CZ20014282A3 - Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu - Google Patents

Description

Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby derivátů steroidních glykosidů Ruscus aculeatus (ruscosaponiny). Vynález se zvláště týká způsobu výroby desglukodesrhamnoruscinu parciální enzymatickou hydrolýzou ruscinu, desglukoruscinu nebo ruscosidu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tedy tvoří způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu, který spočívá v enzymatické hydrolýze steroidních glykosidů (ruscosaponinů), Ruscus aculeatus působením surových hydroláz z Aspergillus niger.

Hydrolázy z Aspergillus niger se běžně dodávají a používají se ve vinařství a potravinářství. Zvláště výhodné je použití prostředku, běžně dodávaného pod obchodním názvem Cytolase PCL5 (Gist Brocades).

Uvedené enzymatické prostředky mají současně také účinnost β-glukopyranosidázy a cc-rhamnopyranosidázy, takže postupně odstraní β-glukosidové zbytky a pak α-rhamnosidové zbytky za vzniku požadovaného produktu.

Enzymatická hydrolýza se provádí ve vodném roztoku, jehož pH se udržuje pomocí pufru na hodnotě 5 nebo ve vodě, která obsahuje až 30 % objemových ethanolu. Bylo pozorováno, že pří praktickém provádění postupu přítomnost ethanolu nepříznivě neovlivní enzymatickou

• 1*	·· »	fcfc	• fc
• fc *	•	•	fcfc	fc «	• «
• fcfcfc	fc	•	fc	• ·	•
					•
• fcfc	•	•	•	• fc	•
fcfcfc fcfc	• fc		fcfcfc	fcfc	• fcfcfc

účinnost. Účinnost β-glukopyranosidázy se v přítomností ethanolu zvyšuje, na druhé straně účinnost α-rhamnopyranosidázy poněkud klesne, avšak pouze ve stupni, který nijak neovlivní průběh reakce podle vynálezu. K úplnému rozpuštění desgiukosuscinu je zapotřebí podíl přibližně 30 % objemových ethanolu, kdežto pro rozpuštění ruscosidu je zapotřebí menšího množství přibližně 17 % objemových. Použití tohoto druhého roztoku může být v některých případech výhodné také z toho důvodu, že při jeho použití není nezbytné žádné předběžné zpracování a mimo to má roztok také povrchově aktivní vlastnosti, takže solubilizuje desglukoruscin, vznikající v prvním stupni enzymatickou hydrolýzou, tuto látku je pak možno účinněji transformovat na cc-rhamnopyranosidázu.

Koncentrace ruscosaponinu se může pohybovat v rozmezí 5 až 40 g/100 ml, hydrolýza se provádí při teplotě v rozmezí 20 až 50 °C po dobu 3 až 7 dnů.

Na konci této biologické přeměny je možno výsledný desglukodesrhamnoruscin, nerozpustný v reakčním systému, snadno izolovat odstředěním a následným promytím methanolem. Mimo to je možn způsob podle vynálezu provádět kontinuálně tak, že se hydrolyzovaný produkt odstraňuje v určitých pevných časových intervalech a kontinuálně se přidává čerstvý substrát, toto provedení je možné vzhledem ke stálosti použitých enzymů. K tomuto účelu se s výhodou užije bioreaktor, opatřený ultrafiltrační membránou, aby nedošlo k nahromadění inhibitorů a denaturačních molekul.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícím příkladem, který však nemá sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Enzymatický prostředek Cytolase PCL5 (Gist Brocades) se před použitím podrobí diafiltraci proti 0,1 M citrátového-fosfátového pufru o pH 5 v přístroji Amicon, opatřeném membránou XM, zadržující látky od molekulové hmotnosti 50 000 tak, aby došlo k odstranění denaturačních činidel a inhibitorů.

Inkubační směs se připraví tak, že se v uvedeném pořadí přidá: substrát (desglukoruscin nebo ruscosid),

0,1 M citrátový-fosfátový pufr o pH 5,0, prostředek Cytolase PCL5 a pak pomalu za míchání ještě ethanol. Koncentrace substrátu se může pohybovat v rozmezí 5 až 40 g/100 ml, koncentrace ethanolu se pohybuje v rozmezí 0 až 30 ml/100 g. Po reakci se uskuteční chromatografie na tenké vrstvě, TLC na silikagelových deskách (60 F250 Merck), jako eluční činidlo se užije směs ethylacetátu, methanolu a vody 100:15:10. Aktivita enzymatického prostředku byla 38 jednotek β-glukopyranosidázy a 2,3 jednotek α-rhamnopyranosidázy na 1 ml inkubační směsi.

Biologická přeměna byla prováděna při teplotě 25 °C. Přeměna na desglukodesrhamnoruscin byla ukončena po době 72 hodin v případě, že výchozí látkou byl desglukoruscin a po 96 hodinách v případě, že výchozí látkou byl ruscosid.

Inkubační směs pak byla odstředěna 30 minut při teplotě 4 °C a při 12 100 g. Vzniklá sraženina byla promyta methanolem a znovu odstředěna za stejných podmínek jako svrchu. Tento stupeň byl 5krát opakován a získané supernatanty byly spojeny. Methanolový roztok byl pak odpařen za sníženého tlaku a výsledný produkt byl rozetřen za vzniku jemného tmavě žlutého prášku, který podle Výsledku HPLC obsahoval 20 % desglukodesrhamnoruscinu.

Claims (6)

1. 7)/ Qj&^A ~

   PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby desglukodesrhamnoruscinu, vyznačující se tím, že se uskuteční enzymatická hydrolýza steroidních glykosidů (ruscosaponinů), Ruscus aculeatus působením surových hydroláz z Aspergillus niger.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se jako surová hydroláza použije prostředek Cytolase PCL5.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m, že se hydrolýza provádí ve vodném roztoku o pH 5 nebo ve směsi vody a ethanolu, obsahující až 30 % objemových ethanolu.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že koncentrace ruscosaponinu je v rozmezí 5 až 40 g/100 ml.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí při teplotě 20 až 40 °C po dobu 3 až 7 dnů.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se výsledný roztok izoluje odstředěním a promytím methanolem.