JPH04267876A

JPH04267876A - グルクロニダーゼ

Info

Publication number: JPH04267876A
Application number: JP4897791A
Authority: JP
Inventors: Shigemitsu Kudo; 工藤　重光; Kazuyoshi Okubo; 一良大久保
Original assignee: ABO SADAKICHI
Current assignee: ABO SADAKICHI
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1991-02-21
Publication date: 1992-09-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、配糖体を加水分解する
加水分解酵素のうちで、糖鎖のグルクロナイド結合を加
水分解するグルクロニダーゼに関する。

【０００２】さらに詳しくいえば、配糖体のグルクロナ
イド結合部分を直接加水分解する新規なグルクロニダー
ゼであって、従来から知られているβ−グルクロニダー
ゼと基質特性が異なるものである。

【０００３】

【従来の技術】配糖体の糖鎖のグルクロナイド結合を加
水分解する酵素としては、従来から知られているβ−グ
ルクロニダーゼとして、大腸菌・海洋軟体動物および肝
臓由来のものがある。

【０００４】また、ヒアルロン酸のグルクロナイド結合
を特異的に加水分解する酵素として薬用ヒル由来のオル
ゲラーゼがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述の従来から知られ
ている配糖体のグルクロナイド結合を加水分解する酵素
のうちの、前者のβ−グルクロニダーゼは、エキソ型の
酵素であり、糖鎖の非還元末端にあるグルクロナイド結
合を加水分解し、グルクロン酸を遊離するので、グルク
ロナイドサポニンを加水分解するとき、グルクロン酸を
還元末端とする糖鎖構造を持つ配糖体を加水分解できな
い問題がある。

【０００６】また、後者のオルゲラーゼは、ヒアルロン
酸のグルクロナイド結合を特異的に加水分解するエンド
型の酵素であるが、疎水性の大きいアグリコンに直接結
合したグルクロナイド結合を加水分解することができな
い。従って、トリテルペン骨格の３位にグルクロン酸が
結合した構造を持つ大豆サポニンのような物質を加水分
解することができない問題がある。

【０００７】本発明は、大豆サポニンのように、疎水性
の大きいアグリコンに直接結合したグルクロナイド結合
を加水分解でき、かつ、その加水分解の際に、グルクロ
ン酸を遊離することのない新規な加水分解酵素を提供す
ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、上述の目的の
ために種々の研究を重ねて得られた知見に基いて完成し
たものであり、以下にその課程を述べる。

【０００９】漢方薬等の薬効成分には、サポニン類が多
く、その中には分子内にグルクロン酸を含むグルクロナ
イドサポニンも数多く存在する。

【００１０】通常、新規なグルクロナイドサポニンの構
造決定は、酸加水分解後、アグリコンおよび遊離糖を調
べ、最終的に全構造を決定するという方法で行なわれる
。ところで、ウロン酸は、酸加水分解により容易に分解
し、また、アグリコンからも二次生成物が生じることか
ら、この酸加水分解による構造決定は容易ではない。

【００１１】しかし、酵素的にグルクロナイド結合を加
水分解し、遊離したアグリコンとグルクロン酸を還元末
端とするオリゴ糖の構造解析を行なえば正確に全構造を
決定することができる。

【００１２】そこで、まず、基質として量的に入手可能
な

【化１】の構造式をもつ大豆サポニンＢｂを用いた。このサポニ
ンは、トリテルペン骨格の３位にグルクロン酸が結合し
、さらに、ガラクトースおよびラムノースが結合してい
る。この基質の酵素分解によるアグリコンの遊離速度を
指標として、アスペルギルス属１６種１５８　株を用い
、大豆サポニン分解酵素生産菌のスクリーニングを行な
った結果、最も高い分解活性を有する菌株としてアスペ
ルギルス・オリーゼＫＯ−２をみつけることができた。

【００１３】また、この菌株が生産する大豆サポニン分
解酵素の精製を行ない、その諸性質について検討した。即ち、培養ろ液を２０〜８０％　飽和硫安分画およびセ
ファデックスＧ−２００　によるゲルろ過の結果、粗酵
素液から約１５００倍に精製され、ディスク電気泳動的
に単一とすることができた。

【００１４】また、この菌株が生産する大豆サポニン分
解酵素（　以下本酵素という）　は、分子量３５，００
０と４５，０００のサブユニットからなる約１５８，０
００　の糖蛋白質であった。本酵素は、４０℃以下およ
びｐＨ５．０　〜８．０　で安定であり、最適ｐＨ４．
５　〜５．０　、最適温度５０℃であった。

【００１５】また、基質として大豆サポニンＢｂを用い
、本酵素による分解挙動を調べた結果、アグリコンであ
るソヤサポゲノールＢとα−Ｌ−　ラムノピラノシル（
１→２）−　β−Ｄ−　グラクトピラノシル（１→２）
−Ｄ−　グルクロノピラノサイド（　α−Ｌ−Ｒｈａｍ
ｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→２）−　β−Ｄ−Ｇａｌ
ａｃｔｏｐｙｒａｏｓｙｌ（１→２）−Ｄ−Ｇｌｕｃｕ
ｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）　からなる三糖を遊離
することから、グルクロナイド結合を特異的に加水分解
することがわかった。

【００１６】また、トリテルペン型アグリコンにジグル
クロン酸が結合しているグリチルリチンに本酵素を作用
した結果、ジグルクロン酸が遊離し、モノグロクロン酸
は検出されなかった。

【００１７】さらに、大豆サポニンＢｂの部分分解物で
ある

【化２】の構造物および

【化３】の構造物と別に

【化４】の構成もつ還元体大豆サポニンＢｂを調製し、本酵素の
基質特異性を調べた結果、還元体大豆サポニンＢｂには
作用せず、さらに、β−　グルクロニダーゼの基質とし
て用いられるｐ−ニトロフェニルグルクロノサイドおよ
び４’　−メチルウンベリフエリルグルクロノサイドに
作用しないことから、本酵素は、比較的疎水性の大きい
アグリコンに直接結合したグルクロン酸のグルクロナイ
ド結合を加水分解する新規なグルクロニダーゼであるこ
とが明らかになった。

【００１８】そして、このことから、本発明においては
、大豆サポニンのように疎水性の大きいアグリコンに直
接結合したグルクロナイド結合を加水分解でき、かつ、
その加水分解の際に、グルクロン酸を遊離することのな
い新規な加水分解酵素として、疎水性のアグリコンにグ
ルクロン酸が直接結合した糖鎖を持つ配糖体のグルグロ
ナイド結合部位を直接加水分解するグルクロニダーゼを
提起するものである。

【００１９】

【実施例１】大豆サポニン分解菌の検索を、次のように
して行なった。即ち、大豆胚軸１ｇに水道水２ｍｌ　を
添加し　１２１℃で３０分間減菌した。斜面培養したア
スペルギルス属菌株の胞子を１　白金耳とり、減菌胚軸
培地に胞子が均一に分散するようによく混合後、３０℃
で４　日間培養した。

【００２０】培養終了後、９ｍｌ　の水を添加し、冷却
しながらポリトロンで　５分間摩砕後、３，０００ｒｐ
ｍで　５分間遠心分離した。その上清を粗酵素液とし、
大豆サポニン分解活性を測定した。即ち、粗酵素液　１
ｍｌにマクバイン緩衝液（ｐＨ６．０　）　　１ｍｌを
加え、基質として、１％粗大豆サポニン溶液　１ｍｌを
添加混合後、３０℃で４　日間反応した。　３ｍｌのｎ
−ブタノールを添加後、激しく撹拌することにより反応
を停止するとともにサポニン成分の抽出を行なった。３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上層
中の大豆サポニン成分を、　ＴＬＣおよびＨＰＬＣで調
べることにより大豆サポニン分解活性の測定を行なった
。

【００２１】その結果、アスペルギルス・タマリは、供
試菌株全てが１００％の分解率を示したのに対して、ア
スペルギルス・ニデュランスは、平均分解率が　１５％
と低い分解活性であった。また、２６菌株が８１〜１０
０％の高い分解率を示し、そのうち　８菌株が１００％
の分解率を示した。

【００２２】この２６菌株を用い、さらに有用菌株の選
定を行なった。２０ｍｌのＭＹ培地（４％　マルツエキ
ス、２％酵母エキス、０．２％リン酸１　カリウム、０
．２％硫酸アンモニウム、０．０３％　硫酸マグネシウ
ム、０．０３％　塩化カルシウム）　に粗大豆サポニン
を１％添加し、１２１℃で３０分間減菌した。これに、
１次スクリーニングで選ばれた菌株の胞子を接種し３０
℃で　４日間静置培養した。次に、Ｎｏ．２のろ紙を用
いブフナーロートで吸引ろ過し、そのろ液を菌体外酵素
とした。さらに、菌体に１ｇの海砂を加えて乳鉢で摩砕
後、緩衝液２０ｍｌ（１％　トリトンＸ−１００　を含
む、ｐＨ５．０，　０．２Ｍ　酢酸緩衝液）　を加え、
さらに摩砕抽出した。遠心により菌体を除去後、その上
清液を菌体内酵素とした。尚、１　分間に大豆サポニンＢｂから　１μモルのソヤ
サポゲノールＢを遊離する酵素量を　１単位と定義した
。その結果

【表１】にあるように、最も分解活性の高いアスペルギルス・オ
リーゼＫＯ−２をみつけることができた。

【００２３】

【実施例２】１％　の粗大豆サポニンを含むＭＹ培地で
アスペルギルス・オリーゼＫＯ−２を培養後、遠心分離
により菌体を除去し、その上清を２０〜８０％　飽和硫
安分画を行なった。酢酸緩衝液（ｐＨ５．０，　０．０
２Ｍ　〜　０．１Ｍ　ＮａＣｌ含む）　に溶解後、同じ
緩衝液に対して、時々緩衝液を交換しながら一晩透析を
行なった。透析終了後、適当な量に濃縮し、同じ緩衝液
で平衡化しているセファデックス　Ｇ−２００カラム（
５×９７ｃｍ）　に供することによりゲル瀘過を行なっ
た。活性画分を、さらに、セファデックス　Ｇ−２００
カラム（２×８３ｃｍ）　に供し、ゲル瀘過を行なうこ
とによりディスク電気泳動的に単一とすることができた
。さらに、同様に電気泳動後、ＰＡＳ　染色法により染
色されることから、本酵素は、糖タンパクと考えられた
。

【００２４】酵素活性に及ぼすｐＨと温度の影響を調べ
た結果、最適ｐＨは、４．５　〜５．０　であり、最適
温度は、５０℃であった。酵素の安定性に及ぼすｐＨの
影響を調べた結果、ｐＨ５．０　〜８．０　で安定であ
り、ｐＨ　４．５以下で急激に不安定となり、ｐＨ　３
．０で１００％失活した。また、酵素の安定性に及ぼす
温度の影響を調べた結果、４０℃まで安定であり、５０
℃で約　２５％失活し、６０℃以上で１００％失活した
。

【００２５】セファデックス　Ｇ−２００カラム（２×
８３ｃｍ）　を用いたゲル瀘過法により本酵素の分子量
を測定した結果、１５８，０００　と推定された。また
、ＳＤＳ　ポリアクリルアミド電気泳動を行なった結果
、分子量３５，０００と４５，０００のサブユニットか
らなる約１５８，０００　の糖蛋白質と推定された。

【００２６】

【実施例３】本酵素による大豆サポニンＢｂの分解挙動
を調べた。即ち、精製した酵素と大豆サポニンＢｂ溶液
を４０℃で反応した。経時的に高速液体クロマトグラフ
ィーおよび薄層クロマトグラフィーで分析することによ
りサポニンＢｂの分解挙動を調べた。その結果、時間の
経過とともにサポニンＢｂが減少し、アグリコンである
ソヤサポゲノールＢの増加とオリゴ糖の生成が観察され
た。そこで、この遊離オリゴ糖を単離し、１３Ｃ−ＮＭ
Ｒ　スペクトルを測定した結果、α−Ｌ−　ラムノピラ
ノシル（１→２）−　β−Ｄ−　ガラクトピラノシル８
１→２）−Ｄ−　グルクロノビラノサイド（α−Ｌ−Ｒ
ｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→２）−　β−−Ｄ
−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏａｙｌ（１→２）−Ｄ−
Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｏｎｏｓｉｄｅ　）　であるこ
とが分かった。従って、本酵素は、大豆サポニンＢｂの
グルクロナイド結合を特異的に加水分解し、アグリコン
であるソヤサボゲノールＢと相当する三糖を遊離するこ
とがわかった。

【００２７】従来のβ−グルクロニダーゼと異なる基質
特異性が示唆されたことから、より詳細にその基質特異
性について検討した。

【００２８】即ち、大豆サポニンＢｂの部分分解物であ
るＢｂ’およびＢＧと還元体大豆サポニンＢｂとを調製
し本酵素を作用した結果

【表２】に示す如く、大豆サポニンＢｂの糖鎖が短くなるに従い
、反応速度が遅くなった。

【００２９】また、グリチルリチンの反応速度は、サポ
ニンＢｂの１．５倍と最も速かった。還元体大豆サポニ
ンＢｂ、β−　グルクロニダーゼの基質として用いられ
るｐ−ニトロフェニルグルクロノサイドおよび４’−メ
チルウンベリフェリルグルクロノサイドにも作用しなか
った。

【００３０】また、β−　グルクロナイド結合をもつ酸
性多糖類（　ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアウロ
ン酸）　を基質とした用いた結果、いずれも加水分解さ
れなかった。従って、本酵素が、比較的疎水性の大きい
アグリコンに直接結合したグロクロン酸のグルクロナイ
ド結合を加水分解する新規なグルクロニダーゼであるこ
とを明らかにすることができた。

【００３１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明による配糖
体を加水分解する加水分解酵素は、疎水性のアグリコン
にグルクロン酸が直接結合した糖鎖を持つ配糖体に対し
、その配糖体のグルクロナイド結合部位を直接加水分解
するグルクロニダーゼであるから、大豆サポニンのよう
に疎水性の大きいアグリコンに直接結合したグルクロナ
イド結合の加水分解ができるようになり、かつ、その際
、グルクロン酸を遊離させることなく加水分解できるよ
うになる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　疎水性のアグリコンにグルクロン酸が
直接結合した糖鎖を持つ配糖体のグルグロナイド結合部
位を直接加水分解するグルクロニダーゼ。