JPH03133377A

JPH03133377A - 糖転移活性の強い耐熱性α―ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法

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Publication number: JPH03133377A
Application number: JP27124489A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Hashimoto; 博之橋本; Chie Yagishita; 柳下　千栄; Masahiro Tokuda; 徳田　正弘
Original assignee: Honen Corp
Current assignee: Honen Corp
Priority date: 1989-10-18
Filing date: 1989-10-18
Publication date: 1991-06-06
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP2688782B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、キャンディダ・ギリエルモンディー（（：ａ
ｎｄｉｄａ　　ｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）菌による
糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびそ
の複合物の製造法に関するものである。

［従来の技術］ α−ガラクトシダーゼは、動物組織、微生物、高等植物
の種子等に広く存在し、α−Ｄ−ガラクトシド結合を加
水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触媒す
る酵素である。この酵素は、１９世期末にメリビオース
を加水分解する酵素（メリビアーゼ）として酵母から抽
出されて以来、種々の起源のものが単離され研究されて
きた。特に利用面では、甜菜糖からの蔗糖の分離精製工
程において、蔗糖の結晶化を妨げるラフィノースを、蔗
糖とガラクトースに効率的に加水分解することを目的と
して研究された。しかしながら、α−ガラクトシダーゼ
の糖転移作用については、基質となるα−ガラクトシル
基をもつ化合物の安価な供給源が知られていなかった為
にほとんど研究されていなかった。一方、近年大豆オリ
ゴ糖を中心にα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖がビフ
ィズス因子など新たな機能性をもつものとして注目され
ている。このようなオリゴ糖あるいは配糖体の合成法と
しては、糖転移酵素又は加水分解酵素の糖転移作用を利
用する方法や縮合反応を利用する方法が開発されている
。このうち、糖転移作用を利用する方法は、縮合反応に
よるオリゴ糖あるいは配糖体の合成とは違い、特定の結
合様式を持ったオリゴ糖あるいは配糖体のみを特異的に
合成できる１例えば、β−フラクトフラノシダーゼによ
るフラクトオリゴ糖、β−ガラクトシダーゼによる３−
ガラクトオリゴ糖の製造がある。同様に、α−ガラクト
シダーゼの糖転移作用を利用してα−ガラクトシル基を
持ったオリゴ糖や配糖体等の有用化合物を製造する方法
が考えられる。この場合、高い収率を得る為には糖転移
活性の強い酵素が必要である。

方、縮合反応は加水分解反応の逆反応で、どの加水分解
酵素も利用できる。しかし、高い収率を得る為には糖濃
度を上げる必要があり、糖濃度を上げる為には溶解度の
点から反応温度を高める必要があることから耐熱性をも
つ酵素が望ましい。

糖転移活性の強い微生物起源のα−ガラクトシダーゼと
しては、ビクノボラス・シナバリヌス（旺匹■二朋ｃｉ
ｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）由来のものや本発明者らが発見
したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のものが知
られているが、前者は高い耐熱性も合せ持つが基質や反
応生成物によって強く阻害を受け、後者は基質や生成物
による阻害を受けないが耐熱性は低い。そこで、本発明
者らは、このα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の合成
とその有効利用を目的として土壌から糖転移活性の強い
耐熱性α−ガラクトシダーゼを生産する菌の分離を試み
た。

［発明が解決しようとする問題点１したがって本発明の目的は、糖転移活性が強く且つ耐熱
性に優れたα−ガラクトシダーゼを安価に且つ大量に生
産し得る方法を提供することにある。

［問題点を解決する手段］本発明者らは、広く自然界より強いα−ガラクトシル基
の転移作用を持つ耐熱性α−ガラクトシダーゼを生産す
る微生物を求めて検索した結果、キャンディダ・ギリエ
ルモンディーの一菌株が、糖転移活性の強い耐熱性α−
ガラクトシダーゼおよびその複合物を培養上清中（菌体
外分泌型）あるいは菌体（細胞吸着型）に蓄積する事実
を見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明のα−ガラクトシダーゼおよびその複
合物の製造方法は、キャンディダ・ギリエルモンディー
を培養することにより、培養物から糖転移活性の強い耐
熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物を得ること
を特徴とするものである。

なお、糖転移活性が強く、耐熱性に優れたα−ガラクト
シダーゼとは、基質としてメリビオースを用いた場合、
基質濃度が１Ｍ前後でもほとんど基質阻害を受けず、生
じたガラクトースの８０％以上を転移することができる
活性を有すると共に、ｐＨ４，５の条件下で６０℃にて
６０分間以上加熱してもほとんど失活しないα−ガラク
トシダーゼをいう。

以下に本発明を更に具体的に説明する６本発明において
使用するキャンディダ属菌は酵母に類似する不完全菌類
で、醸造場等糖類の多い場所に混入菌として見出される
ものである。

本発明に用いられるキャンディダ・ギリエルモンディー
は、この菌に属するもので、糖転移活性の強い耐熱性α
−ガラクトシダーゼを生産する能力を有する菌株ならい
ずれも使用できる。具体的には、その例示菌株としてキ
ャンディダ・ギリエルモンディ−（Ｃａｎｄｉｄａ　駐
圭ｕ−ｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　）　　Ｈ−４０４が有効に
利用される。キャンディダ・ギリエルモンディーやその
テレオモルフ（Ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｌであるビヒア・
ギリエルモンディー止１ｃｈｉａ　　ｕｉｌｌｉｅｒｍ
ｏｎｄｉｉ）起源のα−ガラクトシダーゼが報告されて
いるが、これは糖転移活性が極めて弱いα−ガラクトシ
ダーゼであって、本発明の如く強い糖転移活性を有する
ものについては全く報告されていない。また、生産され
たα−ガラクトシダーゼが、本閑によるα−ガラクトシ
ダーゼの様に多成分によって構成されるものであること
も報告されていない。

次に、本発明者らの見出したー菌株の菌学的性質を示す
と、下記の通りである。

形態学的性質（ａ）細胞の形態液体培地（４８時間）楕円形で単独とかたまりで存在。

（２−３）　ｘ　　（４−５）μｍ寒天培地（４８時間）楕円形、長楕円形で単独に存在。

（２−３１Ｘ　　（７−６１μｍ（ｂ＋培地での生育液体培地（２１日）毛屑状でない沈殿物を形成。皮膜を形成しないかリング
状の皮膜を形成寒天斜面培地（２１日）クリーム色で光沢があり表面は滑らか、偏平状ｆｃｌ菌子体の形成ＣＭＡ上ではチェリーブラツサムタイプの仮性菌子体が
良く発達した。

ＰＤＡ上では菌子を生じなかった。

ｆｄｌ無性胞子の形成射出胞子、分節胞子、芽胞を形成しない。

（ｅ）有性胞子の形成有性胞子を形成しない。

（ｆｌ生理的性質 ■各炭素源に対する発酵性グルコース　　　　　　　　　＋ガラクトースマルトースシュークロース　　　　　　　＋ラクトースメリビオースラフィノース　　　　　　　　−（泡の形成）イヌリンスターチメレジトーストレハロース α−メチル−〇−グルコシドセロビオース ■炭素化合物の同化性グルコースガラクトースソルボースシュークロースマルトースセロビオーストレハロースラクトースメリビオースラフィノースメレジトースイヌリン瀾性澱粉Ｄ−キシロースし−アラビノースＤ−アラビノースＤ−リボースＬ−ラムノースエタノールグリセロールエリスリトールノビトールガラクチトールＤ−マンニトールＤ−ソルビトール α−メチルグルコシドサリシン乳酸コハク酸クエン酸イノシトールグルコノラクトングルコサミンメタノールキシリトール＋＋＋＋＋ ■窒素化合物の同化性硫酸アンモニウム　　　　　　＋塩酸エチルアミン　　　　　　＋カダベリン　　　　　　　　　＋硝酸カリウムリジン　　　　　　　　　　　十〇その他の生理的性質油脂の分解性虫酸性３７℃での生育アルブチンの分解ウレアーゼ活性澱粉の生成ビタミン無添加培地での生育］００ｐｐｍシクロへキシミド添加時の生育１１０００
ｐｐシクロへキシミド添加時の生育５０％グルコース存
在下での生育６０％グルコース存在下での生育１０％塩化ナトリウム存在下での生育１％酢酸存在下での生育＋＋＋＋＋＋以上の諸性状なザ　イースト　ア　クキソノミック　ス
タデイ　第３版（１９８４）の記載と照合することによ
り、本菌がキャンディダ・ギリエルモンディーであるこ
とを確認し、キャンディダ・ギリエルモンディー（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　赳１１ｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　）　　Ｈ−４
０４と命名した。なお、本菌は、微工研菌寄第１１０２
６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１０２６）として、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。

本発明のキャンディダ・ギリエルモンディーにより糖転
移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼ（本酵素）を
生産するためには、通常、メリビオース、ラフィノース
、スタキオース、ガラクトマンナンやその分解物単独、
あるいは、蔗糖、粉飴、ラクトース、澱粉に誘導物質と
してメリビオース、ラフィノース、スタキオース、ガラ
クトマンナンやその分解物を添加したものを炭素源とし
て用い、全脂あるいは脱脂大豆、コーンステイープリカ
ー、ポリペプトン、ソイ［・ン、あるいは、酵母エキス
のような有機または無機の窒素源を含む液体培地を用い
て、２０〜４０°Ｃで、２〜１４日間程度、好気的に培
養すればよい。

本発明で得られる糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクト
シダーゼ複合物とは、後述するａ　−ガラクトシダーゼ
ＩとＴＩの２つの成分から構成されるものであるが、菌
体外と菌体の両方に生産される酵素である為、液体培地
の場合、培養後濾過、あるいは、遠心分離によって得た
培養上清を粗酵素液としてそのまま利用できると共に、
菌体そのものを酵素剤として利用できる。

培養上清から得た粗酵素液は、そのまま使用できるが、
例えば硫安沈殿法や溶媒沈殿法並びに限外濾過法等の公
知の方法により、粗酵素濃縮液を得ることができる。細
胞吸着型の酵素も、溶剤や界面活性剤処理のような公知
の方法により遊離の酵素とすることもできる。なお、こ
の細胞吸着型酵素は、菌体に吸着されているものと菌体
内に保持されているものとがある。

このようにして得られた本発明のα−ガラクトシダーゼ
複合物（本酵素複合物）は、以下に示すような諸性質を
有する。

（１）糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼの
多成分性本酵素複合物は、イオン交換クロマトグラフィー（東ソ
ー■製、ＤＥＡＥ−トヨバール６５０Ｍ）によって２つ
の成分に分離され、それぞれ等電点によって区別された
。

α−ガラクトシダーゼエは等電点６．１６、α−ガラク
トシダーゼＩＩは等電点６．２１であった。また、両酵
素のゲル濾過クロマトグラフィー（東ソー（掬製、トヨ
パール１（Ｗ−５５Ｆ　）を用いたゲル濾過法による分
子量はほぼ同じで２．７Ｘ　１０’に相当した。

（２）作用本酵素複合物は、終濃度４．４ｍＭのα−ガラクトシル
基を持つ化合物にオルトニトロフェニル−〇−ガラクト
シド〉バラニトロフェニル−〇−ガラクトシド〉メリビ
オース〉スタキオース〉ラフィノースの順でよく作用し
た。

（３）最適作用ｐＨ本酵素複合物の最適作用ｐＨ範囲は、ｐＨ４〜５に認め
られた。

（４）安定ｐＨ範囲グリシン−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液の下で４０℃
１時間放置した場合の本酵素複合物の安定ｐＨ範囲は、
ｐＨ３，０〜９．５であった。

（５）最適作用温度囲本酵素複合物の最適作用温度は、約７５°Ｃであった。

（６）熱安定性本酵素複合物を０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の
下で６０°Ｃで６０分間加熱処理した結果、はぼ１００
％の活性を維持した。

（７）糖転移活性 α−ガラクトシル基の供与体としては、本酵素が基質と
するα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体
全てが利用できる。ここでは、基質としてメリビオース
を用いて本酵素の糖転移活性を測定した。各種の濃度の
メリビオースに本酵素複合物を作用させ、反応によって
生じた遊離のグルコースとガラクトースをベーリンガー
・マンハイム社（西ドイツ）のＦキット（商品名）を用
いて定量した。その結果、第１図に示すように本酵素複
合物は、基質濃度が５０ｍＭ前後から基質の切断によっ
て生じたガラクトースを転移反応に利用し始め、１Ｍ前
後でもほとんど基質阻害を受けず生じたガラクトースの
８０％以上を転移するという強い転移活性を有していた
。本酵素複合物の代りに菌体そのものを酵素剤として用
いて同様の実験を行なった結果を第２図に示す。なお、
第１図および第２図おいて横軸は基質濃度を、縦軸は生
成物の量を示し、＋はメリビオースの分解によって生じ
たグルコース量を、口はガラクトース量を示す。すなわ
ち、両者の差が糖転移作用に使われたガラクトース量を
示している。

（８）受容体特異性基質として１％パラニトロフェニル−〇−ガラクトシド
、受容体として４％のガラクトース、グルコース、マン
ノース、キシロース、フラクトース、シュークロース、
グリセリンに本酵素複合物を作用させ反応生成物を薄層
クロマトグラフィーにより確認した。その結果、この受
容体の全ての場合に転移生成物が確認され、本酵素は広
い受容体特異性を持つことが確認された。

（９）精製法遠心分離により得た培養上清を２倍量のエタノールを用
いて溶媒沈殿した。その沈澱を緩衝液に溶解した溶液を
イオン交換クロマトグラフィー（東ソー用製、　ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール６５０Ｍ　）に供し二つの活性画分に分
離した。そこで、その活性画分をａ−ガラクトースーゼ
エとＩ＋と名付は別々に精製した。まず、　０．４飽和
硫安存在下で疎水クロマトグラフィー（東ソー（［η製
、ブチルトヨバール６５０λ１）、続いテケルクロマト
グラフィ−（東ソー（掬製、トヨパールｌ　Ｗ　−５５
Ｆ　）を行ない各々の精製酵素標品を得た。この酵素標
品はディスクゲル電気泳動的に均一であった。

（１０）α−ガラクトシダーゼの活性測定法１０ｎ＋ｌ
Ｊパラニトロフエニル−α−ガラクトシド０．２ｍｌと
４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）　０．２ｍｌにα−
ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍ１を加えて４０°ＣＩ
Ｏ分間反応させた。反応後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム　
０．５ｍｌを加えて反応を止め、遊離したバラニトロフ
ェニール量を分光光度計にて４００ｎｍの吸光度を計る
ことにより測定した。酸素活性１単位は、この条件下で
１分間に１μｍｏｌｅのパラニトロフェノールを生成す
る酵素量と定義した。

［発明の効果］以上のとおり、本発明の糖転移活性の強い耐熱性α−ガ
ラクトシダーゼ複合物は基質濃度が１４前後でもほとん
ど基質阻害を受けず、生じたガラクトースの８０％以上
を転移するという強い糖転移活性をもっていた。また、
受容体特異性もガラクトース、グルコース、マンノース
、キシロース、フラクトース、シュークロース、グリセ
リンと非常に広く、その酵素的性質がこれまで知られて
いる酵素に較べて優れていた。また、本酵素複合物は６
０°Ｃ６０分間の加熱処理においてもほとんど失活しな
いという高い耐熱性を有していた。さらに、本酵素の生
産菌体は菌体そのものを酵素剤として利用可能であった
。また、本酵素複合物は前述のようにα−ガラクトシダ
ーゼＩとＩＩから構成されているが、これらの各成分を
単独で使用しても同様な効果を得ることができた。この
ような本酵素の特徴は、α−ガラクトシダーゼの糖転移
作用や縮合反応を利用したα−ガラクトシル基を含むオ
リゴ糖あるいは配糖体の合成において著しい技術進歩を
もたらしたものである。

［実施例］次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら
に限定されるものではない。

実施例１１％　メリビオース、３％　ポリペプトン、０．５％　
酵母エキス、０．０５％に２ＨＰ０４．０．０１％Ｍｇ
５Ｏ＜・７Ｈ２０，０，０１％ＫＣＩを含む液体培地（
ｐＨ７，０）　６０ｍ１を５００ｍ１坂ロフラスコに入
れ、常法によりオートクレーブにより殺菌後キャンディ
ダ・ギリエルモンディー（Ｃａ　ｎ　ｄ　ｉ　ｄ　ａ　
ｑ　−ｍｏｎｄｉｉ）　Ｈ−４０４を接種し、３０°Ｃ
で４日間振盪培養した。培養後、遠心分離により除菌し
、得られた培養上清についてα−ガラクトシダーゼ活性
を測定した。その結果、培養上清中の酵素活性は培養液
１．ｍ１当り　０．８単位であった。また、細胞吸着型
の酵素活性は湿菌体１ｇ当り約３５単位であった。

実施例２実施例１において、メリビオースに代えて、１％溶性澱
扮に０１％メリビオースを誘導源として添加した培地に
キャンディダ・ギリエルモンディ−（Ｃａｎｄｉｄａ　
　ｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）　Ｈ−４０４を植菌し
、３０°Ｃで４日間振盪培養した。培養後遠心分離によ
って得た培養上清についてα−ガラクトシダーゼ活性を
測定した。その結果、培養上清中の酵素活囲は培養液１
ｍｌ当り　０．６単位であった。また、細胞吸着型の酵
素活性は湿菌体１ｇ当り約３０単位であった。

実施例３実施例１により得られた培養液から遠心分離により得た
培養上清を、まず、２倍量のエタノールを用いて溶媒沈
殿した。その沈澱を緩衝液に溶解した溶液をイオン交換
クロマトグラフィー（東ソー■製、　ＤＥＡＥ−１−ヨ
パール６５０Ｍ　）に供し二つの活性画分に分離した。

そこで、その活性画分をα−ガラクトシダーゼＩとＨと
名付は別々に精製した。まず、０．４飽和硫安存在下で
疎水クロマトグラフィー（東ソー（用製、ブチルトヨパ
ール６５０に（）、続いてゲルクロマトグラフィー（東
ソー（掬製、トヨバール旧Ｖ−５５Ｆ）を行ない各々の
精製酵素標品を得た。この精製法によりａ−ガラクトシ
ダーゼ■の比活性は培養上清の約６７００倍上昇し、そ
の収率は約４２％であった。また、α−ガラクトシダー
ゼＩＩは比活性が培養上清の約５４００倍上昇し、その
収率は約２６％であった。

実施例４１ｇのメリビオースと１ｇのシュークロースを含むｐＨ
４，５の酢酸緩衝液５ｍｌに実施例３によって得られた
α−ガラクトシダーゼエ精製酵素標品５単位を添加し、
６０℃で２００時間反応せた。反応液を１０分間煮沸加
熱し酵素を失活させた後、反応液１ｇｇを濾紙にスポッ
トしｎ−ブタノール：ピリジン：水＝６　：　４　：　
３の組成の溶媒系で４重展開後、フロログルシン法によ
るケトース呈色を行なうと、ラフィノースに相当する位
置にスポットが検出された。この反応液を活性炭カラム
クロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖類な吸着させた後
、エチルアルコールの濃度勾配により溶出させた。この
３量体画分を集め、濃縮し凍結乾燥標品１．１ｇを得た
０本標品は、［ａｌ　α−ガラクトシダーゼで加水分解
するとガラクトースとシュークロースを等モル生成する
こと、（ｂ）β−フラクトシグーゼで加水分解すると、
等モルのメリビオースとフラクトースを生成すること、
（Ｃ）α−ガラクトシダーゼとβ−フラクトシダーゼと
で加水分解するとガラクトース、グルコース、フラクト
ースを１モルずつ生成すること、ｆｄ）ペーパークロマ
トグラフィーの移動度がラフィノースと一致すること、
以上のことからラフィノースであると同定した。

実施例５ガラクトース７０ｇを含むｐＨ４，５の酢酸緩衝液１０
０ｍ１に実施例２によって得られた菌体（細胞吸着型酵
素２０単位）を加え、６０℃にて４８時間反応させた。

反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーにかけ、オリ
ゴ糖類を吸着させた後、エチルアルコールＯ％〜２０％
の濃度勾配により溶出させた。溶出液を濃縮乾燥して脱
水縮合生成物２０ｇを得た。この化合物は、酸で加水分
解するとガラクトースのみを生成し、ペーパークロマト
グラフィーの移動度からガラクトビオ−又と同定した。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は基質のメリビオースに対する本酵
素複合物の糖転移作用を示すグラフで、第１図は酵素に
培養上清の酵素複合物を使用し、第２図は酵素に菌体そ
のものを用いたときの結果を示す。第１図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）キャンディダ・ギリエルモンディー（￥Ｃａｎ￥
−￥ｄｉｄａ￥￥ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ￥）に
属する菌で糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダー
ゼを生産する能力を有する菌を培養することからなる糖
転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその
複合物の製造法。
（２）耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物が
キャンディダ・ギリエルモンディーの菌体外分泌型酵素
である請求項第（１）項記載の糖転移活性の強い耐熱性
α−ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法。
（３）耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物が
キャンディダ・ギリエルモンディーの細胞吸着型酵素で
ある請求項第（１）項記載の糖転移活性の強い耐熱性α
−ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法。
（４）耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物が
キャンディダ・ギリエルモンディーの細胞吸着型酵素と
菌体外分泌型酵素との混合物である請求項第（１）項記
載の糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼおよ
びその複合物の製造法。
（５）キャンディダ・ギリエルモンディーの菌株がキャ
ンディダ・ギリエルモンディーＨ−４０４株である請求
項第（１）項ないし第（４）項のいづれか１項記載の糖
転移活性の強いα−ガラクトシダーゼおよびその複合物
の製造法。