoruscyny polegaj acy na enzymatycznej hydrolizie gli- kozydów steroidowych (ruskosaponiny) za pomoc a nie oczyszczonych hydrolaz z Aspergillus niger. PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania desglukodesramnoruscyny, jako pochodnych glikozydów steroidowych (ruskosaponin) z Ruscus Aculeatus.

Niniejszy wynalazek dotyczy zwłaszcza sposobu otrzymywania desglukodesramnoruscyny przez hydrolizę ruskozydu i/lub deglukoruskozydu na drodze fermentacyjnej.

Desglukoramnoruscyna i odpowiadające jej wolne aglikany, ruskogenina i noeruskogenina, które mogą być łatwo uzyskane z desglukodesramnoruscyny przez hydrolizę kwaśną są cennymi farmaceutycznie aktywnymi zasadami posiadającą, aktywność przeciwzapalną i łącząco-zabezpieczającą.

W DE 22 02 393A ujawniono ekstrakcję i hydrolizę saponin z Ruscus Aculeatus enzymami glikolitycznymi (celulazami i takadiastazami) gdzie jednym z produktów hydrolizy była desglukodesramnoruscyna a źródłem takadiastazy był Aspergillus oryzae.

Perepelista, E.D. i wsp. (Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya, tom 11, 1975, p. 901-905) ujawnia hydrolizę protodioscyny, głównego glikozydu z Tribulus terrestris, do dioscyny i tryliny przez Aspergillus niger BKMt-33.

Chemiczne przygotowanie wspomnianych aktywnych zasad wychodząc od ruskozydu lub desglukoruskozydu jest jednak problematyczne ponieważ wymaga ono drastycznych warunków takich jak hydroliza mocnymi kwasami, złożonych etapów procesu, który daje bardzo niejednorodną mieszaninę produktu i związków pośrednich.

Dlatego jest bardzo pożądanym dostarczenie sposobu przygotowania desglukodesramnoruscyny, pozbawionego niedogodności takich jakie opisywano w odniesieniu do znanych procesów chemicznych.

Niniejszy wynalazek wychodzi naprzeciw tym potrzebom i dostarcza sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny, który polega na hydrolizie wiązania heterozydowego ramnoza/arabinoza glikozydów steroidowych z Ruscus aculeatus (ruskosaponin) poprzez fermentację substratu zawierającego wspomniane glikozydy za pomocą grzybów z rodzaju Aspergillus niger, otrzymanych przez selekcję w medium hodowlanym, przy czym konwencjonalne źródło węgla zostało zastąpione lub uzupełnione ruskozydem lub desglukoruskozydem.

Korzystnie jako substrat stosuje się bulion hodowlany, który jest tutaj typowo używany jako złożony substrat odżywczy.

Fermentacje korzystnie prowadzi się w temperaturze 25-30°C, mieszając i napowietrzając do osiągnięcia pO2 wyższego niż, lub równego 50%, a bardziej korzystnie w temperaturze 27°C.

Stężenie wyjściowych glikozydów steroidowych zwykle waha się od 5 do 15% w/v, korzystnie od 8 do 10% w/v i pH bulionu hodowlanego waha się od 4 do 6, korzystnie 4,5-5,5.

Proces biotechnologiczny według wynalazku pozwala na przeprowadzenie całej sekwencji reakcji w pojedynczym etapie fermentacji, w którym to procesie mikroorganizm wybrany odpowiednimi technikami mikrobiologicznymi jest zdolny do ekspresji enzymów o enzymatycznych aktywnościach koniecznych do kierowania wszystkimi reakcjami sekwencyjnej transformacji, od wyjściowego kompleksu heteroglikozydu do monoglikozydu lub ostatecznego aglikonu. Wspomniane przekształcenia hydrolazowe zawierają ciągi reakcji β-glukozydazy, α-ramnozydazy ze związkami pośrednimi, które są stopniowo uwalniane podczas tego procesu. Dalsza reakcja α-arabinozydazy pozwala na osiągnięcie wolnego aglikonu (ruskogeniny).

Takie podejście jest całkiem nowe i dlatego, nie można napotkać w literaturze przykładów wspomnianej procedury do otrzymywania takiego produktu.

Mikroorganizmy odpowiednie do przeprowadzenia takiej transformacji są uzyskiwane przez selekcję w syntetycznym lub pół-syntetycznym bulionie, dodanym do tych samych substratów jakie mają być transformowane, jako dodatek do, lub w miejsce konwencjonalnych źródeł węgla (glukozy, sacharozy i podobnych). Stężone substraty (ruskozyd, desglukoruskozyd) mogą być dodawane w tym przypadku nawet w dużym stężeniu, na przykład 90-100 g/L. Agaryzowany bulion izolacyjny posiada zwykły dla mikrobiologii skład taki jak, Malt Agar i Czapek Agar, lub podobne składy w których azot jest reprezentowany przez peptony, mocznik, azotan amonu i podobne, podczas gdy konwencjonalne źródło węgla (glukoza, sacharoza) były zastępowane lub uzupełniane przez ruskozyd lub desglukoruskozyd. Wspomniane buliony mogą być następnie dodawane z solami mineralnymi potasu, magnezu, manganu, cynku i tym podobnymi, to znaczy takie jak: fosforany, siarczany i/lub chlorki. W mediach izolacyjnych pH może wahać się od 4 do 6, korzystnie od 4,5 do 5,5.

PL 200 909 B1

Mikroorganizmy odpowiednie do wymaganej biotransformacji są odzyskiwane przez skalarne rozcieńczenia i nałożenie wodnych roztworów próbek gleby, humusu, ekstraktów warzywnych i innych podobnych surowców organicznych.

Hodowle mikroorganizmów wybrane tak jak opisano powyżej są izolowane w mikrobiologicznych probówkach testowych zawierających takie same buliony hodowlane i używane do biotransformacji ruskozydu i desglukoruskozydu, dodawane w wysokim stężeniu (do 100 g/l) do ciekłego bulionu hodowlanego zawierającego takie same źródła azotu jak zastosowano w bulionie do izolowania, takie jak mocznik lub pepton z dodatkiem fosforanów i innych soli mineralnych, jak opisano powyżej przy pH wahającym się od 4 do 6, korzystnie 4,5 do 5,5.

Na podstawie procedur opisanych powyżej stwierdzono, że wybrane hodowle Aspergillus niger są zdolne do przekształcania ruskozydu i desglukoruskozydu w desglukodesramnosuscynę, bezpośredniego prekursora ruskogenin, poprzez kolejno następujące reakcje enzymatyczne β-glukozydazy i α-ramnozydazy.

Kolejna reakcja α-arabinozydazy dostarcza saponinę w postaci aglikogenicznej (ruskogeninaneoruskogenina).

Wybrana hodowla jest zdolna do przeprowadzania takiego przekształcania rosnąc w kontrolowanych warunkach (termostatowanych), w optymalnej temperaturze wahającej się od 25°C do 30°C, w warunkach wytrząsania na mieszarce obrotowej (200 300 rpm). Wspomniana fermentacja może być także prowadzona w odpowiednim bioreaktorze, na różną skalę, do produkcji przemysłowej pożądanych pochodnych saponin.

Mikroorganizmy stosowane do wspomnianej biotransformacji są zdolne do stałego podtrzymywania aktywności katalitycznej, nawet w powtórzonych cyklach fermentacyjnych, w procesach wsadowych lub procesach ciągłych.

Niniejszy sposób dostarcza ważnych korzyści, takich jak mniej złożone etapy do wyodrębniania i odzyskiwania produktu, i jest on także łatwy do przeprowadzenia oraz bardziej oszczędny.

Wybrane mikroorganizmy mogą być zamrażane do długotrwałego przechowywania w zawiesinach wzbogaconych w substancje konserwujące w niskich temperaturach, takie jak j glicerol, pepton i tym podobne, w temperaturze wahającej się od -80°C do -196°C (w ciekłym azocie), lub mogą być poddawane liofilizacji.

Postęp biotransformacji może być monitorowany w próbach TLC i HPLC bulionu hodowlanego, stosując następujące metody analityczne:

Analiza TLC

- płytki z żelem krzemionkowym 60 F250 Merck

- Eluenty:

A) Octan etylu - metanol 9:1

B) Octan etylu - metanol- woda 100:15:10

- Detekcja: reakcja z 10% kwasem siarkowym i ogrzewanie do 120°C przez 5 minut, następnie uwidacznianie i wykrywanie przez UV.

- Analiza HPLC

- Kolumna: Supelcosil LC18, 250 x 4,6 mm, 5 μm

- Eluent: acetonitryl - woda 60 : 40

- Długość fali: 200 nm

- Objętość iniekcyjna: 10 μl

- Przepływ: 1mL/min.

Ostateczny produkt biotransformacji, taki jak desglukodesramnoruscyna może być odzyskiwany przez ekstrakcję bulionu hodowlanego n-butanolem, następnie etapowe oczyszczanie rozpuszczalnikami chlorkowymi (takimi jak trójchloroetan) i przez chromatografię na żelu silikonowym. Ostatecznie, produkt może być wykrystalizowywany z różnych rozpuszczalników, takich jak izopropanol, octan etylu, chloroform, aceton, metanol. Poza produktem głównym może być otrzymywany np., kwas 2-hydroksy-3-metylopentanowy.

Saponiny w postaci aglikonowej (ruskogeniny) otrzymywane są poprzez hydrolizę kwaśną opisanych powyżej produktów fermentacji.

Przykłady realizacji wynalazku przedstawiono poniżej.

P r z y k ł a d 1 słoje z bulionem hodowlanym (Malt Broth, 250 ml na słój) są zaszczepiane sporami z hodowli Aspergillus niger na Malt Agar, otrzymanymi przez selekcję na pożywce słodowej Modified Agar

PL 200 909 B1 (z dodanym 2% ruskozydem). Słoje inkubuje się przez 48 godzin w +27°C, na mieszadle obrotowym przy 250 rpm. Po inkubacji prehodowla jest przenoszona do bioreaktora zawierającego około 71 jałowego bulionu produkcyjnego R090, posiadającego następujący skład (wartości odnoszą się do jednego litra wody dejonizowanej): suchy ekstrakt ruskozydu (90 g), mocznik (g 1), pepton (g 1),

MgSO₄-7H₂O (g 5), KCl (g 1,5), KH₂PO₄ (g 1), MnSO₄-7H₂O (g 0,2), ZnSO₄-7H₂O (g 0,1), środek przeciwpieniący P2000 (mL 1,5), przy pH około 5.

Fermentację prowadzi się w oparciu o: procentowość rozpuszczonego tlenu (pO2), progresywne podwyższanie szybkości mieszania i przepływu powietrza, do otrzymania wartości pO2 wyższej niż 50%.

Postęp biokonwersji jest monitorowany poprzez analizę HPLC i TLC. Po 5 dniach inkubacji przy +27°C fermentacja jest zakończona. Analiza bulionu wykonana metodą TLC i HPLC pokazuje, że ruskozyd zniknął, podczas gdy desglukodesramnoruscyna jest obecna jako produkt główny, z śladami ruskogenin.

Bulion hodowlany jest wyczerpująco ekstrahowany n-butanolem. Butanolowy ekstrakt jest zatężany do suchości pod próżnią przy +60°C, ponownie rozpuszczany w 70% metanolu i zwrotnie ekstrahowany trójchloroetanem. Chlorowany roztwór jest zatężany do stałego produktu pod próżnią. Po ponownym rozpuszczeniu w mieszaninie chloroform-metanol, produkt jest oczyszczany na kolumnie chromatograficznej (Kieselgel, merck), eluentem octan-chloroform 9:1. Frakcje są sprawdzane analizą TLC i HPLC. Oczyszczona frakcja produktu jest zatężana pod próżnią, następnie ponownie rozpuszczana i krystalizowana. Dalsza krystalizacja z metanolu daje około 7 g produktu, identyfikowanego analizą spektroskopową jako desglukodesramnoruscyna. Poza głównym produktem, otrzymywana jest w niskich ilościach (około 800 mg) estryfikowana kwasem 2-hydroksy-3-metylopentanowym przy C-2' desglukodesramnoruscyna.

Hydroliza kwaśna produktu fermentacji opisana powyżej daje w wyniku saponiny w postaci aglukonicznej (ruskogeniny).

P r z y k ł a d 2

Sterując fermentorem jak opisano w przykładzie 1, prowadzono pierwszy cykl biotransformacji, po czym 90% bulionu hodowlanego pobierano do ekstrakcji dla otrzymania produktu; pozostałe 10% bulionu fermentacyjnego jest dodawane do fermentora ze świeżym bulionem RO90 do końcowej objętości około 71. Ten drugi cykl fermentacyjny jest przeprowadzany z tymi samymi parametrami i kontrolą analityczną jak opisano powyżej. Po około 5 dniach inkubacji w +27°C fermentacja jest zakończona.

W celu ekstrakcji i odzyskania produktu buliony hodowlane z dwóch cykli fermentacyjnych są traktowane jak opisano w przykładzie 1. Na koniec ostatniego etapu, otrzymuje się około 14 g desglukodesramnoruscyny.

Claims (8)

1. Sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny, znamienny tym, że przeprowadza się hydrolizę wiązania heterozydowego ramnoza/arabinoza glikozydów steroidowych z Ruscus Aculeatus poprzez fermentację substratu zawierającego te glikozydy za pomocą grzybów z gatunku Aspergillus niger, otrzymanych przez selekcję w medium hodowlanym, przy czym konwencjonalne źródło węgla zostało zastąpione lub uzupełnione ruskozydem lub desglukoruskozydem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany substrat stanowi bulion hodowlany.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że fermentację prowadzi się w temperaturze 25-30°C mieszając i napowietrzając do osiągnięcia pO2 większego niż lub równego 50%.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się temperaturę 27°C.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stężenie początkowe glikozydów steroidowych waha się od 5 do 15% w/v.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stężenie waha się od 8 do 10% w/v.

7. Sposób według zastrz. 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że pH bulionu hodowlanego waha się od 4 do 6.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że pH bulionu hodowlanego waha się od 4,5 do 5,5.