NO162080B - Fruktosyltransferase og anvendelse av denne til fremstilling av et fruktosid. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fruktosyltransferase og anvendelse av denne til fremstilling av et fruktosid fra en alkohol i form av et sukker, et sukkerderivat, en lavere polyol eller en lavere alkanol.

Fruktosyltransferasen ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at den er isolert fra B. subtilis, fortrinnsvis fra en av stammene NCIB. 11871, NCIB 11872 eller NCIB 11873, eller fra Erwinia sp. og hydrolyserer en fruktosyloligosakkarid- eller fruktosyldiaakkariddonor, som er bundet til en aldoses anomere karbonatom med en (1-2) binding, og omdanner den derved oppnådde fruktosyldel til en akseptoraldose slik at det oppnås et fruktosyldisakkarid som hovedprodukt, idet enzymet er i stand til å

danne 6-substituerte sukrosederivater som hovedprodukt når akseptoraldosen er en 6-substituert glukose og ikke danner vesentlige mengder alkoholutfellbare oligo- eller polyfruktoser i nærvær eller fravær av en aldoseakseptor, idet enzymet har en Km overfor sukrose på minst 0,1 M i fravær av en aldoseakseptor og er stort sett uten invertaseaktivitet, idet det er behandlet med invertaseinhibitoren p-hydroksykvikksølvbenzoat.

Ved anvendelse av fruktosyltransferasen til fremstilling av fruktosidet behandles en vandig løsning av alkoholen og et fruktosyldisakkarid eller -oligosakkarid med

fruktosyltransferasen.

4,1' , 6'-triklor-4,1 *,6'-trideoksy-galaktosukrose (TGS) er

et kraftig søtningsmiddel som sammen med andre klorsukrosederi-vater er kjent fra britisk patentskrift 1.543.167. Derivater hvor 6-hydroksygruppen er foretret eller mangler er kjent fra EP 0103479A og GB 2.127.806A. Tilsvarende forbindelser som inneholder andre halogensubstituenter er kjent fra GB 2.104.063A. En fremgangsmåte til fremstilling av TGS er kjent fra GB 2.079.749A

og US-patentskrift 4.380.476. Denne fremgangsmåte omfatter fremstilling av en 6-ester av sukrose eller en blanding som over-veiende inneholder 6-esteren av sukrose, og deretter selektiv klorering av dette 6-substituerte materiale. Etterfølgende avestring av 6-stillingen frembringer TGS. I praksis er det vanske-lig å oppnå en sukrose-6-ester med høyt utbytte på en spesiell måte når det anvendes kjemiske midler. Det har ifølge den foreliggende oppfinnelse vist seg at fremstilling av TGS fra et 6-substituert sukrosederivat kan oppnås uten vanskelighet ved anvendelse av en enzymbasert reaksjon som starter fra den korre-sponderende 6-substituerte glukose og et fruktosidsukker, hvorved det dannes en 6-substituert sukrose som er uten noen annen sukrosederivat som er substituert i andre stillinger, og som lettvint kan skilles fra utgangsmaterialer og glukose.

Pruktosyltransferaser er velkjente innen enzymologien. Et representativt enzym er det såkalte levansukrase, som er ansvarlig for dannelsen av levan, et polyfruktosederivat, ved dekomponering av sukrose eller av raffinose. Ved dets normale virkemåte spalter levansukrase glukose-fruktosebindingen i sukrose og overfører fruktosen til et akseptorsukker, f.eks. sukrose selv. Denne prosess gjentas slik at det bygges opp fruktosekjeder. Dersom et annet sukker enn sukrose er til stede, f.eks. D-xylose, inhibe-res levandannelsen eller i det minste minskes, og istedenfor omdannes fruktosen til det andre konkurrerende sukker som funksjonerer som en akseptor, hvorved det dannes et nytt fruktosid. Det nye fruktosid vil også funksjonere som en donor, slik at

det i praksis har vært anvendt et stort overskudd av donor for å skyve likevekten i den ønskete retning.

Hestrin og Avigad, Biochem, J., Vol 69, 1958, p. 388-398 viste at en rekke sukker funksjonerte som gode fruktoseaksep-torer og derved var tilbøyelige til å inhibere levandannelse. Andre var dårlige akseptorer, mens en tredje klasse tilsyne-latende var inert og ikke inhiberte levandannelse. I den sist-nevnte Kategori var D-glukose-6-fosfat. Alle de øvrige sukker som var nevnt i tidsskriftet var sukker som ikke var omdannet til derivater. Men reaksjonen mellom glukose-6-fosfat og sukrose i nærvær av et enzym avledet fra en mutant av Bacillus subtilis Marburg, stamme 168, er beskrevet (Kunst et al i Eur. J. Biochem, Vol 42, 1974, p. 611-620. Disse og andre forfattere, f.eks. Dedonder i Methods Enzymol., Vol 8, p. 500-505, anvendte alltid et høyt forhold mellom fruktosedonor (f.eks. sukrose) og akseptor, f.eks. fra 5:1 til 10:1, og en lav konsentrasjon som ikke ville være anvendbar i industriell skala. En liknende reaksjon er beskrevet i britisk patentsøknad 2.046.757A, hvor en varietet av aldoseutgangsmaterialer omsettes med sukrose eller raffinose i nærvær av en levansukrase utledet fra en rekke mikroorganismer som omfatter Actinomyces viscosus og B. subtilis (stamme ATCC 6051, dvs. Marburg-staramen). I patentsøknaden er imidlertid aldosen alltid et uderivatisert sukker, og molforholdet mellom donor og akseptor er 1:5, sannsynligvis for å minimalisere kjededannende reaksjoner.

Det har ifølge den foreliggende oppfinnelse vist seg at 6-sukrosederivater kan fremstilles ved omsetning av et tilsvarende 6-derivat av glukose eller galaktose med en fruktosyltransferase i nærvær av sukrose eller raffinose eller stakhyose. Produktet kan deretter halogeneres i 4,1'- og 6'-stillingene,

og om ønsket kan den 6-derivatiserte gruppe fjernes for opp-nåelse av det ønskete halogenerte sukker. Den innledende reak-

sjon foregår med høyt utbytte uten dannelse av noe levan.

Fruktosyltransferasen kan anvendes til fremstilling av et halogendeoksy-sukrose- eller -galaktosukrosederivat med den generelle formel

hvor A er et hydrogenatom eller gruppen Cf^X, hvor X er et hydrogenatom eller en hydroksy- eller alkoksygruppe, og Y er et halo-genatom, hvorved en aldose med den generelle formel hvor A er et hydrogenatom eller gruppen CH2X, hvor X er et hydrogenatom eller en alkoksygruppe eller en beskyttet hydroksygruppe, omsettes med et fruktosyldi- eller -oligosakkarid i nærvær av fruktosyltransferasen, hvorved det dannes en forbindelse med den generelle formel

hvor A er angitt som for formel II, og forbindelsen med formelen III fraskilles og halogeneres, en forbindelse med formelen I hvor A er CH2X og X er en hydroksygruppe, fjernes beskyttelsesgruppen fra den beskyttede hydroksygruppe.

Noen stammer av B.subtilis fås meget lettvint til å vokse i stor skala ved konvensjonell fermentering, og de er vel ansette som kilder for industrielle enzymer (f.eks..'-amylaser og r-lakta-maser). Ved at fruktosyltransferase er et hovedsakelig eksocellu-lært enzym kan den frembringes og renses på lettvint måte. Det er viktig at det anvendte enzym er uten invertaseaktivitet. Enzymet B.subtilis kan utvinnes av en væskeformet kultur av B.subtilis ved selektiv utfelling eller på andre hensiktsmessige måter. F.eks. kan kulturen sentrifugeres for fjerning av celler og rester, bringes på ca. 65% metning med ammoniumsulfat, sentrifugeres igjen for fjerning av invertase og andre proteinforurensninger og deretter bringes på ca. 95% metning med ammoniumsulfat. Derved ut-felles rå levansukrase som kan renses ytterligere ved løsning i fosfatpuffeer og dialyse.

Subtilisstammene NCIE 11871, NCIB 11872 og 11873 har et vidt spesifisitetsområde og kan derved lettvintere anvendes sammen med en rekke 6-substituerte derivater.

Fruktosyltransferasen ifølge oppfinnelsen er upåvirket av overflateaktive stoffer, har en optimal aktivitet ved ca. 30°C og er aktiv i minst 20 minutter ved opp til 45°C.

De to konstanter (K) når det g3 j J elder dette enzym er K m, Michaelis-Menton-konstanten som angir den substratkonsentrasjon hvor halve den maksimale hastighet for enzymreaksjon (for fremstilling av levan etc.) opptrer, og K^, inhibitorkonstanten, som er den inhibitorkonsentrasjon som frembringer halve den maksimalt iakttagbare inhibering av enzymaktivitet (for fremstilling av levan).

K mfor enzymet av stammen NCIB 11871 er ca. 0, 2M for sukrose i fravær av en aksep c tor, mens K mangitt for Dedonder's levansukrase fra B.subtilis BS5 (en klon fra B.subtilis var. nigra) var bare 0,02M. B.subtilis NCIB 11871, og også stammene NCIB 11872 og 11873, er atypiske stammer av B.subtilis. Dette betyr at de oppfyller nesten alle betingelser for artsidentifisering, både ved klas-siske tester (Berkley og Goodfellow, "The Aerobic Endospore-forming Bacteria: Classification and Identificatin" (1981), Academic Press, London. Gordon, Haynes og Pang, "The Genus Bacillus", Agriculture Handbook nr. 427, 1973, US-Dept of Agriculture, Washington D.C.) og i systemene API 50 CHB og API 20E (API system S.A. La Balme les Groltes - 38390 Montalieu Vercieu, Frankrike, og se Logan et al. J. Appl. Bact., 1978,

p. 28-29). I disse tester er den vesentligste forskjell fra hoved-mengden av B.subtilis-stammen at stammen NCIB 11871 er en laktose-negativ stamme som oppviser variabel syredannelse fra xylose. Stammen NCIB 11872 er laktose-negativ og gir også negative resultater med D-mannose, melibiose og trehalose samt i ONPG-reaksjonen. Stammen NCIB 11873 er laktose-positiv og gir negative resultater med D-mannose og inulin.

Fruktosyltransferaser avledet fra mange stammer av B.subtilis og Erwina sp anses generelt som levansukraser, dvs. at i nærvær av sukrose kan de forårsake dannelse av levan, et poly-fruktosemateriale som er alkoholutfellbart. Når de anvendes til fremstilling av fruktosedisakkarider må den konkurrerende reaksjon til dannelse av levan undertrykkes dersom det skal oppnås et anvendbart produkt, derfor begrensningen av disse enzymer i britisk patentsøknad 2.046.757A til reaksjonsblandinger som inneholder høye andeler av akseptormolekylet. Men enzymene B.subtilis NCIB 11871, 11872 og 11873 som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse er mye mindre tilbøyelig til å danne levan. K mfor sukrose for levan-dannelse er ca. 0,2M, dette til sammenlikning med den angitte Km på ca. 0,02M for det ovennevnte Dedonder-enzym av stammen BS5. Selv når det anvendes ekvivalente konsentrasjoner av akseptor- og donormolekylene, og når de betingelser benyttes som viste seg å fremme dannelsen av levan med høy molekylvekt ved hjelp av enzymet Tanaka B.subtilis (dvs. tilsetning av levanprimer, anvendelse av løsning med lav ione-styrke samt reaksjon ved lave temperaturer) dannes det meget lite levan med høy molekylvekt. Først etter at topputbyttet av disakkarid er oppnådd dannes det en polymer med mellommolekyl-vekt. Dessuten synes enzymet fra B.subtilis NCIB 11871 til forskjell fra andre sanne levansukraser ikke å katalysere en dis-proporsjoneringsreaksjon, dvs. at det ikke omdanner lavmolekylære oligosakkarider til høymolekylært levan. F.eks. kan det påvises trisakkarid, som ikke skulle være til stede dersom enzymet ut-fører disproporsjoneringsreaksjonen. Standard levan oppnådd fra Aerobacter levanicum (sigma) kan fraksjoneres til to topper som svarer til materialet med henholdsvis høy molekylvekt og middels molekylvekt. Det ovennevnte Dedonder-enzym har en likevektskon-stant (levan og glukose/sukrose) på ca. 3,6 x 10 -2 ved 37°C, hvorved det dannes levan av DP40. Helt i motsetning til dette danner stammene NCIB 11872, 11872 og 11873 et enzym som ikke produserer en vesentlig mengde alkoholutfellbart polysakkarid fra sukrose alene, og heller ikke de voksende celler av stamme 11871 danner levan. Det fremgår således at den dannete fruktosyl-transf erase faktisk ikke er en "levansukrase" i det hele tatt.

I beskrivelsen her vil den bli benevnt en fruktosyltransferase.

Fruktosekilden for reaksjonen kan være et vilkårlig oligo-eller disakkarid som inneholder en fortrinnsvis usubstituert B-fruktosylring som er bundet til det anomere karbon i en aldose ved hjelp av en (1 > 2) binding, som i sukrose-(8-D-fruktofuranosyl-a-D-glukopyranosid), raffinose-(O-a-D-galaktopyrano-syl-(l ^ 6 ) -O-ct-D-glukopyranosyl-(1 > 2 ) 6-D-f ruktof urano-sid) eller stakhyose.

Utgangsmaterialet i form av den 6-substituerte aldose,

som har formelen II, kan som en beskyttet hydroksygruppe i 6-stillingen ha enhver substituent som er resistent mot den etter-følgende kloreringsreaksjon og som lettvint kan fjernes og derved frigjøre en 6-hydroksygruppe. 6-karboksylsyreestrer fore-trekkes, f.eks. 6-acetatet eller benzoatet. Glukose-6-acetat kan lettvint fremstilles ved hjelp av forskjellige fremgangs-måter (f.eks. Duff, J. Chem. Soc., 1957, p. 4730-34, Reeve et al, J. Amer. Chem. Soc, Vol 79, p. 6041-43, Frohwein et al, Nature, 1960, p. 153, Duff et al, Nature, 1957, p. 103 samt Duff et al., Biochem J., Vol 70, 1958, p. 515-520).

6-substituenten i aldoseutgangsmaterialet med formelen II kan også være en eter, f.eks. benzyleteren, som lettvint kan fjernes ved hydrogenering, eller en alifatisk eter som kan bli værende, hvorved det dannes en klorert 6-eter slik som beskrevet i britisk patentsøknad 2.127.806A. Utgangsmaterialet kan f.eks. også inneholde en 4-klorsubstituent til dannelse av et disakkarid som allerede er delvis klorert, f.eks. 4-klor-4-deoksy-galaktose-6-acetat.

Reaksjonen mellom fruktosedonoren og fruktoseakseptoren

bør finne sted i et vandig medium, fortrinnsvis puffret ved den optimale pH for enzymet, dvs. ved pH 5,4-6,0 ved den optimale temperatur på ca. 30°C. De to reaktanter er vanligvis vannløse-lige, og enzymet kan være dispergert i den felles løsning eller, fortrinnsvis, immobilisert på et uløselig substrat. Immobilisering kan f.eks. utføres ved anvendelse av en ionebytterharpiks, såsom DEAE-cellulose, som enzymet adsorberes sterkt på. Mange andre immobiliseringssubstrater kan anvendes, f.eks. benkull slik som beskrevet i US-patentskrift 4.421.850.

Forholdet mellom fruktosedonor og fruktoseakseptor i reaksjonsblandingen er viktig: for lavt og utbyttet blir lavere,

for høyt kan eventuell levanreaksjon ikke undertrykkes, særlig dersom det anvendes et substrat med høyt tørrstoffinnhold. Generelt har det vist seg at et molforhold mellom donor og akseptor på ca. 2:1 er optimalt. Reaksjonen kan utføres ved ganske høy konsentrasjon idet det ikke er noe problem med løselighet eller viskositet. Typisk er en reaktantkonsentrasjon på ca. 40 vekt% gunstig, selv om høyere konsentrasjoner kan anvendes, avhengig av reaktantenes løselighet, f.eks. opp til 75% for glukose-6-acetat. Enzymkonsentrasjonen må naturligvis avhenge av aktiviteten, men konsentrasjoner på ca. 50 ml/l har vært vellykket ved anvendelse av en vandig løsning som inneholder enzymet avledet fra 33 ml B.subtilis NCIC 11871 kultur pr. ml løsning.

Den etterfølgende klorering av en forbindelse med formelen III kan utføres ved anvendelse av ethvert reagens som er i stand til å erstatte hydroksy med klor selektivt i 4-, 1'- og 6'-stillingene. Et reagens som kan velges er Vilsmeier-reagenset, fremstilt ved omsetning av et dialkylamid med et kloreringsmiddel, f.eks. dimetylformamid med fosforpentaklorid, fosgen eller tio-nylklorid. En detaljert beskrivelse av kloreringen av sukrose-6-estrer er gitt i britisk patentsøknad 2.079.749A og US-patentskrift 4.380.476. Tilsvarende er fjerning av beskyttelsesgruppen fra en 6-ester beskrevet i samme publikasjon, hvorved det f.eks. anvendes natriummetoksyd i metanol. En 6-benzyletergruppe kan fjernes ved hydrogenering.

Substratets spesifisitetsområde for enzymet fra B.subtilis 11871 vil nå bli beskrevet mer detaljert. Tidligere studier viste at fruktosyltransferaseaktivitet for B.subtilis (Marburg) ikke svekkes ved forandringer i C-6 i aldosen med mindre en polar gruppe, såsom fosfat eller en karboksylsyregruppe, innføres i denne stilling. Særlig er det blitt rapportert at følgende forandringer i C-6-stillingen hos akseptoren ikke inhiberer levansukrase: reduksjon (fra L-galaktose til L-fukose), erstatning av OH med 0-glukosyl (fra D-glukose til isomaltose) samt hydroksyl istedenfor H på C (fra D-galaktose til D-glycero-D-galaktoheptose)

(Hestrin et al, 1958). Bare molekyler som har en usubstituert

fruktosegruppe bundet til en alkoksylgruppe med samme glykosid-binding som i sukrose kan funksjonere som en donor, således kan sukrose-6-acetat funksjonere som fruktosedonoren istedenfor sukrose eller raffinose.

Men når det gjelder fruktosyltransferasen ifølge den foreliggende oppfinnelse funksjonerer mange forskjellige sukker i varierende grad som akseptorer for fruktosen fra sukrose eller raffinose.

De fleste av akseptorene er heksoser eller pentoser, såsom ribose, sorbose, lyksose, arabinose og xylose. Den eneste pentose som det er kjent at ikke reagerer er xylulose. De fleste av de reaktive akseptorer kan bearbeide en pyranosering-konfigurasjon,

selv om xylitol og glukonsyre også synes å reagere. Når det fore-ligger en ringstruktur må denne inneholde oksygen eller svovel. Således reagerer inosital ikke, men 5-tioglukose reagerer.

Alle variasjonene i struktur på karbonatomene 3 og 4, f. eks. galaktose, 3-0-metylglukose, 4-klorgalaktose og D-arabinose istedenfor glukose, påvirker ikke den kvalitative reaktivitet. Substituenter på C-l, såsom i metyl-a-D-glukopyranosid, 1-tio-glukose samt sorbose, tillater reaksjon. På karbonatom 2 tåles forskjellige forandringer, f.eks. som i mannose, men 2-deoksyglukose og glukosamin er ureaktive. På karbonatom 6 tåles de fleste strukturelle variasjoner, såsom 6-fosfat, -klorid og -acetat, 6-deoksyglukose, 6-0-metylglukose og 6-0-metylgalak-tose og 6-H som i ramnose, men CH2OH-CHOH-gruppen i glukoheptose hindrer reaktivitet.

Mange av disakkaridene, såsom mellibiose, laktose, isomaltose og cellobiose, er reaktive akseptorer, selv om visse disakkarider, såsom laktulose og isomaltulose er ureaktive. Når det anvendes oligosakkaridakseptorer avtar akseptorens aktivitet med økende størrelse, som i den homologe serie maltose, maltotriose, maltotetraose etc.

I mange tilfeller hindrer ikke strukturelle forandringer (av glukose) på mer enn ett karbonatom ikke reaksjon, f.eks. galaktose-6-acetat, og når det anvendes blandinger av reaktive akseptormolekyler, f.eks. i hydrolysert myse, dannes det blandinger av fruktosylerte disakkarider.

Følgende sukker har vist seg å funksjonere som akseptorer: D-arabinose, fukose, 6-deoksyglukose, 6-0-metylgalaktose, laktose, galaktose-6-acetat, mannose, 5-tio-D-glukose, maltose, 1-tio-glukose, maltotriose, 3-0-metyl-a-D-glukose, maltopentaose, D(-)arabinose, maltoheksose, 6-klor-6-deoksyglukose, mellibiose, galaktose, xylose, isomaltose, L-arabinose, mysepermeat (laktose), 4-klorgalaktose, ribose, lyksose, glukose-6-acetat, glukonsyre, glukose-6-fosfat, L-ramnose, 6-0-metylglukose, metyl-D-glukosid, xylitol, glycerol samt etanol.

En særlig interessant akseptor er xylose som fører til dannelsen av 6-D-fruktofuranosyl (2 > 1)-a-D-xylopyranosid, kjent som xylsukrose. En annen interessant akseptor er galaktose, som fører til dannelsen av B-D-fruktofuranosyl (2 > 1)-D-galaktopyranosid (galaktosukrose). Produkter av denne type har lav cariestilbøyelighet og/eller søthet, noe som gjør dem interes-sante som erstatninger for sukrose på områder hvor for sterk søthet er et problem. Galaktosukrose er interessant særlig på grunn av at det kan fremstilles av f.eks. melasse og hydrolysert mysepermeat, som begge er lett-tilgjengelige kilder. D=t har bare spor av søthet, ca. 10-15% av sukrose.

Når det gjelder donorspesifisitet er sukker basert på sukrose med en a(l > 2)-binding som et absolutt krav er reaktive, hvorved aktiviteten avtar med størrelsen på molekylet. De nye disakkarider som dannes med virkningen av enzymet funksjonerer også som donorer, f.eks. xylsukrose.

Produktet fra den enzym-katalyserte reaksjon kan skilles fra biproduktene og utgangsmaterialene ved konvensjonelle fysio-kjemiske metoder, såsom kromatografi, særlig høytrykksvæske-kromatografi (HPLC) og ionebytterharpiks-kromatografi. Særlig produkter som ikke har noen 6-hydroksygruppe i aldoseringen, f.eks. sukrose-6-estrer og -etre, xyloseavledete produkter og 6-deoksysukrose, har en overraskende lav polaritet som gjør ionebytterharpiks-kromatograf i til en lettvint og effektiv skille-metode. Polystyrenharpikser som er fornettet med divinylbenzen, f.eks. "Amberlite" XAD harpiksene, er særlig egnet. Denne sepa-rering er meget enklere enn separeringen av forskjellige substituerte sukrosederivater, som er nødvendig når sukrose-6-derivatet er fremstilt ved en kjemisk prosess.

Biproduktet fra fruktoseoverføringsreaksjonen hvor det anvendes et glukosylfruktosid, såsom sukrose, er glukose selv. Glukose er selvfølgelig en mulig akseptor og konkurrerer med

den ønskete akseptor, noe som fører til gjendannelse av utgangsmaterialet. Fjerning av glukosen ved omforming til fruktose kan av den grunn være ønskelig. Dette kan oppnås ved tilsetning av glukoseisomerase.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere:

Eksempel 1, Fremstilling av TGS

a) Fremstilling av enzym

B-fruktosyltransferase ble fremstilt fra Bacillus subtilis

stamme NCIB 11871. Enzymet ble innført ved hjelp av sukrose under

vekst av cellene i rysteflasker (250 ml kapasitet, 4 flasker)

som inneholdt minimalt sukrosemedium (100 ml pr. flaske). Kulturen var inkubert inntil den sene eksponential-fase, under rys-ting ved 30°C, og innholdet i de fire rysteflasker ble deretter blandet og vekstmediet separert fra cellene ved sentrifugering (5.000 g i 15 minutter). 20-30% av den totale enzymmengde ble værende forbundet med cellene. Den resulterende oppå liggende væske ble brakt på 65% metning ved tilsetning av fast ammoniumsulfat og hensatt i 45 minutter ved 0°C. Dette felte ut det meste av uønsket invertase og andre proteinforurensninger men etterlot størsteparten av enzymmengden i løsning. Prøven ble deretter sentrifugert igjen (20.000 g i 30 minutter), og bunnfallet som inneholdt invertaseaktiviteten ble frasortert. Mer ammoniumsulfat ble tilsatt til løsningen for å bringe løsningen på 95% metning og hensatt i ytterligere 45 minutter ved 0°C.

Et andre bunnfall, hovedsakelig fruktosyltransferase, ble dannet og oppsamlet ved sentrifugering (40.000 g i 45 minutter) og løst igjen i 12 ml 50 mM fosfatbuffer som hadde pH på 6,0. Nettovirk-ningen av de to utfellinger og gjenoppløsningen av det andre bunnfall var en vesentlig rensing og konsentrering av enzym, slik at bare ett proteinbånd kunne påvises ved polyakrylamidgel-elektroforese. Til slutt ble resterende ammoniumsulfat fjernet fra enzympreparatet ved dialyse ved 0°C i 4 timer mot den 50 mM fosfatbuffer.

Det dialyserte enzym ble prøvet før og etter tilsetning

av p-hydroksy-kvikksølv-II-benzoat, som inhiberer invertase, men ikke påvirker fruktosyltransferaseaktivitet. På denne måte ble fruktosyltransferase-preparater funnet å være fri for invertase. Preparatenes proteininnhold ble anslått til 0,45 mg/ml ved måling av deres absorpsjon ved 280 nm. Et svart pigment er ofte til stede, selv i de rensete enzympreparater, men påvirker ikke preparatenes aktivitet.

b) Sukrose-6-acetat

80 g glukose-6-acetat (tørket under vakuum til konstant

vekt) og 160 g granulert sukrose ble løst ved romtemperatur i 100 ml Mclllvaine-buffer ved pH 5,4 og tynnet til 600 ml, dvs.

40 vekt%, med avionisert vann. Denne løsning ble deretter om-fattende filtrert, og 28 ml av enzymløsningen ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter inkubert ved 30°C, og det ble tatt prøver i intervaller inntil HPLC-analyse viste at det ikke lenger ble dannet sukrose-6-acetat, hvorved den høyeste konsentrasjon av sukrose-6-acetat som ble oppnådd var ca. 120 g/l. Enzymet ble fjernet ved filtrering av reaksjonsblandingen gjennom en søyle av DEAE-cellulose, som adsorberer enzymet. Alternativt kunne det denatureres ved oppvarming ved 65°C i 1 time. Fjerning av enzymet er viktig idet dette også kan katalysere den lang-somme hydrolyse av sukrose-6-acetat og frigjøre fruktose.

Produktet ble deretter isolert ved preparativ høytrykks-væskekromatografi, hvorved det ble oppnådd sukrose-6-acetat med minst 85% renhet med et totalt utbytte på ca. 50%. Den innledende hastighet for enzymreaksjonen var slik at det ble dannet 244,5 mg sukrose-6-acetat pr. mg enzym pr. time. Utbyttet i enzym-trinnet var 58%, basert på glukose-6-acetat-forbruk, eller 48% basert på sukrose-6-acetat-dannelse.

c) Klorering av sukrose-6-acetat

(i) Fremstilling av Vilsmeier-reagens.

140 g fosforpentaklorid ble tilsatt til 250 ml tørt dimetylformamid i et beger under kraftig omrøring, hvorved temperaturen ble holdt på 70-80°C, og omrøring ble fortsatt i 1 time, og reaksjonen ble deretter avkjølt og filtrert. Det krystallinske produkt ble vasket med 2 x 20 ml dimetylformamid og 40 ml dimetyl-eter og tørket i en ekssikator til dannelse av Vilsmeier-reagenset som hvite krystaller (93 g).

(ii) Fremstilling av sukrose-6-acetatløsning:

En viskøs sukrose-6-acetatløsning (41 g, sukrose-6-acetat-innhold 28 g) ble løst i dimetylformamid og tynnet til 86 ml. Løsningen ble tørket med molekylsikt og filtrert.

(iii) Klorering

31 g Vilsmeier-reagens ble tilsatt til 80 ml dimetylformamid, og blandingen ble avkjølt til 0°C. 21 ml sukrose-6-acetat-løsning, som inneholdt 7 g sukrose-6-acetat, ble langsomt tilsatt, hvorved temperaturen ble holdt under 20°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 15 minutter, deretter overført til et oljebad på 60°C i 30 minutter. Badet ble oppvarmet til 120°C

i løpet av 30 minutter og holdt på denne temperatur i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til 20°C og nøytrali-sert ved tilsetning av metanol-880 ammoniakk (2:1, 80 ml), mens temperaturen ble holdt under 50°C. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til en viskøs væske og acetylert ved tilsetning av 100 ml pyridin og 100 ml eddiksyreanhydrid. Etter omrøring ved 50°C

i 2 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til 20°C, og 80 ml metanol ble tilsatt mens temperaturen ble holdt under 60°C. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet til en viskøs væske og ekstrahert med varm (60°C) toluen (4 x 100 ml). Toluenekstrak-tene ble konsentrert til en viskøs væske og løst i 100 ml etylacetat. Etylacetatløsningen ble vasket med 3 x 100 ml vann, og vannet ble tilbakeekstrahert med 2 x 50 ml etylacetat. De kombinerte etylacetatekstrakter ble tørket over magnesiumsulfat, avfarget med aktivt kull og konsentrert til en viskøs væske som krystalliserte fra teknisk denaturert sprit, hvorved det ble oppnådd 4,4 g (39%) 4,1',6'-triklor-4,1',6'-trideoksygalakto-sukrosepentaacetat.

(iv) Avestring.

Pentaacetatet ble løst i tørr metanol og behandlet med en katalytisk mengde natriummetoksyd ved romtemperatur i 5 timer. Løsningen ble deretter avionisert og inndampet, hvorved det ble dannet 4,1',6'-triklor-4,1',6'-trideoksygalaktosukrose i 90% utbytte.

Eksempel 2

Fremstilling av 4, 1', 6'- triklor- 4, 6, 11, 6'- tetradeoksygalakto-sukrose ( 6- deoksy- TGS) ( en analog av TGS som har liknende grad av søthet).

(1) 6- deoksysukrose

Isolering, rensing og krystallisasjon.

20 g 6-deoksy-D-glukose (D-kinovose) og sukrose ble omsatt ved en tilsvarende reaksjon som den i eksempel 1, hvorved det ble oppnådd en blanding av 6-deoksysukrose, D-kinovose, sukrose og glukose, totalt volum 140 ml. 6-deoksysukrosen ble fraskilt fra blandingen ved preparativ høytrykksvæskekromatografi under anvendelse av en Waters Prepak 500-C18 søyle med omvendt fase og med vann som elueringsmiddel. Det ble iakttatt en overraskende stor forskjell i oppholdstid mellom 6-deoksysukrose og de øvrige bestanddeler i blandingen. D-kinovose, sukrose og D-glukose ble eluert 4-9 minutter etter innføring og 6-deoksysukrose først etter 29 minutter (største topphøyde). Den sterke skilling gjør det mulig å fraskille mer materiale pr. tilførsel enn det som ellers ville vært mulig. Elueringsmiddel som inneholdt 6-deoksysukrose ble inndampet til tørr tilstand under senket trykk (bad-temperatur 50°C), hvorved det ble oppnådd 16,7 g (42%) av en

klar viskøs væske som krystalliserte ved oppbevaring i romtemperatur. Produktet ble rekrystallisert fra etanol og hadde et smeltepunkt på 180-181°C, [a] + 57,6° (c ,2,5, vann); masse- + 13 spektrum, m/e 293 (M - CH3 - H20); C-NMR-spektrum (D20-løs-ning, i forhold til indre DSS ved 0 ppm):

(2) Selektiv klorering av 6- deoksysukrose

2,8 g 6-deoksysukrose ble løst i 10 ml dimetylformamid,

og løsningen ble tilsatt til en suspensjon av 15 g Vilsmeier-reagens i 30 ml dimetylformamid mens temperaturen ble holdt under 10°C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 minutter og deretter oppvarmet til 120°C på 2 timer under omrøring. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og 20 ml av

en løsning av metanol og ammoniumhydroksyd i forholdet 1:1 ble tilsatt. Blandingen ble konsentrert ved 70°C, og 2 x 20 ml toluen ble avdampet fra resten, som deretter ble acetylert med 30 ml eddiksyreanhydrid i 30 ml pyridin ved 60°C i 3 timer. 50 ml metanol ble tilsatt og blandingen inndampet til en rest som ble ekstrahert med 4 x 50 ml toluen ved 60°C under omrøring og dekantering. De kombinerte toluenekstrakter ble inndampet til tørr tilstand og resten kromatografert på silikagel med petroleum-eter:eter = 2:1 og deretter 1:1 som elueringsmiddel, hvorved det ble oppnådd 3,1 g (64%) av mellomproduktet 4,1',6'-triklor-4,6, 1',6'-tetradeoksygalaktosukrosetetraacetat som en lysegul viskøs væske etter avdamping av løsningsmidlene. Massespektrum, m/e 283, 285, 287 (9:6:1. diklor-di-O-acetvlfruktoserest) oa topper

som tilsvarte suksessive tap av 60 (CH3C02H), 42 (CH2=C=0) og 36 (HC1); 249, 251 (3:1,-monoklor-dideoksy-di-O-acetylgalaktose-rest med tap av CH2) og topper som tilsvarte suksessive tap av 60 og 42.

Tetraacetatet ble løst i 30 ml metanol og deacetylert med IM natriummetoksyd ved pH 9 ved romtemperatur. Løsningen ble nøytralisert med "Amberlyst" 15 (H<+>) kationbytterharpiks, filtrert og inndampet til tørr tilstand. Produktet ble oppnådd som et hvitt fast stoff, [a] + 87,1° (c 1,0, aceton), <13>C-NMR-spektrum (D20-løsning, i forhold til indre DSS ved 0 ppm):

4,1',6'-triklor-4,6,1<1>,6<1->tetradeoksygalaktosukrose viste seg å være 400 ganger så søtt som sukrose i 8 prosentig løsning.

Eksempel 3

Fremgangsmåten i eksempel 1 ble gjentatt, men under anvendelse av glukose-6-benzoat istedenfor 6-acetatet i trinn b).

Et tilsvarende resultat ble oppnådd, og trinn c) ble utført som i eksempel 1, hvorved TGS ble oppnådd med liknende utbytte.

Eksempel 4

Fremgangsmåten i eksempel 1 kan modifiseres ved anvendelse av et enzym avledet fra B.subtilis Marburg stamme 168, stamme NCIB 11872 eller stamme NCIB 11873 i trinn b). Reaksjonen foregår på tilsvarende måte, men med en lavere reaksjonshastighet.

Eksempel 5

Immobilisering og rensing av fruktosyltransferase fra B. subtilis NCIB 11871 under anvendelse av DEAE ionebyttercellulose, og fremstilling av xylsukrose

DEAE ionebyttercellulose (DE 52) ble vasket grundig i 50 mM Mcllvaine-puffer, pH 5,4, og deretter med puffret substrat (sukrose:xylose = 2:1, 40% vekt/volum totalt sukkerinnhold). Etter filtrering nesten til tørr tilstand på et Buchner-filter ble 10 g av DEAE-cellulosen blandet med 8 ml av et fruktosyl-transferasepreparat fra Bacillus subtilis som i eksempel 1 i 15 minutter ved 30°C under omrøring. Den resulterende blanding av DEAE-cellulose og enzym ble pakket i en 10 ml søyle (19 x 1 cm) som var utstyrt med kappe, og holdt på 30°C ved hjelp av en Churchill-termosirkulasjonsanordning. DEAE-cellulosen fikk renne ut under tyngdekraftens innvirkning, og den utrennende væske ble oppsamlet. Et substrat ble pumpet opp gjennom støylen med en strømningshastighet på ca. 1,0 ml.h 1 under anvendelse av en Watson-Marlow-pumpe, og eluat ble oppsamlet i tidsinter-valler og prøvet på fruktosyltransferaseaktivitet. Absorpsjon ved 280 nm (OD^gQ) ble også målt. For prøving av prøven ble en 0,1 ml porsjon av væskeprøven eller 0,1 g immobilisert enzym (på DE 52) inkubert med 2 ml substrat ved 30°C i 4 timer. Under anvendelse av et xylose/sukrose-substrat for fremstillingen av "xylsukrose" ble proteinkonsentrasjonen og aktiviteten til løs-ningen som var igjen etter at immobiliseringen var avsluttet sammenliknet med proteinkonsentrasjonen og aktiviteten til det opprinnelige enzympreparat. Det viste seg at 68,5% av det enzym som var til stede i begynnelsen i celleekstrakten var blitt immobilisert sammen med 83% av proteinet som opprinnelig var til stede. Det immobiliserte enzym hadde en begynnelsesaktivitet på 80,2% i forhold til aktiviteten til en ekvivalent mengde fritt enzym. Aktivitetene for de to preparater var 0,38 g xylsukrose/g immobilisert enzym/h og 0,865 g xylsukrose/ml enzym-ekstrakt/h.

Det immobiliserte enzym (10 g vekt/vekt) ble kjørt kon-tinuerlig, pakket i en søyle ved 30°C i ca. 2 uker uten noen forandring av pH-verdien i eluatet eller tegn på mikrobiell forurensning. Litt protein og enzym ble desorbert de tre første dager av operasjonen, noe som utgjorde 24% av proteinmengden som opprinnelig var adsorbert og 2,3% av enzymaktiviteten som opprinnelig var adsorbert. Den immobiliserte enzymaktivitet av-tok med en halveringstid på 95 timer og oppviste det uvanlige omvendte forhold mellom grad av omdannelse av substrater til produkter og strømningshastighet gjennom søylen. Ved den laveste strømningshastighet som ble benyttet, 0,086 tomme søylevolumer (ecv)h , ble det oppnådd en 80 prosentig omdannelse til xylsukrose, hvorved søyleeluatet inneholdt 21 g/l xylsukrose. Dette utbytte var høyere enn noe som ble oppnådd i satsvise reaksjoner, sannsynligvis på grunn av at søylens propp-strømningskinetikk favoriserer dannelsen av xylsukrose, idet produktene kontinuer-lig fjernes fra søylen og derved ikke samles opp og forårsaker produktinhibering. Totalt ble det under disse operasjoner dannet 20-25 g xylsukrose i en tilstand som det lettvint kan utvinnes ren xylsukrose fra.

Til forskjell fra det løselige enzym som ble anvendt i begynnelsen førte det immobiliserte enzym til at det ble dannet noen biprodukter under reaksjonen. Det ble dannet litt fruktose, mindre enn den mengde som ble produsert av den opprinnelige enzym-ekstrakt som ble benyttet for immobilisering, sannsynligvis på grunn av at invertaseaktiviteten som forurenser ekstrakten bare delvis ble adsorbert på DE 52. Atskillige forbindelser i mindre mengder, som ble eluert fra høytrykksvæskekromatografisøylen etter oppholdstider på 13 og 20 minutter ble påvist i eluatet fra det immobiliserte enzym, selv om de aldri var blitt påvist ved analyse av de løselige enzymreaksjoner. Disse er sannsynligvis oligosakkarider dannet av de vanlige reaktanter av enzymet. Det antas at det immobiliserte enzyms forsinkelse av reaktant-molekylene øker deres kontakttid med enzymet, slik at muligheten for polymerisasjon inntreffer.

Idet xyloseinnholdet i substratet var 133 gl var den maksimalt mulige xylsukrosekonsentrasjon 266 gl ^. Den maksimale konsentrasjon som ble iakttatt ved 0,086 tomme søylevolumer pr. time var 80% av dette, dvs. 210 gl \ men beregnet på basis av forbrukt xylosemengde under reaksjonen gir en 69,5 prosentig reaksjon. Utbyttene er høyere enn i satsreaksjoner på grunn av at prosessens gjennomstrømningsnatur bevirker at produktet hele tiden fjernes og på grunn av at produktet er forholdsvis upolart sammenliknet med substratene og derved fjernes selektivt fra det positivt ladete immobiliseringssubstrat, begge effekter som favoriserer dannelsen av xylsukrose.

Samme fremgangsmåte ble benyttet for fremstilling av sukrose-6-acetat fra glukose-6-acetat, 6-0-metylsukrose fra 6-0-metylglukose og 6-0-benzylsukrose fra 6-0-benzylglukose.

Enzym fremstilt ifølge eksempel 1 (0,1 ml) ble blandet med 2 ml av en 40 prosentig vekt/volum løsning av sukrose og xylose i forholdet 1:1, puffret på pH 5,5 ved 30°C. Xylsukrose ble påvist ved høytrykksvæskekromatografi. Levandannelse ble bestemt optisk. Resultater fra en sammenlikning med forskjellige enzymer var følgende:

Enzymene ifølge oppfinnelsen produserer således minst 10 ganger mer xylsukrose enn enzymet av Marburg-stammen, minst 100 ganger mer når det gjelder NCIB 11871 enzymet. Den konkurrerende dannelse av levan er mye mindre.

Eksempel 6 Fremstilling av galaktosukrose

15 ml av et 40 vektprosentig (vekt/volum) substrat som inneholdt like store vektmengder sukrose og galaktose løst i fosfat-citratpuffer (pH 5,9) ble inkubert ved 30°C med et lite volum av Bacillus subtilis NCIB 11871 fruktosyltransferase som var delvis renset ved utfelling av enzymet med 95 prosentig mettet ammoniumsulfatløsning, gjenoppløsning av bunnfallet samt utfelling av forurensninger ved 95 prosentig mettet ammonium-sulf atløsning .

Etter ca. 24 timers inkubasjon ble produktene separert ved høytrykksvæskekromatografi i en søyle med omvendt fase (porøst grafittkarbon, 5 (im diameter, elueringsmiddel 5 prosentig, vandig acetonitril). Det kunne ikke oppnås ytterligere økning i utbyttet av galaktosukrose ved ytterligere inkubasjon eller ved tilsetning av friskt enzym. Maksimale utbytter av galaktosukrose var ca. 0,33 g/g forbrukt galaktose og ca. 0,45 g/g forbrukt sukrose.

Eksempel 7

4, 1', 6'- tribrom- 4, 1', 6'- trideoksygalaktosukrose

(a) Fremstilling av Vilsmeier-reagens.

280 ml tionylbromid ble tilsatt til 260 ml tørket, avkjølt dimetylformamid under kraftig omrøring. Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 70-80°C og deretter ytterligere 1 time og hensatt for avkjøling til romtemperatur. Blandingen ble filtrert og resten vasket med 2 x 50 ml dimetylformamid og 100 ml dietyl-eter og tørket i en ekssikator, hvorved det ble oppnådd et utbytte på 320 g reagens.

(b) Bromering av sukroseacetat.

En løsning av 5 g sukrose-6-acetat i 20 ml dimetylformamid ble fremstilt som i eksempel 1 og behandlet med en avkjølt suspensjon av 25 g av Vilsmeier-reagenset i 50 ml dimetylformamid under omrøring, hvorved temperaturen ble holdt under 20°C, i 30 minutter. Den omrørte blanding ble deretter omrørt ved om-givelsestemperatur i 30 minutter og deretter oppvarmet til 110°C og omrørt i ytterligere 1,75 timer. Den ble deretter avkjølt til 20°C og nøytralisert ved tilsetning av en 2:1 blanding av metanol og konsentrert (0,380) ammoniakk, hvorved temperaturen ble holdt under 40°C. Blandingen ble deretter konsentrert til en tyktflytende væske og acetylert med 100 ml eddiksyre i 100

ml pyridin ved 50°C i 2 timer. Produktet ble utvunnet som i eksempel 1 som tribromgalaktosukrosepentaacetat (4,2 g), som var identisk med det i GB 2.101.989A. Dette ble deacetylert med natriummetoksyd (1 molar i metanol ved pH 9) ved omgivelsestem-peratur i 5 timer og deretter avionisert med "Amberlyst" 15 (H<+>) ionebytterharpiks. Den oppå liggende væske ble inndampet til tørr tilstand, hvorved det rene tribromsukker ble oppnådd, som var identisk med sukkeret i GB 2.101.989A.

Eksempel 8 Klorering av xylsukrose

3 g xylsukrose (fra eks. 5) ble løst i 6 ml dimetylformamid ved 10°C og tilsatt under omrøring til en kald suspensjon av 13 g av Vilsmeier-reagenset fra eksempel 1 i 25 ml dimetylformamid, mens temperaturen ble holdt under 10°C. Den omrørte blanding ble deretter oppvarmet til romtemperatur i løpet av 30 minutter og omrørt i 3 timer. Blandingen ble deretter avkjølt, nøytralisert med 1:1 metanol/konsentrert (0,880) ammoniakk og konsentrert ved 70°C. Fuktighet ble fjernet ved suksessive toluen-inndampninger, hvoretter resten ble acetylert med 30 ml eddiksyreanhydrid og 30 ml pyridin ved 60°C i 3 timer. Blandingen ble deretter behandlet med 50 ml metanol og inndampet til tørr tilstand. Resten ble ekstrahert med 4 x 50 ml toluen ved 60°C, og de dekanterte ekstrakter ble kombinert og inndampet. Resten ble kromatografert på silikagel med petroleumeter:dietyleter = 2:1, deretter 1:1, hvorved det ble oppnådd 2,6 g triklorarabinosuk-rosetetraacetat som en tyktflytende væske.

Massespektrum m/e 283, 285, 287 (9:6:1, diklor-di-O-acetyl-fruktoserest): topper som tilsvarte suksessive tap av 60 (CH^CG^H), 42 (CH2=C=0) og 36 (HCl) ;

235, 237 (3:1, monoklor-di-O-acetylarabinoserest) og topper som tilsvarte suksessive tap av 60 og 42.

Tetraacetatet ble løst i 30 ml metanol og deacetylert med

1 molar natriummetoksyd i metanol ved pH 9 ved omgivelsestempera-tur .

Blandingen ble avionisert med "Amberlyst" 15 (H<+>) harpiks og filtrert og inndampet. Produktet ble isolert som et fast skum [ a]^ + 101,9° (c 1,1, aceton), <13>C-NMR-spektrum D2~løsning.

Forbindelsen viste seg å være 25 ganger så søt som sukrose i en 2 prosentig løsning.

Claims (8)

1. Fruktosyltransferase, karakterisert ved at den er isolert fra B. subtilis, fortrinnsvis fra en av stammene NCIB 11871, NCIB 11872 eller NCIB 11873, eller fra Erwinia sp. og hydrolyserer en fruktosyloligosakkarid- eller fruktosyldisakkarid-donor, som er bundet til en aldoses anomere karbonatom med en (1-2) binding, og omdanner den derved oppnådde fruktosyldel til en akseptoraldose slik at det oppnås et fruktosyldisakkarid som hovedprodukt, idet enzymet er i stand til å danne 6-substituerte sukrosederivater som hovedprodukt når akseptoraldosen er en 6-substituert glukose og ikke danner vesentlige mengder alkcholut-fellbare oligo- eller polyfruktoser i nærvær eller fravær av en aldoseakseptor, idet enzymet har en Km overfor sukrose på minst 0,1 M i fravær av en aldoseakseptor og er stort sett uten invertaseaktivitet, idet det er behandlet med invertaseinhibitoren o-hydroksykvikksølvbenzoat.

2. Anvendelse av fruktosyltransferase ifølge krav 1 til fremstilling av et fruktosid fra en alkohol i form av et sukker, et sukkerderivat, en lavere polyol eller en lavere alkanol, ved be-handling av en vandig løsning av alkoholen og et fruktosyldisakkarid eller -oligosakkarid med fruktosyltransferasen.

3. Anvendelse i samsvar med krav 2, hvor fruktosyldi- eller -oligosakkaridet er sukrose, raffinose eller stakhyose.

4. Anvendelse i samsvar med krav 2 eller 3, hvor alkoholen er en aldose uten 6-hydroksygruppe og isoleringen blir utført ved ionebytterharpikskromatografi.

5. Anvendelse i samsvar med krav 4, hvor aldosen har den generelle formel hvor A er et hydrogenatom eller gruppen CH2X, hvor X er et hydrogenatom eller en alkoksygruppe eller en beskyttet hydroksygruppe, omsettes med fruktosyldi- eller -oligosakkaridet i nærvær av fruktosyltransferasen, hvorved det dannes en forbindelse med den generelle formel hvor A er som angitt for formel I.

6. Anvendelse i samsvar med krav 5, til fremstilling av et halogendeoksy-sukrose- eller -galaktosukrosederivat med den generelle formel hvor A er et hydrogenatom eller gruppen Cr^X, hvor X er et hydrogenatom eller en hydroksy- eller alkoksygruppe, og Y er et halo-genatom, ved halogenering av forbindelsen med formelen III, og for en forbindelse med formelen I hvor A er CI^X og X er en hydroksygruppe, fjerning av beskyttelsesgruppen fra den beskyttede hydroksygruppe.

7. Anvendelse i samvar med krav 6, hvor halogeneringen utføres med et Vilsmeier-reagens.

8. Anvendelse i samsvar med krav 6, hvor den beskyttede hydroksygruppe er en alifatisk eller aromatisk karbonyloksygruppe som fjernes ved hydrolyse, eller er en arylalkoksygruppe som fjernes ved reduktiv spalting.