JP2834871B2 - フラクトース含有オリゴ糖の製造法 - Google Patents
フラクトース含有オリゴ糖の製造法Info
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- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フラクトース含有オリゴ糖の製造法に関
し、詳しくは糖転移活性の強い酵素を用いて効率よく安
価にフラクトース含有オリゴ糖を製造する方法に関す
る。
し、詳しくは糖転移活性の強い酵素を用いて効率よく安
価にフラクトース含有オリゴ糖を製造する方法に関す
る。
近年、健康志向の増大にともない、グルコシル基ある
いはフラクトシル基転移酵素を用いた種々の生理活性を
有するオリゴ糖，有用配糖体の合成等を研究が盛んに行
なわれている。カップリングシュガー 、フラクトオリ
ゴ糖，パラチノース，α−グルコシルステビオサイドな
どが虫歯にならない、またビフィズス菌増殖因子等の性
質をもつものとして実用化された例である。
いはフラクトシル基転移酵素を用いた種々の生理活性を
有するオリゴ糖，有用配糖体の合成等を研究が盛んに行
なわれている。カップリングシュガー 、フラクトオリ
ゴ糖，パラチノース，α−グルコシルステビオサイドな
どが虫歯にならない、またビフィズス菌増殖因子等の性
質をもつものとして実用化された例である。
現在、フラクトシル基転移酵素としてはバチルス・ズ
ブチリス（Bacillus subtilis）の生産するレバンシュ
クラーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Aapergillus
niger），ペニシリウム・オキザリクム（Penicillium o
xalicum），ぺニシリウム・フリクエンタンス（Penicil
lium frequentans），ペニシリウム・エスピー（Penici
llium sp.）K25などかびの生産するβ−フラクトフラノ
シダーゼが知らている。このうちレバンシュクラーゼの
糖転移作用を利用して合成されるキシルシュクロース，
イソマルトシルフラクトシドは抗う蝕性の性質を有し、
さらにラクトシュクロースはビフィズス菌増殖因子とし
ての活性を有していることより、これらのオリゴ糖は機
能性糖質として実用化される可能性を秘めている。しか
し、これらのオリゴ糖の生産に用いられていうレバンシ
ュクラーゼはショ糖によって誘導されるため、培地にシ
ョ糖の添加が不可欠であり、このため培養液にレバンを
作り、粘度が高くなるため扱いにくい。また、酵素の生
産性を低く、さらに耐熱性が低いなどの問題点が指摘さ
れている。また、従来のかびの生産するβ−フラクトフ
ラノシダーゼは菌体内酵素であり、受容体特異性も狭い
という欠点を持っている。
ブチリス（Bacillus subtilis）の生産するレバンシュ
クラーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Aapergillus
niger），ペニシリウム・オキザリクム（Penicillium o
xalicum），ぺニシリウム・フリクエンタンス（Penicil
lium frequentans），ペニシリウム・エスピー（Penici
llium sp.）K25などかびの生産するβ−フラクトフラノ
シダーゼが知らている。このうちレバンシュクラーゼの
糖転移作用を利用して合成されるキシルシュクロース，
イソマルトシルフラクトシドは抗う蝕性の性質を有し、
さらにラクトシュクロースはビフィズス菌増殖因子とし
ての活性を有していることより、これらのオリゴ糖は機
能性糖質として実用化される可能性を秘めている。しか
し、これらのオリゴ糖の生産に用いられていうレバンシ
ュクラーゼはショ糖によって誘導されるため、培地にシ
ョ糖の添加が不可欠であり、このため培養液にレバンを
作り、粘度が高くなるため扱いにくい。また、酵素の生
産性を低く、さらに耐熱性が低いなどの問題点が指摘さ
れている。また、従来のかびの生産するβ−フラクトフ
ラノシダーゼは菌体内酵素であり、受容体特異性も狭い
という欠点を持っている。
本発明者らは、受容体特異性が広く、糖転移活性の強
いβ−フラクトフラノシダーゼを菌体外に生産する微生
物アルスロバクター・エスピーＫ−１（FERM BP−319
2）を見出し、該微生物を培養してβ−フラクトフラノ
シダーゼを製造する方法および該β−フラクトフラノシ
ダーゼを利用してアルドシルフラクトシドを製造する方
法を確立した（特願平１−160660号明細書）。しかしな
がら、該β−フラクトフラノシダーゼを用いたフラクト
ース含有オリゴ糖の生産に関する報告はない。
いβ−フラクトフラノシダーゼを菌体外に生産する微生
物アルスロバクター・エスピーＫ−１（FERM BP−319
2）を見出し、該微生物を培養してβ−フラクトフラノ
シダーゼを製造する方法および該β−フラクトフラノシ
ダーゼを利用してアルドシルフラクトシドを製造する方
法を確立した（特願平１−160660号明細書）。しかしな
がら、該β−フラクトフラノシダーゼを用いたフラクト
ース含有オリゴ糖の生産に関する報告はない。
すなわち、本発明はアルドースまたはケトースの存在
下、ショ糖，ラフィノースおよびスタキオース中のいず
れかに下記の性質を有するβ−フラクトフラノシダーゼ
を作用させることを特徴とするフラクトース含有オリゴ
糖の製造法を提供するものである。
下、ショ糖，ラフィノースおよびスタキオース中のいず
れかに下記の性質を有するβ−フラクトフラノシダーゼ
を作用させることを特徴とするフラクトース含有オリゴ
糖の製造法を提供するものである。
（１） 本酵素は受容体として各種単糖，糖アルコー
ル，アルキルアルコール，配糖体，オリゴ糖等の存在
下、ショ糖に作用させると、フラクトシル基を受容体分
子に転移させ、その受容体特異性は極めて広い。
ル，アルキルアルコール，配糖体，オリゴ糖等の存在
下、ショ糖に作用させると、フラクトシル基を受容体分
子に転移させ、その受容体特異性は極めて広い。
（２） 本酵素はショ糖，エルロース，ネオケストー
ス，キシルシュクロース，ラフィノース，スタキオース
をよく分解するが、１−ケストース，ニストース，イヌ
ロビオース，レバンビオースには作用しにくい。
ス，キシルシュクロース，ラフィノース，スタキオース
をよく分解するが、１−ケストース，ニストース，イヌ
ロビオース，レバンビオースには作用しにくい。
（３） 本酵素は40℃にてpH6.5〜6.8が至適であり、pH
5.5〜10で安定である。
5.5〜10で安定である。
（４） 本酵素はpH6.5において至適温度は55℃であ
り、60℃でも70％以上の残存活性を示す。
り、60℃でも70％以上の残存活性を示す。
（５） 本酵素は銀，水銀，亜鉛，銅および錫の中から
選ばれた金属のイオンの存在で阻害を受ける。
選ばれた金属のイオンの存在で阻害を受ける。
（６） 本酵素は分子量52,000±2,500および58,000±
2,500（SDS−ディスクゲル電気泳動およびゲル濾過法に
よる）の２つからなる。
2,500（SDS−ディスクゲル電気泳動およびゲル濾過法に
よる）の２つからなる。
（７） 本酵素の等電点はそれぞれpH4.3および4.6（ア
ンフォライン電気泳動法による）である。
ンフォライン電気泳動法による）である。
本発明で用いるβ−フラクトフラノシダーゼは微生物
を用いて生産され、その生産菌としてはアルスロバクタ
ー属に属し、上記性質を有する酵素生産する能力を有す
るものであればよく、具体的にはアルスロバクター・エ
スピー（Arthrobacter sp.）Ｋ−１とその変異種変異株
などがあるが、これら微生物に制限されるものではな
く、上記酵素の生産能を有するものであればよい。ここ
で変異手段としては定法のものでよく、たとえばラジオ
アイソトープ（RI）、紫外線（UV）、ニトロソグアニジ
ンなどを用いて行えばよい。また、遺伝子組み換え技術
を適用することもできる。なお、アルスロバクター・エ
スピーＫ−１（FERM BP−3192）の菌学的性質の詳細
は、特願平１−160660号明細書に記載されている。
を用いて生産され、その生産菌としてはアルスロバクタ
ー属に属し、上記性質を有する酵素生産する能力を有す
るものであればよく、具体的にはアルスロバクター・エ
スピー（Arthrobacter sp.）Ｋ−１とその変異種変異株
などがあるが、これら微生物に制限されるものではな
く、上記酵素の生産能を有するものであればよい。ここ
で変異手段としては定法のものでよく、たとえばラジオ
アイソトープ（RI）、紫外線（UV）、ニトロソグアニジ
ンなどを用いて行えばよい。また、遺伝子組み換え技術
を適用することもできる。なお、アルスロバクター・エ
スピーＫ−１（FERM BP−3192）の菌学的性質の詳細
は、特願平１−160660号明細書に記載されている。
上記微生物を培養するための培地としては、炭素源，
窒素源等を含有し、微生物が最も効率よくβ−フラクト
フラノシダーゼを生産することのできる組成の培地であ
れば、特に制限はない。炭素源としてはショ糖，マルト
ース，ラクトース，可溶性澱粉などが好ましく、グルコ
ースのように発酵性の高いものは好ましくない。窒素源
としては硝酸塩、アンモニウム塩，酵母エキス，コーン
・スティープ・リカーなどが好ましい。この他、マグネ
シウム塩，カリシウム塩，リン酸塩などの無機塩類や、
微生物の成育に必要な栄養物質を培地に適宜加えること
ができる。最適の培地組成は、1.2％酵母エキス,0.8％
ポリペプトン,4％可溶性澱粉,0.4％（NH4）2HPO4および
0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）を含むものであるが、供試
菌株が目的とする酵素を大量に生産し得る組成を選定す
ればよい。
窒素源等を含有し、微生物が最も効率よくβ−フラクト
フラノシダーゼを生産することのできる組成の培地であ
れば、特に制限はない。炭素源としてはショ糖，マルト
ース，ラクトース，可溶性澱粉などが好ましく、グルコ
ースのように発酵性の高いものは好ましくない。窒素源
としては硝酸塩、アンモニウム塩，酵母エキス，コーン
・スティープ・リカーなどが好ましい。この他、マグネ
シウム塩，カリシウム塩，リン酸塩などの無機塩類や、
微生物の成育に必要な栄養物質を培地に適宜加えること
ができる。最適の培地組成は、1.2％酵母エキス,0.8％
ポリペプトン,4％可溶性澱粉,0.4％（NH4）2HPO4および
0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）を含むものであるが、供試
菌株が目的とする酵素を大量に生産し得る組成を選定す
ればよい。
本発明で用いるβ−フラクトフラノシダーゼを生産す
るためには、選定した培地に上記微生物を植菌し、pHを
中性ないし微アルアリ性、温度20℃から45℃、好ましく
は30℃から40℃に保ちつつ、10時間から５日間振盪ある
いは通気撹拌培養すればよい。
るためには、選定した培地に上記微生物を植菌し、pHを
中性ないし微アルアリ性、温度20℃から45℃、好ましく
は30℃から40℃に保ちつつ、10時間から５日間振盪ある
いは通気撹拌培養すればよい。
以上の様にして得られた培養物より酵素は常法により
採取、精製できる。たとえば培養物より遠心分離し、菌
体を除い上清液を粗酵素液として使用できる。さらに、
必要に応じて、既知の方法を適当に組合せて精製して使
用できる。精製の方法としては、例えば塩析法，疎水ク
ロマトグラフィー法，ゲル濾過法，イオン交換クロマト
グラフィー法など通常に用いられる手段を挙げることが
できる。
採取、精製できる。たとえば培養物より遠心分離し、菌
体を除い上清液を粗酵素液として使用できる。さらに、
必要に応じて、既知の方法を適当に組合せて精製して使
用できる。精製の方法としては、例えば塩析法，疎水ク
ロマトグラフィー法，ゲル濾過法，イオン交換クロマト
グラフィー法など通常に用いられる手段を挙げることが
できる。
本発明で用いるβ−フラクトフラノシダーゼは菌体外
酵素であり、培養液に酵素を畜積する。また、ショ糖に
よる誘導酵素ではなく、培地にショ糖を添加することな
く、他の炭素源を用いて培養が可能である。さらに、レ
バンシュクラーゼと異なり培養液中にレバンを生産する
ことがないことから酵素の回収は容易であり、実用的に
も有用である。
酵素であり、培養液に酵素を畜積する。また、ショ糖に
よる誘導酵素ではなく、培地にショ糖を添加することな
く、他の炭素源を用いて培養が可能である。さらに、レ
バンシュクラーゼと異なり培養液中にレバンを生産する
ことがないことから酵素の回収は容易であり、実用的に
も有用である。
本発明ではアルドースまたはケトース（受容体分子）
の存在下、ショ糖，ラフィノースおよびスタキオース
（供与体分子）の中のいずれかに上記の如くして得られ
るβ−フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトー
ス含有オリゴ糖を製造する。反応を行なうにあたり、本
酵素の性質を考慮して目的とするフラクトース含有オリ
ゴ糖の生成量が最大となるような条件を選定すべきであ
る。
の存在下、ショ糖，ラフィノースおよびスタキオース
（供与体分子）の中のいずれかに上記の如くして得られ
るβ−フラクトフラノシダーゼを作用させてフラクトー
ス含有オリゴ糖を製造する。反応を行なうにあたり、本
酵素の性質を考慮して目的とするフラクトース含有オリ
ゴ糖の生成量が最大となるような条件を選定すべきであ
る。
ここで受容体分子としてはβ−フラクトフラノシダー
ゼのフラクトシル基転移反応の受容体となりうるものが
望ましい。例えばβ−フラクトフラノシダーゼのフラク
トシル基転移反応によりショ糖若しくはラフィノース以
外のアルドシルフラクトシドを新たに生成し得るアルド
ースであり、すなわちグルコース若しくはメリビオース
以外のアルドースである単糖あるいはオリゴ糖が望まし
い。たとえばＤ−キシロース,D−ガラクトース,D−アラ
ビノース,L−アラビノース,L−ソルボース,L−フコー
ス，マルトース，セロビオース，キシロビオース，イソ
マルトース，ラクトース，マルトトリオース，イソマル
トトリオース，パノース，イソパノース等が適してい
る。反応に用いる受容体分子は１つに限らず複数でも可
能であり、これらの混合物でもよく、澱粉，ラアビノガ
ラクタン，キシラン，キシログルカンの様な多糖類の部
分加水分解物でもよい。
ゼのフラクトシル基転移反応の受容体となりうるものが
望ましい。例えばβ−フラクトフラノシダーゼのフラク
トシル基転移反応によりショ糖若しくはラフィノース以
外のアルドシルフラクトシドを新たに生成し得るアルド
ースであり、すなわちグルコース若しくはメリビオース
以外のアルドースである単糖あるいはオリゴ糖が望まし
い。たとえばＤ−キシロース,D−ガラクトース,D−アラ
ビノース,L−アラビノース,L−ソルボース,L−フコー
ス，マルトース，セロビオース，キシロビオース，イソ
マルトース，ラクトース，マルトトリオース，イソマル
トトリオース，パノース，イソパノース等が適してい
る。反応に用いる受容体分子は１つに限らず複数でも可
能であり、これらの混合物でもよく、澱粉，ラアビノガ
ラクタン，キシラン，キシログルカンの様な多糖類の部
分加水分解物でもよい。
目的とするフラクトース含有オリゴ糖を生成させるた
めには、その受容体分子と供与体分子とを共存せしめた
基質溶液にβ−フラクトフラノシダーゼを反応させれば
よい。反応時の受容体分子と供与体分子のモル比は1:5
から5:1が望ましく、基質濃度は10から50w/w％が望まし
い。反応時のpH及び温度はβ−フラクトフラノシダーゼ
が作用し、フラクトース含有オリゴ糖を生成するような
範囲であればよく、pH5.5から7.0、温度40から60℃の範
囲が選ばれる。酵素の添加量は１から50単位/g供与体の
範囲で使用され、反応時間は0.1から100時間の範囲が選
ばれる。
めには、その受容体分子と供与体分子とを共存せしめた
基質溶液にβ−フラクトフラノシダーゼを反応させれば
よい。反応時の受容体分子と供与体分子のモル比は1:5
から5:1が望ましく、基質濃度は10から50w/w％が望まし
い。反応時のpH及び温度はβ−フラクトフラノシダーゼ
が作用し、フラクトース含有オリゴ糖を生成するような
範囲であればよく、pH5.5から7.0、温度40から60℃の範
囲が選ばれる。酵素の添加量は１から50単位/g供与体の
範囲で使用され、反応時間は0.1から100時間の範囲が選
ばれる。
この様にして製造した反応液は、一般には酵素を加熱
失活させ、活性炭脱色，イオン交換樹脂を用いて脱塩，
脱色して混合液を得る。更に、活性炭カラムクロマトグ
ラフィーなどのクロマト操作により高純度に精製して目
的とするフラクトース含有オリゴ糖得ることができる。
失活させ、活性炭脱色，イオン交換樹脂を用いて脱塩，
脱色して混合液を得る。更に、活性炭カラムクロマトグ
ラフィーなどのクロマト操作により高純度に精製して目
的とするフラクトース含有オリゴ糖得ることができる。
次に、本発明を実施例により説明する。
製造例１ 普通寒天斜面培地にアルスロバクター・エスピー K−
１（FERM BP−3192）Ｄを接種し、37℃で２日間培養
後、その１白金耳をとり、1.2％酵母エキス,0.8％ポリ
ペプトン,4％可溶性澱粉,0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO
4・7H2O（pH7.0）の組成からなる液体培地（60ml培地/5
00ml肩付きフラスコ）に植菌し、37℃で２日間通気振盪
培養した。これを種菌とし、同組成からなる液体培地に
分注し、37℃で２日間通気振盪培養した。培養終了後、
培養液を遠心分離し、上清（粗酵素液）を膜1.1得
た。本液にはmlあたり30単位のβ−フラクトフラノシダ
ーゼを含有していた。
１（FERM BP−3192）Ｄを接種し、37℃で２日間培養
後、その１白金耳をとり、1.2％酵母エキス,0.8％ポリ
ペプトン,4％可溶性澱粉,0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO
4・7H2O（pH7.0）の組成からなる液体培地（60ml培地/5
00ml肩付きフラスコ）に植菌し、37℃で２日間通気振盪
培養した。これを種菌とし、同組成からなる液体培地に
分注し、37℃で２日間通気振盪培養した。培養終了後、
培養液を遠心分離し、上清（粗酵素液）を膜1.1得
た。本液にはmlあたり30単位のβ−フラクトフラノシダ
ーゼを含有していた。
製造例２ 1.2％酵母エキス,0.8％ポリペプトン,4％ラクトース,
0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）を培地
とし、500ml容坂口フラスコに培地を60ml分注し、これ
に同培地で２日間前培養した種菌（実施例１と同じ）を
4mlづつ植菌し、37℃で２日間前培養した。これを種菌
とし、12の５％コーンスティープリカー,3％ショ糖,
0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）からな
る培地に植菌し、pHを7.0に調整しながら25時間通気撹
拌培養した。培養終了後、培地液を遠心分離した菌体を
除去し、粗酵素液12を得た。この液の活性はmlあたり
140単位であった。
0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）を培地
とし、500ml容坂口フラスコに培地を60ml分注し、これ
に同培地で２日間前培養した種菌（実施例１と同じ）を
4mlづつ植菌し、37℃で２日間前培養した。これを種菌
とし、12の５％コーンスティープリカー,3％ショ糖,
0.4％（NH4）2HPO4,0.1％MgSO4・7H2O（pH7.0）からな
る培地に植菌し、pHを7.0に調整しながら25時間通気撹
拌培養した。培養終了後、培地液を遠心分離した菌体を
除去し、粗酵素液12を得た。この液の活性はmlあたり
140単位であった。
実施例１ ショ糖10gとキシロース10gの混液に、実施例１で得ら
れた粗酵素液をショ糖1gあたり10単位加え固形分濃度を
50％（w/w）とし、pHを6.5に調整後、60℃で20時間反応
せしめキシロースにフラクトシル基が転移したと思われ
る転移生成物Ａを28％含む反応液を得た。
れた粗酵素液をショ糖1gあたり10単位加え固形分濃度を
50％（w/w）とし、pHを6.5に調整後、60℃で20時間反応
せしめキシロースにフラクトシル基が転移したと思われ
る転移生成物Ａを28％含む反応液を得た。
この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供
し、水洗して単糖を除去したのち、５％エタノールでシ
ョ糖を溶出させた。その後、20％エタノール溶出画分を
濃縮し、さらに凍結乾燥法により粉末化して純度99％の
転移生成物Ａを7g得た。該転移生成物Ａは、酸加水分解
によりフラクトースとキシロースを生成し、サッカロミ
セス（Saccharomyces）を用いたβ−フラクトフラノシ
ダーゼ酵素分解では、フラクトースとキシロースの比が
1:1であった。また、該転移生成物Ａは還元力はなく、
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の保持時間および
ペーパークロマトグラフィーのRf値がレバンシュクラー
ゼを用いて調製した転移生成物と一致した。第１図に該
転移生成物Ａの13C−NMRのスペクトルを示す。
し、水洗して単糖を除去したのち、５％エタノールでシ
ョ糖を溶出させた。その後、20％エタノール溶出画分を
濃縮し、さらに凍結乾燥法により粉末化して純度99％の
転移生成物Ａを7g得た。該転移生成物Ａは、酸加水分解
によりフラクトースとキシロースを生成し、サッカロミ
セス（Saccharomyces）を用いたβ−フラクトフラノシ
ダーゼ酵素分解では、フラクトースとキシロースの比が
1:1であった。また、該転移生成物Ａは還元力はなく、
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の保持時間および
ペーパークロマトグラフィーのRf値がレバンシュクラー
ゼを用いて調製した転移生成物と一致した。第１図に該
転移生成物Ａの13C−NMRのスペクトルを示す。
第１図より明らかなように、104.89ppmにフラクトフ
ラノースの２位炭素のβ結合に特有のピークがみられる
ことおよびキシロースのアノメリック炭素はショ糖のグ
ルコースと同様の93.49ppmにピークがみられることか
ら、キシロースの１位はα結合していることが示され
た。従って、該転移生成物Ａは、キシロースにフラクト
シル基がβ−2,1結合したキシルシュクロースであるこ
とが確認された。
ラノースの２位炭素のβ結合に特有のピークがみられる
ことおよびキシロースのアノメリック炭素はショ糖のグ
ルコースと同様の93.49ppmにピークがみられることか
ら、キシロースの１位はα結合していることが示され
た。従って、該転移生成物Ａは、キシロースにフラクト
シル基がβ−2,1結合したキシルシュクロースであるこ
とが確認された。
実施例３ ラクトース5gとショ糖5gを予め水に溶かし、pHを6.0
とし、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g当り7.5
単位加え固形分濃度を40％（w/w）とし、40℃で15時間
反応せしめ転移生成物Ｂを30％含む反応液を得た。この
反応液の高速液体クロマトグラム（カラム:YMC−Pack A
Q）を第２図に示す。
とし、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g当り7.5
単位加え固形分濃度を40％（w/w）とし、40℃で15時間
反応せしめ転移生成物Ｂを30％含む反応液を得た。この
反応液の高速液体クロマトグラム（カラム:YMC−Pack A
Q）を第２図に示す。
反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、オ
リゴ糖をカラムに吸着させ、アルコール濃度を順次高く
することによってオリゴ糖を溶解させ、15％アルコール
画分を濃縮し、活性炭およびイオン交換樹脂を用いて脱
色，脱塩後、凍結乾燥を行うことにより純度98％の転移
生成物Ｂを2.7g得た。さらに、該転移生成物Ｂの１部を
分取用高速液体クロマトグラフィーに供したところ、第
３図に示したように単一のピークとして得られた。ま
た、該転移生成物Ｂを加水分解したところ、グルコー
ス，ガラクトース，フラクトースから成ることが示され
た。β−フラクトフラノシダーゼによる加水分解ではラ
クトースとフラクトースが等モル生成した。第４図に該
転移生成物Ｂの13C−NMRのスペクトルを示す。
リゴ糖をカラムに吸着させ、アルコール濃度を順次高く
することによってオリゴ糖を溶解させ、15％アルコール
画分を濃縮し、活性炭およびイオン交換樹脂を用いて脱
色，脱塩後、凍結乾燥を行うことにより純度98％の転移
生成物Ｂを2.7g得た。さらに、該転移生成物Ｂの１部を
分取用高速液体クロマトグラフィーに供したところ、第
３図に示したように単一のピークとして得られた。ま
た、該転移生成物Ｂを加水分解したところ、グルコー
ス，ガラクトース，フラクトースから成ることが示され
た。β−フラクトフラノシダーゼによる加水分解ではラ
クトースとフラクトースが等モル生成した。第４図に該
転移生成物Ｂの13C−NMRのスペクトルを示す。
第４図より明らかなように、フラクトースおよびグル
コース部分はグルコースの４位の炭素以外は、ショ糖の
文献値と同様なピークが見られた。また、ガラストース
部分はラクトースの文献値のものと同じケミカルシフト
を示した。従って、該転移生成物Ｂは、フラクトシル基
がラクトースのグルコース部分の１位にβ−2,1結合し
たラクトシルフラクトシド（ラクトシュクロース）であ
ることが確認された。
コース部分はグルコースの４位の炭素以外は、ショ糖の
文献値と同様なピークが見られた。また、ガラストース
部分はラクトースの文献値のものと同じケミカルシフト
を示した。従って、該転移生成物Ｂは、フラクトシル基
がラクトースのグルコース部分の１位にβ−2,1結合し
たラクトシルフラクトシド（ラクトシュクロース）であ
ることが確認された。
実施例３ 以下に示す方法により、ラクトシュクロース生成反応
条件の検討を行った。
条件の検討を行った。
（１） ラクトースとショ糖の混合比率あの影響 ラクトシュクロースの生成量に及ぼすラクトースとシ
ョ糖の混合比率の影響を調べた。ラクトース（0.066〜
1.0g）とショ糖（0.2g）を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）
に溶解し、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g当り
10単位加え固形分濃度を50％（w/w）とし、40℃で20時
間反応せしめ生成物を高速液体クロマトグラフィーで分
析した。結果を第５図に示す。
ョ糖の混合比率の影響を調べた。ラクトース（0.066〜
1.0g）とショ糖（0.2g）を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）
に溶解し、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g当り
10単位加え固形分濃度を50％（w/w）とし、40℃で20時
間反応せしめ生成物を高速液体クロマトグラフィーで分
析した。結果を第５図に示す。
第５図より明らかなように、ラクトースの混合比率が
高いほどフラクトースの生成量は少なく、転移率は高く
なるが、固形分あたりのラクトシュクロースの生成量は
少なくなった。一方、ショ糖の混合比率が高くなるとフ
ラクトースの生成量は多くなり、転移率は低くなった。
ラクトースとショ糖の混合比率を1:1とした場合、ラク
トシュクロース生成量は固形分あたり30％と最も高くな
った。
高いほどフラクトースの生成量は少なく、転移率は高く
なるが、固形分あたりのラクトシュクロースの生成量は
少なくなった。一方、ショ糖の混合比率が高くなるとフ
ラクトースの生成量は多くなり、転移率は低くなった。
ラクトースとショ糖の混合比率を1:1とした場合、ラク
トシュクロース生成量は固形分あたり30％と最も高くな
った。
（２） 反応液の固形分濃度の影響 ラクトース0.2gのショ糖0.2gを0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.0）に溶解し、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1
g当り10単位と水を加え、最終的に固形分濃度が30〜60
％（w/w）になるように調整した。これを50℃で反応せ
しめ15時間および24時間後に反応液を分析し、ラクトシ
ュクロースの生成率を調べた。結果を第６図に示す。
6.0）に溶解し、製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1
g当り10単位と水を加え、最終的に固形分濃度が30〜60
％（w/w）になるように調整した。これを50℃で反応せ
しめ15時間および24時間後に反応液を分析し、ラクトシ
ュクロースの生成率を調べた。結果を第６図に示す。
第６図より明らかなように、固形分濃度が30〜40％
（w/w）では反応後15時間で既に反応は平衡に達し、ラ
クトシュクロースの生成率は48％に達したが、固形分濃
度が高くなると反応は遅く、60％（w/w）では反応後24
時間でも生成率は38％であった。
（w/w）では反応後15時間で既に反応は平衡に達し、ラ
クトシュクロースの生成率は48％に達したが、固形分濃
度が高くなると反応は遅く、60％（w/w）では反応後24
時間でも生成率は38％であった。
実施例４ ガラクトース20kgとショ糖10kgを予め溶解し、pHを6.
5とし、これに製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g
あたり10単位加え固形分濃度を40％（w/w）とし、50℃
で15時間反応せしめ、ガラクトースにフラクトシル基が
転移したと思われる転移生成物Ｃを20％含有する反応液
を得た。
5とし、これに製造例２で得られた粗酵素液をショ糖1g
あたり10単位加え固形分濃度を40％（w/w）とし、50℃
で15時間反応せしめ、ガラクトースにフラクトシル基が
転移したと思われる転移生成物Ｃを20％含有する反応液
を得た。
この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーにかけ
単糖を除去し、ショ糖を含む純度85％の転移生成物Ｃを
5kg得た。次いで、このものをビール酵母由来合のα−
グルコシダーゼでショ糖を分解後、再度活性炭カラムク
ロマトグラフィーに供し、純度98％の転移生成物Ｃを得
た。さらに、該転移生成物Ｃの１部を分取用高速液体ク
ロマトグラフィーにより単一ピークが得られるまで精製
し、実施例１と同様に構造を調べた。酸加水分解の結
果、構成糖はガラクトースとフラクトースであった。β
−フラクトフラノシダーゼによる酵素分解ではガラクト
ースとフラクトースの比が1:1であった。また、該転移
生成物Ｃは還元力は示さなかった。該転移生成物Ｃの13
C−NMRのスペクトルを第７図に示す。
単糖を除去し、ショ糖を含む純度85％の転移生成物Ｃを
5kg得た。次いで、このものをビール酵母由来合のα−
グルコシダーゼでショ糖を分解後、再度活性炭カラムク
ロマトグラフィーに供し、純度98％の転移生成物Ｃを得
た。さらに、該転移生成物Ｃの１部を分取用高速液体ク
ロマトグラフィーにより単一ピークが得られるまで精製
し、実施例１と同様に構造を調べた。酸加水分解の結
果、構成糖はガラクトースとフラクトースであった。β
−フラクトフラノシダーゼによる酵素分解ではガラクト
ースとフラクトースの比が1:1であった。また、該転移
生成物Ｃは還元力は示さなかった。該転移生成物Ｃの13
C−NMRのスペクトルを第７図に示す。
第７図より明らかなように、104.9ppmにフラクトフラ
ノースの２位炭素のβ結合に特有のピークがみられるこ
とおよびガラクトースのアノメリック炭素はα結合して
いることが示された。従って、該転移生成物Ｃはガラク
トースにフラクトシル基がβ−2,1結合したガラクトシ
ルフラクトシド（ガルシュクロース）であることが確認
された。
ノースの２位炭素のβ結合に特有のピークがみられるこ
とおよびガラクトースのアノメリック炭素はα結合して
いることが示された。従って、該転移生成物Ｃはガラク
トースにフラクトシル基がβ−2,1結合したガラクトシ
ルフラクトシド（ガルシュクロース）であることが確認
された。
実施例５ 実施例２において、ラクトースをイソマルトースに代
えたことを以外は実施例２と同様の操作を行い、イソマ
ルトースにフラクトシル基が転移したと思われる転移生
成物Ｄを28％含む反応液を得た。
えたことを以外は実施例２と同様の操作を行い、イソマ
ルトースにフラクトシル基が転移したと思われる転移生
成物Ｄを28％含む反応液を得た。
この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し
たのち、分取用高速液体クロマトグラフィーにより転移
生成物Ｄを単一ピークで得られるまで精製した。該転移
精製物Ｄは、酸加水分解によりその構成糖はグルコース
とフラクトースであることが示され、β−フラクトフラ
ノシダーゼによる酵素分解では等モルのイソマルトース
とフラクトースを生成した。また、該転移生成物Ｄは還
元力を示さなかった。該転移精製物Ｄの13C−NMRのスペ
クトルを第８図に示す。
たのち、分取用高速液体クロマトグラフィーにより転移
生成物Ｄを単一ピークで得られるまで精製した。該転移
精製物Ｄは、酸加水分解によりその構成糖はグルコース
とフラクトースであることが示され、β−フラクトフラ
ノシダーゼによる酵素分解では等モルのイソマルトース
とフラクトースを生成した。また、該転移生成物Ｄは還
元力を示さなかった。該転移精製物Ｄの13C−NMRのスペ
クトルを第８図に示す。
第８図より明らかなように、フラクトース部分のケミ
カルシフトは文献値のショ糖のフラクトース部分と同じ
値を示した。また、２つのグルコースはイソマルトース
と同じケミカルシフトを示し、ショ糖のグルコース部分
の６位の炭素にグルコースが結合していることを示し
た。従って、該転移精製物Ｄはイソマルトースにフラク
トシ基がβ−2,1結合したイソマルトシルフラクトシド
（イソマルトシュクロース）であることが確認された。
カルシフトは文献値のショ糖のフラクトース部分と同じ
値を示した。また、２つのグルコースはイソマルトース
と同じケミカルシフトを示し、ショ糖のグルコース部分
の６位の炭素にグルコースが結合していることを示し
た。従って、該転移精製物Ｄはイソマルトースにフラク
トシ基がβ−2,1結合したイソマルトシルフラクトシド
（イソマルトシュクロース）であることが確認された。
実施例６ マルトース2gとラフィノース2gを予め溶解し、pHを6.
5とし、これに製造例２で得られた粗酵素液をラフィノ
ース1g当り10単位添加し固形分濃度を40％（w/w）と
し、40℃で15時間反応せしめ、マルトースにフラクトシ
ル基が転移したと思われる転移生成物Ｅを20％含有する
反応液を得た。
5とし、これに製造例２で得られた粗酵素液をラフィノ
ース1g当り10単位添加し固形分濃度を40％（w/w）と
し、40℃で15時間反応せしめ、マルトースにフラクトシ
ル基が転移したと思われる転移生成物Ｅを20％含有する
反応液を得た。
この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供
し、水洗して単糖を除去したのち、20％エタノールでオ
リゴ糖を溶出させた。次いで、オリゴ糖画分を分取用高
速液体クロマトグラフィーを繰り返すことにより、単一
ピークとして転移生成物Ｅを得た。該転移生成物Ｅは酸
加水分解によりグルコースとフラクトースを生成し、β
−フラクトノシダーゼによる酵素分解ではマルトースと
フラクトースを等モル生成した。該転移生成物Ｅの13C
−NMRのスペクトルを第９図に示す。
し、水洗して単糖を除去したのち、20％エタノールでオ
リゴ糖を溶出させた。次いで、オリゴ糖画分を分取用高
速液体クロマトグラフィーを繰り返すことにより、単一
ピークとして転移生成物Ｅを得た。該転移生成物Ｅは酸
加水分解によりグルコースとフラクトースを生成し、β
−フラクトノシダーゼによる酵素分解ではマルトースと
フラクトースを等モル生成した。該転移生成物Ｅの13C
−NMRのスペクトルを第９図に示す。
第９図より明らかなように、フラクトース部分のケミ
カルシフトは文献値のショ糖のフラクトース部分と同じ
値を示した。また、２つのグルコースはマルトースと同
じケミカルシフトを示し、ショ糖のグルコース部分の４
位の炭素にグルコースが結合していることを示した。ま
た、該転移生成物Ｅは既知のエルロースと同じケミカル
シフトを示したことから、マルトースにフラクトシル基
がβ−2,1結合したマルトシルフラクトシド（エルロー
ス）であることが確認された。
カルシフトは文献値のショ糖のフラクトース部分と同じ
値を示した。また、２つのグルコースはマルトースと同
じケミカルシフトを示し、ショ糖のグルコース部分の４
位の炭素にグルコースが結合していることを示した。ま
た、該転移生成物Ｅは既知のエルロースと同じケミカル
シフトを示したことから、マルトースにフラクトシル基
がβ−2,1結合したマルトシルフラクトシド（エルロー
ス）であることが確認された。
本発明によれば、糖転移活性の強い酵素を用いること
によってフラクトース含有オリゴ糖を効率よく安価に製
造することがてきる。本発明により得られるキシルシュ
クロース，イソマルトシュクロースは抗う蝕性の性質を
有し、さらにラクトシュクロースをビフィズス菌増殖因
子としての活性を有していることにより、これらのフラ
クトース含有オリゴ糖は有用な甘味料，機能性食品とし
て実用化が期待される。
によってフラクトース含有オリゴ糖を効率よく安価に製
造することがてきる。本発明により得られるキシルシュ
クロース，イソマルトシュクロースは抗う蝕性の性質を
有し、さらにラクトシュクロースをビフィズス菌増殖因
子としての活性を有していることにより、これらのフラ
クトース含有オリゴ糖は有用な甘味料，機能性食品とし
て実用化が期待される。
第１図は、実施例１における転移生成物Ａ（キシルシュ
クロース）の13C−NMRのスペクトルを示す。第２図は、
実施例２における精製前を転移生成物Ｂ（ラクトシュク
ロース）を含む反応液の高速液体クロマトグラムを示
す。第３図は、実施例２において分取用高速液体クラマ
トグラフィーによって単一転移生成物Ｂとした高速液体
クロマトグラムを示す。第４図は、実施例２における転
移生成物Ｂ（ラクトシュクロース）の13C−NMRのスペク
トルを示す。第５図は、実施例３におけるラクトシュク
ロースの生成量とラクトースおよびショ糖の混合比率の
関係を示す。第６図は、実施例３におけるラクトシュク
ロースの生成量と反応液中の固形分濃度の関係を示す。
第７図は、実施例４における転移生成物Ｃ（ガラクトシ
ルフラクトシド）の13C−NMRを示す。第８図は、実施例
５における転移生成物Ｄ（イソマルトシルフラクトシ
ド）の13C−NMRを示す。第９図は、実施例６における転
移生成物Ｅ（マルトシルフラクシド）の13C−NMRを示
す。
クロース）の13C−NMRのスペクトルを示す。第２図は、
実施例２における精製前を転移生成物Ｂ（ラクトシュク
ロース）を含む反応液の高速液体クロマトグラムを示
す。第３図は、実施例２において分取用高速液体クラマ
トグラフィーによって単一転移生成物Ｂとした高速液体
クロマトグラムを示す。第４図は、実施例２における転
移生成物Ｂ（ラクトシュクロース）の13C−NMRのスペク
トルを示す。第５図は、実施例３におけるラクトシュク
ロースの生成量とラクトースおよびショ糖の混合比率の
関係を示す。第６図は、実施例３におけるラクトシュク
ロースの生成量と反応液中の固形分濃度の関係を示す。
第７図は、実施例４における転移生成物Ｃ（ガラクトシ
ルフラクトシド）の13C−NMRを示す。第８図は、実施例
５における転移生成物Ｄ（イソマルトシルフラクトシ
ド）の13C−NMRを示す。第９図は、実施例６における転
移生成物Ｅ（マルトシルフラクシド）の13C−NMRを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/14 C12N 9/10
Claims (3)
- 【請求項１】アルドースまたはケトースの存在下、ショ
糖，ラフィノースおよびスタキオースの中のいずれかに
下記の性質を有するβ−フラクトフラノシダーゼを作用
させることを特徴とするフラクトース含有オリゴ糖の製
造法。 （１） 本酵素は受容体として各種単糖，糖アルコー
ル，アルキルアルコール，配糖体，オリゴ糖等の存在
下、ショ糖に作用させると、フラクトシル基を受容体分
子に転移させ、その受容体特異性は極めて広い。 （２） 本酵素はショ糖，エルロース，ネオケストー
ス，キシルシュクロース，ラフィノース，スタキオース
をよく分解するが、１−ケストース，ニストース，イヌ
ロビオース，レバンビオースには作用しにくい。 （３） 本酵素は40℃にてpH6.5〜6.8が至適であり、pH
5.5〜10で安定である。 （４） 本酵素はpH6.5において至適温度は55℃であ
り、60℃でも70％以上の残存活性を示す。 （５） 本酵素は銀，水銀，亜鉛，銅および錫の中から
選ばれた金属のイオンの存在で阻害を受ける。 （６） 本酵素は分子量52,000±2,500および58,000±
2,500（SDS−ディスクゲル電気泳動およびゲル濾過法に
よる）の２つからなる。 （７）本酵素の等電点はそれぞれpH4.3および4.6（アン
フォライン電気泳動法による。）である。 - 【請求項２】フラクトース含有オリゴ糖が請求項１記載
の酵素の受容体となり得るアルドースまたはケトースを
含むものである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】フラクトース含有オリゴ糖がキシルシュク
ロース，ガルシュクロース，ラクトシュクロース，イソ
マルトシュクロース，エルロース，アラビノシルフラク
トシド，フコシルフラクトシドおよびソルボシルフラク
トシドの中のいずれかである請求項２記載の方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2207582A JP2834871B2 (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | フラクトース含有オリゴ糖の製造法 |
| US07/672,388 US5089401A (en) | 1990-08-07 | 1991-03-20 | Method for the preparation of fructose-containing oligosaccharide |
| ES91106137T ES2093042T3 (es) | 1990-08-07 | 1991-04-17 | Metodo de preparacion de un oligosacarido que contiene fructosa. |
| DK91106137.2T DK0470331T3 (da) | 1990-08-07 | 1991-04-17 | Fremgangsmåde til fremstilling af fructoseholdigt oligosaccharid |
| EP91106137A EP0470331B1 (en) | 1990-08-07 | 1991-04-17 | Method for the preparation of fructose-containing oligosaccharide |
| DE69121337T DE69121337T2 (de) | 1990-08-07 | 1991-04-17 | Methode zur Herstellung von Fruktose enthaltenden Oligosacchariden |
| CA002040877A CA2040877C (en) | 1990-08-07 | 1991-04-19 | Method for the preparation of fructose-containing oligosaccharide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2207582A JP2834871B2 (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | フラクトース含有オリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0491795A JPH0491795A (ja) | 1992-03-25 |
| JP2834871B2 true JP2834871B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=16542146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2207582A Expired - Lifetime JP2834871B2 (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | フラクトース含有オリゴ糖の製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5089401A (ja) |
| EP (1) | EP0470331B1 (ja) |
| JP (1) | JP2834871B2 (ja) |
| CA (1) | CA2040877C (ja) |
| DE (1) | DE69121337T2 (ja) |
| DK (1) | DK0470331T3 (ja) |
| ES (1) | ES2093042T3 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE465516B (sv) * | 1989-08-18 | 1991-09-23 | Kurt G I Nilsson | Saett att framstaella en oligosackaridfoerening varvid glykosidas fraan en mollusk anvaendes |
| AU657405B2 (en) * | 1992-04-10 | 1995-03-09 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Food composition which inhibits formation of intestinal putrefaction product |
| US5334524A (en) * | 1992-05-18 | 1994-08-02 | Solvay Enzymes, Inc. | Process for producing levan sucrase using Bacillus licheniformis |
| CA2180826A1 (en) | 1994-01-13 | 1995-07-20 | Richard J. Ii Stoner | Organic disease control system |
| JPH07274990A (ja) * | 1994-04-15 | 1995-10-24 | Mitsubishi Kasei Eng Co | 環状イヌロオリゴ糖の精製方法 |
| ES2100131B1 (es) * | 1995-11-08 | 1998-02-16 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento enzimatico de obtencion de beta-d-galactopiranosil-d-xilosas utilizables para la evaluacion diagnostica de la lactasa intestinal. |
| EP0780470B1 (en) * | 1995-12-18 | 2001-06-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Beta-fructofuranosidase, its preparation and uses |
| AU721607B2 (en) * | 1996-06-10 | 2000-07-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Polypeptide having beta-fructofuranosidase activity |
| TW557327B (en) * | 1996-11-08 | 2003-10-11 | Hayashibara Biochem Lab | Kojibiose phosphorylase, its preparation and uses |
| EP1690876B1 (en) * | 2003-11-28 | 2016-12-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Nonreducing beta-glucan derivative |
| CN100392091C (zh) * | 2006-04-07 | 2008-06-04 | 江南大学 | 一种低聚糖-新科斯糖的发酵法生产方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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