MXPA02004512A - Preparacion de una lactona macrociclica. - Google Patents

Abstract

El objeto de la invencion es un proceso para la preparacion de un compuesto de la formula (ver formula) en donde R1-R9 representan, independientemente uno del otro, hidrogeno o un sustituyente; m es 0, 1, o 2; n es 0,,-1, 2, o 3; y los enlaces marcados con A, B, C, D, E, y F indican, independientemente unos de otros, que dos atomos de carbono adyacentes estan conectados por un doble enlace, un enlace sencillo, y un puente de epoxido, o un enlace sencillo y un puente de metileno, incluyendo, donde sea aplicable, un isomero E/Z, una mezcla de isomeros E/Z, y/o un tautomero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, cuyo proceso comprende, 1) poner un compuesto de la formula: (ver formula) R1-R7, m, n, A, B. C, D, E, y F tienen los mismos significados como se dan para la formula (I) anterior, en contacto con un biocatalizador que sea capaz de oxidar especificamente el alcohol en la posicion 4", con el objeto de formar un compuesto de la formula (ver formula) en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los significados dados para la formula (I); y 2) hacer reaccionar el compuesto de la formula (111) con una amina de la formula HN(R8)R9, en donde R8 y R9 tienen los mismos significados como se dan para la formula (I), y el cual es conocido, en la presencia de un agente de reduccion.

Description

PREPARACIÓN DE UNA LACTONA MACROCICLICA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ' La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de una lactona acrocíclica, a un proceso para la preparación de los compuestos intermediarios, y a los compuestos intermediarios utilizados en este proceso. De una manera más particular, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula: en donde : R1-R9 representan, independientemente uno del otro, hidrógeno o un sustituyente; m es 0, 1, ó 2; n es O, 1, 2, ó 3; y REF. 138324 los enlaces marcados con A, B, C, D, E, y F indican, independientemente entre sí, que dos átomos de carbono adyacentes están conectados por un doble enlace, un enlace sencillo, un enlace sencillo y un puente de epóxido de la fórmula: , o un enlace sencillo y un puente de metileno de la fórmula : H2 incluyendo, donde sea aplicable, un isómero E/Z, una mezcla de isómeros E/Z, y/o un tautómero del mismo, en. cada caso en forma libre o en forma de sal, cuyo proceso comprende: 1) poner un compuesto de la fórmula: en donde : R1-R7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los mismos significados que se dan para la fórmula (I) anterior, en contacto con un biocatalizador que sea capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4", con el objeto de formar un compuesto de la fórmula: en donde Ri, R , R3, R , R5 Rß- 7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los significados dados para la fórmula (I) ; y 2) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (III) con una amina de la fórmula HN(Ra)R9, en donde Rs y Rg tienen los mismos significados que se dan para la fórmula (I) , y el cual es conocido, en la presencia de un agente reductor; y, en cada caso, si se desea, convertir un compuesto de la fórmula (I) que se puede obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, en un compuesto diferente de la fórmula (I), o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, separar una mezcla de isómeros E/Z que se puedan obtener de acuerdo con el proceso, y aislar el isómero deseado, y/o convertir un compuesto libre de la fórmula (I) que se pueda obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en una sal o convertir una sal, que se pueda obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, de un compuesto de la fórmula (I) o de un isómero E/Z o tautómero del mismo, en el compuesto libre de la fórmula (I) o un isómero E/Z o tautómero del mismo, o en una sal diferente. Los métodos de síntesis para los compuestos de la fórmula (I) se describen en la literatura. Sin embargo, se ha encontrado que los procesos conocidos en la literatura ocasionan problemas considerables durante la producción, básicamente a cuenta de los bajos rendimientos y los tediosos procedimientos que se tienen que utilizar. Por ejemplo, el documento EP-A 0 465 121 describe compuestos de aver ectina de 4"-ceto y 4"-amino-4"-desoxi y derivados de amino sustituido de los mismos. El grupo 4"hidroxi en los compuestos de avermectina es oxidado a un grupo cetona o reemplazado con un grupo amino (sustituido) . Los grupos • hidroxi en la 5 y 23-posiciones necesitan protegerse para evitar oxidaciones indeseadas. El compuesto 4"-ceto es aminado para proporcionar el compuesto correspondiente al de la fórmula (I) anterior. De acuerdo con lo anterior, los procesos conocidos no son satisfactorios en ese aspecto, dando lugar a la necesidad de poner a disposición procesos de preparación mejorados para estos compuestos. Los compuestos (I), ( I ) , y (III) pueden estar en la forma de tautómeros. De acuerdo con lo anterior, y con lo posterior en la presente, donde sea apropiado, se va a entender que los compuestos (I), (II), y (III) incluyen los tautómeros correspondientes, inclusive cuando estos últimos no se mencionen específicamente en cada caso. Los compuestos (I), (II), y (III) son capaces de formar sales de adición de ácido. Estas sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales como ácidos minerales, por ejemplo, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido nitroso, un ácido fosfórico, o un ácido halohídrico, con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcancarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono insustituidos o sustituidos, por ejemplo sustituidos por halógeno, por ejemplo ácido acético, ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo ácido oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, o ftálico, ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, láctico, málico, tartárico, o cítrico, o ácido benzoico, o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos alcansulfónicos o arilsulfónicos de 1 a 4 átomos de carbono insustituidos o sustituidos, por ejemplo sustituidos por halógeno, por ejemplo ácido metansulfónico o p-toluensulfónico . Además, los compuestos de las fórmulas (I), (II), y (III), que tienen cuando menos un grupo ácido, son capaces de formar sales con bases. Las sales con bases adecuadas son, por ejemplo, sales de metales, tales como sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, por ejemplos sales de sodio, potasio, o magnesio, o sales con amoniaco o con una amina orgánica, tal como morfolina, piperidina, pirrolidina, una mono-, di-, o tri-alquilamina inferior, por ejemplo etil-, dietil-, trietil-, o dimetil-propil-amina, o una mono-, di-, o tri-hidroxialquilamina inferior, por ejemplo mono-, di-, o tri-etanolamina. En adición, también se pueden formar las sales internas correspondientes. Dentro del alcance de la invención, se da preferencia a las sales agroquimicamente convenientes. En vista de la estrecha relación entre los compuestos de las fórmulas (I), (II), y (III), en forma libre y en la forma de sus sales, cualquier referencia anteriormente o posteriormente en la presente a los compuestos libres de las fórmulas (I), (II), y (III), o a su sales respectivas, debe entenderse para incluir también las sales correspondientes o los compuestos libres de las fórmulas (I), (II), y (III), donde sea apropiado y conveniente. Se aplica lo mismo en el caso de los tautómeros de los compuestos de las fórmulas (I), (II), y (III), y las sales de los mismos. En general se prefiere la forma libre en cada caso. Dentro del alcance de esta invención, se prefiere un proceso para la preparación de compuestos de la fórmula (I) , en donde, n es 1; es 1; A es un doble enlace; B es un enlace sencillo o un doble enlace, C es un doble enlace, D es un enlace sencillo, E es un doble enlace, F es un doble enlace; o un enlace sencillo y un puente de epóxido; o un enlace sencillo y un puente de metileno; Rif R2, y R3 son H; R4 es metilo; Rs es alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono; R7 es OH; Re y Rg son, independientemente entre sí, H; alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, o acilo de 1 a 10 átomos de carbono; o forman juntos -(CH2)q-; y q es 4, 5, ó 6. Dentro del alcance de esta invención, se prefiere especialmente un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (I), en donde: n es 1; m es 1; A, B, C, y F son dobles enlaces; D es un enlace sencillo; R4 es metilo; R5 es butilo secundario o isopropilo; R6 es H; R7 es OH; R8 es metilo, R9 es H. Se prefiere muy especialmente un proceso para la preparación de Emamectina, más particularmente la sal de benzoato de Emamectina. La Emamectina es una mezcla de 4"-desoxi-4"-N-metilamino-avermectina B?a/B? , y se describe en el documento US-P-4, 4874, 749, y como MK-244 en Journal of Organic Chemistry, volumen 5_9 (1994), 7704-7708. Las sales de Emamectina que son especialmente valiosas agroquímicamente se describen en el documento US-P-5,288,710. Los compuestos de fórmula (I) son plaguicidas valiosos, especialmente para combatir insectos y representantes de la orden Acariña. Las plagas mencionadas incluyen, por ejemplo, aquellas que se mencionan en la página 5, líneas 55 a 58, página 6, y página 7, líneas 1 a 21 de la Solicitud de Patente Europea No. EP-A 736,252. Las plagas mencionadas en la misma se incluyen por hacer referencia a las mismas en la presente materia objeto de la invención. Los términos generales utilizados anteriormente y posteriormente en la presente tienen los siguientes significados, a menos que se definan de otra manera: Los grupos y compuestos que contienen carbono, cada uno contiene desde 1 hasta e incluyendo 8, preferiblemente desde 1 hasta e incluyendo 6, especialmente desde 1 hasta e incluyendo 4, y más especialmente de 1 ó 2 átomos de carbono. Alquilo es de cadena recta, es decir, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, o hexilo, o ramificada, por ejemplo isopropilo, isobutilo, butilo secundario, butilo terciario, isopentilo, neopentilo, o isohexilo.

Alquenilo, tanto como un grupo por si mismo y como un elemento estructural de otros grupos y compuestos, por ejemplo haloalquenilo y arilalquenilo, es, tomando en cada caso debidamente en cuenta el número de átomos de carbono contenidos en el grupo o compuesto en cuestión, ya sea de cadena recta, por ejemplo vinilo, 1-metilvínilo, alilo, 1-butenilo, o 2-hexenilo, o ramificada, por ejemplo isopropenilo . Cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono es ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, o ciciohexilo, especialmente ciciohexilo. Los aspectos adicionales de la invención son los compuestos de la fórmula (III) como se definen anteriormente; o - un proceso para la preparación del compuesto de la fórmula (III), empezando a partir del compuesto de la fórmula (II) de acuerdo con la etapa (1) anterior; o - un proceso para la preparación del compuesto de la fórmula (I), iniciando a partir del compuesto de la fórmula (III) de acuerdo con la etapa (2) anterior. Dentro del alcance de la presente invención, el término "biocatalizador" principalmente incluye: a) un microorganismo vivo, por ejemplo en la forma de células vegetativas, células en reposo, o células secadas por congelación, b) las esporas de este microorganismo, c) un microorganismo muerto, de preferencia en una forma parcialmente- desintegrada, es decir, con la pared celular/membrana celular permeabilizada mecánicamente o químicamente o mediante secado por pulverización, d) extractos crudos de los contenidos celulares de estos microorganismos, y e) una enzima que convierte los compuestos de la fórmula (II) en compuestos de la fórmula (III) . Las bacterias y hongos son microorganismos especialmente adecuados para el proceso de acuerdo con la invención. Las bacterias adecuadas son especialmente representantes de Actinomicetos, especialmente del género Streptomyces. Se prefieren las cepas del género Streptomyces seleccionadas a partir del grupo que consiste en Streptomyces tuber cidicus; Streptomyces cha ttanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus, y Streptomyces kasugaensis . Las cepas Streptomyces R-922 (Streptomyces tubercidicus) , y especialmente Streptomyces I-1529 (Streptomyces tubercidicus) , han probado ser particularmente adecuadas para la oxidación regioespecífica del grupo hidroxilo en la posición 4" de los compuestos de la fórmula (II) . Las cepas de Streptomyces : Streptomyces 1-1529 y Streptomyces R-922, se depositaron de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig- Alemania, bajo los números de acceso DSM-13135 y DSM13136, respectivamente, el 5 de noviembre de 1999. Se han identificado cepas adicionales que se pueden utilizar adecuadamente para realizar la oxidación regioespecífica de acuerdo con la invención, incluyendo, por ejemplo, Streptomyces cepa ' MAAG-7027 ( Streptomyces tubercidicus) , Streptomyces cepa DSM-40241 ( Streptomyces saraceticus, también identificada como Streptomyces chattanoogensis) , Streptomyces cepa NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp . lydi cus) , y Streptomyces cepa A/961208710 ( Streptomyces Kasugaensis) . Todas las cepas anteriores están estrechamente relacionadas con Streptomyces cepas Streptomyces 1-1529 y Streptomyces "R-922 , respectivamente, lo cual se puede demostrar mediante un análisis de ADNr de 16s, que muestra identidades de entre el 99.4 y 100%. Se sabe que los compuestos de la fórmula (I) son agentes altamente activos para controlar plagas de plantas. En el proceso conocido para la preparación de los compuestos de la fórmula (I), como por ejemplo, descrito en la Patente Europea Número EP 301,806, y también el proceso microbiano de acuerdo con la invención, los compuestos de fórmula (II) se utilizan como materiales de partida.

En los procesos conocidos, en un primer etapa, los compuestos de la fórmula (II) se protegen sobre el oxígeno en la posición 5, luego se oxidan a la 4"-cetona, seguido por conversión R a la amina y desprotección del grupo hidroxilo enmascarado en la posición 5, empleando de esta manera la tecnología convencional de grupos protectores, como es descrita por Greene y Wuts, 1999 (Protective Groups in Organic Synthesis) . El proceso de acuerdo con la presente invención tiene la ventaja de que comprende solamente dos etapas, comparándose con cuatro de los procesos conocidos. Además, evita el uso de grupos protectores, y es ecológicamente más seguro, debido a que se tienen que utilizar menos productos químicos. El compuesto de la fórmula (III) resultante de la etapa biocatalítica de acuerdo con la invención se conoce, por ejemplo, de la Patente Europea No. EP 401,029. En una modalidad específica, el proceso de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo, con detalle, como sigue : En una primer etapa, se preparan compuestos de fórmula (III) . Esto se puede realizar poniendo en contacto directamente un compuesto de fórmula (II) con un biocatalizador que sea capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4 " a la cetona de la fórmula (III), y mantener este contacto durante un período de tiempo que sea suficiente para que tenga lugar la reacción de oxidación. De una manera más conveniente, el proceso se realiza utilizando un microorganismo como el biocatalizador, cuyo microorganismo es capaz de realizar la reacción de oxidación de acuerdo con la invención. De preferencia, este microorganismo se cultiva en un medio de cultivo adecuado que promueva la proliferación microbiana y bajo condiciones controladas en presencia de un compuesto de fórmula (II), y manteniendo la incubación conjunta de este microorganismo y su sustrato durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de oxidación, de preferencia hasta que del 25 al 99.9%, más preferiblemente del 50 al 99.9%, y muy preferiblemente del 80 al 99.9% del compuesto agregado de fórmula (II) se haya convertido a compuestos de la fórmula (III) • De una manera alternativa y más preferiblemente, el proceso se realiza cultivando primero un microorganismo que sea capaz de realizar la reacción de oxidación de acuerdo con la invención en un medio de cultivo adecuado que promueva la proliferación microbiana y bajo condiciones controladas, y luego se coseche la biomasa del microorganismo mediante la aplicación de métodos adecuados tales como, por ejemplo, filtración o centrifugación. La biomasa del microorganismo se utiliza entonces inmediatamente como un biocatalizador para la conversión de los compuestos de fórmula (II) en compuestos de fórmula (III) , o bien se puede almacenar en frío, ya sea como tal, o bien después de secarse por congelación o secarse por pulverización, antes de utilizarse en la reacción. Este microorganismo, ya sea recién cosechado o bien almacenado como se describió, y un compuesto de la fórmula (II) , se incuban conjuntamente en un medio de reacción que no favorezca la proliferación microbiana durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de oxidación, de preferencia hasta que del 25 al 99.9%, más preferiblemente del 50 al 99.9%, y muy preferiblemente del 80 al 99.9% del compuesto agregado de la fórmula (II) , se haya convertido en los compuestos de la fórmula (III) . El producto de reacción de la fórmula (III) obtenido de esta manera se puede separar del material de partida de la fórmula (II) sin un gran gasto técnico, por medio de métodos de separación acostumbrados, por ejemplo, mediante cristalización fraccionaria o mediante cromatografía. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía en columna, cromatografía de capa gruesa o cromatografía de capa delgada sobre materiales portadores minerales, tales como gel de sílice, o en resinas intercambiadoras orgánicas.

En lugar de las estructuras celulares vegetativas, se pueden utilizar esporas microbianas cuyas esporas se cosechan de microorganismos que sean capaces de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4" hasta una cetona de la fórmula (III), y luego se incuban con un compuesto de la fórmula (II), durante un período de tiempo que sea suficiente para que tenga lugar la reacción de oxidación correspondiente. La incubación de las esporas y el sustrato de preferencia se realiza en ausencia de un medio de cultivo, con el objeto de impedir que germinen las esporas . Los compuestos de fórmula (II) se utilizan como un sustrato para la reacción de oxidación de acuerdo con la invención. Estos compuestos son conocidos (ver el documento DE 2717040) , o se pueden preparar a partir de compuestos conocidos de una manera análoga a los procesos conocidos. Son adecuados para controlar plagas en animales y plantas, y además son materiales de partida o intermediarios valiosos en la preparación de compuestos de fórmula (I) . La preparación de compuestos de fórmula (III) también se puede realizar utilizando, para la oxidación de los compuestos de la fórmula (II), no el microorganismo por si mismo, sino constituyentes activos que se originen a partir de este microorganismo (de acuerdo con las definiciones b) a e) anteriores que sean capaces de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4" hasta una cetona de fórmula (III) . De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención es el uso en una forma inmovilizada de células de microorganismos vegetativos, extractos libres de células, esporas, enzimas, y mezclas de enzimas de estos microorganismos, que sean capaces de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4" hasta una cetona de fórmula (III) • La inmovilización de los biocatalizadores se puede realizar de una manera análoga a los procesos conocidos por sí mismos. Dentro del alcance de la presente invención, se puede mencionar especialmente los procesos que se basen en enlace absorbente o enlace iónico o covalente de los biocatalizadores a los materiales portadores sólidos, como regla insolubles en agua, en la reticulación de los biocatalizadores mediante reactivos bi- o poli-funcionales, después de la encapsulación en matriz, en la separación de membrana, o en una combinación de dos o más de los procesos anteriormente mencionados . El enlace adsorbente a portadores insolubles en agua (adsorbentes) se realiza especialmente mediante las fuerzas de van der Waals. Numerosos compuestos inorgánicos y orgánicos, y también polímeros sintéticos son adecuados como adsorbentes.

Los métodos para esta inmovilización de microorganismo son descritos por Bickerstaff (Ed.), 1997 (Immobilisation of Enzymes and Cells), van Haecht y colaboradores, 1985 (células de levadura/vidrio) , Black y colaboradores 1984 (células de levadura/acero refinado, poliéster) , Wiegel y Dykstra, 1984 (clostridia/celulosa, hemicelulosa) , Fórberg y Hággstróm, 1984 (clostidia/virutas de madera) y también por Ehrhardt y Rem, 1985 (Pseudo onads/carbón activado) . Los detalles correspondientes para el uso de enzimas inmovilizadas mediante enlace adsorbente se encuentran en Krakowiak y colaboradores, 1984 (glucoamilasa/óxido de aluminio) , Cabral y colaboradores, 1984 (glucoamilasa/vidrio activado con titanio) , Miyawaki y Wingard 1984 (glucosa-oxidasa/carbón activado) , Kato y Horíkoshi, 1984 (glucosa-transferasa/resina sintética), entre otros. Los enlaces iónicos se basan en las atracciones electrostáticas entre los grupos opuestamente cargados del material portador (tales como, por ejemplo, los intercambiadores de iones comercialmente disponibles, por ejemplo basados en polisacáridos o en resinas sintéticas) , y del biocatalizador que se vaya a enlazar. Los métodos para inmovilizar microorganismos, basados el enlace iónicos, son descritos por DiLuccio y Kirwan, 1984 (Azotobacter spec./Cellex E (celulosa)), y por Giard y colaboradores, 1977 (células animales/DEAE-Sephadex) . Se puede realizar una inmovilización correspondiente de enzimas de acuerdo con los detalles dados por Angelino y colaboradores, 1985 (aldehído-oxidasa/octilamino-Sepharose 4B) , Hofstee, 1973 (lactato-deshidrogenasa/octilamino-Sephadex) , Kühn y colaboradores, 1980 (glucosa-oxidasa/DEAE-Sephadex, DEAE-celulosa) , y otros . Un método de inmovilización adicional se basa en el uso de fuerzas de enlace covalente, que en general resulta en un enlace fijo de biocatalizadores entre sí o entre el biocatalizador y el material portador. Los materiales portadores adecuados son los materiales porosos, tales como vidrios, sílice, y otros materiales inorgánicos insolubles . Dentro del alcance del proceso de acuerdo con la invención, los microorganismos se pueden inmovilizar, por ejemplo, de una manera análoga a Messing y Oppermann, 1979 (£nterojacteria/vidrio de borosilicato; células de levadura/óxido de zirconio), Romanovskaya y colaboradores, 1981 (metano bacteria/Silochrome) , Navarro y Durand, 1977 (células de levadura/sílice poroso) . La inmovilización de enzimas se pueden realizar de acuerdo con el método descrito por Weetall y Masón, 1973 (papaina/vidrio poroso) , y Monsan y colaboradores, 1984 (invertasa/sílice poroso) . En el proceso de acuerdo con la invención, no solamente los materiales portadores ya mencionados son adecuados para la inmovilización, sino también toda una serie de polímeros naturales o sintéticos, tales como, por ejemplo, celulosa, dextrano, almidón, agarosa, etc., o polímeros, por ejemplo basados en derivados del ácido acrílico y metacrílico, que normalmente se utilizan en la fabricación de copolímeros reactivos. Los grupos reactivos adecuados mediante los cuales se forma un enlace con el biocatalizador, son los grupos reactivos dinitrofluorofenilo o isotiocianato, o especialmente grupos oxirano y anhídrido de ácido. Una posibilidad adicional reside en la activación con cloro de las resinas que llevan grupos carboxilo, los cuales, están comercialmente disponibles, por ejemplo bajo los nombres comerciales Amberlite® XE-64 y Amberlite® IRC-50. La inmovilización de microorganismos con la ayuda de materiales portadores naturales o sintéticos, se puede realizar como es descrito por Chipley, 1974 (Bacillus subtilis/agarosa) Gainer y colaboradores, 1980 (especies de Azotobacter/celulosa) , Jack y Zajic, 1977 ( icrococcLzs/carboximetilcelulosa) , Jirku y colaboradores, 1980 (células de levadura/hidroxialquilmetacrilato) , y también por Shimizu y colaboradores 1975 (células bacterianas/copolimero de etileno-anhidrido maleico) . La inmovilización de enzimas se puede realizar de una manera análoga a Cannon y colaboradores, 1984 (lactatooxidasa / celulosa) , Dennis y colaboradores, 1984 (quimiotripsina/Sepharose) , Ibrahim y colaboradores, 1985 (epoxi hidrolasa/dextrano) ; Beddows y colaboradores, 1981 ( oi-galactosidasa/copolímero de nailon-acrilato) , Raghunath y colaboradores, 1984 (ureasa/metacrilato-acrilato) , entre otros. En el proceso de reticulación, los biocatalizadores se enlazan entre sí mediante reactivos bi-o poli-funcionales, tales como glutardialdehído, diisocianatos entre otros, y forman agregados característicamente insolubles, normalmente gelatinosos de alto peso molecular. Estas inmovilizaciones de microorganismos se pueden realizar de una manera análoga a De Rosa y colaboradores, (1981) (células bacterianas/co-reticulación con albúmina de huevo por medio de glutardialdehído) . Los procesos para la inmovilización de enzimas que se pueden utilizar dentro del alcance de la presente invención son descritos por Barbarie y colaboradores, 1984 (invertasa/reticulación con dihidrazida del ácido adípico) , Talsky y Gianitsopoulos, 1984 (quimiotripsina/enlace de péptido entre las moléculas enzimáticas sin agente reticulante) , Workman y Day, 1984 (inulinasa/reticulación de las células que contienen enzima con glutardialdehído) , Khan y Siddiqi, 1985 (pepsila/reticulación con glutardialdehído) , Bachmann y colaboradores, 1981 (glucosa-iso erasa/co-reticulación con gelatina por medio de glutardialdehído) , Kaul y colaboradores, 1984 ( -galactosidasa/co-reticulación con albúmina de huevo por medio de glutardialdehído) . La encapsulación en matriz comprende la inclusión de los biocatalizadores en polímeros naturales o sintéticos, que normalmente son de una estructura gelatinosa. Los materiales de matriz que son especialmente adecuados para la inclusión de células, organelos, y esporas, son polímeros naturales, tales como alginato, carrageno, pectina, ágar, agarosa, o gelatina, debido a que estos compuestos no son tóxicos, y protegen a las células durante el manejo. También son adecuados los polímeros sintéticos, tales como, por ejemplo, poliacrilamidas, foto-reticuladas, entre otros. La forma de la encapsulación de matrices es variable dentro de amplios límites, y puede incluir, por ejemplo, las formas esférica, cilindrica, fibrosa, y de hoja. La inmovilización de microorganismos con la ayuda d materiales de matriz naturales o sintéticos se puede realizar como es descrito por Mazumder y colaboradores, 1985 (células bacterianas/resinas foto-reticuladas), Bettmann y Rehm, 1984 (células bacterianas/poliacrilamida-hidrazida) , Umemura y colaboradores, 1984 (células bacterianas/carrageno) , Karube y colaboradores, 1985 (protoplastos bacterianos/agar-acetilcelulosa) , Cantarella y colaboradores, 1984 (células de levadura/hidroxietilmetacrilato) , Qureshi y Tanhane, 1985 (célula de levadura/alginato) , Deo y Gaucher, 1984 (Hifomicetes/carrageno) , Eikmeier y Rehm, 1984 (Hifomicetos/alginato) , Bihari y colaboradores, 1984 (conidias de hifomicetos/poliacrilamida) , Vogel y Brodelius, 1984 (células de plantas/alginato, agarosa), Nakajima y colaboradores, 1985 (células de plantas/ágar, alginato, carr geno) . La inmovilización de las enzimas se puede realizar de una manera análoga a Mori y colaboradores, 1972 (aminoacilasa/poliacrilamida) . La separación de membrana involucra la creación de áreas definidas específicas en donde procede la reacción. Las variantes básicas de la separación de membrana se diferencian como se indica a continuación: a) microencapsulación, b) técnica de liposoma, c) el uso de biocatalizador en los reactores de membrana. Los métodos de inmovilización anteriormente descritos pueden combinarse entre sí, tal como, por ejemplo adsorción y reticulación. En ese caso, primero que nada las enzimas son adsorbidas sobre un portador, y luego reticuladas entre sí mediante un reactivo bifuncional. La incubación de los biocatalizadores utilizados dentro del alcance de la presente invención con los compuestos de la fórmula (II) para la oxidación específica del alcohol en la posición 4" hasta una cetona de la fórmula (III) se puede realizar con la ayuda de procesos tales como aquellos acostumbrados en la microbiología aplicada. En adición al uso de cultivos agitados, se pueden mencionar especialmente diferentes sistemas fermentadores que se han establecido durante mucho tiempo en la investigación microbiológica y en la producción industrial. La principal tarea de los biorreactores es la creación de condiciones hidrodinámicas óptimas, con el objeto de reducir las constantes aparentes de Michaelis, y para incrementar la velocidad de la reacción. Esto se logra esencialmente manteniendo un movimiento relativo adecuado entre el biocatalizador y el medio circundante, que incremente la transferencia de masa externa hasta un grado tal que en la práctica ya no se aplique su impedimento. Los tipos de reactores que son adecuados para el proceso concernido incluyen, por ejemplo, reactores de recipiente agitado, reactores de tipo cíclico, reactores de lecho, reactores de lecho fluidizado, reactores de membrana, y también numerosas formas especiales de reactores, por ejemplo reactores de tamiz agitado, reactores romboides, reactores de tubo, entre otros (W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger y A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Prave y colaboradores, Handbuch der Biotechnologie, 1984) . Se prefiere el uso de reactores de recipiente agitado dentro del alcance de la presente invención. Los reactores de recipiente agitado están entre los tipos de reactores más utilizados en la técnica biotecnológica de la fermentación. Este tipo de rector asegura una mezcla rápida y completa del sustrato y el biocatalizador, como un resultado de las altas capacidades de agitación y de una alta capacidad de transferencia de oxigeno . Las ventajas de los reactores de recipiente agitado residen en su construcción simple y por lo tanto económica, y en sus propiedades bien investigadas. En principio, cuando se utilizan reactores de recipiente agitado, son posibles dos clases de operación: la primera y de mayor preferencia, es un proceso operado de "tipo por lotes", también referido proceso "por lotes", y en segundo lugar, un proceso continuo.

En el proceso "por lotes", los biocatalizadores se remueven mediante separación o filtración una vez que se termina el proceso, y se desechan (células vegetativas) , o bien se utilizan nuevamente en un segundo lote (biocatalizadores inmovilizados) . Cuando se utiliza el proceso continuo, hay un intercambio continuo permanente del nuevo sustrato para el producto final de la reacción. Se debe impedir que los biocatalizadores salgan del reactor, por medio de medidas adecuadas (tamices, filtros, dispositivos de retorno) . El cultivo de células de microorganismos vegetativos dentro del alcance de la presente invención, se realiza de acuerdo con los métodos generalmente acostumbrados conocidos, utilizándose de preferencia medios nutrientes líquidos por razones de práctica. La composición de medio nutriente varia dependiendo del microorganismo utilizado. En general, se prefieren medios complejos con fuentes de carbono (C) y nitrógeno (N) pobremente definidas, fácilmente asimilables, como se utilizan normalmente, por ejemplo, también para la producción de antibióticos. En adición, se necesitan vitaminas y iones de metales esenciales que, sin embargo, como regla, están contenidos en una concentración adecuada como constituyentes o impurezas en el medio nutriente complejo utilizado. Si se desea, estos constituyentes tal como, por ejemplo, vitaminas esenciales y también iones de Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4+, (S0 )2", Cl", (C03)2~ y los elementos de traza cobalto y manganeso y zinc, entre otros, se pueden agregar en la forma de sus sales. Las fuentes de nitrógeno especialmente adecuadas, aparte de los extractos de levadura, hidrolizados de levadura, autolizados de levadura, y células de levadura, son especialmente harina de soya, harina de maíz, harina de avena, edamina (lactalbúmina enzimáticamente digerida) , peptona, hidrolizado de caseína, licores profundos de maiz, y extractos de carne. La concentración preferida de las fuentes de nitrógeno es de 0.1 a 6 gramos/litro. Las fuentes de carbono adecuadas son especialmente glucosa, lactosa, sacarosa, dextrosa, maltosa, almidón, cerelosa, celulosa, manitol, extracto de malta, y melaza. La escala de concentración preferida de estas fuentes de carbono es de 1.0 a 25 gramos/litro. El uso de D-glucosa, almidón soluble, o extracto de malta, y también de cerelosa, como fuente de carbono, es conveniente para el proceso de oxidación descrito en los siguiente, especialmente si los microorganismos utilizados son representantes del género Streptomyces . Por consiguiente, por ejemplo, los siguientes medios de cultivo son excelentemente adecuados para los representantes del género Streptomyces .

Medio 1 1.0 gramos de almidón soluble. 0.2 gramos de peptona 0.2 gramos de extracto de levadura se ajusta hasta 1 litro con agua destilada, se ajusta a un pH 7 n con NaOH, y se pasa por autoclave.

Medio 2 1.0 gramos de D-glucosa 10.0 gramos de extracto de malta 4.0 gramos de extracto de levadura se ajusta hasta 1 litro con agua destilada, se ajusta a un pH 7 NaOH, se pasa por autoclave.

Medio 3 10.0 gramos de glicerol 20.0 gramos de dextrina 10.0 gramos de Soytone (Difco Manual, 9a edición, Detroit, Difco Laboratories, 1969) 2.0 gramos de (NH4)2S04 2.0 gramos de CaC03 se ajusta hasta un litro con agua destilada, se ajusta a un pH Re 7 con NaOH, se pasa por autoclave.

Medio 4 10.0 gramos de D-glucosa 10.0 gramos de extracto de malta 3.0 gramos de extracto de levadura 10.0 gramos de Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton Oil Co., Memphis TN. EUA) 1.0 gramos de extracto de carne se ajusta hasta 1 litro con agua destilada, se ajusta a un pH 7 con NaOH, se pasa por autoclave.

Medio 5 (agar ISP-2) extracto de levadura 4 gramos (Oxoid Ltd. Basingstoke, Hampshire, Inglaterra) D (+) -glucosa 4 gramos extracto de bacto-malta 10 gramos (Difco No. 0186-17-7) agar 20 gramos (Difco No. 0140-01) se disuelven en 1 litro de agua desmineralizada, y el pH se ajusta a 7.0. La solución se esteriliza a 121°C durante 20 minutos, se enfría, y se mantiene a 55 °C durante el corto tiempo necesario para la preparación inmediata de las placas de agar.

Medio 6 (medio PHG) peptona - 10 gramos (Sigma 0521) extracto de levadura 10 gramos (Difco) D- (+) -glucosa 10 gramos NaCl 2 gramos MgS0 x 7 H20 0.15 gramos NaH2P04 x H20 1.3 gramos K2HP04 4.4 gramos se disuelven en un litro de agua desmineralizada, y el pH se ajusta a 7.0. Los medios anteriormente mencionados también son excelentemente adecuados para cultivar representantes del género Streptomyces y para realizar la reacción de oxidación. Tanto los datos generales anteriores acerca de la composición de los medios, con también los medios enlistados con detalle en la presente, sirven únicamente para ilustrar la presente invención, y no son de una índole limitante. Aparte de la composición de los medios, el procedimiento utilizado para producir los medios, tal como, por ejemplo, la secuencia de disolución o suspensión, la esterilización de la solución nutriente como un todo, o la esterilización de los constituyentes individuales, la prevención de contaminación entre otras cosas, también desempeña un papel significativo, y se debe optimizar de acuerdo con lo anterior para el proceso de producción concernido .

También se debe observar que la esterilización puede ocasionar alteraciones en el valor de pH del medio nutriente, y también precipitaciones. Los métodos de cultivo restantes también corresponden a los procesos utilizados normalmente para el cultivo de microorganismos. A una pequeña escala, las fermentaciones realizadas dentro del alcance de la presente invención, incluyendo cualesquier precultivo, normalmente están en la forma de cultivos agitados, en cuyo caso, es conveniente utilizar matraces de vidrio de una capacidad de 0.1 a 5 litros, de preferencia de 0.5 a 5 litros, que contengan de 0.05 a 2 litros, de preferencia de 0.1 a 2 litros de medio nutriente. Los matraces de preferencia están equipados con una pantalla. Después de pasar por autoclave y de ajustar el pH hasta valores desde un pH 4 hasta un pH 8, especialmente desde un pH 7.0 hasta un pH 7.5 (bacterias), o hasta valores desde un pH 6 hasta un pH 7.5 (hongos), los matraces se inoculan con los cultivos de microorganismos correspondientes bajo condiciones estériles. El material de inoculación utilizado en general es un precultivo que se haya producido a partir de un material de inoculación conservado de acuerdo con los datos dados enseguida. Los cultivos, incluyendo ' cualquier precultivo, convenientemente se cultivan bajo condiciones aeróbicas, a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37 °C, de preferencia de aproximadamente 26°C a aproximadamente 30 °C, pero de manera especial a aproximadamente 28 °C, con agitación continua entre aproximadamente 80 rpm y aproximadamente 300 rpm, de preferencia entre aproximadamente 100 rpm y 250 rpm, pero de manera especial a aproximadamente 120 rpm (revoluciones por minuto), en una maquina de agitación giratoria. Bajo las condiciones anteriormente mencionadas, con Streptomyces, en general se ha alcanzado una actividad de oxidación óptima después de un cultivo de 1.5 a 7 días. Una vez que la capacidad -catalítica de las células es suficientemente alta para realizar la reacción de oxidación deseada, de preferencia después de 40 horas, se agrega el sustrato (compuestos de la fórmula II), mediante lo cual, los microorganismos y la sustancia que se vaya a oxidar, se pueden poner en contacto entre sí de cualquier manera. Por razones prácticas, ha probado ser conveniente agregar el sustrato, es decir, un compuesto de fórmula (II), al microorganismo en la solución nutriente. La sustancia que se vaya a oxidar se puede utilizar, por ejemplo, en forma de polvo o en forma de una solución, ya sea en un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, dimetilformamida, acetona, sulfóxido de dimetilo, N-metil-2-pirrolidona, o un disolvente alcohólico, tal como, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, o terc-butanol, o un disolvente de éter, tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano o 1,4-dioxano (de 0.5 al 15% por volumen, de preferencia 2% por volumen) o un disolvente de éster, tal como, por ejemplo, acetato de etilo o un disolvente de hidrocarburo, tal como, por ejemplo, octano o ciciohexano o tolueno o xilano, o en una mezcla de un disolvente adecuado y un tensoactivo adecuado. El término "tensioactivo" comprende tensoactivos iónicos, no iónicos, y zwitteiónicos, y se entenderá que también incluye mezclas de tensoactivos. Tanto los jabones solubles en agua como los compuestos de actividad superficial sintéticos solubles en agua, son tensoactivos aniónicos adecuados. Los jabones adecuados son las sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos, sales de amonio insustituido o sustituido de los ácidos graso superiores (de 10 a 22 átomos de carbono) , por ejemplo, sales sódica o de potasio del ácido oleico o esteárico, o de mezclas de los ácidos grasos naturales que se pueden obtener, por ejemplo, de aceite de coco o de aceite de sebo. Los tensoactivos adecuados adicionales también son las sales de metiltaurina del ácido graso. Sin embargo, con más frecuencia se utilizan los denominados tensoactivos sintéticos, especialmente sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados de bencimidasol sulfonatados o alquilarilsulfonatos . Los sulfonatos o sulfatos grasos normalmente están en la forma de sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos, o sales de amoniaco insustituido o sustituido, y contienen un radical de alquilo de 10 a 22 átomos de carbono, el cual también incluye la fracción de alquilo de los radicales de acilo, por ejemplo la sal sódica o de calcio del ácido lignosulfónico, de dodeciisulfato, o de una mezcla de sulfatos de alcohol graso obtenidos de ácidos grasos naturales. Estos compuestos también comprenden las sales de los aductos sulfatados y sulfonatados de alcohol graso/óxido de etileno. Los derivados de bencimidazol sulfonatados de preferencia contienen dos grupos de ácido sulfónico y un radical de ácido graso que contiene de 8 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos de los alquilarilsulfonatos son las sale de sodio, calcio, o trietanolamina del ácido dodecilbencensulfónico, del ácido dibutilnaftalensulfónico, o de un condensado del ácido naftalensulfónico y formaldehído. También son tensoactivos aniónicos adecuados las sales del ácido biliar, por ejemplo, las sales sódicas del ácido cólico o del ácido desoxicólico . También son adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo, sales del éster del ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con 4 a 14 moles de óxido de etileno; o fosfolípidos.

Los tensoactivos catiónicos apropiados son sales de tetra-alquilamonio por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio . Los tensoactivos neutros adecuados son glicósidos de alquilo, por ejemplo, alquil-ß-D-glucopiranosidas, alquil-ß-D-tioglucopiranosidas, alquil-ß-D-maltosidas que contengan un radical de alquilo de 6 a 12 átomos de carbono.

Los tensoactivos neutros adecuados adicionales son glucamidas, por ejemplo N,N-bis (3-D-gluconamidopropil) -colamida, N,N-bis (3-D-gluconamidopropil) -desoxicolamida, N-metilglucamidas del ácido graso que contienen un radical acilo de 7 a 12 átomos de carbono. Los tensoactivos neutros adecuados adicionales son polioxietilenos mono- y polidispersos, por ejemplo BRIJ®, GENAPOL®, LUBROL®, PLURONIC®, THESIT®, TRITÓN®, TWEEN®. Los tensoactivos zwítteriónicos adecuados son N,N,N-trialquilo-glicinas, por ejemplo N-n-dodecil-N,N-dimetilglicina. Los tensoactivos zwiteriónicos adecuados adicionales son alquilsulfonatos de ?-N,N,N-trialquilamonio, por ejemplo, 3- (N-alquil-N, N-dimetil) -1-propano-sulfonato que contiene un radical de alquilo de 8 a 16 átomos de carbono. Los tensoactivos zwitteriónicos adecuados adicionales son 3- [ (3-colamidopropil) -dimetilamonio] -1-propano-sulfonato y 3- [ (3-colamidopropil) -dimetilamonio] -2-hidroxi-1-propano-sulfonato.

Los tensoactivos empleados normalmente en la técnica de la solubilización y formulación se describen, entre otras, en las siguientes publicaciones: Bhairi S.M. (1997) "A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA; "1999 International McCutcheon' s Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, E.U.A. El curso de la reacción se supervisa continuamente mediante métodos cromatográficos utilizados en general en la investigación microbiológica. La presente invención también se refiere al cultivo de microorganismos que son capaces de oxidar específicamente el alcohol en posición 4" hasta una cetona de fórmula (III), y a su incubación con estos compuestos en biorreactores, especialmente en biorreactores del tipo de reactor de recipiente agitado. Con el objeto de asegurar una velocidad óptima de formación del producto en el fermentador de producción real, se recomienda que primero que nada se multipliquen los microorganismos en precultivos.

El número de precultivos del fermentador depende de la concentración del material de inoculación que sea óptima en cada caso particular. De una manera conveniente, dependiendo de los microorganismos utilizados, se producen las siguientes concentraciones de material de inoculación para una etapa del fermentador: bacterias del 0.1 a 3%, hongos del 5 a 10%, Actinomicetales del 5 a 10%. La inoculación de fermentadores pequeños (de hasta 20 litros) normalmente se realiza utilizando precultivos de matraz agitado. En este caso, se utiliza el contenido total del matraz para inocular el fermentador. El material de partida utilizado para la producción de los precultivos normalmente es material de inoculación conservado que puede estar, por ejemplo, en la forma de liofilizados, o de un material congelado o almacenado en frío. El material de inoculación conservado utilizado dentro del alcance de la presente invención, de preferencia es un material almacenado a -80°C. La multiplicación del material de inoculación de preferencia se realiza en medios líquidos en matraces de vidrio en una maquina de agitación giratoria, o, cuando se utilicen esporas, sobre sustratos nutrientes sólidos. Se deben optimizar las condiciones relacionadas con los sustratos nutrientes y parámetros de cultivo, tales como temperatura, pH, introducción de oxígeno, entre otros, de acuerdo con el microorganismo o proceso utilizado. Los tiempos de cultivo para el material de inoculación conservado varian desde unas cuantas horas hasta varios días, dependiendo del material de inicio utilizado. liofilizados 3-10 días conservado congelado bacterias 4-18 horas Actinomicetales 1-5 días hongos 1-7 días cultivos almacenados en frío bacterias 4-24 horas actinomicetales 1-3 días hongos 15 días Si se utilizan esporas como material de inoculación, primero que nada, se multiplican las esporas a partir del material de inoculación conservado sobre sustratos nutrientes sólidos bajo condiciones estandarizadas (aireación estéril, cámara climática) . Si se utilizan sustratos nutrientes porosos basados en turba, salvado, arroz o cebada, los cultivos se agitan por completo diariamente para alcanzar altas densidades de esporas. Una posibilidad adicional reside en cultivar el material de inoculación conservado sobre el medio nutriente solidificado con ágar y otros agentes gelificantes generalmente utilizados, siendo preferible usar el medio nutriente que desencadene la inducción de formación de esporas.

El tiempo de esporulación es de 7 a 30 días, dependiendo del microorganismo utilizado y del medio nutriente utilizado. Para inocular los fermentadores de precultivo o producción, las esporas se suspenden con agentes de actividad superficial, por ejemplo una solución de Tween '80 (tensoactivo, disponible en Sigma-Aldrich Co . , St. Louis, MO EUA) , y se transfieren junto con su medio nutriente al fermentador o, si se utilizan medios nutrientes sólidos, se lavan los sustratos nutrientes sólidos también utilizando los agentes de actividad superficial. La solución que contiene esporas obtenida de esta manera se utiliza entonces para inocular los fermentadores. De preferencia, tanto la recuperación de las esporas como la inoculación de los fermentadores se realizan bajo condiciones estériles. Para producir compuestos de fórmula (III) dentro del alcance de la presente invención, se pueden utilizar biorreactores de diferentes dimensiones, que abarquen capacidades del orden de 0.001 m3 a 450 m3, dependiendo de la cantidad del producto requerido. Si se utilizan biorreactores de recipiente agitado, entonces se deben considerar críticos los siguientes parámetros de fermentación para que el curso de la reacción sea óptimo. 1. Temperatura: La reacción de oxidación - biocatalítica dentro del alcance del proceso de acuerdo con la invención, de preferencia se realiza en el intervalo de temperatura mesofílica (intervalo de temperatura de 20°C a 45°C) . El intervalo de temperatura óptimo para el crecimiento y la formación del producto es de 20 °C a 32 °C, especialmente de 24°C a 30°C. 2. Aireación: La velocidad de aireación es de 0.1 a 2.5 vvm (volumen de aire por volumen de líquido por minuto), de preferencia de 0.3 a 1.75 vvm. Si es necesario, la velocidad de aireación se debe adaptar al requerimiento de oxigeno adquirido en el curso de la fermentación. 3. Presión: Los reactores de recipiente agitado generalmente se operan baj"o una ligera presión excesiva de 0.20 a 1.01 kg/cm2 (0.2 a 1.0 bar), de preferencia de 0.50 a 0.71 kg/cm2 (0.5 a 0.7 bar) con el objeto de reducir el riesgo de contaminación. 4. Valor de pH: El valor de pH puede variar dentro de ciertos límites, dependiendo del microorganismo utilizado. Si se utilizan microorganismos del grupo de Actinomicetos, el valor de pH inicial es desde un pH 6 hasta un pH 8, de preferencia desde un pH 6.5 hasta un pH 7.5. Si se utilizan hongos, el pH inicial de la solución del cultivo es de preferencia de pH 4 a un pH 8, especialmente de pH 6 hasta un pH 7.5. 5. Agitación: La velocidad de agitación depende del tipo de agitador utilizado, y del tamaño del fermentador. Dentro del alcance de la presente invención, se prefieren los agitadores con hélices del tipo disco que, con un tamaño de reactor de recipiente agitado de 0.002 m3, se operan a velocidades de 150 rpm a 550 rpm, especialmente de 200 rpm a 500 rpm. Dentro del alcance de la presente invención, la duración de la fermentación varia desde 20 horas hasta 10 días, dependiendo del microorganismo utilizado. La reacción biocatalítica se descontinúa cuando se haya convertido de aproximadamente 25 a 99.9%, más preferiblemente de aproximadamente 50 a 99.9%, y muy preferiblemente de aproximadamente 80 a 99.9% del sustrato (compuestos de la fórmula (II)) agregado al principio, en compuestos de la fórmula (III) . Para aseverar el tiempo óptimo para la terminación de la reacción de oxidación, se supervisa el curso de la reacción durante toda la fermentación mediante procesos de análisis acostumbrados, especialmente procesos cromatográficos, tales como, por ejemplo, HPLC, o procesos cromatográficos de capa delgada. En una modificación del proceso anteriormente descrito, el biorreactor solamente se puede utilizar para generar biomasa, que luego se cosecha mediante filtración o centrifugación. La biomasa del microorganismo se utiliza entonces inmediatamente como un biocatalizador para la conversión de los compuestos de la fórmula (II) en compuestos de la fórmula (III) , o bien se almacena en frío como tal o después de secarse por congelación o de secarse por pulverización. Este microorganismo, ya sea recién cosechado o almacenado como se describió, se distribuye luego adicionalmente a otros recipientes, tales como, por ejemplo, matraces de preferencia equipados con pantallas, o biorreactores de recipiente agitado, en donde se realiza el proceso de bioconversión. Se agrega el sustrato (compuestos de fórmula (II)), mediante lo cual, el microorganismo y la sustancia que se vaya a oxidar, se pueden poner en contacto entre sí de cualquier manera. Por razones prácticas, se ha probado ser conveniente agregar el sustrato, es decir, un compuesto de fórmula (II) , al microorganismo en una solución regulada que no favorezca la proliferación. El sustrato (compuestos de la fórmula (II) ) que se va a oxidar se puede utilizar, por ejemplo, en forma de polvo, o en la forma de una solución en un disolvente adecuado, tal como aquellos descritos previamente en la presente. En una modalidad preferida de la invención, primero se disuelve el sustrato (compuestos de fórmula (II)) en un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, sulfóxido de dimetilo o Tween 40 (tensoactivo, disponible en Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), o una combinación de ambos, y se agrega a matraces con pantalla que contengan una solución reguladora, de preferencia un regulador de fosfato, más preferiblemente un regulador de fosfato de 0.07 M, pH 7.0. Luego la solución resultante se esteriliza antes de que se agregue el biocatalizador (biomasa del microorganismo) . Luego esta mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente, y se agita entre 100 rpm y 150 rpm, de preferencia a aproximadamente 120 rpm, durante aproximadamente 2 a 7 días, dependiendo de la cepa microbiana. En una modalidad preferida adicional de la invención, primero se disuelve el sustrato (compuestos de fórmula (II) ) en un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, sulfóxido de dimetilo o Tween 40 (tensoactivo, disponible en Sigma-Aldrich Co . St. Louis, MO, EUA), o una combinación de ambos, y se agrega a matraces con pantalla que contengan un medio de cultivo que promueva el crecimiento del microorganismo que se vaya a utilizar para realizar la reacción de oxidación deseada. Luego se esteriliza la solución resultante antes de que se agregue el biocatalizador (biomasa del microorganismo) . Luego esta mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente, y se agita entre 100 rpm y 150 rpm, de preferencia a aproximadamente 120 rpm, durante aproximadamente 2 a 9 días, dependiendo de la cepa microbiana. En una modalidad especifica adicional de la invención, se prepara un extracto libre de células utilizando células húmedas, que se lavan en una solución reguladora adecuada, se resuspenden en el regulador de alteración, y se alteran, por ejemplo, mediante elementos mecánicos a una temperatura de entre 2°C y 15°C, de preferencia a una temperatura de entre 3°C 6°C, y más preferiblemente a 4°C. La suspensión resultante es centrifugada, y se colecta el extracto libre de células sobrenadante. Al extracto exento de células así obtenido, se le agrega soluciones que comprendan una alícuota adecuada de un sistema de suministro de electrones extraños, tal como, por ejemplo, ferredoxina y ferredoxina-reductasa y un sustrato.

Después de la adición del sustrato, la mezcla de preferencia se mezcla y se airea de inmediato y completamente. Luego se agrega una alícuota adecuada de NADPH, y la mezcla se incuba a una temperatura de entre 15°C y 40°C, de preferencia a una temperatura de entre 20°C y 35°C, y más preferiblemente a 30°C. El procesamiento del caldo de fermentación con el objeto de recuperar el producto de la oxidación (compuestos de fórmula (III)), se puede realizar mediante procesos utilizados normalmente en la técnica de fermentación (W. Crueger y A Crueger, 1984; F. Prave, 1984) . Primeramente, se remueven los constituyentes particulados del caldo de reacción, utilizando filtros, centrifugas, o separadores, para extraerse por separado del filtrado . Sí se utilizan células vegetativas o muertas como biocatalizador, y si una porción de los productos de reacción (compuestos de fórmula (III) están presentes dentro de las células) , las células se deben desintegrar antes de la extracción. Para este propósito, están disponibles diferentes métodos de desintegración celular basados en procesos mecánicos térmicos, químicos, o enzimáticos. Los métodos mecánicos adecuados para utilizarse en el proceso de acuerdo con la invención son, por ejemplo, molienda en molinos de bolas agitados o molinos de coloides, el uso de presión y relajación en un homogeneizador, y desintegración celular mediante la acción de ultrasonido. Los procesos no mecánicos incluyen desintegración celular mediante secado, lisis de las células mediante choque osmótico, autólisis química, y lisis enzimática de las células . Una vez que se hayan removido los constituyentes particulados, los productos de reacción se concentran mediante la extracción de la solución de cultivo y los constituyentes celulares separados con disolventes adecuados. Para la extracción también hay numerosos auxiliares disponibles que se utilizan normalmente en la técnica de la fermentación, tales como, por ejemplo, mezcladoras-asentadoras, columnas a contra-corriente, centrifugas de extracción, entre otras. También es posible concentrar los productos de reacción, por ejemplo, mediante filtración de membrana, ultrafiltración, concentración por congelación, procesos de intercambio de iones, entre otros. El procesamiento adicional del producto crudo obtenido después de la extracción se puede realizar mediante métodos que están bien establecidos en la investigación microbiológica y química, y en el uso industrial. Estos procesos incluyen, por ejemplo, métodos cromatográficos, tales como cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía por afinidad, cromatografía hidrofóbica, cromatografía por división, cromatografía covalente, y otras, pero en adición a estas, también diferentes procesos de cristalización. Los disolventes adecuados para extracción, ya sea como tales o como mezclas de los mismos, son hidrocarburos aromáticos, tales como tolueno, mezclas de xilenos, o naftalenos sustituidos, ftalatos, tales como ftalato de sulfonatos o sulfatos grasos normalmente están en la forma de sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos, o sales de amonio insustituido o sustituido, y contienen un radical de alquilo de 10 a 22 átomos de carbono que también incluye la fracción de alquilo de radicales de acilo, por ejemplo, sal sódica o de calcio del ácido lignosulfónico, de dodeciisulfato, o de una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos partir de los ácidos grasos naturales. Estos compuestos también comprenden las sales de aductos de alcohol graso sulfatado y sulfonado/óxido de etileno. Los derivados de bencimidazol sulfonatados de preferencia contienen dos grupos de ácido sulfónico y un radical de ácido graso que contiene de 8 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos de los alquilarilsulfonatos son sales de sodio, calcio, o trietanolamina del ácido dodecilbencensulfónico, del ácido dibutilnaftalensulfónico, o de un condensado del ácido naftalensulfónico y formaldehído. También son adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo, sales del éster del ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con 4 a 14 moles de óxido de etileno; o fosfolípidos. Los tensoactivos empleados normalmente en la técnica de la formulación se describen, entre otras, en la siguiente publicación: "1986 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The dibutilo o ftalato de dioctilo, hidrocarburos alifáticos, tales como isómeros de hexano, heptano, octano, o parafinas o ciciohexano, alcoholes y glicoles y sus éteres y esteres, tales como metanol, etanol, 2-propanol, 1-butanol, tere.butanol, etilenglicol, metiltercbutiléter, acetato de etilo, monometilo monoetiléter de etilenglicol, cetonas, tales como acetona o 2-butanona o ciciohexanona, hidrocarburos clorados, tales como diclorometano o cloroformo o tetracloruro de carbono. También se entenderá que el término "tensoactivo" incluye mezclas de tensoactivos. Tanto los jabones solubles en agua como los compuestos de actividad superficial sintéticos solubles en agua son tensoactivos aniónicos adecuados. Los jabones adecuados son sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos, o sales de amonio insustituido o sustituido de ácidos grasos superiores (de 10 a 22 átomos de carbono), por ejemplo, sales sódica o de potasio del ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que se pueden obtener, por ejemplo, de aceite de coco o aceite de sebo. Los tensoactivos adecuados adicionales son también las sales de metiltaurina del ácido graso. Sin embargo, con más frecuencia se utilizan los denominados tensoactivos sintéticos, especialmente sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados de bencimidazol sulfonatados, o alquilarilsulfonatos. Los Manufacturig Confectioner Publishing Co . , Glen Rock, Nueva Jersey, E.U.A. Una modalidad preferida de la invención es un método para producir 4"-oxo-avermectina poniendo un biocatalizador, tal como un microorganismo capaz de convertir la avermectina en 4"-oxo-avermectina en contacto con avermectina, y aislar 4"-oxo-avermectina producida a partir de la mezcla de reacción. Una modalidad de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III) , que de preferencia es 4"-oxo-vermectina, el cual comprende las siguientes etapas : (1) producción de células mediante inoculación de un medio nutriente que promueva el crecimiento celular con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), de preferencia avermectina a 4"-oxo-avermectina; (2) cosecha de las células después de crecer, (3) disolución de un compuesto de fórmula (II), de preferencia avermectina, en un disolvente adecuado, (4) adición de la solución de la etapa (3) a un medio de reacción que no promueva la proliferación celular, (5) adición de las células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa 4, (6) agitación de la mezcla de reacción de la etapa (5) en presencia de aire, (7) separación de las células del medio, (8) extracción del sobrenadante y de células con disolventes apropiados, (9) concentración de las fases del disolvente orgánico de la etapa (8) , (10) purificación de un compuesto de fórmula (III), que de preferencia es 4"-oxo-avermectina, contenida en el extracto (9) , mediante cromatografía o cristalización. Una modalidad preferida adicional de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III), que de preferencia es 4"-oxo-avermectina, el cual comprende las siguientes etapas: (1) producción de células mediante inoculación de un medio nutriente que promueva el crecimiento celular con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), de preferencia avermectina a 4"-oxo-avermectina; (2) cosecha de las células después de crecer, (3) disolución de un compuesto de fórmula (II), de preferencia avermectina, en un disolvente adecuado, (4) adición de la solución de . la etapa (3) a un medio de reacción que no promueva la proliferación celular, (5) adición de células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa (4), (6) agitación de la mezcla de reacción de la etapa (5) en presencia de aire, (7) extracción del caldo entero con un disolvente apropiado, (8) separación de fases, (9) concentración de la fase del disolvente de la etapa (8) en vacío, (10) purificación de un compuesto de formula (III) , que de preferencia sea 4"-oxo-avermectina, contenida en el extracto (9) , mediante cromatografía o cristalización. Una modalidad preferida adicional de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III) , que de preferencia es 4"-oxo-avermectina, y, el cual comprende las siguientes etapas: (1) disolución de un compuesto de fórmula (II) , que de preferencia sea avermectina, en un disolvente apropiado, (2) adición de la solución de la etapa (1) a un medio nutriente que promueva el crecimiento celular, (3) inoculación del medio nutriente de la etapa (2) con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), de preferencia avermectina a 4"-oxo-avermectina; (4) cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), de preferencia avermectina a 4"-oxo-avermectina; (5) separación de las células a partir del medio, (6) extracción del sobrenadante y de las células con disolventes apropiados, (7) concentración de las fases del disolvente orgánico de la etapa (6) al vacío, (8) purificación de un compuesto de fórmula (III) que de preferencia es 4"-oxo-avermectina, contenida en el extracto (7), mediante cromatografía o cristalización. Una modalidad preferida adicional de la invención es un método para producir un compuesto de fórmula (III), que de preferencia es 4"-oxo-avermectina, el cual comprende las siguientes etapas: (1) disolución de un compuesto de fórmula (II), de preferencia avermectina, en un disolvente apropiado, (2) adición de la solución de la etapa (1) a un medio nutriente que promueve el crecimiento celular, (3) inoculación del medio nutriente de la etapa (2) con precultivos de un microorganismo capaz de convertir avermectina a 4"-oxo-avermectina, (4) cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III), de preferencia avermectina a 4"-oxo-avermectina; (5) extracción de caldo entero con un disolvente apropiado, (6) separación de fases, (7) concentración de la fase del disolvente de la etapa (6) al vacío, (8) purificación de un compuesto de fórmula (III), que de preferencia sea 4"-oxo-avermectina, contenida en el extracto (7) , medíante cromatografía o cristalización. En una segunda etapa puramente química, el compuesto así obtenido de fórmula (III) se puede hacer reaccionar con una amina de la fórmula HN(Rs)Rg, en donde Re, y Rg tienen los mismos significados que se dan para la fórmula (I), y que es conocido, en la presencia de un agente reductor. Los componentes de reacción se pueden hacer reaccionar en ausencia de un disolvente, de preferencia sin embargo, en presencia de un disolvente. Otra posibilidad consiste en realizar a reacción en un exceso de uno de los componentes de la reacción, especialmente en una amina líquida. Sin embargo, normalmente es conveniente la adición de un disolvente o diluyente líquido inerte. Los ejemplos de estos disolventes o diluyentes son hidrocarburos aromáticos, alifáticos, y alicíclicos, e hidrocarburos halogenados, tales como benceno, tolueno, xileno, mesitileno, tetralina, clorobenceno, diclorobenceno, bromobenceno, éter de petróleo, hexano, ciciohexano, diclorometano, triclorometano, tetraclorometano, dicloroetano, tricloroeteno, o tetracloroeteno; esteres, tales como etiléster del ácido acético; éteres, tales como dietiléter, dipropiléter, diisopropiléter, dibutiléter, tercbutilmetiléter, monometiléter de etilenglicol, monoetiléter de etilenglicol, dimetiléter de etilenglicol, dimetoxidietiléter, tetrahidrofurano, o dioxano; cetonas, tales como acetona, metiletilcetona, o metilisobutilcetona; alcoholes, tales como metanol, etanol, propanol, isoprosanol, butanol, etilenglicol, o glicerina; amidas, tales como N, N-dimetilformamida, N,N-dietilformamida, N, N-dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, o triamida del ácido hexa etilfosfórico; nitrilos, tales como acetonitrilo o propionitrilo; y sulfóxidos, tales como sulfóxido de dimetilo; ácidos orgánicos, tales como ácido acético; y agua. Los disolventes preferidos son éteres, tales como tetrahidrofurano y dimetiléter de etilenglicol; especialmente tetrahidrofurano; alcoholes, tales como metanol, etanol, o isopropanol; disolventes halogenados, tales como diclorometano o dicloroetano; disolventes aromáticos, tales como benceno o tolueno; nitrilos, tales como acetonitrilo, amidas tales como N, N-dimetilformamida, ácidos carbónicos tales como ácido acético; agua; y mezclas de los mismos. Los disolventes muy especialmente preferidos son metanol o etanol o mezclas de los mismos. La reacción de preferencia se realiza en un intervalo de pH de entre 0 y 14, especialmente de entre 2 y 10, en muchos casos entre 6 y 9, muy especialmente a un pH 9. La reacción de preferencia se realiza en un intervalo de temperatura de entre -80°C y +140°C, de preferencia entre -30°C y +100°C, en muchos casos entre -10°C y +80°C, especialmente entre 0°C y +50°C. Los agentes reductores preferidos son hidruros, tales como borohidruros; boranos; ácido fórmico; formiatos; o hidrógeno. Se prefieren especialmente hidruros, tales como borohidruro de sodio, borohidruro de zinc, borohidruro de litio, cianoborohiruro de sodio, triacetoxiborohidruro de sodio, o triacetoxiborohidruro de tetrametilamonio. Se prefiere especialmente borohidruro de sodio. La reacción se puede realizar - donde sea aplicable - en presencia de ciertos productos químicos adicionales, tales como catalizadores homogéneos o heterogéneos, o ácidos. Son especialmente adecuados los ácidos, tales como el ácido clorhídrico, el ácido p-toluensulfónico, el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido tartárico, o el ácido ftálico; ácidos de Lewis, tales como, por ejemplo, tetracloruro de titanio, tetraisopropilato de titanio o cloruro de zinc, sales tal como, por ejemplo perclorato de magnesio, acetato de sodio, tartrato de sodio y potasio, cloruro de iterbio, o p-toluensulfonato de piridinio; agentes absorbentes de agua, tales como, por ejemplo, sulfato de sodio, tamiz molecular, o gel de sílice; o mezclas de los mismos. Los agentes adicionales preferidos son ácidos, tales como ácido acético, ácido propiónico, o ácido tartárico; se prefiere ácido acético. Cuando se realiza la reducción con hidrógeno, es conveniente la adición de uno o varios catalizadores homogéneos o heterogéneos adecuados. Los catalizadores preferidos son catalizadores de metales heterogéneos que son conocidos en la técnica, de preferencia catalizadores de Ni, Pt- ó Pd, especialmente catalizadores de níquel de Raney y de Lindlar (Pd-CaC03-PbO) . Los catalizadores homogéneos adecuados son especialmente complejos de Rodio, tales como catalizadores de Wilkinson (Cloro-tris-trifenil-rodio) . Los compuestos de la fórmula (1), en cada caso en forma libre o en forma de sal, pueden estar en la forma de uno de los posibles isómeros, o en la forma de una mezcla de los mismos, por ejemplo, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos en la molécula y de su configuración absoluta y relativa y/o dependiendo de la configuración de los dobles enlaces no aromáticos en la molécula, pueden estar en la forma de isómeros puros, tales como antípodas y/o diaestereoisómeros, o en la forma de mezclas de isómeros, tales como mezclas de enantiómeros, por ejemplo racematos, mezclas de diaestereoisómeros, mezclas de racematos; la invención se refiere tanto a los isómeros puros como a todas las posibles mezclas de isómeros, y esto se debe entender anteriormente y posteriormente en la presente, inclusive cuando no se mencionen específicamente los detalles estereoquímicos en cada caso. Las mezclas de diaestereoisómeros y las mezclas de racematos de los compuestos de fórmula (I), o sales de los mismos, que se pueden obtener de acuerdo con el proceso, dependiendo de los materiales de partida y de los procedimientos elegidos, o mediante otros medios, se pueden separar con base en las diferencias fisicoquímicas entre los constituyentes en los diaestereoisómeros o racematos puros de una manera conocida, por ejemplo mediante cristalización fraccionaria, destilación, y/o cromatografía. Las mezclas de enantiómeros, tales como racematos, que se pueden obtener de esta manera, se pueden resolver en las antipodas ópticas mediante métodos conocidos, por ejemplo mediante recristalización a partir de un disolvente ópticamente activo, mediante cromatografía sobre absorbentes quirales, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) sobre acetilcelulosa, con la ayuda de microorganismos adecuados, mediante disociación con enzimas inmovilizadas específicas, vía la formación de compuestos de inclusión, por ejemplo, utilizando éteres de corona quirales, en cuyo caso solamente se forma complejo con un enantiómero, o mediante conversión en sales diaestereoisoméricas, por ejemplo mediante la reacción de un racemato de producto final básico con un ácido ópticamente activo tal como un ácido carboxilico, por ejemplo ácido alcanfórico, tartárico, o málico, o un ácido sulfónico, por ejemplo ácido alcanforsulfónico, y separación de la mezcla resultante de diaestereoisómeros, por ejemplo con base en sus diferentes solubilidades mediante cristalización fraccionaria, en los diaestereoisómeros a partir de los cuales se puede liberar el enantiómero deseado mediante la acción de agentes adecuados, por ejemplo básicos. Aparte de hacerlo mediante separación de las mezclas de isómeros correspondientes, es posible, de acuerdo con la invención, obtener diaestereoisómeros o enantiómeros puros también mediante los métodos generalmente conocidos de síntesis de diaestereoselectiva o enantioselectiva, por ejemplo, realizando el proceso de acuerdo con la invención utilizando materiales de inicio que tengan una diaestereoquímica correspondientemente adecuada.

Los compuestos de fórmulas (I) y (III), los productos d adición de ácido, y sales de los mismos, también se pueden obtener en la forma de sus hidratos, y/o pueden incluir otros disolventes, por ejemplo disolventes que se puedan haber utilizado para la cristalización de los compuestos que se presenten en forma sólida. La invención se refiere a todas las formas del proceso de acuerdo con las cuales se utiliza un compuesto que se pueda obtener como material de partida o intermediario en cualquier etapa del proceso, como material de inicio, y se realicen todas o algunas de las etapas restantes, o se utilice un material de inicio en la forma de un derivado o una sal y/o sus racematos o antipodas, o especialmente se forme bajo las condiciones de reacción. Los compuestos de fórmulas (I) y (III) que se puede obtener de acuerdo con el proceso, o por otros medios, se pueden convertir en diferentes compuestos de fórmulas (I) y (III) de una manera conocida por sí misma. En el proceso de la presente invención, de preferencia se utilizan los materiales de inicio e intermediarios, en cada caso en forma libre o en forma de sal, que den como resultado los compuestos de fórmulas (I) y (III) , o sales de los mismos, descritos al principio como especialmente valiosos.

En el caso de que R9 sea hidrógeno, la etapa de reacción (2) se puede dividir en dos etapas separadas, en donde, en una primer etapa, se forma un compuesto de la fórmula: en donde Ri, R2, R3, R4, R5, Re, 7, Rs, m, n, A, B, C, D, E y F tienen los significados dados para la fórmula (I) anterior, es formada mediante la reacción de un compuesto de fórmula (III) con un compuesto de la fórmula H2N(R8), en donde Rs tiene el mismo significado que se da para la fórmula (I) anterior, y en una segunda etapa, este compuesto de fórmula (IV) se reduce de acuerdo con el procedimiento de la etapa (2) anterior. Estas dos etapas individuales se pueden realizar en una síntesis de un recipiente sin aislar el compuesto de fórmula (IV) ; sin embargo, puede ser conveniente aislar el compuesto (IV), por ejemplo, para propósitos de purificación. Los compuestos de fórmula (IV) son novedosos, y también un aspecto de la presente invención.

EJEMPLOS La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan para propósitos de ilustración solamente, y no pretenden ser limitantes, a menos que se especifique de otra manera. La invención se refiere especialmente a los procesos de preparación descritos en los Ejemplos .

Ejemplo 1: Producción de Células 1.1. Streptomyces tubercidicus cepa 1-1529 Precultivos de la cepa 1-1529 ( Streptomyces tubercidi cus; DSM-13135) se cultivan en 20 matraces Erlenmeyer de 500 mililitros con pantalla, cada uno conteniendo 100 mililitros del medio 2, con agitación orbital a 120 rpm a 28 °C durante 3 días. Estos cultivos se utilizan para inocular un fermentador de 50 litros que contiene 40 litros del medio 4.

Las células se cultivan a 28 °C con una aireación de 0.7 vvm (= 30 litros/minuto) . La velocidad del agitador se mantuvo entre 200 rpm y 300 rpm, guiado por un sensor de p02, para impedir que cayera el p0 debajo del 25%. Después de 2 días de cultivo, las células se cosechan mediante centrifugación, utilizando una centrifuga de flujo atravesado, se obtienen 4.2 kilogramos de células (húmedas). 1.2 Streptomyces tubercidicus cepa R-922 La Streptomyces tubercidicus cepa R-922 (DMS-13136) se cultiva en una caja Petri sobre ágar ISP-2 (medio 5) . Este cultivo se utiliza para inocular 4 matraces de agitación de 50 mililitros con pantalla, cada uno conteniendo 100 mililitro del medio PHG (medio 6) . Estos precultivos se hacen crecer sobre un agitador orbital con 120 rpm a 28 °C durante 96 horas, y después se utilizan para inocular un fermentador de 10 litro equipado con un agitador mecánico y que contiene 8 litros del medio PHG. Este cultivo principal se hace crecer a 28 °C con agitación a 500 rpm y una aireación 1.75 vvm (14 litros/minuto), y a una presión de 0.7 bar. Al final del crecimiento exponencial, después de aproximadamente 20 horas, las células se cosechan mediante centrifugación. El rendimiento de las células húmedas es de 70 a 80 gramos/litro de cultivo. Para un procesamiento adicional, las células húmedas se pueden almacenar a 4°C, preferiblemente no más de 1 semana.

Ejemplo 2: Procedimiento de Reacción 2.1 Cultivo en Reposo 2.1.1 Condiciones de Reacción Se disuelven 35.5 gramos de avermectina (técnica) en 1.05 litros de sulfóxido de dimetilo/Tween 40, 1:1. Esta solución se distribuye agregando alícuotas de 25 mililitros a 42 matraces Erlenmeyer de 3 litros con pantalla, cada uno conteniendo 1 litro del medio de reacción. Estas soluciones se esterilizan a 121 °C durante 20 minutos. Después de enfriarse a temperatura ambiente, se agregan 100 gramos de células húmedas (frescas, almacenadas a 4°C durante no más de 4 días), como se preparan en los Ejemplos 1.1 y 1.2, respectivamente. Subsecuentemente estas mezclas de reacción se agitan a temperatura ambiente con 120 rpm durante 4 a 5 días .

Medio de reacción: 0.5 gramos de melasa 0.5 gramos de MgCl2 12.5 miligramos de ZnCl2 12.5 miligramos de MnCl2-4H20 25 miligramos de CoCl -6H20 12.5 miligramos de NiCl2-6H20 2.5 miligramos de CuCl2-2H20 6.3 miligramos NaMo04-2H20 0.15 mililitros de HCl ÍM se ajusta a un litro con regulador de fosfato 70 M, pH de 6.0, y se pasa por autoclave. 2.1.2 Procesamiento Las mezclas de reacción se centrifugan en matraces centrífugos de polipropileno de 500 mililitros a 4°C durante 15 minutos a 13000 x g. Los sobrenadantes de la mezcla de reacción de 40 litros se agrupan y se extraen dos veces con metiltercbutiléster (0.5 equivalentes por volumen, 0.4 equivalentes por volumen) . Las fases agrupadas de metiltercbutiléter se extraen de vuelta entonces tres veces con 0.185 equivalentes por volumen de agua destilada. La fase de metiltercbutiléter se concentra al vacío sobre el evaporador giratorio. El secado del residuo produce de 10 a 12 gramos de extracto S. Las fases acuosas se desechan. Las células centrifugadas de 120 a 132 matraces centrifugas se extraen como sigue: Las células de 24 matraces centrífugos se transfieren a un matraz Erlenmeyer de 2 litros. A cada matraz Erlenmeyer se agregan 80 gramos de tierra diatomea (Hyflo Supercell®, purificada), y 1.2 litros de acetona.

Después de la mezcla manual, la mezcla se homogeneiza por medio de una gran barra de agitación magnética. La pulpa resultante se filtra al vacío a través del papel sobre un embudo Büchner de 20 centímetros de diámetro, y se lava con acetona hasta lograr una elución incolora. De esta manera se obtienen el filtrado Cl y la torta del filtro Cl. El filtrado Cl se concentra al vacío sobre un evaporador giratorio para eliminar la acetona. Después la fase acuosa resultante se extrae tres veces con 0.7 litros de tolueno. Las fases de tolueno combinadas se secan sobre sulfato de sodio anhidro. La filtración y evaporación sobre el evaporador giratorio al vacio producen el extracto Cl . La torta del filtro Cl se transfiere a un matraz Erlenmeyer de 2 litros, y se mezcla manualmente con 1.5 litros de tolueno. La mezcla se homogeneiza por medio de una barra de agitación magnética grande. La pulpa resultante se filtra al vacío a través de papel sobre un embudo Büchner de 20 centímetros de diámetro, y se lava con tolueno hasta lograr una elución incolora. De esta manera se obtienen el filtrado C2 y la torta del filtro C2. La torta del filtro C2 se desecha. El filtrado C2 se concentra al vacío sobre un evaporador giratorio, para dar el extracto C2, el cual se seca al alto vacío. Los extractos combinados Cl y C2 de la mezcla de reacción de 40 litros se secan en alto vacío para dar de 30 a 35 gramos del extracto C. 45 gramos de los extractos combinados S y C se pasan por cromatografía instantánea de manera análoga a la descripción de Clark-Still y colaboradores, sobre una columna empacada con 1.5 kilogramos de gel de sílice (Merck 60, 0.040-0.063 milímetros) mediante elución con acetato de etilo: hexano 3:2, a una presión de N2 de 0.5 bar, y verificando con cromatografía de capa delgada. La producción de 4"-oxo-avermectina pura es de 5.6 gramos. 2.1 Cultivo de Proliferación 2.2.1 Condiciones de Reacción Un gramo de avermectina (técnica) se disuelve en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo/Tween 40, 1:1. Esta solución se distribuye agregando alícuotas de 2.5 mililitros a 20 matraces Erlenmeyer de 500 mililitros con pantalla, cada uno conteniendo 100 mililitros del medio 4. Estas soluciones se esterilizan a 121 °C durante 20 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregan 5 mililitros de precultivo, como se preparó en los Ejemplos 1.1 y 1.2, respectivamente. Subsecuentemente, estos cultivos inoculados se incuban a 28 °C durante 7 días con agitación orbital a 120 RPM. 2.2.2 Procesamiento Las mezclas de reacción se centrifugaron en matraces centrífugos de polipropileno de 500 mililitros a 4°C durante 15 minutos a 13,000 x g y se procesan análogamente como se describe en el Ejemplo 3. Se obtienen 252 miligramos de 4"-oxo-avermectina pura. 2.3 Biocatalizadores Libres de Células 2.3.1 Preparación de extracto libre de células Sol uci ones de suministro : Regulador de PP: K2HP04/KH2P04 50 mM (pH de 7.0) Regulador de alteración: K2HP04/KH2P0 50 mM (pH de 7.0), benzamidina 5 mM, ditioeritritol 2 mM, Pefabloc 0.5 mM (de Roche Diagnostics) Sustrato: 10 miligramos de avermectina se disuelven en 1 mililitro de isopropanol. 6 gramos de células húmedas, lavadas en regulador de PP, se resuspenden en 35 mililitros de regulador de alteración, y se alteran en una prensa French a 4°C. La suspensión resultante se centrifugó durante 1 hora a 35,000 x g. Se recolecta el extracto libre de células sobrenadantes . 2.3.2 Desarrollo de un ensayo para determinar la actividad enzimática Soluciones de suministro : Ferredoxina: solución de 5 miligramos de ferredoxina (de espinaca) , 1-3 miligramos/mililitro en reguladox Tris/HCl (de Fluka) o solución de 5 miligramos de ferredoxina (a partir de Cl os tri di um pas teuri anum) , 1-3 miligramos/mililitro en regulador Tris/HCl (de Fluka) . o solución de 5 miligramos de ferredoxia (de Porphyra umbili calis) , 1-3 miligramos/mililitro en regulador Tris/HCl (de Fluka) Ferredoxina-Reductasa: solución de 1 miligramo de ferredoxina-reductasa secada por congelación (de espinaca), .3.9 unidades/miligramo en 1 mililitro de H20 (de Sigma) NADPH: NADPH 100 mM en H20 (de Roche Diagnostics) ( todas las sol uciones de suministro se almacenaron a -20 ° C, y mantuvieron sobre hielo) . Condiciones de HPLC: Instrumento de HPLC: Merck-Hitachi Columna de HPLC: 70 x 4 milímetros, Kromasil 100 C18 3.5 µ (de Macherey-Nagel, Suiza) Disolvente A: acetonitrilo, conteniendo ácido trifluoroacético del 0.01% Flujo : 1.5 mililitros/minuto detección: UV 243 nanómetros muestra: 30 µl Tiempos de retención: avermectina Bla 3.18 minutos 4"-oxo-avermectina Bla 4.74 min. Tabla de Bombeo: 0.0 min. 75%A 25% B gradiente lineal hasta 7.0 min. 100% A 0% B 9.0 min. 100% A 0% B por paso hasta 9.1 min. 75% A 25% B 12.0 min. 75% A 25% B A 475 microlitros de extracto libre de células, se les agregan las siguientes soluciones: 10 microlitros de ferredoxina, 10 microlitros de ferredoxina-reductasa, y 1 microlitros de sustrato. Después de la adición del sustrato, la mezcla de inmediato se mezcla y se airea completamente. Después se agregan 5 microlitros de NADPH, y la mezcla se incuba a 30 °C durante 30 minutos. Después se agrega 1 mililitro de metil-t-butiléter a la mezcla de reacción, y se mezcla por completo. La mezcla se centrifuga durante 2 minutos a 14,000 rpm, y la fase de metil-t-butiléter se transfiere a un matraz de 10 mililitros, y se evapora al vacío por medio de un evaporador giratorio. El residuo se disuelve en 200 microlitros de acetonitrilo, y se transfiere a un frasco de muestra de HPLC. Después de la inyección de una muestra de 30 microlitros, apareció un pico a los 4.7 minutos, indicando la presencia de 4"-oxo-avermectina Bla. Se puede asignar una masa de 870 Da a este pico mediante espectrometría de masas de HPLC, que corresponde al peso molecular de la 4"-oxo-avermectina Bla. Cuando se analiza la formación del producto mediante espectrometría de HPLC y de masas de HPLC, aparece un segundo pico a los 2.01 minutos, que corresponde a al cetohidrato de 4"-hidroxi-avermectina. Esta es una indicación de que el extracto libre de células convierte la avermectina mediante hidroxilación hasta 4"-hidroxi-avermectina, a partir de la cual se forma la 4"-oxo-avermectina mediante deshidratación. La ferredoxina de espinaca puede ser reemplazada, por ejemplo, por ferredoxina a partir de la bacteria Clostridi um pasteurianum, o a partir del alga roja Porphyra umbilicalis, que también dan como resultado la conversión biocatalítica de la avermectina a 4"-oxo-avermectina.

Ejemplo 3: Cepas de Streptomyces Las cepas del género Streptomyces que se pueden utilizar en el proceso de acuerdo con la invención, y su relación de las cepas 1-1529 y R-922 de S, tubercidicus, basándose en un análisis de ADNr de 16s, se pueden ver en las siguiente tabla.: Ejemplo 4: Preparación de 4"-desoxi-4"-epi- (metilamino] avermectina Bl de la fórmula en donde R es metilo y etilo; 3 mililitros del ácido acético en 30 mililitros de metanol, se enfrían de 0°C a 5°C. Se agrega metilamina gaseosa hasta que el pH de la solución sea 9. A 8.25 mililitros de esta solución de metilamina, se les agrega, a 0°C, una solución de 1.0 gramos de 4"-oxo-avermectina Bl en 6 mililitros de metanol. La mezcla se deja calentar a temperatura ambiente, y después se agita durante 50 minutos adicionales a temperatura ambiente. Luego, se agregan 90 miligramos de borohidruro de sodio en 2.5 mililitros de etanol, y la mezcla resultante se agita durante otros 45 minutos. Se agregan 10 mililitros de acetato de etilo a la mezcla de reacción, la fase orgánica se extrae tres veces con una solución acuosa saturada de carbonato ácido de sodio, la fase orgánica se separa y se seca sobre sulfato de sodio. El disolvente se destila produciendo 4"-desoxí-4"-epi- (metilamino) -avermectina Bl . La pureza es mayor del 90%.

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Literatura de Patentes Citada: US-P-5,288,710 EP-A-736,252 EP-301,806 EP-401,029 DE-2,717,040 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula: caracterizado porque: R?~Rg representan, independientemente uno del otro, hidrógeno o un sustituyente; m es 0, 1, ó 2; n es O, 1, 2, ó 3; y los enlaces marcados con A, B, C, D, E, y F indican, independientemente unos de otros, que dos átomos de carbono adyacentes están conectados por un doble enlace, un enlace sencillo, un enlace sencillo y un puente de epóxido de la fórmula: H O H S N/ enlace sencillo y un puente de metileno de la ?ormuia : H2 incluyendo, donde sea aplicable, un isómero E/Z, una mezcla de isómeros E/Z, y/o un tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, caracterizado porque el proceso comprende 1) producir un compuesto de la fórmula: en donde R1-R7, m, n, A, B, C, D, E y F tienen los mismos significados que se dan para la Figura (I) anterior, en contacto con un biocatalizador que sea capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4", con el objeto de formar un compuesto de la fórmula en donde Ri, R2, R3, R4, R5, R6 R7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los significados dados para la fórmula (I); y 2) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (III) con una amina de la fórmula HN(R8)Rg, en donde R8 y R9 tienen los mismos significados como se dan para la fórmula (I), y el cual es conocido, en presencia de un agente reductor; y en cada caso, si se desea, convertir un compuesto de la fórmula (I) se puede obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, en un compuesto diferente de la fórmula (I) , o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, separar una mezcla de isómeros E/Z que se puedan obtener de acuerdo con el proceso, y aislar el isómero deseado, y/o convertir un compuesto libre de la fórmula (I) que se pueda obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, o un isómero E/Z o tautómero del mismo, en una sal, o convertir una sal, que se pueda obtener de acuerdo con el proceso o mediante otro método, de un compuesto de la fórmula (I) o de un isómero E/Z o tautómero del mismo, en el compuesto libre de la fórmula (I), o un isómero E/Z o tautómero del mismo, o en una sal diferente.

2. Un proceso APRA 1 preparación de un compuesto de la fórmula en donde Ri, R2, R3, R , Rs, Re, R7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los significados dados para la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el proceso 1) producir un compuesto de la fórmula en donde R?~R7, m, n, A, B, C, D, E y F tienen los mismos significados como se dan para la Figura (I) anterior, en contacto con un biocatalizador que sea capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4", manteniendo el contacto durante un tiempo suficiente para la reacción de oxidación, y aislar y purificar el compuesto de fórmula (II) -

3. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, para la preparación de un compuesto de la fórmula (I) , caracterizado porque n es 1; m es 1; A es un enlace doble; B es un enlace sencillo o un enlace doble, C es un enlace doble, D es un enlace sencillo, E es un enlace doble, F es un enlace doble, o un enlace sencillo y un puente de epoxi; o un enlace sencillo y un puente de metileno; Ri, R2 y 3 son H; R es metilo; R5 es alquilo de C1-C10, cicloalquilo de C3-C8 o alquenilo de C2-C10; R6 es H; R7 es OH; R8 y Rg son independientemente cada uno entre si H; alquilo de Cx-C?o o. acilo de C?-C?0; o juntos forman -(CH2)q-; y q es 4, 5 ó 6.

4. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, para la preparación de un compuesto de la fórmula (I), caracterizado porque n es 1; m es 1; A, B, C, E y F son un enlace doble; D es un enlace sencillo; Ri, R2, y R3 son H; R4 es metilo; R es butilo secundario o isopropilo; R6 es H; R7 es OH; R8 es metilo, R9 es H .

5. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, para la preparación de la sal de benzoato de 4"-desoxi-4"-N-metilamino-avermectina B?a B?b .

6. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el biocatalizador es un microorganismo.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el biocatalizador se selecciona del grupo que consiste de a) un microorganismo vivo, en la forma de células vegetativas, células en reposo, o células secadas por congelación, b) las esporas del microorganismo, c) un microorganismo muerto, de preferencia en una forma parcialmente desintegrada, es decir, con la pared celular/membrana celular permeabilizada mecánicamente o químicamente o mediante secado por pulverización, d) extractos crudos de los contenidos celulares del microorganismo, y e) una enzima que convierte los compuestos de la fórmula (II) en compuestos de la fórmula (III) .

8. Un proceso de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque el microorganismo es un representante del genero Streptomyces .

9. Un proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el microorganismo es una cepa de Streptomyces seleccionada del grupo que consiste en Streptomyces tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus, y Streptomyces kasugaensis .

10. Un proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el microorganismo es la cepa Streptomyces R-922, depositada bajo el número de acceso DSM-13136.

11. Un proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el microorganismo es la cepa Streptomyces 1-1529, depositada bajo el número de acceso DSM-13135.

12. Un proceso para producir un compuesto de la fórmula (III) , caracterizado porque comprende las siguientes etapas (1) producción de células mediante inoculación de un medio nutriente que promueva el crecimiento celular con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de la fórmula (II) a un compuesto de la fórmula (III) ; (2) cosecha de las células después de crecer. (3) disolución de un compuesto de la fórmula (II), en un disolvente adecuado, (4) adición de la solución de la etapa (3) a un medio de reacción que no promueva la proliferación celular, (5) adición de las células de la etapa (2) al medio de reacción de la etapa (4) , (6) revolver o agitación de la mezcla de reacción de la etapa (5) en presencia de aire, (7) separación de las células del medio, (8) extracción del sobrenadante y de las células con disolventes apropiados, (9) concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (8) , (10) purificación de un compuesto de la fórmula (III), contenido en el extracto (9) mediante cromatografía o cristalización.

13. Un proceso para producir un compuesto de fórmula (III), caracterizado porque comprende las siguientes etapas : (1) disolución de un compuesto de la fórmula (II), en un disolvente adecuado, (2) adición de la solución de la etapa (1) a un medio nutriente que promueva el crecimiento celular, (3) inoculación del medio nutriente de la etapa (2) con precultivos de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III) ; (4) cultivo de un microorganismo capaz de convertir un compuesto de fórmula (II) a un compuesto de fórmula (III) ; (5) separación de las células a partir del medio, (6) extracción del sobrenadante y de las células con disolventes apropiados, (7) concentración de las fases de disolvente orgánico de la etapa (6) al vacío, (8) purificación de un compuesto de la fórmula (III), contenido en el extracto (7) mediante cromatografía o cristalización.

14. Un proceso de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque el compuesto de la fórmula (II) es avermectina, y el compuesto de la fórmula (III) es 4"-oxo-avermectina. Resumen de la Invención El objeto de la invención es un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula en donde Ri-Rg representan, independientemente uno del otro, hidrógeno o un sustituyente; m es 0, 1, 6 2; n es 0, 1, 2, ó 3; y los enlaces marcados con A, B, C, D, E, y F indican, independientemente unos de otros, que dos átomos de carbono adyacentes están conectados por un doble enlace, un enlace sencillo, y un puente de epóxido, o un enlace sencillo y un puente de metileno, incluyendo, donde sea aplicable, un isómero E/Z, una mezcla de isómeros E/Z, y/o un tautómero del mismo, en cada caso en forma libre o en forma de sal, cuyo proceso comprende, vi ?li 1) poner un compuesto de la fórmula: R?-R7, m, n, A, B. C, D, E, y F tienen los mismos significados como se dan para la fórmula (I) anterior, en contacto con un biocatalizador que sea capaz de oxidar específicamente el alcohol en la posición 4", con el objeto de formar un compuesto de la fórmula VSI?, en donde Ri, R2, R3, R, R5, Re, R7, m, n, A, B, C, D, E, y F tienen los significados dados para la fórmula (I) ; Y 2) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (III) con una amina de la fórmula HN(R8)R9, en donde R8 y Rg tienen los mismos significados como se dan para la fórmula (I) , y el cual es conocido, en la presencia de un agente de reducción . siz.