FI85160C - B-fruktosyltransferas-enzym och foerfarande foer framstaellning av fruktosid fraon en fruktosacceptor. - Google Patents

Description

85160 /?-fruktosyylitransferaasi-entsyymi ja menetelmä fruktosidin valmistamiseksi fruktoosin akseptorista /9-fruktosyltransferas-enzym och förfarande för framställning av fruktosid frän en fruktosacceptor 5

Keksinnön kohteena on organismista B.subtilis eristetty /3-fruktosyyli-trans feraas i-entsyymi.

10

Keksinnön kohteena on myös menetelmä fruktosidin valmistamiseksi fruktoosin akseptorista.

Tämä keksintö liittyy menetelmään fruktosyylidisakkaridien valmistami-15 seksi, erityisesti halosakkaroosimakeuttajien, erityisesti 4,l',6'-tri-kloori- 4.1'.6'-trideoksiealaktosakkaroosin (tunnettu aineena TGS), entsymaattisen reaktion avulla.

4,1',6'-trikloori-4,1'6'-trideoksigalaktosakkaroosi on mahdollinen 20 makeuttaja, joka on esitetty ja vaadittu muiden kloorisakkaroosijohdan-naisten yhteydessä UK-patentissa n:o 1543167. Vastaavia aineita, jossa

6-hydroksiryhmä on eetteröitynyt tai puuttuu, on esitetty julkaisussa EP 0103479A ja GB 2127806A. Analogeja, jotka sisältävät muita halo-geenisubstituentteja, on esitetty julkaisussa GB 2104063A. Yksi mene-25 telmä TGS:n valmistamiseen on esitetty ja vaadittu julkaisussa GB

2079749A ja US 4 380 476. Tämä menetelmä sisältää sakkaroosin erään 6-esterin, tai pääasiallisesti sakkaroosin 6-esteriä sisältävän seoksen valmistamisen, ja sen jälkeisen selektiivisen 6-substituoidun aineen kloorauksen. Sen jälkeisen 6-aseman de-esteröinnin tuloksena on aine 30 TGS. Käytännössä sakkaroosin 6-esterin saaminen hyvällä saannolla on vaikeata varsinkin kemiallisia menetelmiä käyttämällä. Olemme nyt havainneet, että TGS:n valmistaminen 6-substituoidusta sakkaroosijohdannaisesta voidaan suorittaa ilman vaikeuksia käyttämällä entsyymiin perustuvaa reaktiota aloittamalla vastaavasta 6-substituoidusta glukoo-35 sista ja fruktosidisokerista, sellaisen 6-substituoidun sakkaroosin valmistamiseksi, jossa ei ole muita sakkaroosijohdannaisia substituoi-— tuna muihin asemiin, ja joka on helposti erotettavissa lähtöaineista ja glukoosista.

2 85160

Kyseinen entsyymi on fruktosyylitransferääsi. Fruktosyylitransferaasit ovat hyvin tunnettuja entsymologiassa. Eräs käyttökelpoinen entsyymi on ns. levaanisakkaraasi, joka vastaa levaanin tuottamisesta, joka on polyfruktoosijohdannainen, sakkaroosin tai raffinoosin hajoituksessa.

5 Normaalisti levaanisakkaraasi toimii niin, että se hajottaa glukoosi-fruktoosi-sidoksen sakkaroosiksi ja muuttaa fruktoosin akseptorisoke-riksi, esim. itse sakkaroosiksi. Tämä prosessi toistuu niin, että fruk-toosiketjuja muodostuu. Jos sakkaroosin lisäksi on muita sokereita läsnä, esim. D-ksyloosi, levaanin muodostaminen estyy, tai ainakin 10 vähenee, ja sen sijasta fruktoosi muuttuu toiseksi kilpailevaksi sokeriksi, joka käyttäytyy akseptorina uuden fruktosidin valmistamiseksi. Uusi fruktosidi toimii myös donorina, joten käytännössä on käytetty suurta donori ylimäärää tasapainon kääntämiseksi haluttuun suuntaan. Hestrin ja Avigad ovat julkaisussa Biochem.J.69(19581 388-398 näyttä-15 neet, että sokerit eräässä sokeriryhmässä toimivat hyvinä fruktoosiak-septoreina ja pyrkivät näin estämään levaanin muodostumisen; toiset olivat pelkkiä akseptoreja; kun taas kolmas luokka oli ilmeisen inertti ja epäonnistui levaanin muodostumisen ehkäisemisessä. Viimeisessä kategoriassa oli D-glukoosi-6-fosfaatti. Mitkään muut lehdessä viitatut 20 sokerit eivät olleet johdannaisia. Glukoosi-6-fosfaatin reaktio sakkaroosin kanssa mutantista Bacillus subtilis kantaa Marburg 168 johdetun entsyyminen länsäolossa on kuitenkin esitetty (Kunst et ai, Eur.- J.Biochem. 42, 611-620 (1974)). Nämä, ja muut tekijät (esim. Dedonder, Methods Enxymol., 8, 500-505) käyttivät aina suurta fruktoosidonorimää-25 rää (esim. sakkaroosia) suhteeseen akseptoria, esim. 5:1-10:1, ja matalaa konsentraatiota, joka ei olisi käyttökelpoinen teollisessa mittakaavassa. Samankaltaista reaktiota on esitetty UK-patenttihakemuksessa 2046757A, jossa erilaisia aldoosilähtöaineita reagoidaan sakkaroosin tai raffinoosin kanssa levaanisakkaraasin läsnäollessa, joka on johdet-30 tu mikro-organismiryhmästä, joka sisältää mikro-organismit Actinomyces viscosus ja B.subtilis (kanta ATCC 6051, siis Marburg-kanta). Patenttihakemuksessa aldoosi on kuitenkin aina ei-johdettu sokeri ja käytetty moolisuhde donoria/akseptori on 1;5, ilmeisesti ketjua muodostavien reaktioiden minimoimiseksi.

35

II

3 85160

Keksinnön mukainen entsyymi on pääasiassa tunnettu siitä, että se hydrolysoi donorifruktosyylioligosakkaridin tai -disakkaridin, joka sisältää substituoimattoman 0-fruktosyylirenkaan, joka liittyy aldoosin anomeeriseen hiiliatomiin l->2 -liitoksella ja muuntaa näin vapautetun 5 fruktosyyliosuuden akseptorialdoosiksi fruktosyylidisakkariidin saamiseksi päätuotteena, jolloin entsyymillä on kyky muodostaa 6-substituoi-tuja sakkaroosijohdannaisia päätuotteena, kun akseptorialdoosi on 6-substituoitu glukoosi, jolloin entsyymi ei tuota merkittäviä määriä alkoholissa saostuvia oligo- tai polyfruktooseja aldoosiakseptorin 10 läsnäollessa tai poissaollessa, jolloin entsyymin Κ,,-arvo sakkaroosia varten on ainakin 0,1 M aldoosiakseptorin poissaollessa ja sen ollessa olennaisesti ilman invertaasiaktiivisuutta.

Keksinnön mukainen menetelmä on taas pääasiassa tunnettu siitä, että 15 akseptori on valittu seuraavista: glukoosin, 6-deoksiglukoosin, ksyloo-sin ja galaktoosin 6-esterit ja 6-eetterit tai 1-alkyyliglukosidista tai sen tioli-analogista tai alkoholista käsittelemällä akseptorin ja fruktosyylidi- tai oligosakkaridin vesiliuosta jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisella fruktosyylitransferaasilla ja erottamalla frukto-20 sidi reaktioseoksesta.

Olemme siis nyt havainneet, että 6-johdettuja sakkaroosijohdannaisia voidaan valmistaa reagoimalla vastaava 6-johdettu glukoosi tai galak-toosi fruktosyylitransferaasin kanssa sakkaroosin tai raffinoosin tai 25 stakyoosin läsnäollessa. Tuotteen 4,1' ja 6'-asemat voidaan sitten halogenisoida ja, jos halutaan, 6-johdettu ryhmä voidaan poistaa vaaditun halogeenisokerin saamiseksi. Lähtöreaktio etenee hyvin, ilman että mitään levaania muodostuu.

30 Tämän keksinnön mukaisesti esitämme menetelmän halodioksisakkaroosin tai galaktosakkaroosijohdannaisen valmistamiseksi, joiden yleinen kaava ____ on 35 4 85160 ν° ιΗ2Γ

Υλλλ/ ΝιιιιΟμηΚ^ ^•••'CHjY

HO '*0Η of Sh jossa A on vetyatomi tai CH2X-ryhmä, jossa X on vetyatomi, tai hydroksi-tai alkoksiryhmä ja Y on halogeeniatomi, joka sisältää aldoosin reak-10 tion, jonka aldoosin yleinen kaava on & HO-( ).....OH <Il> )-\

H(f 'OH

20 jossa A on vetyatomi tai CH2X-ryhmä, jossa X on vetyatomi tai alkoksiryhmä tai suojattu hydroksiryhmä, fruktosyylidi- tai oligosakkaridin kanssa fruktosyylitransferaasin läsnäolossa yhdisteen, jonka yleinen 25 kaava on

A\_o CH2°K

3o ^•""0,"'\^^N|"iCH;0H (IIII

m 0H OH OH

35 saamiseksi, jossa A on kuten määriteltiin kaavassa II; kaavan I-II mukaisen yhdisteen erottamisen; kaavan I-II mukaisen yhdisteen halo- 5 85160 genisoimisen ja, suojatun hydroksiryhmän suojan poistamisen kaavan I mukaisesta yhdisteestä, jossa A on CH2X ja X on hydroksiryhmä.

Keksinnön mukaisessa reaktiossa käytetty fruktosyylitransferaasi on 5 edullisesti johdettu organismeista B.subtilis tai Erwinla sp. (aikaisemmin tunnettu nimellä Aerobacter levanicum). B.subtilis on erityisen edullinen lähde ja jotkut lajit ovat hyvin helppoja kasvattaa suuremmassa mittakaavassa tavanomaisessa fermentaatiossa ja ne ovat täysin hyväksyttyjä teollisten entsyymien lähteinä (esim. a-amylaasit ja β-10 laktamaasit). Lisäksi, fruktosyylitransferaasi on pääasiallisesti solun ulkopuolinen entsyymi ja voidaan näin saada ja puhdistaa helpommin. On tärkeätä, että käytetyllä entsyymillä ei ole invertaasiaktiivisuutta. Tarpeen vaatiessa pitää käyttää selektiivistä invertaasi-inhibiittoria, kuten pi-hydroksimerkurobentsoaattia. B.subtilis-entsyvmi voidaan saada 15 B.subtilis nesteviljelmästä selektiivisellä saostuksella tai muilla sopivilla menetelmillä. Viljelmä voidaan esimerkiksi sentrifugoida solujen ja jätteiden poistamiseksi; saattaa 65 %:n kyllästymiseen asti ammoniumsulfaatilla; uudelleen sentrifugoida invertaasin poistamiseksi ja muiden proteiinijäännösten poistamiseksi ja viedä sitten noin 95 %:n 20 kyllästymiseen asti ammoniumsulfaatilla. Raaka levaanisakkaraasi seostetaan sitten, joka voidaan edelleen puhdistaa uudelleen liuottamalla fosfaatti-puskuriin ja dialysoida.

Valittu entsyymi on fruktosyylitransferaasi, joka on saatu organismista 25 B.subtilis NCIB 11871, vaikka kannat NCIB 11872 ja 11873 ovat myös mielenkiintoisia. Näistä laaduista saaduilla entsyymeillä on myös laajempi erityisyys ja voidaan siten käyttää helpommin 6-substituoituihin johdannaisiin.

30 Tämän keksinnön toisena kohteena esitetään fruktosyylitransferaasi, jonka Ka sakkaroosiin nähden on ainakin 0,1 M ilman akseptorialdoosia, ____ joka ei muodosta merkittäviä määriä alkoholiin seostettavaa ainetta fruktoosidonorista ilman akseptorialdoosin läsnäoloa ja johon läsnä olevat pinta-aktiiviset aineet eivät vaikuta, optinen aktivisuus on 35 noin 30°C ja on aktiivinen ainakin 20 minuuttia lämpötilaan 45°C asti.

6 85160

Mainitut kaksi vakiota (K) viitaten näihin entsyymeihin on K,,, Michae-lis-Menten vakio, joka on se ainekonsentraatio, jossa entsyymin reaktion nopeus on puolet maksimista (levanin valmistamiseksi jne.); Ki, inhibiittorivakio, joka on se inhibiittorikonsentraatio, jossa puolet 5 havaittavasta entsyymiaktivisuuden maksimi-inhiboimisesta muodostuu (levaanin tuottamiseksi).

Kannan NCIB 11871 entsyymin on noin 0,2 M sakkaroosille ilman aksep-torin läsnäoloa, kun taas organismista ”B.subtilis BS5”, (klooni 10 B.subtilis var. nigrasta) saadun Dedonderin levääni sakkaraasille ilmoitettu oli vain 0,02 M.

B.subtilis NCIB 11871, sekä kannat NCIB 11872 ja 11873 eivät ole organismin B,subtilis tyypillisiä kantoja. Tämä tarkoittaa, että ne täyt-15 tävät melkein kaikki kantaidentifioinnin vaatimukset, sekä klassillisilla testeillä (Berkley and Goodfellow, "The Aerobic Endospore-forming Bacteria: Classification and identification" (1981) Academix Press, London; Gordon, Haynes and Pang, "The Genus Bacillus". Agriculture Handbook No.427 (1973) U.S. Dept of Agriculture, Washington D.C.) ja 20 API 50 CHB ja API 20E systeemeillä (API system S.A, La Balme les Grol-tes - 38390 Montalieu Vercieu, France and see Logan et al. J.Appl.

Bact. 1978 pp 28-29). Näiden testien mukaan merkittävin ero useimpiin B.subtilis kantoihin nähden on se, että NCIB 11871 kanta on laktoosi-negatiivinen kanta, jonka happotuotanto ksyloosista vaihtelee. NCIB 25 11872 kanta on laktoosinegatiivinen ja antaa myös negatiivisia tuloksia D-mannoosin kanssa, melibioosin ja trehaloosin kanssa ja ONPG-reaktiol-la. NCIP 11873 kanta on laktoosipositiivinen ja antaa negatiivisia tuloksia D-mannoosin ja inuliinin kanssa.

30 Fruktosyylitransferaaseja, jotka on johdettu useasta ]J.subtilis- ja

Erwina sd-kannasta pidetään yleensä levaanisakkaraaseina; tämä tarkoittaa, että sakkaroosin läsnäollessa ne aiheuttavat levaanin tuottamisen, polyfruktoosiaine, joka on alkoholiin saostettavissa. Kun niitä käytetään fruktoosidisakkaridien valmistuksessa, tämä kilpaileva levaania 35 tuottava reaktio pitää estää, jos käyttökelpoista tuotetta aiotaan saada, siten näiden entsyymien rajoittamiseksi julkaisussa GB 2046757A

li 7 85160 reaktioseoksiin, joka sisältää suuria akseptorimolekyylimääriä. Tässä käytetyt B.subtilis NCIP 11871, 11872 ja 11873 entsyymit ovat kuitenkin paljon vähemmän taipuvaisia levaanin tuottoon. Sakkaroosin K,„ levaanin tuottamiselle on noin 0,2 M. Tämä on verrannollinen mainittuun Dedonde-5 rin (loc.cit.) BS5-kannan entsyymin Κ,,,-arvoon, joka on noin 0,02 M. Vaikka saman suuruisia akseptori- ja donorimolekyylikonsentraatioita käytetään ja kun sellaisia olosuhteita käytetään, jotka havaittiin edistävän korkean molekyylipainon omaavan levaanin synteesiä Tanaka B.subtilis entsyymillä (esim. levääni-valmisteen lisäys, sellaisen liu-10 oksen käyttäminen, jonka ionivahvuus on alhainen, ja reaktion suorittaminen matalissa lämpötiloissa (J.Biochem 90, 521, 1981), hyvin vähän korkeamolekyylistä levaania muodostuu. Vasta sen jälkeen, kun disakka-ridin huippumäärä on saavutettu, muodostuu polymeeri, jonka molekyyli-paino on keskisuuruinen. Lisäksi, toisin kuin todelliset levaanisakka-15 raasit, B.subtilis NCIB 11871 kannasta saatu entsyymi ei näytä katalysoivan epäsuhteista reaktiota (ei siis muuta matalamolekyylipainoisia oligosakkariideja korkeamolekyylipainoiseksi levaaniksi). Esimerkiksi trisakkaridia voidaan havaita, jota ei olisi läsnä, jos entsyymi katalysoisi tätä epäsuhteista reaktiota. Aerobacter levanicum (Sigma) or-20 ganismista saatua standardilevaania voidaan fraktioida kahdeksi huipuksi vastaten korkeaa ja keskisuurta molekyylipainoista ainetta. De-donder-entsyymin (loc.cit.) tasapainovakio (levääni ja glukoosi/sakka-roosi) on noin 3,6 x 10'2 lämpötilassa 37°C, jolloin muodostuu DP40-arvoista levaania. Juuri päinvastoin kannat NICB 11871, 11872 ja 11873 25 tuottavat entsyymiä, joka ei tuota merkittäviä alkoholiin saostettavia polysakkaridimääriä sakkaroosista yksinään, eikä edes kannan 11871 kasvavat solut tuota levaania. Näyttää siis siltä, että muodostunut fruktosyylitransferaasi ei ole tehokas 'levääni sakkaraasi' lainkaan. Tässä hakemuksessa sitä käytetään nimellä fruktosyylitransferaasi.

30

Reaktion fruktoosilähde voi olla mikä vain oligo- tai disakkaridi, joka sisältää edullisesti substituoimattoman 0-fruktosyylirenkaan aldoosin anomeerisen hiilen läheisyydessä sidoksella (1 -> 2) kuten sakkaroosissa (/9-D-fruktofuranosyyli α-D-glukopyranosidi), raffinoosissa (O-a-D-35 galaktopyranosyyli-(1 -> 6)-O-a-D-glukopyranosyyli-(1 -> 2)0-D-fruktof-uranosidi) tai stakyoosissa.

8 85160

Kaavan II mukainen 6-substituoitu aldoosilähtöaine voi suojattuna hyd-roksiryhmänä kantaa minkälaista vain subsituenttia 6-asemassa, joka on vastustuskykyinen sitä seuraavalle kloorausreaktiolle ja joka voidaan helposti poistaa 6-hydroksiryhmän vapauttamiseksi. 6-karboksyyliesterit 5 ovat edullisia, esim. 6-asetaatti tai bentsoaatti. Glukoosi 6-asetaat-tia voidaan helposti valmistaa erilaisilla menetelmillä (esim. Duff, J. Chem. Soc. p 4730-4 1957; Reeve et ai j. Amer. Chem. Soc., 79,6041-3; Frohwein et ai Nature p 153, 1960; Duff et ai. Nature p 103, 1957; ibid Biochem J. 515-520, 70, 1958).

10

Kaavan II mukaisen aldoosilähtöaineen 6-substituentti voi myös olla eetteri, kuten bentsyylieetteri, joka helposti voidaan poistaa hydro-genoinnilla tai alifaattinen eetteri, joka voi jäädä klooratun 6-eette-rin saamiseksi, kuten on esitetty julkaisussa GB 2127806A. Lähtöainees-15 sa voi myös olla esimerkiksi 4-kloorisubstituentti jo osittain klooratun disakkaridin saamiseksi esim. 4-kloori-4-deoksi-galaktoosi-6-asetaatti .

Fruktoosidonorin ja fruktoosiakseptorin välinen reaktio pitäisi tapahtua vesiväliaineessa, joka edullisesti on puskuroitu entsyymien opti-20 maaliseen pH-arvoon, siis pH-arvoon 5,4-6,0 optimaalisessa lämpötilassa, joka on noin 30°C. Nämä kaksi reaktanttia ovat yleensä vesiliukoisia ja entsyymi voidaan dispergoida yhteiseen liuokseen tai, edullisesti, sijoittaa liukenemattomaan kantajaan. Sisällyttäminen voidaan esimerkiksi suorittaa käyttämällä ioninvaihtohartsia, kuten DEAE-selluloosaa, 25 johon entsyymi on vahvasti absorboitunut. Monia muita sijoituskantajia voidaan käyttää, kuten esimerkiksi hiilimustaa kuten on esitetty julkaisussa US 4421850.

Fruktoosidonorin ja fruktoosiakseptorin välisellä suhteella reaktio-30 seoksessa on merkitystä; liian alhainen ja saanti vähenee; liian korkea ja mahdollista levääni-reaktiota ei ehkä estetä varsinkin, jos käytetään ainetta, jonka kiintoainepitoisuus on suuri. Yleensä havaitaan, että moolisuhde (donori/akseptori), joka on noin 2:1, on optimaalinen. Reaktio voidaan suorittaa melko korkeissa konsentraatioissa, koska 35 Huokoisuus- tai viskositeettiongelmia ei ole. Menestyksellinen reak-tanttikonsentraatio on yleensä noin 40 %, vaikka korkeampia konsent- 9 85160 raattloita voidaan käyttää, riippuen reaktanttien liukoisuudesta, esimerkiksi jopa 75 %, kun kyseessä on glukoosi 6-asetaatti. Entsyymin konsentraatio riippuu luonnollisesti aktiivisuudesta, mutta noin 50 ml/litran suuruiset arvot ovat olleet onnistuneita, kun käytetään vesi-5 liuosta, joka sisältää entsyymiä, joka on johdettu 33 ml’.sta B.subtllis NCIB 11871 viljelmää per ml liuosta.

Kaavan III mukaisen yhdisteen sen jälkeinen klooraus voidaan suorittaa käyttämällä mitä vain reagenssia, joka pystyy vaihtamaan hydroksin 10 klooriksi selektiivisesti 4,1'- ja 6'-asemissa. Valittu reagenssi on Vilsmeier-reagenssi, joka on saatu reagoimalla dialkyyliamidia kloo-rausreagenssin kanssa, esim. dimetyyliformamidia fosforipentakloridin, fosgeenin tai tionyylikloridin kanssa. Sakkaroosi 6-estereiden kloorauksen yksityiskohtainen kuvailu on julkaisuissa GB 2079749A ja US 15 4 380 476. Samoin 6-esterin suojan poisto on samassa julkaisussa, jossa käyttämällä esimerkiksi natriummetoksidia metanolissa, 6-bentsyyli-eetteriryhmä voidaan poistaa hydrauksella.

Lisäksi esitetään menetelmä fruktosidin valmistamiseksi antamalla fruk-20 toosiakseptorialkoholin (erityisesti aldoosi) reagoida fruktosyylidi-tai oligosakkaridin kanssa fruktosyylitransferaasin läsnäollessa, jonka Κ„ sakkaroosiin nähden on ainakin 0,1 H ilman akseptorialdoosin läsnäoloa; joka ei muodosta merkittäviä määriä alkoholiin saostettavaa ainetta fruktoosidonorista ilman akseptorialdoosin läsnäoloa; ja johon 25 läsnäolevat pinta-aktiiviset aineet eivät vaikuta, jolla on optinen aktivisuus lämpötilassa noin 30°C ja on aktiivinen ainakin 20 minuuttia lämpötilaan 45°C asti. Fruktoosiakseptori voi yleensä olla mikä vain pyranoosi- tai fyranoosisokeri tai substituoitu sokeri, joka halutaan sisällyttää fruktosyylidisakkaridiin. Esimerkkejä ovat 6-substituoidut 30 glukoosijohdannaiset, kuten glukoosi 6-esterit ja eetterit ja 6-deoksi-D-glukoosi, (TGS:n ja sen makeiden analogien valmistuksessa), tai mikä vain aine, joka on esitetty käytettäväksi levaanisakkaraasin kanssa UK-patenttihakemuksessa GB 2046757A (mutta katso alle). Fruktosyylidi- tai oligosakkaridi voi sisältää sakkaroosia, raffinoosia tai stakioosia.

35 10 851 60

Kannan B. subtills 11871 entsyymin substraattierityisyyttä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset aldoosin C-6-asemassa ei heikennä kannan B.subtilis (Marburg) fruktosyylitransferaasiaktiivisuutta paitsi, jos polaarinen ryhmä, 5 kuten fosfaatti- tai karboksyylihapporyhmä, on substituoituna tässä asemassa. Erityisesti on esitetty, että seuraavat muutokset akseptorin C-6-asemassa eivät inhiboi levaanisakkaraasia: pelkistys (L-galaktoosi L-fukoosiksi); OH- ryhmän korvaaminen O-glukosyylillä (D-glukoosi iso-maltoosiksi); ja hydroksialkyyli H:n sijasta C:en (D-galaktoosi D-gly-10 sero- D-galaktoheptoosiksi) (Hestrin et ai, 1958). Vain molekyylit, joissa ei-substituoitu fruktoosiryhmä on sidottu alkosyyliryhmään samalla glykosidisellä sidoksella kuin sakkaroosissa, voivat toimia dono-rina, joten sakkaroosi-6-asetaatti voi toimia fruktoosidonorina sakkaroosin tai raffinoosin sijasta.

15 Tämän keksinnön mukaisen uuden entsyymin tapauksessa hyvin suuri ryhmä sokereita kuitenkin toimii enemmän tai vähemmän fruktoosin akseptoreina sakkaroosista tai rafflnoosista. Useimmat akseptoreista ovat heksooseja tai pentooseja kuten riboosi, sorboosi, lyksoosi, arabinoosi ja ksyloo-20 si. Ainoa pentoosi, jonka tiedetään reagoivan, on ksyloosi. Useimmat reaktiivisista akseptoreista voivat muokata pyranoosirenkaan konfiguraatiota, vaikka myös ksylitoli ja glukonihappo näyttää reagoivan. Kun läsnä on rengasrakenne, sen pitää sisältää happea tai rikkiä, ja näin ollen inositaali ei reagoi, mutta 5-tioglukoosi reagoi.

25

Kaikki hiiliasemissa 3 ja 4 tapahtuvat rakennemuutokset, esim. galak-toosi, 3-0-metyyliglukoosi, 4-kloorigalaktoosi ja D-arabinoosi, glukoosin sijasta eivät aiheuta kvalitatiivista reaktiivisuutta. Hiiliaseman 1 substituentit, esim. metyyli-a-D-glukopyranosidissa, 1-tioglukoosissa 30 ja sorboosissa sallivat reaktion. Hiiliasemassa 2 jotkut muutokset ovat sallittuja, esim. mannoosissa, mutta 2-deoksiglukoosi ja glukosamiini eivät reagoi. Hiiliasemassa 6 useimmat rakennemuutokset sallitaan, kuten 6-fosfaatti, kloridi ja asetaatti, 6-deoksiglukoosi, 6-0-metyyli-glukoosi ja 6-0-metyyligalaktoosi ja 6-H kuten ramnoosi, mutta CH2OH, 35 CHOH-ryhmä glukoheptoosissa estävät reaktiivisuuden.

Il 11 85160

Monet disakkaridit, kuten mellibioosi, laktoosi, isomaltoosi ja sello-bioosi, ovat reaktiivisia akseptoreita, vaikka monet disakkaridit, kuten laktuloosi ja isomaltuloosi, ovat reagoimattomia. Kun oligosakka-ridiakseptoreita käytetään, akseptorin aktiivisuus vähenee koon suuren-5 tuessa, kuten homologisessa maltoosi-, maltotrioosi-, maltotetraoosi-jne. sarjassa.

Lopuksi, monessa tapauksessa rakennemuutokset (glukoosissa) useammassa kuin yhdessä hiiliatomissa ei estä reaktiota, esim. galaktoosi-6-ase-10 taatissa; ja kun käytetään reaktiivisten akseptorimolekyylien seosta esim. hydrolysoitua heraa, muodostuu fruktosyloituja disakkaridiseok-sia.

On havaittu, että seuraavat sokerit toimivat akseptoreina: D-arabinoo-15 si, fukoosi, 6-deoksiglukoosi, 6-0-metyyligalaktoosi, laktoosi, galak-toosi- 6-asetaatti, mannoosi, 5-tio-D-glukoosi, maltoosi, 1-tio-glukoo-si, maltotrioosi, 3-0-metyyli-a-D-glukoosi, maltopentaoosi, D(-)ara-binoosi, maltoheksoosi, 6-kloori-6-deoksiglukoosi, mellibioosi, galak-toosi, ksyloosi, isomaltoosi, L-arabinoosi, herapermeaatti (laktoosi), 20 4-kloorigalaktoosi, riboosi, lykoosi, glukoosi-6-asetaatti, glukonihap-po, glukoosi- 6-fosfaatti, L-rhamnoosi, 6-O-metyyliglukoosi, metyyli-D-glukoosidi, ksylitoli, glyseroli ja etanoli.

Yksi erityisen kiinnostava akseptori on ksyloosissa, joka johtaa 25 jö-D-fruktofuranosyyli (2 -> 1)-α-D-ksylopyranosidin tuotantoon, tunnettu ksylosakkaroosina. Toinen kiinnostava akseptori on galaktoosi, joka johtaa ^-D- fruktofuranosyyli (2 -> 1)-D-galaktopyranosidin tuotantoon (galaktosakkaroosi). Tämän tyyppisten tuotteiden kariesta aiheuttava vaikutus ja/tai makeus on alhainen, joka tekee ne mielenkiintoiseksi 30 korvaamaan sakkaroosin alueilla, jossa ylimääräinen makeus on ongelma. Galaktosakkaroosi on kiintoisa erityisesti siksi, koska se voidaan tuottaa melasseista ja hydrolysoiduista herakyllästeistä, jotka molemmat ovat helposti saatavissa olevia lähteitä. Siinä on vain hieman makeutta (n. 10-15 % sakkaroosin makeudesta).

35 12 85 1 60

Mitä tulee donorin erityisyyteen, sokerit, jotka perustuvat sakkaroosiin, joilla on a (1 -> 2) side ehdottomana vaatimuksena, on reakti-viisiä, mikä aktiivisuus vähenee molekyylin koon mukaan. Entsyymin toiminnalla muodostuneet uudet disakkaridit toimivat myös donoreina, 5 esim. ksylosakkaroosi.

Entsyymikatalysoidun reaktion tuote voidaan separoida sivutuotteista ja lähtöaineista tavallisilla fysikaalis-kemiallisilla menetelmillä, kuten kromatografiällä, varsinkin korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) ja 10 ioninvaihtohartsikromatografialla. Varsinkin tuotteilla, joiden al- doosirenkaassa ei ole 6-hydroksiryhmää, esimerkiksi sakkaroosin 6-este-rit ja eetterit, ksyloosista johdetut tuotteet ja 6-deoksisakkaroosi, on yllätyksellisen alhainen polaarisuus, joka tekee ioninvaihtohartsi-kromatografiän helpoksi ja tehokkaaksi erotusmenetelmäksi. Polysty-15 reenihartsit, jotka ovat divinyylibentseenillä poikkisidottuja, esim. Amberlite XAD-hartsit, ovat erityisen sopivia. Tämä erotus on paljon helpompi kuin eri tavalla substituoitujen sakkaroosijohdannaisten erotus, joka on tarpeellinen, kun sakkaroosin 6-johdannaista valmistetaan kemiallisella menetelmällä.

20

Fruktoosisiirtoreaktion sivutuote, kun käytetään gluktosyylifruk-tosidia, kuten sakkaroosia, on glukoosi itse. Glukoosi on, tietenkin, mahdollinen akseptori ja kilpailee halutun akseptorin kanssa, joka johtaa lähtöaineiden uudelleenmuodostamiseen. Glukoosin poistaminen 25 muuntamalla se fruktoosiksi voi siksi olla toivottavaa. Tämä voidaan saada aikaan lisäämällä glukoosi-isomeraasia.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä edelleen: 30 Esimerkki 1 TGS:n valmistandnen a) Entsyymin valmistus ^-fruktosyylitransferaasi saatiin kannasta Bacillus subtilis NCIB 35 11871. Entsyymi oli sakkaroosin indusoima solujen kasvaessa ravistus- pulloissa (250 ml tilavuus, 4 pulloa), jotka sisälsivät minimaalisen

II

13 85 1 60 määrän sakkaroosikasvualustaa (100 ml per pullo). Viljelmä viljeltiin viimeiseen eksponenttifaasiin asti ravistaen lämpötilassa 30°C, ja neljän ravistuspullon sisällöt yhdistettiin sitten ja kasvualusta erotettiin soluista sentrifugoimalla (5000 g 15 minuutin ajan). 20-30 % 5 koko jäljellä olevasta entsyymistä liittyi soluihin. Tuloksena saatu kelluva aine vietiin 65 %:n kyllästymiseen lisäämällä kiinteätä am-moniumsulfaattia ja jätettiin seisomaan 45 minuutiksi lämpötilaan 0°C. Tämän menettelyn ansiosta suurin osa ei-halutusta invertaasista sakkau-tui ja muut proteeiinijäännökset, mutta suurin osa entsyymistä jäi 10 liuokseen. Sitten näyte uudelleen sentrifugoitiin (20000 g 30 minuutin ajan) ja sakka, joka sisälsi invertaasiaktiivisuuden, poistettiin. Enemmän ammoniumsulfaattia lisättiin liuokseen sen saamiseksi 95 %:n kyllästymiseen ja jätettiin seisomaan vielä 45 minuutin ajaksi lämpötilassa 0°C. Toinen sakka, ensisijaisesti fruktosyylitransferaasia, 15 muodostui ja kerättiin sentrifugoimalla (40000 g 45 minuutin ajan) ja uudelleenliuotettiin 12 ml 50 mM:seen fosfaattipuskuriin, pH - 6,0. Kaksi saostusta ja toisen sakan uudelleenliuottaminen johtivat oleelliseen entsyymin puhdistukseen ja konsentrointiin niin, että ainoastaan yksi proteiinivyöhyke erottui polyakryyliamidigeelielektroforeesissa.

20 Lopuksi jäljellä oleva ammoniumsulfaatti poistettiin entsyymivalmis-teesta dialyysillä (0°C 4 tunnin ajan) 50 mM fosfaattipuskurilla.

Dialysoitu entsyymi määritettiin ennen ja jälkeen £-hydroksimerkuro-bentsoaatin lisäystä, joka inhiboi invertaasin, mutta ei vaikuta fruk-25 tosyylitransferaasin aktiivisuuteen. Tällä tavalla fruktosyylitransfe-raasivalmisteiden yleensä havaittiin olevan ilman invertaasisisältöä. Valmisteiden proteiinisisältö arvioitiin olevan 0,45 mg per ml mittaamalla niiden absorbanssi aallonpituudella 280 nm. Mustaa pigmenttiä on usein läsnä puhdistetuissa entsyymivalmisteissä, mutta se ei vaikuta 30 valmisteiden aktiivisuuteen.

b) Sakkaroosi-6-asetaatti

Glukoosi-6-asetaatti (80 g kuivattu in vacuo vakiopainoiseksi) ja gra-35 nuloitua sakkaroosia (160 g) liuotettiin huoneen lämmössä 100 ml:aan Mclllvaine-puskuriin pHrssa 5,4 ja laimennettiin 600 ml:ksi (siis 40 % 14 85160 p/v) ionivaihdetulla vedellä. Liuos suodatettiin sitten hyvin ja 28 ml entsyymiliuosta lisättiin. Reaktioseosta haudottiin sitten lämpötilassa 30°C ja näytteitä otettiin aikaväliajoin, kunnes HPLC- analyysi näytti, että sakkaroosi-6-asetaattia ei enää muodostuisi, sakkaroosi-6- asetaa-5 tin saavutetun maksimikonsentraation ollessa noin 120 gl'1. Entsyymi poistettiin suodattamalla reaktioseos DEAE-selluloosakolonnin läpi, joka absorboi entsyymin. Vaihtoehtoisesti se voidaan denaturoida kuumentamalla lämpötilassa 65°C 1 tunnin ajan. Entsyymin poistaminen on tärkeätä, koska se voi myös katalysoida hitaan sakkaroosi-6-asetaatin 10 hydrolyysin, fruktoosin vapauttamiseksi.

Tuote eristettiin sitten valmistelevalla HPLC:llä sakkaroosi-6-asetaa-tin saamiseksi, jonka puhtaus on ainakin 85 % ja keskimääräinen saanto noin 50 %. Entsyymireaktion alkunopeus oli 244,5 mg sakkaroosi-6-ase-15 taatin tuotto per mg per tunti. Entsyymivaiheen saanto oli 58 %, laskettuna glukoosi-6-asetaatin kulutuksesta tai 48 %, laskettuna sakkaroosi - 6 -asetaatin muodostuksesta.

c) Sakkaroosi-6-asetaatin klooraus 20 (i) Vilsmeier-reagenssin valmistus

Fosforipentakloridia (140 g) lisättiin kuivaan dimetyyliformamidiin (250 ml) dekanterilasissa voimakkaasti sekoittaen. Lämpötilaa pidet-25 täessä 70-80°C sekoitusta jatkettiin 1 tunnin ajan ja reaktioseos jäähdytettiin ja suodatettiin sen jälkeen. Kiteinen tuote pestiin DMF:llä (2 x 20 ml) ja dietyylieetterillä (40 ml) ja kuivattiin eksikaattorissa Vilsmeier-reagenssin saamiseksi valkoisina kiteinä (93 g).

30 (ii) Sakkaroosi-6-asetaattiliuoksen valmistus:

Sakkaroosi-6-asetaattisiirappi (41 g, todellisen sakkaroosi-6-asetaatin sisältö 28 g) liuotettiin DMF:ään ja laimennettiin 86 ml:ksi. Liuos kuivattiin molekulaarisella seulalla ja suodatettiin.

35

II

is 8 5160 (ili) Klooraus

Vilsmeier-reagenssi (31 g) lisättiin DMF:ään (80 ml) ja seos jäähdytettiin lämpötilaan 0°C. Sakkaroosi-6-asetaattiliuosta (21 ml, 7 g sakka-5 roosi-6-asetaattia) lisättiin hitaasti, lämpötilaa pidettäessä alle 20°C. Reaktioseosta sekoitettiin lämpötilassa 0° 15 minuutin ajan, siirrettiin sitten 60°:en öljyhauteeseen 30 minuutiksi. Haude kuumennettiin lämpötilaksi 120° yli 30 minuuttia ja pidettiin tässä lämpötilassa 2 tuntia. Reaktioseosta jäähdytettiin sitten lämpötilaksi 20° ja neutra-10 lisoitiin lisäämällä metanoli - 880 ammoniakkia (2:1, 80 ml), lämpötilaa pidettäessä alle 50°. Reaktioseos väkevöitiin siirapiksi ja asety-loitiin lisäämällä pyridiiniä (100 ml) ja etikka-anhydridia. Kun oli sekoitettu lämpötilassa 50° 2 tuntia, reaktioseos jäähdytettiin lämpötilaan 20° ja metanoli (80 ml) lisättiin lämpötilaa pidettäessä alle 60°. 15 Reaktioseos haihdutettiin sitten siirapiksi ja uutettiin kuumalla (60°) tolueenilla (4 x 100 ml). Tolueeniuutteet konsentroitiin siirapiksi ja liuotettiin etyyliasetaattiin (100 ml). Etyyliasetaattiliuos pestiin vedellä (3 x 100 ml) ja vesi uudelleenuutettiin etyyliasetaatilla (2 x 50 ml). Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestiin magneesiumsulfaatil-20 la, väri poistettiin aktivoidulla puuhiilellä ja konsentroitiin siirapiksi, joka kiteytyi teollisesta metyloidusta spriistä 4,1',6'-trikloo-ri- 4.1*.6'-trideoksigalaktosakkaroosi penta-asetaatin saamiseksi (4,4 g, 39 %).

25 (iv) DE-esterisöinti

Penta-asetaatti liuotettiin kuivaan metanoliin ja käsiteltiin katalyyttisellä määrällä natriummetoksidia huoneen lämmössä 5 tunnin ajan.

Liuos deionisoitiin sitten ja haihdutettiin 4,1',6'-trikloori-4,1',6'-30 trideoksiealaktosakkaroosin saamiseksi (90 %).

Esimerkki 2 4.1'.6'-trikloori-4.6.1*.6'-tetradeokslgalaktosakkaroosin (6-deoksi-35 TGS) (TGS:n analogi, lonka makeusaste on saman suuruinen).

85160 (1) 6-deoksisakkaroosi Eristäminen, puhdistus ja kiteytys.

5 6-Deoksi-D-glukoosi (D-kinovoosi, 20 g) ja sakkaroosi alistettiin esimerkin 1 tapaiselle reaktiolle, josta saatiin 6-deoksisakkaroosin, D-kinovoosin, sakkaroosin ja glukoosin seos, yhteensä 140 ml. 6-deoksi-sakkaroosi eristettiin seoksesta valmistus-HPLC:llä käyttämällä "Waters Prepak 500-C18"-käänteisfaasikolonnia ja eluenttina vettä. Yllättävän 10 suuri retentioaikaero havaittiin 6-deoksisakkaroosin ja muiden seoksessa olevien yhdisteiden välillä. D-kinovoosi, sakkaroosi ja D-glukoosi eluoitiin 4-9 minuuttia kyllästyksen jälkeen ja 6-deoksisakkaroosi vain 29 minuuttia sen jälkeen (maksimaalinen huipun korkeus). Suurempi erotus sallii suuremman määrän materiaalia erotettavaksi per injektio kuin 15 muuten olisi mahdollista. Eluentti, joka sisälsi 6-deoksisakkaroosia, haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa (haudelämpötila 50°C) kirkkaan siirapin saamiseksi (16 g, 42 %), joka kiteytyi seistessä huoneen lämmössä. Tuote uudelleen kiteytettiin etanolista ja sen s.p. oli 180-181°C, [a]D + 57,6° 2,5, vesi); massaspektri, m/e 293 20 (M+ - CH3 - H20) ; 13C-NMR spektri (D20 liuos, suhteeseen sisäiseen DSS:ään, 0 ppm):

Hiiliatomi Kemiallinen siirtymä, ppm - 25 2' 106,32 1 94,70 5' 84,01 3' 79,04 5 77,74 30 4' 76,73 3 74,93 2 73,95 4 71,09 6' 65,02 35 1' 63,77 6 19,36

II

i7 851 60 (2) 6-deoksisakkaroosin selektiivinen klooraus 6-Deoksisakkaroosi (2,8 g) liuotettiin DMF:ään (10 ml) ja liuos lisättiin Vllsmeier-reagenssisuspensioon (15 g) DMF:ssä (30 ml), lämpötilaa 5 pidettäessä alle 10°C. Seosta sekoitettiin huoneen lämmössä 10 minuuttia ja kuumennettiin sitten lämpötilaan 120°C 2 tunniksi, sekoittaen. Reak-tioseos jäähdytettiin huoneen lämpöiseksi ja metanoliammoniumhydrok-sidiliuos (1;1, 20 ml) lisättiin. Seos konsentroitiin lämpötilassa 70°C ja tolueeni (2 x 20 ml) haihdutettiin jäännöksestä, joka sitten asety-10 loitiin etikka-anhydridillä (30 ml) pyridiinissä (30 ml) lämpötilassa 60°C 3 tuntia. Metanoli (50 ml) lisättiin ja seos haihdutettiin jäännökseksi, joka uutettiin tolueenilla lämpötilassa 60°C (4 x 50 ml) sekoittamalla ja dekantoimalla. Yhdistetyt tolueeniuutteet haihdutettiin kuivaksi ja jäännös kromatografioitiin silikageelillä (petroolieetteri-15 eetteri, 2:1, sitten 1:1 eluenttina) väliaineen 4,1',6'-trikloori- 4.6.1*.6*-tetradeoksiealaktosakkaroositetra-asetaatin saamiseksi vaaleankeltaisena siirappina liuosten haihduttamisen jälkeen (3.1 g, 64 %); massa spektrin, m/e 283,285,287 (9;6;1, kloori-di-O-asetyylifruk-toosijäännös) ja piikkien vastaten 60 (CH3C02H)-, 42 (CH2-C-0) ja 36 20 (HCL)-ryhmien peräkkäistä irtoamista: sekä 249,251 (3;1,-monokloori- dioksi- di-O-asetyyligalaktoosijäännös, josta irtoaa CH2), jotka piikit vastaavat 60- ja 42-ryhmien peräkkäistä irtoamista.

Tetra-asetaatti liuotettiin metanoliin (30 ml) ja deasetyloitiin nat-25 riummetoksidillä (1 M, pH:ssa 9) huoneen lämmössä. Liuos neutralisoitiin Amberlyst 15 (H+) kationinvaihtohartsilla, suodatettiin ja haihdutettiin kuivaksi. Tuote saatiin valkoisena, kiinteänä aineena, [a]D + 87,1° (c 1,0 , asetoni): 13^^ spektri (D20-liuos, suhteeseen sisäistä DSS:ää, Oppm): 30 18 85 1 60

Hiiliatomi Kemiallinen siirtymä, ppm 2' 106,02 1 95,41 5 5' 83,75 3' 78,89 4' 78,04 5 70,95 4 70,03 10 2 69,78 3 69,28 1' 47,46 6' 45,99 6 19,61 15 4,1',6'-Trikloori-4,6,1',6'-tetradeoksigalaktosakkaroosin havaittiin olevan 400 kertaa makeampaa kuin sakkaroosi (8 % liuos).

Esimerkki 3 20

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin, mutta 6-bentsoaattia 6-ase-taatin sijasta käytettiin vaiheessa b). Samankaltainen tulos saatiin ja vaihe c) suoritettiin kuten ennen TGS:n valmistamiseksi samanlaisessa määrässä.

25

Esimerkki 4

Esimerkin 1 mukaista menetelmää voidaan muokata käyttämällä kannasta B.subtilis Marburg 168 kannasta NCIB 11872 tai kannasta NCIB 11873 joh-30 dettua entsyymiä vaiheessa b). Reaktio etenee saman kaltaisena, mutta reaktionopeus on alhaisempi.

35

II

w 85160

Esimerkki 5

Fruktoswlitransferaasin immobilisaatio 1a puhdistus organismista B.subtilis NCIB 11871 käyttämällä DEAE-ioninvaihtoselluloosaa 1a ksv-5 losakkaroosin valmistus.

DEAE-ionivaihtoselluloosa (DE 52) pestiin perusteellisesti 50 mM Mclll-vaine-puskurissa (pH - 5,4) ja sitten puskuroidulla substraatilla (sakkaroosi -ksyloosi 2:1, 40 % p/v, kokosokereita). Kun oli suodatettu 10 melkein kuivaksi Buchner-filtterillä, DEAE-selluloosa (10 g) sekoitettiin 8 ml fruktosyylitransferaasivalmisteeseen organismista Bacillus subtllis. kuten esimerkissä 1, viideksitoista minuutiksi lämpötilassa 30°C sekoittaen. Tuloksena saatu DEAE-selluloosan ja entsyymin seos pakattiin 10 ml:n päällystettyyn kolonniin (19 x 1 cm) ja pidettiin 15 lämpötilassa 30°C Churchill-termosirkulaattorilla. DEAE-selluloosan annettiin valua pois painovoiman vaikutuksesta ja se kerättiin talteen. Substraattia pumpattiin kolonnia pitkin ylös virtausnopeudella n. 1,0 ml h"1 käyttämällä Watson-Marlow-pumppua ja eluentti kerättiin aikavälein ja sen fruktosyylitransferaasi aktiivisuus määritettiin. Absor-20 banssi aallonpituudella 280 nm (OD2eo) mitattiin myös. Näytteen määrittämiseksi 0,1 ml nestenäytteestä tai 0,1 g immobilisoidusta entsyymistä (DE 52) haudettiin 2 ml:n substraatin kanssa lämpötilassa 30°C 4 tunnin ajan. Käyttämällä ksyloosi/sakkaroosisubstraattia "ksylosakkaroosin" valmistukseen proteiinikonsentraatiota ja loppuun käytetyn liuoksen 25 aktiivisuutta, joka jää sen jälkeen, kun immobilisaatio oli lopetettu, verrattiin alkuperäisen entsyymivalmisteen proteiinikonsentraatioon ja aktiivisuuteen. Havaittiin, että 68,5 % alkuperäisesti solu-uutteessa läsnäolevasta entsyymistä oli immobilisoitu yhdessä 83 %:n kanssa alkuperäisesti läsnäolevan proteiinin kanssa. Immobilisoidun entsyymin 30 alkuaktiivisuus oli 80,2 % verrattuna saman määrän vapaan entsyymin alkuaktiivisuuteen; kahden valmisteen aktiivisuuden ollessa 0,38 g ksylosakkaroosia/g immobilisoitua entsyymiä/h ja 0,865 g ksylosakkaroo-sia/ml entsyymiuutetta/h.

35 Immobilisoitu entsyymi (10 g p/p) ajettiin katkeamattomasti, pakattuna kolonniin lämpötilassa 30°C, noin 2 viikkoa ilman, että mitään pH-muu- 20 85 1 60 tosta eluaatissa tai merkittävää mikrobista kontaminaatiota tapahtui. Vähän proteiinia ja entsyymiä desorboitui operaation ensimmäisten kolmen päivän aikana. Proteiinin määrä oli 24 % alkuperäisestä absorboidusta proteiinista ja entsyymiaktiivisuus 2,3 % alkuperäisestä absor-5 boidusta enstyymiaktiivisuudesta. Käytössä immobilisoidun entsyymiaktiivisuuden hajoamispuoliintumisaika oli 95 h puoliajalla ja niin kuin tavallisesti aineiden muuntuminen tuotteiksi oli kääntäen verrannollinen virtausnopeuteen kolonnin läpi. Alhaisimmalla käytetyllä virtausnopeudella, joka oli 0,086 tyhjää kolonnitilavuutta (ekv)h"1, saatiin 10 muuntuminen ksylosakkaroosiksi, oli 80 % kolonnieluaatin sisältäessä 21 g l"1 ksylosakkaroosia. Tämä saanto oli korkeampi kuin missään seos-reaktioissa, luultavasti siksi, että kolonnin hanaulosvirtausjärjesteistä suosii ksylosakkaroosin muodostumista, koska tuotteita poistetaan jatkuvasti kolonnista eikä näin ollen varastoidu ja aiheuta tuotteen 15 inhibiitiota. Yhteensä näiden toimenpiteiden aikana noin 20-25 g ksylosakkaroosia muodostui olomuotoon, josta puhdasta ksylosakkaroosia helposti voidaan saada.

Toisin kuin alussa käytetty liukeneva entsyymi, immobilisoitu entsyymi 20 johti muutamiin sivutuotteisiin, jotka muodostuivat reaktion aikana. Fruktoosia muodostui vähemmän kuin mitä immobilisaatiossa käytetty alkuperäinen entsyymiuute tuotti, luultavasti, koska invertaasiaktiivi-suus, joka saastuttaa uutteen, absorboitui vain osittain DE52:een. Useita sivuaineita, jotka eluoituivat hyvin myöhään HPLC-kolonnista 13 25 ja 20 minuutin retentioajoilla, havaittiin immobilisoidun entsyymin eluaatissa, vaikka niitä ei oltu huomattu liukenevien entsyymien reaktioiden analyysissa. Luultavasti entsyymi muodostaa oligosakkaridejä tavallisista reaktanteista. Luullaan, että immobilisoidun entsyymin reaktanttimolekyylien pysäyttäminen lisää niiden kontaktiaikaa entsyy-30 min kanssa niin, että on olemassa polymerisoinnin mahdollisuus.

Koska substraatin ksyloosisisältö oli 133 gl"1, suurin mahdollinen ksylosakkaroosin konsentraatio oli 266 gl"1. Suurin konsentraatio, joka havaittiin arvolla 0,086 ekvh"1 oli 80 % tästä, siis 210 gl’1, mutta kun 35 lasketaan sen perusteella kuinka paljon ksyloosia kului reaktion aikana, saadaan 69,5 %:n reaktio. Määrät ovat korkeampia kuin seosreakti- li 21 85160 oissa, koska prosessin "läpivirtaus"-luonne aiheuttaa, että tuotetta poistetaan jatkuvasti ja koska tuote on suhteellisen polaariton verrattuna substraatteihin ja erottuu näin selektiivisesti, pois positiivisesti ladatusta immobilisaation kantajasta, molempien vaikutusten pyr-5 kien suosimaan ksylosakkaroosin tuotantoa.

Samaa menetelmää käytettiin sakkaroosi-6-asetaatin tuottamiseksi glukoosi- 6-asetaatista, 6-O-metyylisakkaroosin tuottamiseksi 6-0-metyyli-glukoosista, ja 6-O-bentsyylisakkaroosin tuottamiseksi 6-O-bentsyyli-10 glukoosista.

Esimerkin 1 mukaan valmistettua entsyymiä (0,1 ml) sekoitettiin 2 mlraan 40Ä p/v sakkaroosi- ja ksyloosiliuokseen (1:1), puskuroitiin pH-arvoon 5,5 lämpötilassa 30°C. Ksylosakkaroosi arvioitiin HPLC:llä.

15 Levaanin tuotanto arvioitiin optisesti. Tulokset erilaisten entsyymien vertauksesta oli seuraavanlaiset: Lähde Ksylosakkaroosia/ml entsyymiä Levaanin per tunti muodostuminen 20 NCIB 11871 8,6 0 NCIB 11872 2,9 havaittavissa NCIB 11873 1,4 + NCIB 3610 (Marburg) 0,08 -H- 25 Ferm 3119/1979 (b.subt var.saccharo- lyticus) 0,19 ++ NCIB 9966 (Erwinia herbicolor) 0,87 ++ 30 — Keksinnön mukaiset entsyymit tuottavat siis ainakin 10 kertaa enemmän ksylosakkaroosia kuin Marburg-kantojen entsyymit: ainakin 100 kertaa enemmän entsyymin NCIB 11871 tapauksessa. Kilpailevaa levaanin muodostumista on paljon vähemmän.

35 22 8 5 1 60

Esimerkki 6 Galaktosakkaroosin valmistus 15 ml 40 %:sta (p/v) ainetta, joka sisälsi yhtä suuria määriä sakkaroosia ja galaktoosia liuotettuna fosfaattisitraatti-puskuriin (pH 5,9), 5 haudettiin lämpötilassa 30° yhdessä pienen määrän Bacillus subtilis NCIB 11871 fruktosyylitransferaasin kanssa, joka oli osittain puhdistettu saostamalla entsyymi 95 %:iin kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksel-la, uudelleen liuottamalla sakka ja saostamalla epäpuhtaudet 65 %:iin kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella.

10

Noin 24 tunnin hautumisen jälkeen tuotteet erotettiin HPLC-kromatogra-fiällä käänteisfaasikolonnilla (huokoinen grafiittihiili, 5 mikronin halkaisija; eluenttina 5 % asetonitriilivesiliuos). Hautomisen jatkamisella tai uuden entsyymin lisäämisellä ei enää voitu saada suurempaa 15 galaktosakkaroosin saantoa. Galaktosakkaroosin maksimisaannot olivat noin 0,33 g/g galaktoosia ja noin 0,45 g/g kulutettua sakkaroosia.

Esimerkki 7 20 4.1'.6*-Tribromi-'4.1*.6'-trideoksigalaktosakkaroosi (a) Vilsmeier-reagenssin valmistus

Tionyylibromidia (280 ml) lisättiin kuivaan jäähdytettyyn dimetyyli-25 formamidiin (260 ml) voimaakkasti sekoittaen. Seosta sekoitettiin 30 minuuttia lämpötilassa 70-80°C, sitten vielä yhden tunnin ajan ja annettiin jäähtyä ympäristön lämpötilaan. Seos suodatettiin ja jäännös pestiin dimetyyliformamidillä (2 x 50 ml) ja dietyylieetterillä (100 ml) ja kuivattiin eksikaattorissa 320 g reagenssin saamiseksi.

30 (b) Sakkaroosiasetaatin brominointi

Sakkaroosi-6-asetaattiliuos (5 g) DMF:ään (20 ml) valmistettiin, kuten esimerkissä 1 ja käsiteltiin jäähdytetyllä Vilsmeier-reagenssisuspen-35 siolla (25 g) DMFissä (50 ml) sekoittaen, lämpötilaa pidettäessä alle 20°C 30 minuutin ajan. Sekoitettua seosta sekoitettiin sitten ympäristön

II

23 851 60 lämpötilassa 30 minuuttia ja kuumennettiin sitten lämpötilaan 110°C ja sekoitettiin vielä 1,75 tuntia. Se jäähdytettiin sitten lämpötilaan 20°C ja neutralisoitiin lisäämällä metanolin ja väk. (0,880) ammoniakin 2:1 seos, lämpötilaa pidettäessä alle 40°C. Seos konsentroitiin sitten sii-5 rapiksi ja asetyloitiin asetanhydridillä (100 ml) pyridiinissä (100 ml) lämpötilassa 50°C 2 tunnin ajan. Tuote saatiin, kuten esimerkissä 1, tribromigalaktosakkaroosipenta-asetaattina (4,2 g), joka oli samanlainen kuin julkaisussa GB 2101989A. Tämä deasetylisoitiin natriummetoksi-dilla (1 M metanolissa, pH:ssa 9) ympäristön lämpötilassa 5 tuntia ja 10 deionisoitiin sitten Amberlyst 15 (H+) ioninvaihtohartsilla. Liuos haihdutettiin kuivaksi puhtaan tribromisokerin saamiseksi, joka oli samanlainen kuin julkaisussa GB 2101989A.

Esimerkki 8 Ksvlosakkaroosin klooraus 15

Ksylosakkaroosi (esimerkistä 5) (3 g) liuotettiin DMF:ään (6 ml) lämpötilassa 10°C ja lisättiin sekoittaen kylmään Vilsmeier-reagenssisuspen-sioon esimerkistä 1 (13 g) DMF:ssä (25 ml) lämpötilaa pidettäessä alle 10°C. Sekoitettu seos lämmitettiin sitten huoneen lämpöiseksi yli 30 20 minuuttia ja sitten lämpötilaan 120° ja pidettiin siinä sekoittaen 3 tuntia. Seos jäähdytettiin sitten, neutralisoitiin 1:1 metanoli/väk. (0,880) ammoniakkiliuoksella ja konsentroitiin lämpötilassa 70°G. Kosteus poistettiin peräkkäisillä tolueenihaihduttamisilla ja sitten jäännös asetyloitiin asetanhydridillä (30 ml) ja pyridiinillä (30 ml) läm-25 pötilassa 60°C 3 tunnin ajan. Seos käsiteltiin sitten metanolilla (50 ml) ja haihdutettiin kuivaksi. Jäännös uutettiin kuumalla tolueenilla (60°C, 4 x 50 ml) ja dekantoidut uutteet yhdistettiin ja haihdutettiin. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä (petrolieetteri: dietyylieet-teri 2:1, sitten 1:1) triklooriarabinosakkaroositetra-asetaatin saa-30 miseksi siirappina (2,6 g).

Massaspektri m/e 283,285,287 (9:6:1, dikloori-di-O-asetyylifruktoosi-jäännös); 35 jossa piikit vastaavat peräkkäistä 60 (CH3C02H), 42 (CH2-C-0) ja 36 (HC1)-ryhmien irtoamista; 24 8 5 1 60 235,237 (3:1, monokloori-di-O-asetyyliarabinoosijäännös) ja jossa piikit vastaavat peräkkäistä 60- ja 42-ryhmien irtoamista.

Tetra-asetaatti liuotettiin metanoliin (30 ml) ja deasetyloitiin 1 M 5 metoksidillä metanolissa pH:ssa 9, ympäristön lämpötilassa.

Seos deionisoitiin Amberlyst 15 (H+) hartsilla ja suodatettiin ja haihdutettiin. Tuote eristettiin kiinteänä vaahtona [a]D x 101,9° c 1.1, asetoni; 13C-NMR-spektri D2-liuos, suhteessa sisäiseen DSS:ään, - ppm.

10

Hiiliatomi Kemiallinen siirtymä, ppm 2' 106,0 1 95,8 15 5' 83,9 3' 78,8 4' 77,9 2 70,6 3 70,4 20 5 66,4 4 63,9 1' 47,3 6' 45,9 25 Yhdisteen havaittiin olevan 25 x makeampi kuin sakkaroosi 2 %:na liuoksena.

li

Claims (15)

25 85160

1. Organismista B.subtilis eristetty £-fruktosyylitransferaasi-entsyy-mi, tunnettu siitä, että se hydrolysoi donorifruktosyylioli- 5 gosakkaridin tai -disakkaridin, joka sisältää substituoimattoman β-fruktosyylirenkaan, joka liittyy aldoosin anomeeriseen hiiliatomiin 1->2 -liitoksella ja muuntaa näin vapautetun fruktosyyliosuuden aksepto-rialdoosiksi fruktosyylidisakkariidin saamiseksi päätuotteena, jolloin entsyymillä on kyky muodostaa 6-substituoituja sakkaroosijohdannaisia 10 päätuotteena, kun akseptorialdoosi on 6-substituoitu glukoosi, jolloin entsyymi ei tuota merkittäviä määriä alkoholissa saostuvia oligo- tai polyfruktooseja aldoosiakseptorin läsnäollessa tai poissaollessa, jolloin entsyymin Κ,,,-arvo sakkaroosia varten on ainakin 0,1 M aldoosiakseptorin poissaollessa ja sen ollessa olennaisesti ilman invertaasiaktii-15 visuutta.

2. Enzym enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att det härleds frän organismen B.subtilis stammen NCIB 11871, NCIB 11872 eller NCIB 11173. 20

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymi, tunnettu siitä, että se johdetaan organismin B.subtilis kannasta NCIB 11871, NCIB 11872 tai NCIB 11173. 20

3. Enzym enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att det har behandlats med en selektiv invertasinhibitor.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen entsyymi, tunnettu siitä, että se on käsitelty selektiivisellä invertaasi-inhibiittorilla.

4. Enzym enligt patentkravet 3, kännetecknat därav, att 25 invertasinhibitorn är p-hydroxi-kvicksilverbensoat.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen entsyymi, tunnettu siitä, 25 että invertaasi-inhibiittori on p-hydroksi-elohopeabentsoaatti.

5 HO )'··"0"·"Υ^^>·"·0Η2θΗ (ΠΙΙ HO OH 0¾ 10 där A är som definierats för formel 2.

5. Enzym enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknat därav, att det är immobiliserat.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen entsyymi, tunnettu siitä, että se on immobilisoitu.

6. Immobiliserat enzym enligt patentkrav 5, kännetecknat därav, att det har immobiliserats med jonbytarharts.

6-O-metyyliglukoosi, ja 6-0-bentsyyliglukoosi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen immobilisoitu entsyymi, tun nettu siitä, että se on immobilisoitu ioninvaihtohartsilla.

7. Förfarande för framställning av fruktosid frän en fruktosacceptor, k ä n n e tecknat därav, att acceptorn valts bland följande: 35 6-estrar och 6-etrar av glukos, 6-deoxiglukos, xylos och galaktos eller 30 851 60 frän 1-alkylglukosid eller dess tiol-analog eller frän alkohol genom att behandla en vattenlösning av acceptorn och fruktosyldi- eller oligosackarid med en fruktosyltransferas enligt nägot av patentkraven 1-7 och genom att separera fruktosiden frän reaktionsblandningen. 5

7. Menetelmä fruktosidin valmistamiseksi fruktoosin akseptorista, tunnettu siitä, että akseptori on valittu seuraavista: 35 glukoosin, 6-deoksiglukoosin, ksyloosin ja galaktoosin 6-esterit ja 6-eetterit tai 1-alkyyliglukosidista tai sen tioli-analogista tai alko- 26 8 5 1 60 hölistä käsittelemällä akseptorin ja fruktosyylidi- tai oligosakkaridin vesiliuosta jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisella fruktosyylitrans-feraasilla ja erottamalla fruktosidi reaktioseoksesta.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, kännetecknat därav, att fruktosacceptorn väljs bland följande: 6-deoxiglukos, galaktos, xylos, glukos-6-acetat, glukos-6-bensoat, 6-0-metylglukos och 6-0-bensylglukos. 10

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fruktoosiakseptori valitaan seuraavista: 6-deoksiglukoosi, galaktoosi, ksyloosi, glukoosi-6-asetaatti, glukoosi-6-bentsoaatti,

9. Förfarande enligt patentkravet 7 eller 8, kännetecknat därav, att fruktosyldi- eller oligosackariden väljs bland ämnena sacka-ros, raffinos och stakyos. 15 10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 7-9, känneteck nat därav, att acceptorn är en aldos utan 6-hydroxi-grupp och pro-dukten separeras medelst jonbyteshartskromatografi.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fruktosyylidi- tai oligosakkaridi valitaan aineista sakkaroosi, raffinoosi ja stakioosi.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 7-9 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että akseptori on aldoosi, jossa on 6-hydroksi-ryhmä ja tuote eristetään ioninvaihtohartsikromatografiällä.

11. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat därav, 20 att det innefattar en reaktion mellan en aldos med den allmänna formeln A 25 .....OH (II) H(f' \ 30 där A är en väteatom eller CH2X-grupp, där X är en väteatom eller alko-xigrupp eller en skyddad hydroxigrupp, och en fruktosyldi- eller oligosackarid under närvaro av fruktosyltransferas för att fä en förening med den allmänna formeln 35 II 3i 85160 \ 0 ch2oh

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää aldoosin reaktion, jonka yleinen kaava on 20 A 0 HO^-/ \nmOH ΠΙ1 )—ζ Ηϋ 'OH 30 jossa A on vetyatomi tai CH2X-ryhmä, jossa X on vetyatomi tai alkoksi-ryhmä tai suojattu hydroksiryhmä, fruktosyylidi- tai oligosakkaridin kanssa fruktosyylitransferaasin läsnäollessa yhdisteen saamiseksi, jonka yleinen kaava on 35 II 27 8 5 1 60 \ ch2°h HO ——.....CHjOH UH I HO 0H OH OH 10 jossa A on kuten määritelty kaavalle 2.

12. Förfarande enligt patentkrav 11 för framställning av halodeoxisack-aros eller ett galaktosackarosderivat med den allmänna formeln 15 V° CHi Y \imjmik N^""CH2Y ^ HO 40H ol \h där A är en väteatom eller en C2X-grupp, där X är en väteatom eller 25 en hydroxl- eller alkoxigrupp och Y är en halogenatom, k ä n n e - t e c k n a t därav, att det Innefattar halogenisering av förenlngen enligt formel III för att fä en förening enligt formel I, där A är CH2X och X en skyddad hydroxigrupp, och avlägsnande av skyddet frän den skyddade hydroxigruppen. 30

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä halodeoksisakkaroosin tai galaktosakkaroosijohdannaisen valmistamiseksi, joiden yleinen kaava on 15 A\ CH2Y / °\ (II Y λλλ/ \iiii Oiriir^ >'"CH2Y HO "'OH oi X0H 25 jossa A on vetyatomi tai CH2X-ryhmä, jossa X on vetyatomi tai hydroksi-tai alkoksiryhmä ja Y on halogeeniatomi, tunnettu siitä, että se käsittää kaavan III mukaisen yhdisteen halogenisoinnin ja kaavan I mukaista yhdistettä varten, jossa A on CH2X ja X on suojattu hydroksi-ryhmä, ja suojatun hydroksiryhmän suojan poistamisen. 30

13. Förfarande enligt patentkravet 11 eller 12, känneteck-n a t därav, att fruktosylsackariden är sackaros, raffinos eller stakyos. 35 14. Förfarande enligt patentkravet 12, kännetecknat därav, att halogeniseringen utförs genom att använda Vilsmeier-reagens. 32 8 51 60

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fruktosyylisakkaridi on sakkaroosi, raffinoosi tai stakioo-si.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että halogenisointi suoritetaan käyttämällä Vilsmeier-reagenssia. 28 8 5 1 60

15. Jonkin patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojattu hydroksiryhmä on alifaattinen tai aromaattinen karbonyylioksiryhmä ja suoja poistetaan hydrolysoimalla; tai on aryylialkoksiryhmä, josta suoja poistetaan pelkistyslohkeamisella. 5 li 29 85160 1. β-fruktosyltransferas-enzym som isolerats frän organismen B.subtl-lis. kännetecknat av, att det hydrolyserar en donorfruk- 5 tosyloligasackarid eller -disackarid som innehäller en icke-substitue-rad ^-fruktosylring som är ansluten till den anomeriska kolatomen av en aldos genom en l->2 bindning och överför den sälunda frigjorda fruk-tosylandelen till en acceptoraldos för att fa en fruktosyldisackarid som huvudprodukt, varvid enzymet har förmäga att bilda 6-substituerade 10 sackarosderivat som huvudprodukt dk acceptoraldosen är 6-substituerad glukos, varvid enzymet inte producerar betydelsefulla mängder i alkohol utfällbara oligo- eller polyfruktoser i närvaro eller frinvaro av en aldosacceptor, varvid enzymet har ett K,„-värde för sackaros pä dtminstone 0,1 M i fränvaro av en aldosacceptor och som är väsentligen fritt 15 frän invertasaktivitet.

15. Förfarande enligt nägot av patentkrav 12 eller 13, kanne-t e c k n a t darav, att den skyddade hydroxigruppen är en alifatisk eller aromatisk karbonyloxigrupp och skyddet avlägsnas genom hydro-lysering; eller ar en arylalkoxlgrupp, frän vilket skyddet avlägsnas 5 genom reduktiv avspjälkning. Il