JP2004097233A - 新規イソマルトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】グルコースの存在下において、α−1,4−グルコシド結合を加水分解する酵素をプルラン又はパノースに作用させることを特徴とする、新規イソマルトオリゴ糖IMIMの製造法。
【選択図】なし
Description
(1)次式(I):
(2)以下に示す理化学的性質:
(イ)作用
(a)澱粉から主にマルトースを生成する。
(b)プルランからパノースを生成する。
(c)グルコースの存在下でプルランを加水分解し、次式(I):
(ロ)基質特異性
澱粉やプルラン等のα−1,4−グルコシド結合を加水分解し、マルトースやパノースを生成する。生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式(I)で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式(II)で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式(II)で示されるイソマルトシルマルトースを分解する。
(ハ)至適pH及びpH安定性
プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜9 で安定である。
プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃まで安定である。
(ホ)分子量は約60,000である(SDSポリアクリルアミドゲル・スラブ電気泳動法による)。
を有するα−アミラーゼ。
(3)グルコースの存在下において、α−1,4−グルコシド結合を加水分解する酵素をプルラン又はパノースに作用させることを特徴とする前記(1)に記載の新規イソマルトオリゴ糖IMIMの製造法。
かかる酵素としては、例えば、高温放線菌 Thermoactinomyces vulgaris R-47(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1681(1978))の生産するα−アミラーゼ、即ち本発明の新規α−アミラーゼが挙げられる。
清水らは高温放線菌Thermoactinomyces vulgaris R-47 の生産するα−アミラーゼTVAIがプルランを分解してパノースを生成することを見出した。次いで、本発明者はTVAIの酵素作用について詳細な研究を行い、その性質を明らかにしている (Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1121(1982); Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1423(1982); Y. Sakano et al., Agric.Biol. Chem., 47, 2211(1983); Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 49,3391(1985)) 。
その後、TVAIIの蛋白質合成能を高める発現系を構築して大腸菌の本酵素生産を大きく増加させると同時に、大腸菌を培養した後、加熱、超音波処理等の抽出操作によって容易に結晶化する高純度な酵素の生産方法を開発した。
本発明のIMIMは、プルラン又はパノースとグルコースとを溶解してα−1,4−グルコシド結合を加水分解する酵素を作用させることにより容易に製造できる。
例えば、TVAIIを用いる場合、プルランとグルコースを共に5%濃度でリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)1.5Lに溶解し、TVAIIを60mg加えて40℃で72時間反応させる。この反応液を経時的に採取し、薄層クロマトグラフィーにかけると図2に示すように、IMIMとIMMが生成した。この時、IMMはTVAIIによって加水分解を受けるため、反応24時間以降は減少する。
反応で得られるIMIMを含む糖液は、常法に従い活性炭による脱色及びイオン交換樹脂による脱塩等の精製操作を経て、そのままシロップとして利用できる。また、還元処理すれば糖アルコールとしても利用することができる。
(実施例1)
Thermoactinomyces vulgaris R-47を清水らの方法(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1681(1978)) により培養し、Marmurの方法(J. Marmur, J.Mol. Biol., 3, 208(1961))により本菌の培養菌体からゲノムDNAを調製した。このゲノムDNAを制限酵素 Sau3AI で部分消化し、得られた4〜10kbのDNA断片をpUC119プラスミドの BamHIサイトに導入した。こうして得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM83 株を形質転換した。
前記形質転換体1白金耳を培地(1%ペプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%食塩を含む)に接種し、37℃で16時間培養して種培養を行った。得られた種培養液1mLを1.6gペプトン、1.0g酵母エキス、 0.5g 食塩、5mgアンピシリンを含む培地 100mLに加えて、500mL 容坂口フラスコで37℃で16時間往復振盪して本培養(培地 100mL×10)した。なお、培養5時間で0.5Mイソプロピルβ−D−チオガラクトシド0.1mL を培地に添加した。菌体は培養液を遠心分離(2,000g, 20分)して回収し、5mM CaCl2を含む100mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に懸濁した。懸濁菌体は80℃で30分間加熱処理してから超音波処理により破砕され、遠心分離(7,500g, 10分)により上清液が回収された。得られた上清液をTVAIIの粗酵素液とし、反応に用いた。酵素蛋白質の測定はLowry の方法により行った。
MOS 一連のマルトオリゴ糖
1 イソマルトース
2 IMM
3 1%IMMを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶かしたもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 Unit/ml) を10μl 加え、40℃で1時間反応させたもの
4 IMIM
5 1%IMIMを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶かしたもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 Unit/ml) を10μl 加え、40℃で1時間反応させたもの
Claims (3)
- α−1,4−グルコシド結合を加水分解する酵素がプルランからパノースを生成するα−アミラーゼである請求項1記載の製造法。
- α−1,4−グルコシド結合を加水分解する酵素が、
以下に示す理化学的性質:
(1)作用
(a)澱粉から主にマルトースを生成する。
(b)プルランからパノースを生成する。
(c)グルコースの存在下でプルランを加水分解し、
次式(I):
(2)基質特異性
澱粉及びプルランのα−1,4−グルコシド結合を加水分解し、それぞれマルトース及びパノースを生成する。生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式(I)で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式(II)で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式(II)で示されるイソマルトシルマルトースを分解する。
(3)至適pH及びpH安定性
プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜9 で安定である。
(4)至適温度及び熱安定性
プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃まで安定である。
(5)分子量は約60,000である(SDSポリアクリルアミドゲル・スラブ電気泳動法による)。
を有するα−アミラーゼである、請求項1記載の製造法。
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2003
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