ITMI991222A1 - Processo per la preparazione di derivati di glicosidi steroidei di ruscus aculeatus mediante idrolisi enzimatica - Google Patents

Processo per la preparazione di derivati di glicosidi steroidei di ruscus aculeatus mediante idrolisi enzimatica Download PDF

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Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PROCESSO PER LA PREPARAZIONE DI DERIVATI DI GLICOSIDI STEROIDEI DI RUSCUS ACULEATUS MEDIANTE IDROLISI ENZIMATICA"
La presente invenzione ha per oggetto un processo per la preparazione di derivati di glicosidi steroidei di Ruscus aculeatus (ruscosaponina).
Più in particolare, l'invenzione si riferisce a un processo per la preparazione di desglucodesramnoruscina per idrolisi enzimatica parziale di ruscina, desglucoruscina o ruscos /ide.
L'idrolisi enzimatica secondo l'invenzione viene effettuata per mezzo di preparazioni enzimatiche grezze a base di idrolasi estratte da Aspergillus nigèr. Tali preparazioni sono disponibili commercialmente e vengono utilizzate nel settore enologico o alimentare. E' particolarmente preferito l’uso * della preparazione disponibile commercialmente da Gist Brocades con il marchio di Cytolase PCL5.
Tali preparazioni enzimatiche presentano contemporaneamente attività β-glùcopiranosidasica e aramnopiranosidasica e permettono pertanto la rimozione sequenziale del residuo β-glicosidico seguita dalla rimozione del residuo a-ramnosidico fino al prodotto desiderato .
L'idrolisi enzimatica viene effettuata in soluzione acquosa tamponata a pH 5 o in acqua contenente fino ad un massimo di circa il 30% in volume di etanolo. Si è notato che la presenza di etanolo non ha effetti negativi nei confronti dell'attività enzimatica, dal punto di vista pratico: l'attività β-glucopiranosidasica aumenta in presenza di etanolo mentre, al contrario, diminuisce leggermente, ma comunque in modo ininfluente sulla reazione oggetto dell'invenzione, l'attività α-ramnopiranosidasica . Una percentuale di etanolo pari a circa il 30% v/v è necessaria per la completa solubilizzazione di desglucoruscina mentre percentuali inferiori, pari a circa il 17% v/v, sono richieste per il ruscoside. L'impiego di quest'ultimo può pertanto essere talvolta preferito anche poiché non richiede particolari pre-trattamenti e le sue proprietà tensioattive solubilizzano la desglucoruscina ottenuta nel primo stadio di idrolisi enzimatica che può quindi essere trasformata con miglior efficienza dalla aramnopiranosidasi .
La concentrazione di ruscosaponina può essere compresa tra circa il 5 e circa il 40% p/v mentre l'idrolisi viene effettuata a temperatura variabile tra 20 e 50°C per tempi variabili tra 3 e 7 giorni.
Alla fine del processo di bioconversione, il prodotto finale desglucodesramnoruscina è insolubile nel sistema di reazione e. può essere convenientemente recuperato per centrifugazione e lavaggi successivi con metanolo. Il processo dell'invenzione si presta inoltre ad essere effettuato in ciclo continuo, allontanando ad intervalli fissi il prodotto idrolizzato e aggiungendo in continuo substrato fresco, grazie alla stabilità degli enzimi utilizzati. Allo scopo, sarà preferibile utilizzare un bioreattore dotato di una membrana da ultra filtrazione così da evitare l'accumulo di inibitori e di molecole denaturanti .
L'esempio seguente illustra l'invenzione in maggior dettaglio .
Esempio
La preparazione enzimatica Cytolase PCL5 (Gist Brocades) fu diafiltrata prima dell'uso contro un tampone 0,1 M citrato-fosfato pH 5 in un dispositivo Amicon fornito di una membrana XM (cut-off 50 kDa) allo scopo’di rimuovere agenti denaturanti ed inibitori.
La miscela di incubazione fu preparata aggiungendo nell'ordine il substrato (desglucoruscina o ruscoside), il tampone citrato-fosfato 0,1 M pH 5,0, Cytolase PCL5 e, lentamente, sotto agitazione, etanolo. La concentrazione di substrato variava dal 5 al 40% (p/v) e la concentrazione di etanolo dallo 0 al 30% (v/w). La reazione veniva seguita per TLC su piastre di gel di silice (60 F250 Merck) con eluente acetato di etile/metanolo/acqua 100:15:10. L'attività enzimatica risultava pari a 38 unità di β-glupiranosidasi e 2,3 unità di α-ramnopiranosidasi per mi di miscela di incubazione .
La bioconversione fu effettuata alla temperatura di 25°C. La trasformazione in desglucodesramnoruscina veniva completata in circa 72 ore partendo da desglucoruscina e in circa 96 ore partendo da ruscoside.
La miscela di incubazione veniva quindi centrifugata a 12.100 g per 30 minuti a 4°C. Il precipitato era lavato con metanolo e centrifugato ancora nelle stesse condizioni precedenti. Questo stadio fu ripetuto cinque volte e i surnatanti furono riuniti. La soluzione metanolica fu quindi evaporata sotto vuoto e il prodotto risultante fu triturato fino ad ottenere una polvere fine giallo scura, contenente il 20% di desglucodesramnoruscina (titolo ΗΡLC)

Claims (6)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un .processo per la preparazione di desglucodesramnoruscina che comprende l'idrolisi enzimatica di glicosidi steroidei di Ruscus aculeatus (ruscosaponine) ad opera di idrolasi grezze da Aspergillus niger.
  2. 2. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui la idrolasi grezza è la preparazione Cytolase PCL5.
  3. 3 . Un processo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui l'idrolisi è effettuata in soluzione acquosa a pH 5 o in miscela acqua-etanolo contenente fino al 30% in volume di etanolo.
  4. 4. Un processo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui la concentrazione di ruscosaponina è compresa tra il 5 e il 40% p/v.
  5. 5. Un processo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui l'idrolisi è effettuata a temperatura tra 20 e 40°C per tempi compresi tra 3 e 7 giorni.
  6. 6. Un processo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui il prodotto finale è isolato per centrifugazione e lavaggio con metanolo.
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