JPS6037993A - フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法 - Google Patents
フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法Info
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- JPS6037993A JPS6037993A JP59128395A JP12839584A JPS6037993A JP S6037993 A JPS6037993 A JP S6037993A JP 59128395 A JP59128395 A JP 59128395A JP 12839584 A JP12839584 A JP 12839584A JP S6037993 A JPS6037993 A JP S6037993A
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- C07H5/02—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to halogen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はフラクトシルジサッカライド、特にノ・ロスク
ロース甘味剤特に4. 1’、6’−)リクロロ−4,
1’−6’−)リゾオキシ−ガラクトスクロース(TG
Sとして知られる)を酵素反応により製造する方法に関
する。
ロース甘味剤特に4. 1’、6’−)リクロロ−4,
1’−6’−)リゾオキシ−ガラクトスクロース(TG
Sとして知られる)を酵素反応により製造する方法に関
する。
4、 1’、6’−トリクロロ−4,1’、6’−)リ
ゾオキ7−がラクトスクロースは英国特許第15461
67号明細書に他のクロロスクロース誘導体と共に1示
されている強力な甘味剤である。6−ヒドロキシ基がエ
ーテル化されているか存在しない類似化合物はE P
0103479 fi−および()B2127806A
に記述されている。その他のハロケゞン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。
ゾオキ7−がラクトスクロースは英国特許第15461
67号明細書に他のクロロスクロース誘導体と共に1示
されている強力な甘味剤である。6−ヒドロキシ基がエ
ーテル化されているか存在しない類似化合物はE P
0103479 fi−および()B2127806A
に記述されている。その他のハロケゞン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。
TGSの一製造法は()B2079749Aおよび米国
特許第4,380,476号明細書に記載されている。
特許第4,380,476号明細書に記載されている。
この方法はスクロースの6−エステル、又はスクロース
の6−エステルを主として含有する混合物を調製し、つ
いでこの6−置換化合物を選択的に塩素化するものであ
る。続いてこの6−位で脱エステル化するとTGSが得
られる。実際、化学的手段を使う場合、特定の方法でス
クロース6−エステルを好収量で得るのは難しい。相当
する6−置換グルコースおよびフラクトシド糖から出発
して酵素反応を行ない、他の位置に置換基を有する他の
スクロースを含まない6−置換スクロースを得、ついで
出発物質とグルコースから容易に分離できる、6−置換
スクロース誘導体からTGSを難なく製造することがで
きる。
の6−エステルを主として含有する混合物を調製し、つ
いでこの6−置換化合物を選択的に塩素化するものであ
る。続いてこの6−位で脱エステル化するとTGSが得
られる。実際、化学的手段を使う場合、特定の方法でス
クロース6−エステルを好収量で得るのは難しい。相当
する6−置換グルコースおよびフラクトシド糖から出発
して酵素反応を行ない、他の位置に置換基を有する他の
スクロースを含まない6−置換スクロースを得、ついで
出発物質とグルコースから容易に分離できる、6−置換
スクロース誘導体からTGSを難なく製造することがで
きる。
問題の酵素はフラクトシルトランフェラーゼ゛である。
これは周知の酵素である。代表的酵素は75JrM’A
レバンスクラーゼであり、スクロース又はラフィノース
を分解してレバン、ボ゛リフラクトース誘導体を製造す
るものである。その通常の作用機作は、レバンスクラー
ゼはスクロース中のグルコーヌーフラクトース結合を分
解し、フラクトースをアクセプター糖例えばスクロース
自体に転換するものである。この方法は反復され、フラ
クトース鎖が完成される。スクロース以外に他の糖例え
ばD−キシロースが存在すると、レバンの生成が抑えら
れるかあるいは少なくとも減少し、その代りフラクトー
スは新規のフラクトシドを製造するためにアクセプター
として作用する他の拮抗糖(compθting su
gar )に転換する。この新規フラクトシドはドナー
としても作用し、実際所望の方向で均衡を増すために、
過量のドナーが使われて来た。
レバンスクラーゼであり、スクロース又はラフィノース
を分解してレバン、ボ゛リフラクトース誘導体を製造す
るものである。その通常の作用機作は、レバンスクラー
ゼはスクロース中のグルコーヌーフラクトース結合を分
解し、フラクトースをアクセプター糖例えばスクロース
自体に転換するものである。この方法は反復され、フラ
クトース鎖が完成される。スクロース以外に他の糖例え
ばD−キシロースが存在すると、レバンの生成が抑えら
れるかあるいは少なくとも減少し、その代りフラクトー
スは新規のフラクトシドを製造するためにアクセプター
として作用する他の拮抗糖(compθting su
gar )に転換する。この新規フラクトシドはドナー
としても作用し、実際所望の方向で均衡を増すために、
過量のドナーが使われて来た。
ある糖が良好なフラクトースーアクセゾターとして作用
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHe5t
rinとAuigad (Biochem、 J、 6
9(1958)388〜698)は示した。第6番群は
明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しなかった。
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHe5t
rinとAuigad (Biochem、 J、 6
9(1958)388〜698)は示した。第6番群は
明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しなかった。
D−グルコース6−リン酸塩は最後のカテゴリーにあっ
た。この論文で言及されている他のすべての糖は誘導化
されていない糖であった。
た。この論文で言及されている他のすべての糖は誘導化
されていない糖であった。
しかし、Bacillus 5ubtilis Mar
burg株168の変異株由来の酵素の存在下でグルコ
ース6−リン酸塩とスクロースとの反応が記述されてい
る( Kunst等、Eur、 J、 Biochem
、 42.611〜620(1974))。これらのお
よび他の著者(例えばDedonder、 Metho
ds in27mo1. 、8.5 Q Q〜505)
は常にフラクトースドナー(例えばシュクロース)/ア
クセプターの高化、例えば5:1〜10:1および工業
規模で実施不可能な低濃度を使用した。類似の反応は英
国特許出願第2046757Aに記述され、各種アルド
ース出発物質をActinomyces uiecos
usとB、 sub、tilis(株ATOO6051
、即ちMarburg株)を含むある微生物由来のレバ
ンスクラーゼの存在下スクロース又はラフィノースと反
応させる方法である。
burg株168の変異株由来の酵素の存在下でグルコ
ース6−リン酸塩とスクロースとの反応が記述されてい
る( Kunst等、Eur、 J、 Biochem
、 42.611〜620(1974))。これらのお
よび他の著者(例えばDedonder、 Metho
ds in27mo1. 、8.5 Q Q〜505)
は常にフラクトースドナー(例えばシュクロース)/ア
クセプターの高化、例えば5:1〜10:1および工業
規模で実施不可能な低濃度を使用した。類似の反応は英
国特許出願第2046757Aに記述され、各種アルド
ース出発物質をActinomyces uiecos
usとB、 sub、tilis(株ATOO6051
、即ちMarburg株)を含むある微生物由来のレバ
ンスクラーゼの存在下スクロース又はラフィノースと反
応させる方法である。
しかし、この特許出願では、アルドース番末常に未誘導
の糖であり、多分鎖形成反応を最小にするプこめに、ド
ナ一対アクセプターのモル比は1:5である。
の糖であり、多分鎖形成反応を最小にするプこめに、ド
ナ一対アクセプターのモル比は1:5である。
6−置換スクロース誘導体は相当する6−置換グルコー
ス又はがラクトースとフラクトシルトランフェラーゼと
スクロース、ラフィノース又に−Lスタキオースの存在
下で反応させて製造できることを本発明者は見出した。
ス又はがラクトースとフラクトシルトランフェラーゼと
スクロース、ラフィノース又に−Lスタキオースの存在
下で反応させて製造できることを本発明者は見出した。
ついでこの生g?+を4゜1′および6′−位置でノ・
ロデン化し、必賛なら6−置換基を除いて、目的のノ・
四糖を得ることカーできる。最初の反応はレバンの生成
なしで良収量で進行する。
ロデン化し、必賛なら6−置換基を除いて、目的のノ・
四糖を得ることカーできる。最初の反応はレバンの生成
なしで良収量で進行する。
本発明によれば、一般式
(式中、Aは水素原子又は基0H2X (但し、又は水
素原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)であり
、Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキマス
クロース又はがラクトスクロース誘導体の製造法を供し
、一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但り、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基を示
す)である)を有するアルドースをフラクトシルジー又
はオリゴサツカライドとフラクトシルトランスフェラー
ゼの存在下反応させて、一般式 (式中、Aは弐…について記載した通りである)を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてA
がan2xでありかつXがヒドロキシ基である式■の化
合物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するもので
ある。
素原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)であり
、Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキマス
クロース又はがラクトスクロース誘導体の製造法を供し
、一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但り、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基を示
す)である)を有するアルドースをフラクトシルジー又
はオリゴサツカライドとフラクトシルトランスフェラー
ゼの存在下反応させて、一般式 (式中、Aは弐…について記載した通りである)を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてA
がan2xでありかつXがヒドロキシ基である式■の化
合物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するもので
ある。
本発明に係る反応で使用するフラクトシルトランスフェ
ラーゼはB、 5ubtilis又は]lcrwini
a sp。
ラーゼはB、 5ubtilis又は]lcrwini
a sp。
(以前はAerobacter levanicumと
して知られていた)由来のものが望ましい。B、θub
tilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵で大
規模によ(生育し、工業用酵素(例えばα−アミラーゼ
とβ−ラクタマーゼ)源として十分認容されている。
して知られていた)由来のものが望ましい。B、θub
tilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵で大
規模によ(生育し、工業用酵素(例えばα−アミラーゼ
とβ−ラクタマーゼ)源として十分認容されている。
更に、フラクトシルトランスフェラーゼは主に更に、フ
ラクトシルトランスフェラーゼは主とじて細胞外酵素で
あるから、一層容易に得かつ精製−することができる。
ラクトシルトランスフェラーゼは主とじて細胞外酵素で
あるから、一層容易に得かつ精製−することができる。
使用酵素はインベルターゼ活性がないことが肝要である
。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター例え
ばp−ヒドロキシマーキュリベンゾエートを使用せねば
ならない。
。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター例え
ばp−ヒドロキシマーキュリベンゾエートを使用せねば
ならない。
B、 5ubtilis酵素は選択的沈澱又はその他の
簡便技術によりに3.5ubtilis液体培養物から
採ることができる。例えば、この培養物を遠心芥離して
細胞や細胞片を除き、硫酸アンモニウムで約65%にし
、再度遠心分離して、インベルターゼその他タン白系不
純物を除いてから、硫酸アンモニウムで約95%にもっ
ていく。ついで粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこ
れをリン酸塩バッファー中に再溶解し、透析して精製す
ることができる。
簡便技術によりに3.5ubtilis液体培養物から
採ることができる。例えば、この培養物を遠心芥離して
細胞や細胞片を除き、硫酸アンモニウムで約65%にし
、再度遠心分離して、インベルターゼその他タン白系不
純物を除いてから、硫酸アンモニウムで約95%にもっ
ていく。ついで粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこ
れをリン酸塩バッファー中に再溶解し、透析して精製す
ることができる。
重要な酵素はB、 5ubtilis Noより 11
871から得たフラクトシルトランスフェラーゼである
が、Noより 11872と11873株も興味がある
。
871から得たフラクトシルトランスフェラーゼである
が、Noより 11872と11873株も興味がある
。
これら菌株からの酵素も広い特異性を有するから、6−
置換銹導体に一層容易に使用できる。
置換銹導体に一層容易に使用できる。
本発明の別の特徴によれは、アクセプターアルドースの
不存在下で少なくとも0.1 MのkIn/スクロース
を有し、アクセプターアルドースの不存在下でフラクト
ースドナーから有意量のアルコール沈澱性物質を生成せ
ず、かつ界面活性剤に影響されず、約60℃で最適の活
性を示し、45℃までで少なくとも20分間活性である
、フラクトシルトランスフェラーゼを供する。
不存在下で少なくとも0.1 MのkIn/スクロース
を有し、アクセプターアルドースの不存在下でフラクト
ースドナーから有意量のアルコール沈澱性物質を生成せ
ず、かつ界面活性剤に影響されず、約60℃で最適の活
性を示し、45℃までで少なくとも20分間活性である
、フラクトシルトランスフェラーゼを供する。
これらの酵素に関し℃引用した2つの定数(K)ハ論、
ミカエリス−メントン定数であり、これは酵素反応の最
大率(レバン等を生成)の半分がおきる基質濃度であり
、そしてに1、インヒビタ一定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害(レバン生成せず)の半分を生
成するインヒビター濃度である。
ミカエリス−メントン定数であり、これは酵素反応の最
大率(レバン等を生成)の半分がおきる基質濃度であり
、そしてに1、インヒビタ一定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害(レバン生成せず)の半分を生
成するインヒビター濃度である。
株NOより 11871酵素の艙はアクセプターの不存
在下でスクロースについて約0.2 Mであり、[B、
5ubtilis B S 5 J (B、5ubti
lis var。
在下でスクロースについて約0.2 Mであり、[B、
5ubtilis B S 5 J (B、5ubti
lis var。
nigraからのクローン)からのDedonderの
レバンスクラーゼについて報告された勉はわずか0.0
2 Mであった。
レバンスクラーゼについて報告された勉はわずか0.0
2 Mであった。
B、 5ubtili8yaxB11871とhaxB
l 1872および11873はB、 5ubt’1m
1sの変種株テアル。
l 1872および11873はB、 5ubt’1m
1sの変種株テアル。
すなわち、分類試験(BarkleyとσoOdfel
low 。
low 。
「The Aerobic Endospore −f
orming Bacteria:01aeeific
ation ancl工dentifica、tion
J (1981)、Academic Press、
ロンドン、0ordon、 HaynesとPang
、[The Genus Bacillus J 、A
griculturalHandbook 1i0.4
27 (1976)、米国農務省、ワシントン州)およ
びAPI5 Q OHBとAPI 20にシステム(A
PPaystem S、A、 La Balme 1e
sGro1tes −3839[I Montalie
u Verciew、 FranceおよびLoqan
等、J 、 API91. Bact、 1978.2
8〜29)において、種間の殆んどすべての要件を満た
している。これらの試験では、多くのB。
orming Bacteria:01aeeific
ation ancl工dentifica、tion
J (1981)、Academic Press、
ロンドン、0ordon、 HaynesとPang
、[The Genus Bacillus J 、A
griculturalHandbook 1i0.4
27 (1976)、米国農務省、ワシントン州)およ
びAPI5 Q OHBとAPI 20にシステム(A
PPaystem S、A、 La Balme 1e
sGro1tes −3839[I Montalie
u Verciew、 FranceおよびLoqan
等、J 、 API91. Bact、 1978.2
8〜29)において、種間の殆んどすべての要件を満た
している。これらの試験では、多くのB。
5ubtilie株との主な有怠な差は、11cIB1
1B71株がラクトース陰性株で、キシロースから各種
酸生成を示すことである。Noより11872株はラク
トース陰性で、D−マンノース、メルビオースおよびト
レハロース、および0NPG反応において負の結果を示
す。N0IB 11 B 73株はラフ) −ス陽性で
、D−マンノースやイヌリンで負の結果を与える。
1B71株がラクトース陰性株で、キシロースから各種
酸生成を示すことである。Noより11872株はラク
トース陰性で、D−マンノース、メルビオースおよびト
レハロース、および0NPG反応において負の結果を示
す。N0IB 11 B 73株はラフ) −ス陽性で
、D−マンノースやイヌリンで負の結果を与える。
B、 5ubtt1isやFirWina SFの多く
の菌株から誘導したフラクトシルトランスフェラーゼは
一般にレバンスクラーゼであると見なされている。すな
ワチ、スクロースの存在下で、この酵素はレバン、アル
コール沈澱性であるポリフラクトース物質を生成させる
。フラクトースジサッカライドの生成に使用する場合、
レバン生成拮抗反応は、任意の有用な物質が得られる時
に抑えられねばならないから、高割合のアクセプター分
子を含有する反応混合物にGB2046757A中のこ
れら酵素を限定する。しかし、ここで使用するB、 [
1ut)tililllNolB 11871.118
72および11875酵素は余りレバンな生成しない。
の菌株から誘導したフラクトシルトランスフェラーゼは
一般にレバンスクラーゼであると見なされている。すな
ワチ、スクロースの存在下で、この酵素はレバン、アル
コール沈澱性であるポリフラクトース物質を生成させる
。フラクトースジサッカライドの生成に使用する場合、
レバン生成拮抗反応は、任意の有用な物質が得られる時
に抑えられねばならないから、高割合のアクセプター分
子を含有する反応混合物にGB2046757A中のこ
れら酵素を限定する。しかし、ここで使用するB、 [
1ut)tililllNolB 11871.118
72および11875酵素は余りレバンな生成しない。
「レバン」生成についてスクロースの艙は約0.2Mで
ある。これはDeaoncLer (loc、 cit
、 ) Marburg株酵素の約0.02Mの−と匹
敵する。均等濃度のアクセプターとドナー分子を使用し
かつ田中B、 5ubtiliθ酵素による高分子量レ
バンの合成(すなわち、レバンゾライマーの添加、低イ
オン強度溶液の使用および低温度の反応(J、 Bio
chem 90.921.1981))を促進すること
が分った条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサッ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成しt
も更に、他の真のレバンスクラーゼと違って、B。
ある。これはDeaoncLer (loc、 cit
、 ) Marburg株酵素の約0.02Mの−と匹
敵する。均等濃度のアクセプターとドナー分子を使用し
かつ田中B、 5ubtiliθ酵素による高分子量レ
バンの合成(すなわち、レバンゾライマーの添加、低イ
オン強度溶液の使用および低温度の反応(J、 Bio
chem 90.921.1981))を促進すること
が分った条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサッ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成しt
も更に、他の真のレバンスクラーゼと違って、B。
5ubtilie Noより 11871由来の酵呆は
不均合反応(すなわち、低分子量オリゴサツカライドを
高分子量レバンに転換しない)に触媒反応を示さないよ
うである。例えば、トリサツカライドが検出できるが、
酵素が不均合反応を行なう場合、存在させるべきでない
。Aerobacter levanicum(Sig
ma )から得た標準的レバンは高分子および中間分子
量物質に相当する2つのピークに分画することができる
。Dedonder (:toc、 cit、 )酵素
は67℃で約6.6 X 10−”の平衡定数(レバン
とグルコース/スクロース)を有し、DP4Qのレバン
が生成される。全く反対に、yaxn 11871゜1
1872および11873株はスクロース単独から実質
量のアルコール沈澱性ポリサッカライドを産生じない酵
素を生じ、11871株の生育細胞でもレバンな生成し
ない。したがって、生成したフラクトシルトランスフェ
ラーゼは有効にルパンスクラーゼ」では全(ない。この
8All誉では、フラクトシルトランスフェラーゼと呼
ぶ。
不均合反応(すなわち、低分子量オリゴサツカライドを
高分子量レバンに転換しない)に触媒反応を示さないよ
うである。例えば、トリサツカライドが検出できるが、
酵素が不均合反応を行なう場合、存在させるべきでない
。Aerobacter levanicum(Sig
ma )から得た標準的レバンは高分子および中間分子
量物質に相当する2つのピークに分画することができる
。Dedonder (:toc、 cit、 )酵素
は67℃で約6.6 X 10−”の平衡定数(レバン
とグルコース/スクロース)を有し、DP4Qのレバン
が生成される。全く反対に、yaxn 11871゜1
1872および11873株はスクロース単独から実質
量のアルコール沈澱性ポリサッカライドを産生じない酵
素を生じ、11871株の生育細胞でもレバンな生成し
ない。したがって、生成したフラクトシルトランスフェ
ラーゼは有効にルパンスクラーゼ」では全(ない。この
8All誉では、フラクトシルトランスフェラーゼと呼
ぶ。
反応のフラクトース源はスクロース(β−D−フラクト
フラノシルα−D−グルコピラノシド)、ラフィノース
(0−α−D−がラクトピラノシル−(1→6)−〇−
α−D−グルコぎラフシル−(1→2)β−D−フラク
トフラノシド)又はスタキオースのようにリンク(1→
2)によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴ−又
はジ−サツカライドでよい。
フラノシルα−D−グルコピラノシド)、ラフィノース
(0−α−D−がラクトピラノシル−(1→6)−〇−
α−D−グルコぎラフシル−(1→2)β−D−フラク
トフラノシド)又はスタキオースのようにリンク(1→
2)によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴ−又
はジ−サツカライドでよい。
式Hの6−置換アルドース出発物質は続く塩素化反応に
耐性でありかつ6−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる6−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。6−カルボン酸エステル例えば6−アセ
テート又はペンゾエ−トが望ましい。グルコース6−ア
セテートは各種方法(例えばDuff、 ;r、 Oh
em、 soa、 p 4760〜4.1957 ;
Reeve %、J、 Am、 Ohem、 soa、
。
耐性でありかつ6−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる6−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。6−カルボン酸エステル例えば6−アセ
テート又はペンゾエ−トが望ましい。グルコース6−ア
セテートは各種方法(例えばDuff、 ;r、 Oh
em、 soa、 p 4760〜4.1957 ;
Reeve %、J、 Am、 Ohem、 soa、
。
79.6041〜3 ; Frohwein等Natu
re、p156.1960 ; Duff等、Natu
re、 p 103.1957;同じく、Bioch、
em :r、 515〜520170.19り8)によ
り容易に製造することができる。
re、p156.1960 ; Duff等、Natu
re、 p 103.1957;同じく、Bioch、
em :r、 515〜520170.19り8)によ
り容易に製造することができる。
式■のアルドース出発物質の6−置換基は水素化により
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化6−エー
テルをそのま〜供しうる脂肪族エーテルであってもよい
。この出発物質は例えば4−クロロ置換基を有して、既
に部分的に塩素化した4−クロロ−4−デオキシーガラ
クトース6−アセテートの如きジサッカライドを得るこ
とができる。
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化6−エー
テルをそのま〜供しうる脂肪族エーテルであってもよい
。この出発物質は例えば4−クロロ置換基を有して、既
に部分的に塩素化した4−クロロ−4−デオキシーガラ
クトース6−アセテートの如きジサッカライドを得るこ
とができる。
フラクトースドナーとフラクトースアクセフタ−間の反
応は水性系望ましくは酵素の最適−すなわち約60℃の
最適温度でPH5,4〜6.0で緩衝化させて行なうべ
きである。この2棟の反応体は一般に水溶性で、酵素は
相互の溶液中で分散させることができ、あるいは不溶性
担体に固定化するのがよい。固定化は例えばDIAIセ
ルロースの如きイオン交換樹脂を使い、それに酵素を強
力に成層させることができる。その他多くの固定化担体
として例えば米国特許第4,421.850号明細書に
記載の骨炭を使うことができる。
応は水性系望ましくは酵素の最適−すなわち約60℃の
最適温度でPH5,4〜6.0で緩衝化させて行なうべ
きである。この2棟の反応体は一般に水溶性で、酵素は
相互の溶液中で分散させることができ、あるいは不溶性
担体に固定化するのがよい。固定化は例えばDIAIセ
ルロースの如きイオン交換樹脂を使い、それに酵素を強
力に成層させることができる。その他多くの固定化担体
として例えば米国特許第4,421.850号明細書に
記載の骨炭を使うことができる。
反応混合物中のフラクトースドナ一対フラクトースアク
セプター比は1要である。余り低いと、収量が減少する
。余り高いと、特に筒面形含量の基質を使う場合、可能
なレバン反応か抑制されな(なる。一般に、約2=10
モル比(ドナー−アクセプター)が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高磯度で行な
うことができる。一般には、約401量%の反応体濃度
がうまくいくが、反応体の溶解性例えはグルコース6−
アセテートでは約75%までにより丈に高濃度も使用で
きる。酵素濃度は当然活性に依るか、溶液a当りB、
5ubtilis Noより 11871培養物33m
6から誘導した酵素を含む水溶液を使う場合、約50m
1/ljの濃度がうまくいく。
セプター比は1要である。余り低いと、収量が減少する
。余り高いと、特に筒面形含量の基質を使う場合、可能
なレバン反応か抑制されな(なる。一般に、約2=10
モル比(ドナー−アクセプター)が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高磯度で行な
うことができる。一般には、約401量%の反応体濃度
がうまくいくが、反応体の溶解性例えはグルコース6−
アセテートでは約75%までにより丈に高濃度も使用で
きる。酵素濃度は当然活性に依るか、溶液a当りB、
5ubtilis Noより 11871培養物33m
6から誘導した酵素を含む水溶液を使う場合、約50m
1/ljの濃度がうまくいく。
式■の化合物の続(塩素化は、4,1′−および6′−
位置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができ
る試薬を使って行なうことができる。
位置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができ
る試薬を使って行なうことができる。
この試薬はビルスマイヤー試薬で、ジアルキルアミドと
塩素化試薬との反応例えばジメチルホルムアミドと五塩
化燐、ホスゲン又は塩化チオニルと反応させて得られる
。スクロース6−エステルの塩素化の詳細はGB207
9749Aおよび米国特許第4,380,476号明細
1″に記載されている。
塩素化試薬との反応例えばジメチルホルムアミドと五塩
化燐、ホスゲン又は塩化チオニルと反応させて得られる
。スクロース6−エステルの塩素化の詳細はGB207
9749Aおよび米国特許第4,380,476号明細
1″に記載されている。
同様に、6−エステルの脱保睦は同一刊行物に記述され
、例えばメタノール中ナトリウムメトキシドを使う。6
−ベンジルエーテル基は水素化により除くことができる
。
、例えばメタノール中ナトリウムメトキシドを使う。6
−ベンジルエーテル基は水素化により除くことができる
。
史に、フラクトース−アクセプターアルコール(%にア
ルドース)とフラクトシルジー又はオリゴ−サツカライ
ドとを、アクセプターアルドースの不存在下少な(とも
0.1Mの辷/スクロースを有し、アクセプターアルド
ースの不存在下フックドースドナーからアルコール沈澱
性物質の実質県を生成せず、界面活性剤の存在により影
響を受けず、約60℃で最適活性を有しかつ45℃まで
で少なくとも20分間活性であるフラクトシルトランス
フェラーゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する
方法が供される。フラクトースアクセゾターは一般に、
ピラノース、フラノース糖又は置換糖でよ(、フラクト
シルジサッカライドに加えるのが望ましい。例には6−
置換グルコース誘導体例えばグルコース6−エステルと
エーテルおよび6−ゾオキシーD−グルコース(TGE
Iおよびその甘味類似物の製造上)、又は英国時計出願
GB2046757A(下記参照)のレバンスクラーゼ
と併用するのに示唆された物質を含む。フラクトシルジ
ー又はオリゴ−サツカライドはスクロース、ラフィノー
ス又はスタキオースを含んでよい。
ルドース)とフラクトシルジー又はオリゴ−サツカライ
ドとを、アクセプターアルドースの不存在下少な(とも
0.1Mの辷/スクロースを有し、アクセプターアルド
ースの不存在下フックドースドナーからアルコール沈澱
性物質の実質県を生成せず、界面活性剤の存在により影
響を受けず、約60℃で最適活性を有しかつ45℃まで
で少なくとも20分間活性であるフラクトシルトランス
フェラーゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する
方法が供される。フラクトースアクセゾターは一般に、
ピラノース、フラノース糖又は置換糖でよ(、フラクト
シルジサッカライドに加えるのが望ましい。例には6−
置換グルコース誘導体例えばグルコース6−エステルと
エーテルおよび6−ゾオキシーD−グルコース(TGE
Iおよびその甘味類似物の製造上)、又は英国時計出願
GB2046757A(下記参照)のレバンスクラーゼ
と併用するのに示唆された物質を含む。フラクトシルジ
ー又はオリゴ−サツカライドはスクロース、ラフィノー
ス又はスタキオースを含んでよい。
B、 5ubtilie 11871由来の酵素の基質
特異性を更に詳述する。初期の仙死の示すところでは、
B、 5ubtilis (Marburg )のフラ
クトンルトランスフエラーゼ活性は、リン酸塩又はカル
ボン酸基の如き極性基がa−6の位置で置換されない限
り、アルドースのc−6における変化傾より修復されな
い。%に、アクセプタ〜のc−6位置での次の変化はレ
バンスクラーゼ、還元(L−ガラクトースからL−フコ
ース)、OHのO−グルコシルへの置換(D−グルコー
スからイソマルトース)およびC上のHのヒドロキシア
ルキル(m−が2クトーヌからD−グリセロ−D〜ガラ
クトヘプトース) (He5trin等、195B)を
抑制しない。スクロースのように同じグリコシド結合に
よりアルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有
する唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース6
−アセテートはスクロース又はラフィノースの代りにフ
ラクトースドナーとして作用しうる。
特異性を更に詳述する。初期の仙死の示すところでは、
B、 5ubtilis (Marburg )のフラ
クトンルトランスフエラーゼ活性は、リン酸塩又はカル
ボン酸基の如き極性基がa−6の位置で置換されない限
り、アルドースのc−6における変化傾より修復されな
い。%に、アクセプタ〜のc−6位置での次の変化はレ
バンスクラーゼ、還元(L−ガラクトースからL−フコ
ース)、OHのO−グルコシルへの置換(D−グルコー
スからイソマルトース)およびC上のHのヒドロキシア
ルキル(m−が2クトーヌからD−グリセロ−D〜ガラ
クトヘプトース) (He5trin等、195B)を
抑制しない。スクロースのように同じグリコシド結合に
よりアルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有
する唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース6
−アセテートはスクロース又はラフィノースの代りにフ
ラクトースドナーとして作用しうる。
しかし、本発明の新規酵素の場合に、非常に広範囲の糖
類はスクロース又はラフィノースから7ラクトースのア
クセプターとしているいろ働く。
類はスクロース又はラフィノースから7ラクトースのア
クセプターとしているいろ働く。
アクセプターの多くは、ヘキソース又はペントース例え
ばリボース、ソルボース、リキソース、アラビノースお
よびキシロースである。反応しないことが分っている唯
一のペントースはキシロースである。反応性アクセプタ
ーの多くはピラノース環構造を応用しうるか、キシリト
ールとグルコン酸も反応するようである。環構造が存在
する時、酸素又は硫黄を含むに違いないから1.イノシ
トールは反応せず、5−チオグルコースが反応する。
ばリボース、ソルボース、リキソース、アラビノースお
よびキシロースである。反応しないことが分っている唯
一のペントースはキシロースである。反応性アクセプタ
ーの多くはピラノース環構造を応用しうるか、キシリト
ールとグルコン酸も反応するようである。環構造が存在
する時、酸素又は硫黄を含むに違いないから1.イノシ
トールは反応せず、5−チオグルコースが反応する。
炭素3および4の構造上、例えばグルコースの代りにガ
ラクトース、6−0−メチルグルコース、4−クロロガ
ラクトースおよびD−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素1例えばメチルα−D−
グルコピラノシド、1−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素2で、マンノースの
ように各椎変化に耐えるが、2−ジオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素6では多くの構造
上の変化は6−リン酸塩、クロライド、アセテート、6
−ジオキシグルコース、6−0−メチルグルコース、6
−0−メチルがラクトースおよびラムノースの6−Hの
ように耐えるが、グルコヘプトースのOH,OH,0H
OH−基は反応性を抑制する。
ラクトース、6−0−メチルグルコース、4−クロロガ
ラクトースおよびD−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素1例えばメチルα−D−
グルコピラノシド、1−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素2で、マンノースの
ように各椎変化に耐えるが、2−ジオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素6では多くの構造
上の変化は6−リン酸塩、クロライド、アセテート、6
−ジオキシグルコース、6−0−メチルグルコース、6
−0−メチルがラクトースおよびラムノースの6−Hの
ように耐えるが、グルコヘプトースのOH,OH,0H
OH−基は反応性を抑制する。
メリビオース、ラクトース、インマルトースおよびセロ
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、2クチユロースやイソマルチュロース
の如きあるジサッカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセフ0タ
ー油桂は類似のマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、2クチユロースやイソマルチュロース
の如きあるジサッカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセフ0タ
ー油桂は類似のマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
最後に、多(の場合、1炭素原子以上で構造上の変化(
グルコースの)は反応を抑制しない、例えばがラクトー
ス6−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物が
例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクトシ
ル化ジサッカライドの混合物が生成される。
グルコースの)は反応を抑制しない、例えばがラクトー
ス6−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物が
例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクトシ
ル化ジサッカライドの混合物が生成される。
次の糖類はアクセプターとして作用することが分った。
D−アラビノース、フコース、6−ゾオキシグルコーヌ
、6−o−メチルガラクトース、ラクトース、がラクト
ース6−アセテート、マンノース、5−チオーD−グル
コース、マルトース、1−チオ−グルコース、マルトト
リオース、6−〇−メチルα−D−グルコース、マルト
ペンタオース、D(−)アラビノース、マルトトリオー
ス、6−クロロ−6−ジオキシグルコース、メリビオー
ス、ガラクトース、キンロース、イソマルトース、L−
アラビノース、ホエイ透過*<ラクトース)、4−クロ
ロがラクトース、リボース、リキソース、グルコース6
−アセテート、グルコン酸、グルコース6−リン酸塩、
L−ラムノース、6−〇−メチルグルコース、メチル−
〇−グルコシド、キシリトール、グリセロールおよびエ
タノール。
、6−o−メチルガラクトース、ラクトース、がラクト
ース6−アセテート、マンノース、5−チオーD−グル
コース、マルトース、1−チオ−グルコース、マルトト
リオース、6−〇−メチルα−D−グルコース、マルト
ペンタオース、D(−)アラビノース、マルトトリオー
ス、6−クロロ−6−ジオキシグルコース、メリビオー
ス、ガラクトース、キンロース、イソマルトース、L−
アラビノース、ホエイ透過*<ラクトース)、4−クロ
ロがラクトース、リボース、リキソース、グルコース6
−アセテート、グルコン酸、グルコース6−リン酸塩、
L−ラムノース、6−〇−メチルグルコース、メチル−
〇−グルコシド、キシリトール、グリセロールおよびエ
タノール。
キシロースにおいて特に興味あるアクセプターは、キシ
ルスクロースとして知られるβ、D−フラクトフラノン
ラフ2→1)α−D−キンロビラノシラフ産生する。他
の興味あるアクセプターはガラクトースで、β−D−フ
ラクトフラノンラフ2→1)−D−ガラクトビラノンド
(ガラクトヌクロース)を産生する。このタイプの生成
物はフ蝕性低く、過剰の七味が問題となっている分野で
は、スクロースの代替品として興味がある。ガラクトス
クロースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることか
でき、また容易に人手できることから、特に興味かもた
れる。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない(ス
クロースの約1θ〜15チ)。
ルスクロースとして知られるβ、D−フラクトフラノン
ラフ2→1)α−D−キンロビラノシラフ産生する。他
の興味あるアクセプターはガラクトースで、β−D−フ
ラクトフラノンラフ2→1)−D−ガラクトビラノンド
(ガラクトヌクロース)を産生する。このタイプの生成
物はフ蝕性低く、過剰の七味が問題となっている分野で
は、スクロースの代替品として興味がある。ガラクトス
クロースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることか
でき、また容易に人手できることから、特に興味かもた
れる。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない(ス
クロースの約1θ〜15チ)。
ドナー%異性について、絶対的要件としてα(1→2)
結合をもったスクロースに基づ(糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。
結合をもったスクロースに基づ(糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。
酵素作用により生成する新規のジサッカライド例えはキ
フルスクロースはドナーとして作用する。
フルスクロースはドナーとして作用する。
酵素触媒反応の生成物に常法の物理化学的手段例えばク
ロマトグラフィ特に尚圧液体クロマトグラフィ(I(P
LO)およびイオン交換樹脂クロマトグラフィにより副
生物と出発物質から分離できる。
ロマトグラフィ特に尚圧液体クロマトグラフィ(I(P
LO)およびイオン交換樹脂クロマトグラフィにより副
生物と出発物質から分離できる。
特に、アルドース環に6−ヒドロキシ基をもたなイ生成
物、例えばスクロース6−エステルやエーテル、キシロ
ース銹4体および6−デオキシスクロースは驚く程低い
極性を有し7、これがイオン交換樹脂クロマトグラフィ
な容易かつ効果的分離方法ニスる。ジビニルベンゼンで
架橋したポリスチレン樹脂例えはアンバーライ) XA
D樹脂は特に適している。この分離は、スクロース6−
誘導体を化学的方法により製造する時に必要な各柚置換
したスクロース誘導体の分離よりはるかに容易である。
物、例えばスクロース6−エステルやエーテル、キシロ
ース銹4体および6−デオキシスクロースは驚く程低い
極性を有し7、これがイオン交換樹脂クロマトグラフィ
な容易かつ効果的分離方法ニスる。ジビニルベンゼンで
架橋したポリスチレン樹脂例えはアンバーライ) XA
D樹脂は特に適している。この分離は、スクロース6−
誘導体を化学的方法により製造する時に必要な各柚置換
したスクロース誘導体の分離よりはるかに容易である。
スクロースの如きグルコシルフラクンドを使うフラクト
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を改質する。したがって、フ
ラクトースに転換することによりグルコースを除くのは
望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して達
成することができる。
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を改質する。したがって、フ
ラクトースに転換することによりグルコースを除くのは
望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して達
成することができる。
次の例により本発明を説明する。
例 I TGsの製造
a)酵素の調製
β−フラクトンルトランスフエラーゼをBacillu
、s 5ubtilie Noより 11871株から
得た最小スクロース培地(1001ffA/フラスコ)
を含む振盪フラスコ(250In/(容、4個のフラス
コ)に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導した。
、s 5ubtilie Noより 11871株から
得た最小スクロース培地(1001ffA/フラスコ)
を含む振盪フラスコ(250In/(容、4個のフラス
コ)に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導した。
培養物は指数期まで培養し、60℃で振盪し、ついで4
つの振盪フラスコの中味を・−緒にし、生育培地を遠心
分離(5000g15分間)により細胞から分離した。
つの振盪フラスコの中味を・−緒にし、生育培地を遠心
分離(5000g15分間)により細胞から分離した。
全酸素の20〜30%は細胞に結合したま〜であった。
生成した清澄液に固形硫酸アンモニウムを加えて65%
の飽和rtr−シ、o℃で45分間放置した。この操作
により望ましくないインベルターゼと他のタン白不純物
の殆んどが沈澱したか、多くの酵素は溶液中に残った。
の飽和rtr−シ、o℃で45分間放置した。この操作
により望ましくないインベルターゼと他のタン白不純物
の殆んどが沈澱したか、多くの酵素は溶液中に残った。
ついでこの試料を再遠心分PfI(20,0005’/
30分間)し、インベルターゼ活性を含む沈澱物を除い
た。更に硫酸アンモニウムをこの溶液に加え、95%飽
和度にし、0℃で45分間史に放置した。
30分間)し、インベルターゼ活性を含む沈澱物を除い
た。更に硫酸アンモニウムをこの溶液に加え、95%飽
和度にし、0℃で45分間史に放置した。
主としてフラクトシルトランスフェラーゼである2番目
の沈澱物が生成し、遠心分離(40,000&/45分
間)により集取し、50 mM IJン酸塩バッファー
、pH6に再溶解した。2回の沈澱の正味効果と2番目
の沈澱物の再溶解により実質的精製と酵素の濃縮をし、
タン白帯だけがポリアクリルアミド/l’A/電気泳動
により検出できた。最後に、残渣のJa酸アンモニウム
を53 mMリン酸塩バッファーに対し透析(0°C/
4時間)して、醇累調製物から除いた。
の沈澱物が生成し、遠心分離(40,000&/45分
間)により集取し、50 mM IJン酸塩バッファー
、pH6に再溶解した。2回の沈澱の正味効果と2番目
の沈澱物の再溶解により実質的精製と酵素の濃縮をし、
タン白帯だけがポリアクリルアミド/l’A/電気泳動
により検出できた。最後に、残渣のJa酸アンモニウム
を53 mMリン酸塩バッファーに対し透析(0°C/
4時間)して、醇累調製物から除いた。
透析した酵素はp−ヒドロキシマーキュリベンゾエート
(インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フェラーゼ活性に惑影伽を及はさない)の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフェラ
ーゼiA!!品は通常インベルターゼを含まないことが
分った。調製品のタン白含量は280 nmの吸収度を
測定して0.45 m9/ mlであった。N製した酵
素磨製品にもしばしば黒い色素が見られたが、調製品の
活性に悪影響はない。
(インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フェラーゼ活性に惑影伽を及はさない)の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフェラ
ーゼiA!!品は通常インベルターゼを含まないことが
分った。調製品のタン白含量は280 nmの吸収度を
測定して0.45 m9/ mlであった。N製した酵
素磨製品にもしばしば黒い色素が見られたが、調製品の
活性に悪影響はない。
b)スクロース6−アセテート
グルコース6−アセテート(真空乾燥恒[8051)と
粒化スクロース(160,? )なpi(5,4、マキ
ルベンバッファ−1oomeに室温で浴解し、脱イオン
水600me(40%w/v)で稀釈した。ついでこの
溶液を十分濾過し、酵素溶液28幅を加えた。
粒化スクロース(160,? )なpi(5,4、マキ
ルベンバッファ−1oomeに室温で浴解し、脱イオン
水600me(40%w/v)で稀釈した。ついでこの
溶液を十分濾過し、酵素溶液28幅を加えた。
ついで反応混合物を60℃で培養し、HPLO分析によ
りスクロース6−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース6−アセテートの最大濃度は約12091−
1であった。酵素を吸着するD]LiAEセルロースカ
ラムに通して反応混合物を濾過して酵素を取った。別法
には、65℃/1時間加熱して変性させることもできる
。酵素はスクロース6−アセテートをゆっくり加水分解
してフラクトースを遊離するように作用するので、酵素
を除くことは重要である。
りスクロース6−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース6−アセテートの最大濃度は約12091−
1であった。酵素を吸着するD]LiAEセルロースカ
ラムに通して反応混合物を濾過して酵素を取った。別法
には、65℃/1時間加熱して変性させることもできる
。酵素はスクロース6−アセテートをゆっくり加水分解
してフラクトースを遊離するように作用するので、酵素
を除くことは重要である。
ついで、生成物を分取HPLOにより単離して、少なく
とも85チ純度のスクロース6−アセテートを得、全体
の約50%の収率であった。酵素反応の初期速度は24
4.5111&スクロース6−アセテート/り酵素/時
間を生成することであった。酵素工程の収率はグルコー
ス6−アセテート消費で58%、スクロース6−アセテ
ート生成で48%であった。
とも85チ純度のスクロース6−アセテートを得、全体
の約50%の収率であった。酵素反応の初期速度は24
4.5111&スクロース6−アセテート/り酵素/時
間を生成することであった。酵素工程の収率はグルコー
ス6−アセテート消費で58%、スクロース6−アセテ
ート生成で48%であった。
C)スクロース6−アセテートの塩素化1)ビルスマイ
ヤー試薬の調製 五塩化燐(140g)を激しく攪拌しながらビーカー中
無水ジメチルホルムアミl’(250mlに加え、温度
は70〜80℃に保ち、攪拌しま1時間続け、反応混合
物を冷却、濾過した。結晶生成物をamf(2X20m
l)とジエチルエーテル(40ml )で洗い、デシケ
ータ−中で乾燥し、白色結晶としてビルスマイヤー試薬
(93F)を得た。
ヤー試薬の調製 五塩化燐(140g)を激しく攪拌しながらビーカー中
無水ジメチルホルムアミl’(250mlに加え、温度
は70〜80℃に保ち、攪拌しま1時間続け、反応混合
物を冷却、濾過した。結晶生成物をamf(2X20m
l)とジエチルエーテル(40ml )で洗い、デシケ
ータ−中で乾燥し、白色結晶としてビルスマイヤー試薬
(93F)を得た。
(11) スクロース6−アセテート溶液の調製スクロ
ース6−アセテードシラツデ(41,!i’。
ース6−アセテードシラツデ(41,!i’。
実際のスクロース6−アセテート含量28g1dmfに
溶解し稀釈して861R13とした。この溶液を分子フ
ルイで脱水し濾過した。
溶解し稀釈して861R13とした。この溶液を分子フ
ルイで脱水し濾過した。
(llil 塩素化
ビルスマイヤー試薬(ろ1/)をdmf (80m1)
に加え、混合物を0℃に冷却した。スクロース6−アセ
テート浴液(21mg、スクロース6−アセテ−)71
)をゆっくり加え、温度を20°C以1に維持した。反
応混合物を0℃で15分間攪拌してから、60℃の油浴
に60分移した。この浴を120℃60分加熱し、この
温度で2時間維持した。ついで反応混合物を20℃に冷
却し、メタノール−880アンモニア(2:1.8ON
)を添加して中和し、50℃以下に保持した。混合物を
シラツブ状に濃縮し、ピリジン(1007+11と無水
酢酸(100mlを加えてアセチル化した。
に加え、混合物を0℃に冷却した。スクロース6−アセ
テート浴液(21mg、スクロース6−アセテ−)71
)をゆっくり加え、温度を20°C以1に維持した。反
応混合物を0℃で15分間攪拌してから、60℃の油浴
に60分移した。この浴を120℃60分加熱し、この
温度で2時間維持した。ついで反応混合物を20℃に冷
却し、メタノール−880アンモニア(2:1.8ON
)を添加して中和し、50℃以下に保持した。混合物を
シラツブ状に濃縮し、ピリジン(1007+11と無水
酢酸(100mlを加えてアセチル化した。
50℃/2時間攪拌後、混合物を20℃に冷却し、温度
を60℃以下に保ちながらメタノール(80ml8)を
加えた。ついで混合物をシラツブ状に濃縮し、熱トルエ
ン(4X 10 Q me )で抽出した。トルエン抽
出液をシラツブ状に濃縮し、エチルアセテ−)(100
m#)に溶解した。エチルアセテート溶液を水(5X1
00ml)で洗い、その水はエチルアセテート(2X5
0m/l:)で逆抽出した。−緒にしたこのエチルアセ
テート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で脱
色し、シラツブ状に濃縮し、工業用メチル化スピリット
より結晶化して、4、 1’、6’−)リクロロ−4,
1’、6’−)リゾオキシガラクトスクロースペンタア
セテ−)(4,42,69%)を得た。
を60℃以下に保ちながらメタノール(80ml8)を
加えた。ついで混合物をシラツブ状に濃縮し、熱トルエ
ン(4X 10 Q me )で抽出した。トルエン抽
出液をシラツブ状に濃縮し、エチルアセテ−)(100
m#)に溶解した。エチルアセテート溶液を水(5X1
00ml)で洗い、その水はエチルアセテート(2X5
0m/l:)で逆抽出した。−緒にしたこのエチルアセ
テート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で脱
色し、シラツブ状に濃縮し、工業用メチル化スピリット
より結晶化して、4、 1’、6’−)リクロロ−4,
1’、6’−)リゾオキシガラクトスクロースペンタア
セテ−)(4,42,69%)を得た。
(1v)脱エステル化
ペンタアセテートを無水メタノールに溶解し、室温で5
時間触媒量のす) IJウムメトキシドで処理した。つ
いでこの溶液を脱イオン化し蒸発させて、4. 1’、
6’−)リクロロ−4,1’、6’−)リゾオキシが
ラクトスクロース(90%)を得た。
時間触媒量のす) IJウムメトキシドで処理した。つ
いでこの溶液を脱イオン化し蒸発させて、4. 1’、
6’−)リクロロ−4,1’、6’−)リゾオキシが
ラクトスクロース(90%)を得た。
例 2
4、 1’、6’−トリクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシがラクトスクロース(6−ジオキシ−T
GS ) (類似の甘味度を有するTGSの関連体)の
製造。
テトラデオキシがラクトスクロース(6−ジオキシ−T
GS ) (類似の甘味度を有するTGSの関連体)の
製造。
(1)6−ジオキシスクロース
単離、精製および結晶化
6−ゾオキシーD−グルコース(D−キノボース、20
g)とスクロースを、例1と同じ反応条件に供し、6−
ジオキシスクロース、D−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容fc 140 mt、を得
た。6−ジオキシスクロースを1、Waters Pr
epak 500 C18(逆相カラム)と水を溶離剤
として使って、分取HPLOにより混合物から分別した
。混合物中の6−ジオキシスクロースと他の成分間に篤
(程保持時間に大きな差異がみられた。D−キノボース
、スクロースおよびD−グルコースを注入後4〜9分間
で溶離され、6−ジオキシスクロースにわずか29分(
極大ピーク)であった。大きな分離は材料の分別を一層
可能にした。、6−ジオキシスクロースを含む溶離剤を
減圧不蒸発乾固(給温度50℃)して、きれいなシラツ
ブ(16,7,?、42%)を得、室温で放置して結晶
化させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は
180〜181℃、〔α〕9十57.6°(旦2.5、
水)、マススペクトル、m/θ293(M″−0H3−
H2O)、130−NMRスペクトル(Oppmで内部
DSSについてのD20溶液)炭素原子 化学シフト、
ppm 2’ 106.32 1 94.70 5’ 84.01 3′79.04 5 77.74 4’ 76.73 3 74.93 2 73.95 4 71 、oソ ロ’ 65.[)2 1’ 65.77 6 19.56 (2)6−ジオキシスクロースの選択的塩素化6−ジオ
キシスクロース(2,8,?)をDMF(10mlに溶
解し、その溶液なりMF (ろQmA)中ビルスマイヤ
ー試薬(15,@)のサスヘンジョンに松加し、温度を
10℃以下に保った。混合物を室温で10分間攪拌し、
ついで攪拌しながら120℃で2時間加熱した。混合物
を室温に冷却し、メタタール−水酸化アンモニウム浴液
(1:1.20” )を加えた。混合物を70℃で濃縮
し、トルエン(2X 2 D m/i )を残渣から蒸
発させ、ビリジy(50mjn中無水自゛「酸で600
C/ろ時間アセチル化した。メタノール(50廐)を加
え、混合物を蒸発濃縮して、攪拌と傾潟によりトルエン
(4X50mg)で60℃抽出した。−緒にしたトルエ
ン抽出液を蒸発乾固し、残渣をシリカゲル(石油エーテ
ル−エーテル、2:1、ついで1:1)でクロマトグラ
フにかけ、溶媒蒸発後淡黄色ンラツプとして中間の4.
1’、6’−トリクロロ−4゜6、 1’、6’−テ
トラデオキシガラクトスクローステトラアセテート(ろ
i、?、64%)を得た。
g)とスクロースを、例1と同じ反応条件に供し、6−
ジオキシスクロース、D−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容fc 140 mt、を得
た。6−ジオキシスクロースを1、Waters Pr
epak 500 C18(逆相カラム)と水を溶離剤
として使って、分取HPLOにより混合物から分別した
。混合物中の6−ジオキシスクロースと他の成分間に篤
(程保持時間に大きな差異がみられた。D−キノボース
、スクロースおよびD−グルコースを注入後4〜9分間
で溶離され、6−ジオキシスクロースにわずか29分(
極大ピーク)であった。大きな分離は材料の分別を一層
可能にした。、6−ジオキシスクロースを含む溶離剤を
減圧不蒸発乾固(給温度50℃)して、きれいなシラツ
ブ(16,7,?、42%)を得、室温で放置して結晶
化させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は
180〜181℃、〔α〕9十57.6°(旦2.5、
水)、マススペクトル、m/θ293(M″−0H3−
H2O)、130−NMRスペクトル(Oppmで内部
DSSについてのD20溶液)炭素原子 化学シフト、
ppm 2’ 106.32 1 94.70 5’ 84.01 3′79.04 5 77.74 4’ 76.73 3 74.93 2 73.95 4 71 、oソ ロ’ 65.[)2 1’ 65.77 6 19.56 (2)6−ジオキシスクロースの選択的塩素化6−ジオ
キシスクロース(2,8,?)をDMF(10mlに溶
解し、その溶液なりMF (ろQmA)中ビルスマイヤ
ー試薬(15,@)のサスヘンジョンに松加し、温度を
10℃以下に保った。混合物を室温で10分間攪拌し、
ついで攪拌しながら120℃で2時間加熱した。混合物
を室温に冷却し、メタタール−水酸化アンモニウム浴液
(1:1.20” )を加えた。混合物を70℃で濃縮
し、トルエン(2X 2 D m/i )を残渣から蒸
発させ、ビリジy(50mjn中無水自゛「酸で600
C/ろ時間アセチル化した。メタノール(50廐)を加
え、混合物を蒸発濃縮して、攪拌と傾潟によりトルエン
(4X50mg)で60℃抽出した。−緒にしたトルエ
ン抽出液を蒸発乾固し、残渣をシリカゲル(石油エーテ
ル−エーテル、2:1、ついで1:1)でクロマトグラ
フにかけ、溶媒蒸発後淡黄色ンラツプとして中間の4.
1’、6’−トリクロロ−4゜6、 1’、6’−テ
トラデオキシガラクトスクローステトラアセテート(ろ
i、?、64%)を得た。
MBXm/e 283.285.287(ソ:6:1、
ジクロロ−ジー〇−アセチルフラクトース残渣)および
継続ロスに相当するビーク6 D (0R3C’02H
)、42 (C!H2=O=0)および36 (Mol
) ; 249.251 (0H20ロスでろ:1、
−モノクロロージデオキシ−ジー〇−アセチルガラクト
ース残渣)および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
ジクロロ−ジー〇−アセチルフラクトース残渣)および
継続ロスに相当するビーク6 D (0R3C’02H
)、42 (C!H2=O=0)および36 (Mol
) ; 249.251 (0H20ロスでろ:1、
−モノクロロージデオキシ−ジー〇−アセチルガラクト
ース残渣)および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
テトラアセテートをメタノール(30mlに溶解し、室
温でナトリウムメトキサイド(i M、 pi−19)
により脱アセチル化した。溶液をABberlyst
15(H+)カチオン交換樹脂で中和し、泗過し、蒸発
乾固した。白色固体の生成物が得られた。
温でナトリウムメトキサイド(i M、 pi−19)
により脱アセチル化した。溶液をABberlyst
15(H+)カチオン交換樹脂で中和し、泗過し、蒸発
乾固した。白色固体の生成物が得られた。
〔α)9+87.1°(、(!1.0、アセトン):
130−NMRスペクトル(Oppmの内部DSSにつ
いてD20溶液) 2’ 106.02 1 95.41 5’ 83.75 3’ 78.89 4’ 78.04 5 7[]、95 4 70、[]3 2 69 、78 3 69.28 1 ’ 47.46 6’ 715.99 6 19.61 4、 1’、6’−)ジクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシガラクトスクロースはスクロースの40
0倍の甘味があることが分った(8qb溶液)。
130−NMRスペクトル(Oppmの内部DSSにつ
いてD20溶液) 2’ 106.02 1 95.41 5’ 83.75 3’ 78.89 4’ 78.04 5 7[]、95 4 70、[]3 2 69 、78 3 69.28 1 ’ 47.46 6’ 715.99 6 19.61 4、 1’、6’−)ジクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシガラクトスクロースはスクロースの40
0倍の甘味があることが分った(8qb溶液)。
例 6
例1の方法を繰り返えしたが、b)段階で6−アセテー
トの代りにグルコース6−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた3、段階C)は前のように行なって、
類似の収率でTGSを得た。
トの代りにグルコース6−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた3、段階C)は前のように行なって、
類似の収率でTGSを得た。
例 4
B、5ubtilis Marburg 株 16 B
、N0IB 11872株又はN0IB11873株か
ら誘導した酵素を段階b)で使って、例1の方法を改変
することかできる。反応は同じように進行したが、反応
速度は低かった。
、N0IB 11872株又はN0IB11873株か
ら誘導した酵素を段階b)で使って、例1の方法を改変
することかできる。反応は同じように進行したが、反応
速度は低かった。
例 5
DBAEイオン交換セルロースを使ってB、 5ubt
il土θN0IE 11871由来の7ラクトンルトラ
ンスフエシーゼの固定化と精製おJ−ひキシルスクロー
スの製造。
il土θN0IE 11871由来の7ラクトンルトラ
ンスフエシーゼの固定化と精製おJ−ひキシルスクロー
スの製造。
DEARイオン交換セルロース(DE52)を50mM
マキルベンバッファーpH5,4で完全K Aい、つい
でM 術化した基質(スクロース−キシロース2:1.
40%w/■、全糖)で洗った。ブフナーフィルターで
殆んど乾燥するまで濾過した後、例1のようにB、 5
ubtilis由来の7ラクトンルトランスフエ2−ゼ
標品8uとDEAE−1=ルロ−ス(10,V )を攪
拌下60℃715分出1混合した。DEAFiセルロー
スと酵素の混合物をIQmAジャケット伺きカラム(1
9X1cm)に詰め、チャーチルサーモザーキュL’−
タ−テ30℃ニ保った。DEAEセルロースを落下流出
させ、落下物を果めた。基質を約1.0m1h−”の流
速で、ワトソンーマーロウポンフ0を使いカラムまで送
り、溶離剤を−i+)J隔で集め、フラクトシルトラン
スフェラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
m(OD280 )も沖1足した。試料を試験するため
に、Q、im#の液体試料又は0.1 gの固定化酵素
(DE52に)を基質2 ml、!:AK30℃/4時
間培養した。「キシルスクロース」製造用キシロース/
スクロース基質を使って、固定化処理後に残っている清
濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素調製物りタン白
濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に最初に存在する
酵素の68.5 %は最初に存在するタン白質の86襲
と共に固定化されたことが分った。この固定化酵素は遊
離酵素の均等量と比較して80.2%の初期活性を示し
た。2つの調製物の活性は夫々0.38&キシルスクロ
一ス/I固定化酵素/時間および0.865 、?キシ
ルスクロース/縦酵素抽出液/時間であった。
マキルベンバッファーpH5,4で完全K Aい、つい
でM 術化した基質(スクロース−キシロース2:1.
40%w/■、全糖)で洗った。ブフナーフィルターで
殆んど乾燥するまで濾過した後、例1のようにB、 5
ubtilis由来の7ラクトンルトランスフエ2−ゼ
標品8uとDEAE−1=ルロ−ス(10,V )を攪
拌下60℃715分出1混合した。DEAFiセルロー
スと酵素の混合物をIQmAジャケット伺きカラム(1
9X1cm)に詰め、チャーチルサーモザーキュL’−
タ−テ30℃ニ保った。DEAEセルロースを落下流出
させ、落下物を果めた。基質を約1.0m1h−”の流
速で、ワトソンーマーロウポンフ0を使いカラムまで送
り、溶離剤を−i+)J隔で集め、フラクトシルトラン
スフェラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
m(OD280 )も沖1足した。試料を試験するため
に、Q、im#の液体試料又は0.1 gの固定化酵素
(DE52に)を基質2 ml、!:AK30℃/4時
間培養した。「キシルスクロース」製造用キシロース/
スクロース基質を使って、固定化処理後に残っている清
濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素調製物りタン白
濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に最初に存在する
酵素の68.5 %は最初に存在するタン白質の86襲
と共に固定化されたことが分った。この固定化酵素は遊
離酵素の均等量と比較して80.2%の初期活性を示し
た。2つの調製物の活性は夫々0.38&キシルスクロ
一ス/I固定化酵素/時間および0.865 、?キシ
ルスクロース/縦酵素抽出液/時間であった。
固定化酵素(10gw/w )をカラムに詰め、30℃
で約2週間連続して作用させ、溶離液のpi(の変化又
は微生物のコンタミの徴候はみられなかった。少しのタ
ン白質と酵素が最初の操作6日で脱着し、最初に吸着し
たクン白質の24%および最初に吸着した酵素活性の2
66%となった。固定化酵素活性は処理半減ル195時
間で駄目になり、基質を生成物に転換する程度とカラム
を通る流速間の通常の逆関係を示した。使用した最低の
流速では、o、o 86qカラム容蓋(ecv )h
”、80T。
で約2週間連続して作用させ、溶離液のpi(の変化又
は微生物のコンタミの徴候はみられなかった。少しのタ
ン白質と酵素が最初の操作6日で脱着し、最初に吸着し
たクン白質の24%および最初に吸着した酵素活性の2
66%となった。固定化酵素活性は処理半減ル195時
間で駄目になり、基質を生成物に転換する程度とカラム
を通る流速間の通常の逆関係を示した。使用した最低の
流速では、o、o 86qカラム容蓋(ecv )h
”、80T。
キシルスクロースへの転換率が達成され、カラム溶離散
には21 & l−’キシルスクロースを含有スる。こ
の収率はバッチ反応で得られたものより尚く、生成物は
)!1続的にカラムがら取り出され、蓄積せずかつ生成
物の阻害を来たさないから、カラムのプラグφフローは
キシルスクロースの生成には有利である。全体にこれら
の操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこで生
成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られる。
には21 & l−’キシルスクロースを含有スる。こ
の収率はバッチ反応で得られたものより尚く、生成物は
)!1続的にカラムがら取り出され、蓄積せずかつ生成
物の阻害を来たさないから、カラムのプラグφフローは
キシルスクロースの生成には有利である。全体にこれら
の操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこで生
成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られる。
最初に使用した易溶性酵素と違って、固定化酵素は若干
の副産物を導き、反応中に生成される。
の副産物を導き、反応中に生成される。
フラクトースは少し生成されるか、固定化に使った最初
の酵素抽出液により生成されるより少ない。
の酵素抽出液により生成されるより少ない。
多分抽出液を汚染するインベルターゼ活性がDE52に
ほんの一部吸着されたからであろう。16〜20分の保
持時間でHPLOカラムから非常に遅く溶離された少量
の化合物は固定化酵素から溶離液中に見られるが、可溶
性酵素反応の分析中気が付かなかった。これらは多分酵
素により反応体分子のホールド・アップは酵素との接触
時IBJを増すから、重合化の可能性がおきる。
ほんの一部吸着されたからであろう。16〜20分の保
持時間でHPLOカラムから非常に遅く溶離された少量
の化合物は固定化酵素から溶離液中に見られるが、可溶
性酵素反応の分析中気が付かなかった。これらは多分酵
素により反応体分子のホールド・アップは酵素との接触
時IBJを増すから、重合化の可能性がおきる。
基質のキクローヌ含量は13311!−” であるから
、最大可能キシルスクロース濃度は266111!−’
であった。0.086 ecvh−”で観察された最大
調度はこれの80チ、すなわち210 Ml−’であっ
たか、反応中に消費されたキシロースを基準にして計算
して、69.5%の反応を示した。収率はバッチ反応よ
り高(、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタント
に生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比較
して非4か性だから、正荷電した固定化担体がら離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利そあろう。
、最大可能キシルスクロース濃度は266111!−’
であった。0.086 ecvh−”で観察された最大
調度はこれの80チ、すなわち210 Ml−’であっ
たか、反応中に消費されたキシロースを基準にして計算
して、69.5%の反応を示した。収率はバッチ反応よ
り高(、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタント
に生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比較
して非4か性だから、正荷電した固定化担体がら離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利そあろう。
グルコース6−アセテートからスクロース6−アセテー
ト、6−o−メチルグルコースから6−〇−メチルスク
ロース、および6−0−ベンジルグルコースかう6−0
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
ト、6−o−メチルグルコースから6−〇−メチルスク
ロース、および6−0−ベンジルグルコースかう6−0
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
例1にしたがって調製した酵素(0,1mi )をスク
ロースとギンロース(1:1)の4%w/v溶M2 m
ljと混合し、pH5で50℃で緩衝化した。キシルス
クロースなHPLOにより確認した。レバン生成をプ゛
C学的に確認した。谷線酵素による比較結果は次の通り
である。
ロースとギンロース(1:1)の4%w/v溶M2 m
ljと混合し、pH5で50℃で緩衝化した。キシルス
クロースなHPLOにより確認した。レバン生成をプ゛
C学的に確認した。谷線酵素による比較結果は次の通り
である。
Noより 11871 8.6 0
No1B 11872 2.9 検出可能1[3より1
18751.4 + ハービカラー 0.87 廿 したがって、本発明の酵素はMarburg株酵素より
少なくとも10倍のキシルスクロースを生成した。No
より 11871酵素の場合には少なくとも100倍で
ある。レバンの拮抗的産生は少ない。
18751.4 + ハービカラー 0.87 廿 したがって、本発明の酵素はMarburg株酵素より
少なくとも10倍のキシルスクロースを生成した。No
より 11871酵素の場合には少なくとも100倍で
ある。レバンの拮抗的産生は少ない。
例 6 ガラクトスクロースの製造。
リン酸塩、クエン酸塩バッファー(pH5,9)に溶解
した等重量のスクロースとがラクトースを含む基質40
%(w/v ) 15 mlは、酵素を95%硫酸アン
モニウム飽和浴液で沈澱させ、この沈澱物を再溶解しつ
いで不純物を65%硫酸アンモニウム飽和浴液で沈澱さ
せて一部精製した少容量のS。
した等重量のスクロースとがラクトースを含む基質40
%(w/v ) 15 mlは、酵素を95%硫酸アン
モニウム飽和浴液で沈澱させ、この沈澱物を再溶解しつ
いで不純物を65%硫酸アンモニウム飽和浴液で沈澱さ
せて一部精製した少容量のS。
5ubtilis N0IB 11871フラクトンル
トランスフエラーゼと共に60℃で培養した。
トランスフエラーゼと共に60℃で培養した。
約24時間の培養後、生成物は逆相カラム(多孔性黒鉛
炭素、5μ直径、溶離剤5qb水性アセトニトリル)で
HPLOクロマトグラフィにより分離した。がラクトス
クロースの収率では丈に増加は、それ以上培養を続けて
もあるいは新しい酵素を加えても得られなかった。ガラ
クトスクロースの最大収率は約0.35&/9がラクト
ースと約0.45Vjl消費スクロースであった。
炭素、5μ直径、溶離剤5qb水性アセトニトリル)で
HPLOクロマトグラフィにより分離した。がラクトス
クロースの収率では丈に増加は、それ以上培養を続けて
もあるいは新しい酵素を加えても得られなかった。ガラ
クトスクロースの最大収率は約0.35&/9がラクト
ースと約0.45Vjl消費スクロースであった。
例 7
4、I’、6’−トリブロモ−4,1’、6’−トリデ
オキシガラクトスクロース。
オキシガラクトスクロース。
(al ビスマイヤー試系の調製
臭化チオニル(280ml)を激しく憤拌しながら、無
水冷ジメチルホルムアミド<260m1)に加えた。混
合物を70〜b 史に1時間攪拌し、周囲温度に冷却した。混合物をjし
過し、残渣をジメチルホルムアミド(2X50me)と
ジエチルエーテル(100miで洗い、デシケータ−中
で脱水し、32011の試楽を得た。
水冷ジメチルホルムアミド<260m1)に加えた。混
合物を70〜b 史に1時間攪拌し、周囲温度に冷却した。混合物をjし
過し、残渣をジメチルホルムアミド(2X50me)と
ジエチルエーテル(100miで洗い、デシケータ−中
で脱水し、32011の試楽を得た。
(b) スクロースアセテートのブロム化DMF (2
0ml )中スクロース6−アセテート(5y)の溶液
を例1のように調製し、攪拌1温度を20℃以下/ 3
0分間保ちながら、DMF(507111)中ビスマイ
ヤー試薬(251)の冷サスペンションで処理した。つ
いで、攪拌混合物を周囲温度760分間攪拌し、110
℃に加熱しついで更に1.75時間攪拌した。それを2
0℃に冷却し、メタノールと濃アンモニア(0,880
)の2:1混合物を添加して中和し、そして40℃以下
に保った。混合物をシラツブに濃縮し、ピリジン(10
0mA)中無水酢酸(1007d)で50℃/2時間ア
セチル化した。生成物はGB2101989Aと同じト
リブロムガラクトスクロースペンタアセテート(4,2
11)として例1のように回収した。
0ml )中スクロース6−アセテート(5y)の溶液
を例1のように調製し、攪拌1温度を20℃以下/ 3
0分間保ちながら、DMF(507111)中ビスマイ
ヤー試薬(251)の冷サスペンションで処理した。つ
いで、攪拌混合物を周囲温度760分間攪拌し、110
℃に加熱しついで更に1.75時間攪拌した。それを2
0℃に冷却し、メタノールと濃アンモニア(0,880
)の2:1混合物を添加して中和し、そして40℃以下
に保った。混合物をシラツブに濃縮し、ピリジン(10
0mA)中無水酢酸(1007d)で50℃/2時間ア
セチル化した。生成物はGB2101989Aと同じト
リブロムガラクトスクロースペンタアセテート(4,2
11)として例1のように回収した。
これを周囲温度で5時間ナトリウムメトキサイド(メタ
ノール91モル、pH9)で脱アセチル化し、ついでA
mberlyst 15 (H” )イオン交換樹脂で
脱イオン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB21019
89Aと同じ純粋のトリブロム糖を得た。
ノール91モル、pH9)で脱アセチル化し、ついでA
mberlyst 15 (H” )イオン交換樹脂で
脱イオン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB21019
89Aと同じ純粋のトリブロム糖を得た。
例 8 キシルスクロースの塩素化
キシルスクロース(例5がら)C5fl)を10℃でD
MFに溶解し、攪拌下10℃以下に維持したDMF (
25N)中側1のビルスマイヤー試薬(13&)の冷サ
スペンションに加えた。混合物を室温に60分かけて加
温し、ついで120℃にし、攪拌下3時間保った。混合
物を冷却し、メタノール/濃(0,880)アンモニア
1:1′で中和し、70℃で濃縮した。続いてトルエン
を蒸発させて水分を除き、残渣をピリジン(30mJ)
中無水酢酸(30ml )で60℃/6時間アセチル化
した。混合物をメタノール(507fflで処理し、蒸
発乾固した。残液を熱トルエン(60℃、4X5Q+n
A)で抽出し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。
MFに溶解し、攪拌下10℃以下に維持したDMF (
25N)中側1のビルスマイヤー試薬(13&)の冷サ
スペンションに加えた。混合物を室温に60分かけて加
温し、ついで120℃にし、攪拌下3時間保った。混合
物を冷却し、メタノール/濃(0,880)アンモニア
1:1′で中和し、70℃で濃縮した。続いてトルエン
を蒸発させて水分を除き、残渣をピリジン(30mJ)
中無水酢酸(30ml )で60℃/6時間アセチル化
した。混合物をメタノール(507fflで処理し、蒸
発乾固した。残液を熱トルエン(60℃、4X5Q+n
A)で抽出し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。
残渣をシリカゲル(石油エーテルニジメチルエーテル2
:1、ついで1:1)でクロマトグラフにかけ、ンラツ
デとしてトリクロロアラビノスクローステトラアセテ−
)(2,6,?)を得た。
:1、ついで1:1)でクロマトグラフにかけ、ンラツ
デとしてトリクロロアラビノスクローステトラアセテ−
)(2,6,?)を得た。
MSw/C283,285,287(9:6:1、ジク
ロロ−ジーO−アセチルフラクトース残俄):60 (
OH3002H)、42 (cH2=c=o )および
36 ()101 )の継続ロスに相当するピーク。
ロロ−ジーO−アセチルフラクトース残俄):60 (
OH3002H)、42 (cH2=c=o )および
36 ()101 )の継続ロスに相当するピーク。
265.237(3:1、モノクロロージー〇−アセチ
ルアラビノ残渣)および60と42の継続ロスに相当す
るピーク。
ルアラビノ残渣)および60と42の継続ロスに相当す
るピーク。
テトラアセテートをメタノール(30mg)に溶解し、
周囲温度pH9でメタノール中1モルナトリウムメトキ
サイドで脱アセチル化した。
周囲温度pH9でメタノール中1モルナトリウムメトキ
サイドで脱アセチル化した。
混合物をAmberlyst 15 (、H” )樹脂
で脱イオン化し、濾過、蒸発させた。生成物固形フオー
ムとして単離した。DXlol、9°(90済液、o
ppmで内部DSSについて)。
で脱イオン化し、濾過、蒸発させた。生成物固形フオー
ムとして単離した。DXlol、9°(90済液、o
ppmで内部DSSについて)。
2’ 106.0
1 95.8
5’ 83.9
5’ 78.8
4’77.9
2 70.6
3 70.4
5 66.4
4 63.9
1’ 47.3
6’ 45.9
この化合物は2qb溶液でスクロースめ甘味の25倍で
あることが分った。
あることが分った。
代理人 浅 村 皓
手続補正占(自発)
昭和59年8月//11
特許庁長官殿
1゜事件の表示
昭和59年特ir1願第128395号3、補正をする
者 事1′1との関係 持3′「出願人 住 所 4、代理人 昭和 年 月 口 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更なし)
者 事1′1との関係 持3′「出願人 住 所 4、代理人 昭和 年 月 口 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但しXは水素
原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基である)であり、
Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキシスク
ロース又はガラクトスクロース銹導体の製造において、
一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但し、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基であ
る)である)を有するアルドースを、フラクトシルトラ
ンスフェラーゼの存在下、フラクトシルジ−サツカライ
ド又はオリゴサツカライドと反応させて、一般式 (式中、Aは式Hについて記載した通りである)を有す
る化合物を得、式■の化合物を分離し、ついでこの化合
物を塩素化し、式1(Aが0H2Xを示し、Xがヒドロ
キシ基である)の化合物の場合、保護されたヒドロキシ
基を脱保護することを特徴とする、上記製造方法。 (2) フラクトシルトランスフェラーゼがバチルス・
サチルス(B、 eubtiliθ)又はエルウィニア
棟(Jl!rwinia sp、 )由来のものである
、特許請求の範囲第1項記載の方法。 (3) フラクトシルトランスフェラーゼはバチルス・
サチルス(B、 5ubtilis )株、Noより
11871、N0IB11872又はNOより1117
1由来のものである、特許請求の範囲第2項記載の方法
。 (4) フラクトシルトランスフェラーゼはアクセプタ
ーアルドースの不存在下で少なくとも0.1Mの軸対ス
クロース比を有し、アクセプターアルドースの不存在下
でフラクトースドナーから有意量のアルコール沈澱可能
な物質を形成せず、界面活性剤の存在に影響されず、約
60℃で最適活性を有しかつ45℃までで少なくとも2
0分間活性である、特許請求の範囲第2項、第6項又は
第4項記載の方法。 (5) フラクトクルサツカライドはスクロース、ラフ
ィノース又はスタキオースである、特許請求の範囲第1
項記載の方法。 (6) ビルスマイヤー試薬を使って塩素化を行なう、
特許請求の範囲第1項記載の方法。 (7) 保護されたヒドロキシ基は脂肪族又は芳香族カ
ルボニルオキシ基であり、加水分解により脱保護される
か、あるいはアリールブルコキシ基であり、還元開裂に
より脱保護する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 (8) アクセプターアルドースの不存在下で少なくと
も0.1Mの辷対シュクロース比を有し、アクセプター
アルドースの不存在下でフラクトースドナーから有意蓋
のアルコール沈澱可能な物質を形成せず、界面活性剤の
存在により影響されず、約60℃で最適活性を有しかつ
45℃までで少なくとも20分間活性である、フラクト
クルトランスフェラーゼ。 (9) バチルス・サチルス(、B、 5ubtili
s )由来の、特許請求の範囲第8項記載のフラクトシ
ルトランスフェラーゼ。 On バチルス・サチルス(B、 su’btilie
)株Noより11871.11872又は11875由
来の、特許請求の範囲第9項記載のフラクトシルトラン
スフェラーゼ。 αJ アルコール、フラクトシルジサッカライド又はオ
リゴザツカライドの水溶液を特許請求の範囲第8項記載
のフラクトシルトランスフェラーゼにより処理し、つい
で反応混合物からフラクトシドを分離することを特徴と
する、アルコールからフラクトシドを製造する方法。 (12酵素は固定化している、特許請求の範囲第1項又
は第11項記載の方法。 (131フルコールはD−7ラビノース、L−フコース
、6〜デオキシグルコース、6−oニメチルガラクトー
ス、ラクトース、がラクトース6−アセテート、マンノ
ース、5−チオ−シーグルコース、マルトース、1−チ
オ−グルコース、マルトトリオース、6−0−メチルα
−シーグルコース、マルトペンタオース、D−アラビノ
ース、マルトヘキサオース、6−クロロ−6−ジオキシ
グルコース、メリビオース、ガラクトース、キシロース
、インマルトース、L−アラビノース、ホエイ透過′r
i、(ラクトース)、4−クロロがラクトース、リボー
ス、リキソース、グルコース6−アセテート、グルコン
酸、グルコース6−リン酸塩、L−ラムノース、6−0
−メチルグルコース、メチルα−D−グルコシド、キシ
リトール、グリセロールおよびエタノールから選択する
、特許請求の範囲第11項記載の方法。 ■ フラクトフルジー又はオリゴサツカライドはスクロ
ース、ラフィノース又はスタキオースから選ぶ、特許請
求の範囲第11項又は第12項記載の方法。 (2) 4−クロロ−4−デオキシ−L−アラビノピラ
ノンルー1,6−ジクロロ−1,6−ジヂオキシフラク
トフラノシド(4,1’、 6’−トリクロロ−4,1
’、6’−トリデオキシ)アラビノスクロース。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8316790 | 1983-06-21 | ||
GB838316790A GB8316790D0 (en) | 1983-06-21 | 1983-06-21 | Chemical process |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6037993A true JPS6037993A (ja) | 1985-02-27 |
JPH0777559B2 JPH0777559B2 (ja) | 1995-08-23 |
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ID=10544535
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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---|---|
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EP (1) | EP0130054B1 (ja) |
JP (1) | JPH0777559B2 (ja) |
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CA (1) | CA1225348A (ja) |
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-
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1984
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