KR20080018880A

KR20080018880A - 리보플라빈의 발효 생산 시에 영양 배지로서 용해 처리되는바이오매스의 재활용

Info

Publication number: KR20080018880A
Application number: KR1020077028427A
Authority: KR
Inventors: 울리케 벡케르; 카를하인즈 브레트즈; 우도 콜레르
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-02-28
Also published as: WO2006131240A3; EP1731617A1; US20090061491A1; DE112006001407A5; WO2006131240A2; CN101238220A

Abstract

본 발명은 발효 과정 중에 바이오매스(biomass)를 재활용하는 방법에 관한 것으로, 이 방법에서 발효 산물의 생산 중에 생성되는 바이오매스는 특수한 방법에 의해서 처리되어 시스템으로 재순환된다. 상기 처리된 바이오매스는 비타민, 특히 비타민 B2의 발효 생산을 위한 발효 과정 중에 배지 성분으로서 사용될 수 있다.

Description

리보플라빈의 발효 생산 시에 영양 배지로서 용해 처리되는 바이오매스의 재활용{RECYCLING OF BIOMASSES SUBJECTED TO LYSIS AS NUTRIENT MEDIUM ON FERMENTATIVE PRODUCTION OF RIBOFLAVIN}

한편, 비타민을 포함하여 상업적으로 값비싼 다수의 산물들은 발효 방식으로 생산된다. 그 한 가지 예는 모든 박테리아, 동물 및 식물을 위한 필수 비타민으로서 인정되는 비타민 B2(리보플라빈)다. 리보플라빈을 자체적으로 합성할 수 있는 식물 및 박테리아와 달리, 예컨대 척추 동물과 같은 고등 동물의 경우에 리보플라빈은 영양 섭취에 의해서 제공될 수밖에 없다.

발효 과정이 종료된 후에는, 통상적으로 제일 먼저 발효 산물이 예컨대 바이오매스와 같은 다른 성분들로부터 격리되어 상황에 따라 추가로 정제(clean-up) 과정을 거치게 되는데, 이와 같은 정제 과정은 발효 산물의 수율에 손실을 야기할 수도 있다. 생성되는 바이오매스가 비록 에너지를 매우 풍부하게 함유한다 하더라 도, 상기 바이오매스는 대부분 폐기물로 간주하여 더 이상 활용되지 않으며, 상기 바이오매스의 폐기(저장, 퇴비화, 소각) 처리를 위해서는 상당한 비용 및 자원이 투입되어야만 한다.

공지된 발효 방법에서의 또 다른 단점은, 원료를 배양 배지에 공급함으로써 야기되는 발효 과정 자체의 고비용이다. 따라서, 미생물의 성장을 개선하기 위하여 예를 들어 효모 추출물이 사용된다.

본 발명의 과제는, 한편으로는 비용 및 자원을 절감시키지만, 또 다른 한편으로는 발효 산물의 최상의 수율 및 순도를 보장해주는 개선된 발효 방법을 개발하는 것이다.

놀라운 사실은, 처리된 바이오매스를 발효 과정 중에 배지 성분으로서 사용하면("바이오매스의 재활용") 효모 추출물을 추가할 필요가 더 이상 없다는 것이다. 또한, 처리 과정 중에 선택되는 조건들에 의해서는 발효 산물의 순도 및 수율도 높아질 수 있다.

본 발명은 특별히 발효 과정 중에 바이오매스를 재활용하는 방법에 초점을 맞추고 있다.

본 경우에 "바이오매스의 재활용"이라는 용어 그리고 "재활용된 바이오매스"라는 용어는 바이오매스가 처리되어 재순환되거나 혹은 다시 사용된다는 의미로서 사용된다. 발효 중에 생성되는 바이오매스가 적절한 조건하에서 처리됨으로써, 결국 상기 바이오매스는 시스템으로, 즉 발효 과정으로 다시 공급(재순환)될 수 있다. 이때 상기 처리 과정은 단리(isolation) 및 분해(decomposition) 작용 그리고 경우에 따라서는 추가의 세척 단계 및 농축 단계를 포함한다. 재활용된 바이오매스는 통상적으로 미생물의 성장을 개선할 목적으로 배양 배지에 첨가되는 다른 배지 성분들을 대체할 수 있다. 상기 재활용된 바이오매스로 대체될 수 있는 성분의 한 가지 예는 효모 추출물이다.

본 발명은 또한 재활용된 바이오매스의 사용에 의해서/사용 중에 예컨대 비타민과 같은 발효 산물들을 발효 생산하는 방법과도 관련이 있다.

이 방법은 발효 방식으로 생산되는 모든 비타민에 적용될 수 있다. 선호되는 비타민은 비타민 B-복합체 또는 비오틴이다. 선호되는 비타민 B-복합체는 리보플라빈, 판토텐산, 티아민, 엽산 및 피리독신이며, 그들의 염 형태 및 유도체도 포함된다. 특히 바람직한 비타민은 예컨대 리보플라빈-인산염과 같은 유도체를 포함한 리보플라빈이다. 본 발명의 의미에 따른 산물, 즉 발효 방식을 통해 생산된 비타민은 "발효 산물"로서도 명명된다.

비타민을 생산하기 위한 본 발명에 따른 발효 방법은 회분식(batch)-방법, 유가식(fed-batch)-방법, 연속적인 또는 반(semi)-연속적인 방법으로 실행될 수 있다. 상기 발효 방법은 예를 들어 미생물의 성장을 위해서 그리고 발효 산물의 생산을 위해서 반드시 필요한 모든 기질들을 함유하는 적합한 배지 내에 미생물을 집어넣음으로써 미생물, 특히 재조합 미생물의 세포를 적절한 성장 조건하에서 배양하는 과정을 포함할 수 있다. 상기 시딩(seeding)된 배지는 예를 들어 온도, pH 및 산소 공급과 같이 바이오매스의 최상의 성장 그리고 발효 산물의 축적을 가능케 하는 소정의 물리-화학적 파라미터들에 의존한다. 사용된 미생물 그리고 생산될 산물에 따라 상기 파라미터들은 심하게 변동될 수 있다. 따라서, 예를 들어 발효 과정은 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 진행될 수 있다. 상기 파라미터들을 경험적으로 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

발효 과정이 종료된 후에 결과적으로 얻어지는, 특히 무엇보다도 바이오매스 및 원하는 (세척되지 않은) 발효 산물을 포함하는 세포 추출물은 예를 들어 발효 액체 배지(broth)로부터 단리되고, 더 나아가서는 분해되는데, 예를 들어 소위 "다운스트림-프로세싱(Downstream-Processing)"에서 부가적으로 처리될 수 있다. 상기 단리 방법 및 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 발효 산물은 배지 및 예를 들어 미생물과 같은 다른 성분들로부터 단리될 수 있다. 본 출원서의 의미에서 볼 때 "단리"라는 용어는, 예를 들면 산물이 예컨대 여과, 원심 분리 및/또는 추출에 의해서 세척되거나 또는 적어도 부분적으로 세척된다는 뜻으로 이해된다. 그 다음에 이어지는 산물의 세척은 예를 들어 수성 용매로부터 유기 용매로의 재결정화를 통해서 또는 당업자에게 공지된 추가의 방법들, 말하자면 예컨대 이온 교환 방법, "크기 배제"("Size-Exclusion") 방법 또는 소수성 상호 작용을 통한 크로마토그래피 방법을 적용함으로써 이루어질 수 있다.

결정의 형태로 배양 배지 내부에 침전되는, 발효 방식으로 생산된 리보플라빈의 경우에는, 발효 액체 배지로부터의 단리 과정이 원심 분리에 의해서 이루어질 수 있다. 그 경우 리보플라빈 결정은 공지된 방식으로 정제되며, 상기 정제 과정과 관련해서는 EP 730034 A1호 또는 브렛첼 등의 "Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 22, 19-26"을 참조할 수 있다.

발효 산물 및 바이오매스를 포함한 세포 추출물과 연관된 "정제", "분해" 그리고 "처리"라는 용어는 본 출원서에서 동의어로 사용된다.

발효 과정으로부터 결과적으로 얻어지는 세포 추출물을 처리하기 위한 공지된 방법들은 예를 들어 물리적, 화학적 또는 생물학적 분해 방법들이다. 화학적 분해는 예를 들어 강한 산 또는 염기, 용매 또는 세정제를 사용하는 처리 과정을 포함한다. 물리적 분해의 경우에는, 예컨대 초음파 또는 압력(고압 균질화)을 이용하는 기계적인 방법들과 예컨대 삼투압 충격(osmotic shock), 원형질 분리(plasmolysis), 냉동(freezing)/해빙(unfreezing) 또는 가열 분해 반응(thermolysis)과 같은 비-기계적인 방법들이 구별된다. 생물학적 방법들은 효소, 항생 물질, 파지(phage) 또는 자가 용해(autolysis)를 이용한 처리를 포함한다.

발효가 이루어진 후에 진행되는 본 발명에 따른 세포 추출물 처리 과정은 물리적, 화학적 또는 생물학적 분해에 의해서 실행될 수 있다. 바람직한 과정은 자가 용해이다. 본 발명의 의미에서 볼 때 "세포 추출물"이라는 용어는 발효 과정으로부터 결과적으로 얻어지는 세포 추출물과 관련이 있으며, 상기 추출물은 세척되지 않은 상태로 존재하고, 다른 무엇보다도 바이오매스 및 발효 산물을 함유할 수 있다.

예를 들어 자가 용해를 이용한 세포 추출물의 처리는 발효 과정에 바로 이어서 이루어질 수 있는데, 다시 말하자면 분해는 발효 액체 배지로부터 직접 이루어진다. 이 경우에 처리될 세포 추출물은 다른 무엇보다도 바이오매스 및 발효 산물 을 함유하고 있다. 발효 과정이 종료된 후에, 그리고 예를 들어 자가 용해에 의해서 바이오매스의 처리가 이루어지기 전에, 우선 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 바이오매스를 발효 액체 배지로부터 단리시키고 그리고/또는 농축시키는 방식도 또한 가능하다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에서 세포 추출물의 처리는 발효 과정에 바로 이어서, 즉 예컨대 리보플라빈과 같은 발효 산물을 사전에 분리하지 않은 상태에서 이루어진다. 이 경우 상기 처리, 바람직하게 자가 용해 과정은 발효 과정에 바로 이어서 유도된다. 이와 같은 자가 용해 과정의 유도는 예를 들어 온도 변동에 의해서 이루어질 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서 세포 추출물의 처리는 자가 용해에 의해서 실시된다. 자가 용해 기간은 미생물 및 조건들에 따라 약 1시간 내지 여러 날이 될 수 있으며, 특히 약 8시간, 16시간 또는 24시간이 될 수 있다. 세포 건조 질량(ZTM)의 측정에 의해서 용해 정도(lysis degree)가 검출될 수 있으며, 이 경우 상기 ZTM 값이 일정하게 유지되면 자가 용해 과정은 종료될 수 있다. 측정된 ZTM이 낮을수록, 용해 정도는 그만큼 더 높다. ZTM을 측정하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 자가 용해 과정은 약 24시간 동안 실행되는 것이 바람직하다.

자가 용해에서 적합한 pH-값은 약 6.0 내지 약 9.0일 수 있고, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.5, 특히 약 6.5 내지 약 8일 수 있다. 약 6.5 내지 약 7.5의 pH-값이 특히 바람직하다. 최상의 결과는 pH-값이 6.5 및 7.5인 경우에 얻어진다.

자가 용해에서 적합한 온도는 약 30℃ 내지 약 60℃의 범위에서, 바람직하게 는 약 30℃ 내지 약 50℃의 범위에서, 특히 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 45℃의 범위에서 변동될 수 있다. 최상의 결과는 온도가 약 40℃ 내지 약 45℃인 경우에 얻어진다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에서, 세포 추출물의 처리는 자가 용해에 의해, pH-값이 약 6.5 내지 약 8.0이고 온도가 약 35℃ 내지 45℃인 상태에서 약 24시간 동안 실시된다.

본 발명의 추가의 한 바람직한 실시예에서, 상기 처리는 자가 용해에 의해, pH-값이 약 6.5 내지 약 7.5이고 온도가 약 40℃ 내지 45℃인 상태에서 약 24시간 동안 실시된다.

세포 추출물의 처리 상태를 최상으로 만들기 위하여, 자가 용해는 예컨대 가수 분해 효소 또는 단백질 분해 효소(내부 단백질 분해 효소 및 외부 단백질 분해 효소)와 같은 추가 효소의 존재하에서 실시될 수 있다. 효소의 양은 예를 들어 ZTM의 1.5%일 수 있으며, 첨가는 예를 들어 자가 용해의 시작부터 약 1시간 내지 5시간 후에 이루어질 수 있다. 그밖에 조건들이 일정한 경우에, ZTM은 상기 효소의 첨가에 의해서 50%까지만큼 떨어질 수 있다. 또한, 이와 같은 과정은 용해 정도를 50%까지만큼 상승시키고, 용해 시간을 단축하며, 산물의 품질을 높여주는데, 다시 말하자면 발효 산물의 순도를 더 높여준다(전술된 바와 같이 자가 용해 과정이 발효 과정에 바로 이어서 실시되는 경우에). 상기와 같은 단백질 분해 효소들의 비-제한적인 예들로서는 알칼라아제(Calbiochem), 아마노(Amano) N, 우미마자임(Umimazyme), 아마노 P, 펩티다아제 R(모두 Amano Enzyme Europe Ltd) 또는 프로 모드(Promod)(Biocatalysts Ltd)가 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 상기 처리는 자가 용해에 의해, pH-값이 약 6.5 내지 약 7.5이고 온도가 약 40℃ 내지 45℃인 상태에서, 첨가된 단백질 분해 효소들을 사용하는 가운데 약 24시간 동안 실시된다. 바람직한 것은 내부 단백질 분해 효소와 외부 단백질 분해 효소로 이루어진 혼합물이다.

재활용되는 바이오매스(처리된 바이오매스 추출물)는 비타민을 발효 생산하는 경우에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 발효 산물의 생산을 가능케 하는 여러 가지 조건하에서 그리고 적절한 배지 내에서 이루어지는 미생물 발효 과정 및 (b) 특히 자가 용해에 의해서 이루어지는 바이오매스 처리 과정을 포함하는, 비타민, 특히 리보플라빈을 발효 생산하는 방법과 관련이 있다.

바이오매스는 전술된 바와 같은 방식으로 생산된, 잔류 바이오매스 및 발효 산물을 함유하는 세포 추출물로부터 단리/분리된 다음에 계속해서 정제 및/또는 농축될 수 있다. 용해물(lysate)의 정제 과정은 예를 들어 크로스 플로우 여과(crossflow filtration) 방식에 의해서 이루어질 수 있고, 농축은 예를 들어 다운 플로우 증발기(downflow evaporator)에 의해서 이루어질 수 있다. 이와 같이 생산된 처리된 바이오매스 추출물은 발효 공정에 배지 성분으로서 주입되어/다시 사용될 수 있다.

본 발명의 의미에서 볼 때, 자가 용해에 의해서 처리된 (바이오매스) 추출물은 "용해물"로도 언급된다. 상기 처리된 바이오매스 추출물 또는 용해물은 통상적 으로 발효 과정에서 성장 개선의 목적으로 배양 배지에 첨가되는 효모 추출물의 대체물로서 발효 공정에 주입될 수 있다. 이와 같은 내용이 의미하는 바는, 전술된 바와 같은 상응하는 처리 후에 바이오매스가 재활용된다는 것이다. 당업자에게 공지된 효모 추출물의 탄소 함량으로부터, 예를 들어 CHN-원소 분석기에 의해서 상기 처리된 바이오매스 추출물의 탄소 함량이 결정된다. 따라서, 효모 추출물은 배양 배지 내에서 처리된 바이오매스 추출물과 1:1의 비율로(탄소 함량을 기준으로) 대체된다.

따라서, 본 발명은 아래와 같은 단계들을 포함하는, 비타민, 특히 리보플라빈을 발효 생산하는 방법과 관련이 있다:

(a) 비타민의 생산을 가능케 하는 여러 가지 조건하에서 그리고 적절한 배지 내에서 이루어지는, 비타민을 생산하기 위하여 미생물을 발효시키는 단계,

(b) 특히 자가 용해에 의해서 세포 추출물을 처리하는 단계로서, 이 경우 본 처리 단계는 상기 발효 단계에 바로 이어지며,

(c) 비타민 및 잔류 바이오매스를 포함하는 발효 액체 배지로부터 상기 처리된 바이오매스를 단리시키는 단계,

(d) 상기 처리된 바이오매스를 정제 및 농축하는 단계, 및

(e) 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 가운데 상기 (처리된) 바이오매스 추출물을 발효 공정으로 재순환시키는 단계로서, 이 경우 상기 발효는 배양 배지 내에 효모 추출물을 첨가하지 않은 상태에서 실시된다.

상기 단계 (a) 내지 (e)와 연관된 바람직한 실시예들은 아래와 같이 기술된 다.

본 발명을 실시하기에 적합한 미생물은 전술된 산물, 예컨대 리보플라빈을 발효 생산하기에 적합한 모든 미생물들일 수 있다. 상기 미생물들은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 시아노박터(Cyanobacter), 스트렙토마이시스(Streptomyces) 및 코리네박테리움(Corynebacterium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 재조합 미생물들 및 비-재조합 미생물들이 사용될 수 있다.

리보플라빈을 생산하기 위해 적합한 미생물의 한 가지 예는 바실러스(Bacillus)이다. 바실러스(Bacillus) 속(屬)의 포자를 형성하지 않는 미생물, 특히 비. 섭틸리스(B. subtilis)가 바람직하며, 비. 섭틸리스(B. subtilis) RB50이 특히 바람직하다. 대부분은 비. 섭틸리스(B. subtilis) RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m(퍼킨스 등, J. Ind. Microbiol Biotechnol 22:8-18, 1999)이 특히 바람직하다.

비. 섭틸리스(B. subtilis) RB50은 1989년 5월 23일에 미합중국 일리노이주 퍼리아(Peoria)에서 열린 "Agricultural Research Culture Collection(NRRL)"에서 부다페스트 협약에 따라 NRRL B-18502라는 번호로 기탁되었다. 플라스미드(Plasmid) pRF69는 미합중국 매릴랜드주 로크빌에서 열린 "American Type Culture Collection(ATCC)"에서 부다페스트 협약에 따라 ATCC 68338이라는 번호로 기탁되었다. 플라스미드 pRF93은 EP 0 821 063호에 기재되어 있다.

한 실시예에서, 본 발명은 아래와 같은 단계들을 포함하는, 리보플라빈을 생 산하는 방법과 관련이 있다:

(a) 리보플라빈의 생산을 가능케 하는 여러 가지 조건하에서 그리고 적절한 배지 내에서 비. 섭틸리스(B. subtilis) 속(屬)의 미생물을 발효시키는 단계,

(b) pH-값이 약 6.5 내지 약 7.5고 온도가 약 45℃인 상태에서 약 24시간 동안 자가 용해하는 단계,

(c) 상기 처리된 바이오매스를 리보플라빈 및 잔류 바이오매스를 포함하는 발효 액체 배지로부터 단리시키는 단계,

(d) 상기 처리된 바이오매스를 정제 및 농축하는 단계, 및

(e) 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 가운데 비. 섭틸리스(B. subtilis)-용해물을 발효 공정으로 재순환시키는 단계로서, 이 경우 상기 발효는 배양 배지 내에 효모 추출물을 첨가하지 않은 상태에서 실시된다.

본 발명의 추가의 한 양상에서는 리보플라빈을 생산하기 위한 한 가지 방법이 청구되고 있는데, 상기 방법에서는 전술된 바와 같이 자가 용해에 의해서 발효 액체 배지를 처리함으로써, 얻어진 리보플라빈의 수율 및 순도가 증가할 수 있다.

특별히 본 발명은 아래와 같은 단계들을 포함하는, 리보플라빈을 생산하는 방법과 관련이 있다:

(b) 단계 (a)로부터 얻어지는, 발효 방식으로 생산된 리보플라빈을 포함하는 발효 액체 배지의 자가 용해 단계,

(c) 리보플라빈을 단리시키는 단계, 및 상황에 따라서는

(d) 리보플라빈을 세척하는 단계.

리보플라빈을 단리 및 세척하는 방법들은 위에 기술되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 자가 용해는 전술된 바와 같은 조건하에서 이루어진다. 상기 방법에 의해서는, 수율이 2%, 4%, 6%, 10%, 20% 또는 30%까지 달성될 수 있으며, 이때 리보플라빈 농도는 단계 (b) 전에 그리고 단계 (b) 후에 측정된다. 이 경우에는 자가 용해 과정이 발효 과정에 바로 이어서 이루어지는 방법이 바람직하다.

한 바람직한 실시예에서는, 아래와 같은 단계들을 포함하는, 리보플라빈을 생산하는 방법이 청구된다:

(b) 단계 (a)로부터 얻어지는 발효 액체 배지가 약 6.5 내지 약 7.5의 pH-값 및 약 45℃의 온도에서 약 24시간 동안 자가 용해되는 단계,

(c) 처리된 바이오매스 및 리보플라빈을 나머지 성분들로부터 분리하는 단계,

(d) 리보플라빈의 세척 그리고 상기 처리된 바이오매스의 정제 및 농축 단계, 및

임의적으로는, 위에서 상세하게 기술된 바와 같이, 다양한 효소들을 사용함으로써 자가 용해 과정이 지지될 수 있다.

본 발명의 추가의 한 양상은 생합성 생산의 마지막 단계에서 비. 섭틸리스(B. subtilis)로 촉매 반응하는 리보플라빈-합성 효소(synthase), 즉 6,7-디메틸-8-리비틸루마진(DMRL)이 리보플라빈으로 변환되는 과정과 관련이 있다. 전술한 방법은 리보플라빈-합성 효소-활성을 높여준다. 상기 활성은 예를 들어 DMRL이 리보플라빈으로 변환되는 변환율에 의해서 측정될 수 있다.

전술된 리보플라빈 생산 방법도 발효 산물의 순도를 높여주며, 이와 같은 순도 상승은 예를 들어 리보플라빈 결정 속에 있는 환원된 DNA-함량에 의해서 측정될 수 있다. 이와 같은 내용은 특히 재조합 미생물에 의해서 리보플라빈을 생산하는 경우에 중요하다. 예컨대 PCR과 같은 DNA-함량 측정 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.

실시예

실시예 1: 배양 기술 및 분석 방법

리보플라빈을 생산하기 위하여, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 균주 RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m을 글루코오스-제한된 배지 내에서 유가식(Fed-Batch) 발효에 의하여 48시간 동안 배양하였다(퍼킨스 등, J. Ind. Microbiol Biotechnol 22:8-18, 1999).

바이오 건조 질량(BTM)을 참조해서 바이오매스의 성장을 결정하였다. 발효 액체 배지를 실온으로 냉각함으로써 상기 바이오 건조 질량을 결정하였다. 이어서 10 ml를 사전에 개량된 시약 유리 내부에 제공하고, 11000g에서 원심 분리하였다. 초과 부분을 파기하였고, 펠릿을 95℃에서 일정한 중량에 도달할 때까지 적어도 24시간 동안 건조시켰다. 사전에 결정된 GTM(전체 건조 질량)으로부터 리보플라빈 함량(HPLC에 의한 리보플라빈 함량의 결정)을 감산함으로써 BTM을 산출하였다.

실시예 2: 압력을 이용한 추출물 생산(물리적 분해)

리보플라빈-발효 과정(실시예 1 참조)이 종료된 후에 얻어진 발효 용액을 4250g에서 원심 분리하였고, 바이오매스를 단리시켰다. 상기 얻어진 바이오매스를 50 mM의 나트륨-칼륨-인산염 완충액(pH 7.0)으로 세 번 세정하였고, 단백질 함량 그리고 BTM을 검사했다. 상기 바이오매스를 고압 균질화 장치(Microfluidizer M110-EH, Microfluides, Newton, MA, USA) 내부에서, 1900 bar의 압력하에 3회 순환 중에 분해하였다(2-노즐 시스템, 제 1 노즐: 200 ㎛; 제 2 노즐: 100 ㎛).

실시예 3: 자가 용해를 이용한 추출물 생산(생물학적 분해)

자가 용해의 최적 온도를 검출하기 위하여, 실시예 1에서 얻어진 발효 용액을 20 g/l를 초과하는 리보플라빈-함량으로 교반에 의해 그리고 공기를 도입하지 않은 상태로, 7.0의 일정한 pH-값에서 그리고 표 1에 기재된 온도에서 24시간 동안 배양(incubating)하였다. 이어서 BTM을 참조하여 용해 정도를 결정하였다(표 1 참 조). 40-45℃의 온도에서 최상의 자가 용해 정도에 도달했다.

자가 용해의 최적의 pH-값을 검출하기 위하여, 실시예 1에서 얻어진 발효 용액을 20 g/l를 초과하는 리보플라빈-함량으로 교반에 의해 그리고 공기를 도입하지 않은 상태로, 40℃의 일정한 온도에서 그리고 표 1에 기재된 pH-값에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 BTM을 참조하여 용해 정도를 결정하였다(표 2 참조). 6.5 내지 7.5의 pH-값에서 최상의 자가 용해 정도에 도달했다.

상기와 같은 결과들로부터, 40 내지 45℃의 온도에서 최상의 자가 용해를 위한 6.5 내지 7.5의 pH-설정값을 얻어냈다. 방부제를 사용하지 않은 상태에서 오염의 위험을 최소화하기 위하여, 이후로는 온도를 45℃로 설정하였다.

추가의 한 연속 테스트에서는, 다양한 단백질 분해 효소의 존재하에서 자가 용해 과정을 테스트하였고, 용해 정도에 미치는 상기 자가 용해의 영향을 검사하였다.

다음과 같은 효소들을 사용하였다: 알칼라아제(Calbiochem, San Diego, CA, USA), 아마노 N, 아마노 P, 우미마자임, 펩티다아제 R(모두 Amano Enzyme Europe Ltd, Chipping Norton, U.K.) 그리고 프로모드 194P(Biocatalysts Ltd, Treforest, U.K.).

전술된 바와 같이 6.5 또는 7.5의 pH에서(45℃, 24시간), 표 3에 따라 진술된 효소들이 제공된 상태에서 또는 제공되지 않은 상태에서 자가 용해 과정을 실시하였다. 이어서 BTM을 참조하여 용해 정도를 결정하였다. 용해 공정 중에 내부 단백질 분해 효소를 첨가함으로써, 용해 정도를 최대 20%만큼 상승시켰다(표 3 참조).

실시예 4: 재순환된 바이오매스 추출물을 이용한 리보플라빈 생산

실시예 3에서 얻어진 추출물을 크로스 플로우 여과(컷오프 10 kDa) 방식에 의해서 부유물로부터 세척하였고, 실시예 1에서와 마찬가지로 발효 과정에 주입하였으며, 이때 탄소 균형 상태를 근거로 하여 효모 추출물을 1:1의 비율로 대체하였다. 이 경우에는 아래와 같은 결과들을 얻어냈다(표 3 참조).

Claims

발효 과정으로부터 얻어지는 세포 추출물을 처리하여 정제된 바이오매스를 발효 과정으로 재순환하는 단계를 포함하는,

발효 공정 중에 바이오매스를 재활용하는 방법.
제 1 항에서 생산된 재활용된 바이오매스를 사용하여 비타민을 발효 생산하는 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 비타민은 리보플라빈, 판토텐산, 비오틴, 티아민, 피리독신 및 엽산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 리보플라빈이 바람직한 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포 추출물의 처리가 물리적, 화학적 또는 기계적인 용해에 의해서, 특히 자가 용해에 의해서 이루어지는 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 자가 용해는 약 6.0 내지 약 9.0, 특히 약 6.0 내지 약 8.5의 pH-값에서, 그리고 약 30℃ 내지 약 60℃, 특히 약 30℃ 내지 50℃의 온도에서, 약 24시간 동안 실시되는 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 자가 용해는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH-값에서 그리고 약 40℃ 내지 약 45℃의 온도에서 약 24시간 동안 실시되는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 바이오매스의 처리가 첨가된 단백질 분해 효소의 존재하에 자가 용해에 의해서 실시되는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 바이오매스의 처리가 세척 단계를 중간에 삽입하지 않은 상태에서 발효 과정에 바로 이어서 이루어지는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) 비타민의 생성을 가능케 하는 여러 가지 조건하에서 그리고 적절한 배지 내에서 비타민, 특히 리보플라빈을 생산하기 위하여 미생물을 발효시키는 단계,

(b) 상기 발효 과정에 바로 이어지며, 특히 자가 용해에 의해서 바이오매스를 처리하는 단계,

(c) 상기 처리된 바이오매스를 비타민 및 잔류 바이오매스를 포함하는 발효 액체 배지로부터 단리시키는 단계,

(d) 상기 처리된 바이오매스를 정제 및 농축하는 단계, 및

(e) 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 가운데 상기 처리된 바이오매스 추출물을 발효 공정으로 재순환시키는 단계를 포함하며, 이 경우 상기 발효는 배양 배지 내에 효모 추출물을 첨가하지 않은 상태에서 실시되는 방법.
제 9 항에 있어서,

상기 방법이 리보플라빈을 생산하기 위함이며, 상기 단계 (b)의 처리는 자가 용해에 의해서, 약 6.5 내지 약 7.5의 pH-값 그리고 약 45℃의 온도에서 약 24시간 동안 이루어지는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,

발효 과정에 주입된 미생물들은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 시아노박터(Cyanobacter), 스트렙토마이시스(Streptomyces) 및 코리네박테리움(Corynebacterium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 바실러스(Bacillus)가 바람직한 방법.
제 11 항에 있어서,

발효 과정에 주입된 미생물이 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 특히 포자를 형성하지 않는 비. 섭틸리스(B. subtilis)인 방법.
제 12 항에 있어서,

발효 과정에 주입된 미생물이 비. 섭틸리스(B. subtilis) RB50, 특히 RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m인 방법.
제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) 리보플라빈의 생산을 가능케 하는 여러 가지 조건하에서 그리고 적절한 배지 내에서 비. 섭틸리스(B. subtilis) 속(屬)의 미생물을 발효시키는 단계,

(b) 단계 (a)로부터 얻어지는 발효 액체 배지가 약 6.5 내지 약 7.5의 pH-값 및 약 45℃의 온도에서 약 24시간 동안 자가 용해되는 단계,

(c) 처리된 바이오매스 및 리보플라빈을 나머지 성분들로부터 분리하는 단계,

(d) 리보플라빈의 세척 그리고 상기 처리된 바이오매스의 정제 및 농축 단계, 및

(e) 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 가운데 비. 섭틸리스(B. subtilis)-용해물을 발효 공정으로 재순환시키는 단계를 포함하며, 이 경우 상기 발효는 배양 배지 내에 효모 추출물을 첨가하지 않은 상태에서 실시되는 방법.