JP2021180640A - 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 - Google Patents
分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021180640A JP2021180640A JP2020087827A JP2020087827A JP2021180640A JP 2021180640 A JP2021180640 A JP 2021180640A JP 2020087827 A JP2020087827 A JP 2020087827A JP 2020087827 A JP2020087827 A JP 2020087827A JP 2021180640 A JP2021180640 A JP 2021180640A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- xylose
- branched oligosaccharide
- producing
- xylosidase
- branched
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 title claims abstract description 83
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 70
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 69
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 108010038658 exo-1,4-beta-D-xylosidase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 13
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 claims description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 6
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-[(3r,4r,5r,6r)-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N 0.000 description 3
- LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 4-O-beta-D-xylopyranosyl-beta-D-xylopyranose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N D-xylobiose Natural products O=CC(O)C(O)C(CO)OC1OCC(O)C(O)C1O SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTTUBRHJNAGMKL-UHFFFAOYSA-N Xylohexaose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(OC5C(C(O)C(O)OC5)O)OC4)O)OC3)O)OC2)O)OC1 FTTUBRHJNAGMKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFFQNKFIEIYIKL-UHFFFAOYSA-N Xylopentaose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)OC4)O)OC3)O)OC2)O)OC1 LFFQNKFIEIYIKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000010907 stover Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100506054 Cellulomonas fimi cex gene Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187413 Streptomyces olivaceoviridis Species 0.000 description 1
- JVZHSOSUTPAVII-UHFFFAOYSA-N Xylotetraose Natural products OCC(OC1OCC(OC2OCC(OC3OCC(O)C(O)C3O)C(O)C2O)C(O)C1O)C(O)C(O)C=O JVZHSOSUTPAVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001877 deodorizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- UNSKAUSCLTVFGO-FSIIMWSLSA-N methyl (2s,3s,4s,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O UNSKAUSCLTVFGO-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- -1 small molecule xylan Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 150000003741 xylose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- KPTPSLHFVHXOBZ-BIKCPUHGSA-N xylotetraose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)C(O)OC3)O)OC2)O)OC1 KPTPSLHFVHXOBZ-BIKCPUHGSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、低分子化キシランから分岐オリゴ糖を得るに当たり、酵素を作用させた後の混合物からの分離が容易で、かつ、産生した分岐オリゴ糖を分解させずに保持できる技術を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする分岐オリゴ糖の製造方法である。また、この製造方法では、同時にキシロースも製造することができる。【選択図】図３
Description
本発明は、低分子化キシランから分岐オリゴ糖およびキシロースを製造する方法に関する。
キシランは、セルロースに次ぐバイオマス資源であり、その構造は以下の式で示されるように、キシロースがβ−１，４−結合でつながった主鎖にアラビノース（α−１，３−）や４−Ｏ−メチル−グルクロン酸またはグルクロン酸（α−１，２−）の側鎖を持つヘテロ多糖である。
このキシランに、従来より知られているキシラナーゼ（エンド型酵素）を作用させると、分解物は分岐オリゴ糖と直鎖状オリゴ糖の混合物となってしまうため、この混合物からは分岐オリゴ糖の分離が困難となる。そのため、キシラナーゼ分解物にキシロシダーゼを作用させ、直鎖状オリゴ糖を単糖に分解し、分岐オリゴ糖とキシロースを活性炭や膜分離により容易に分離する手法が考えられるが、分岐オリゴ糖にもキシロシダーゼが作用してしまい、非還元末端に分岐のあるオリゴ糖ばかりになってしまう。
また、ＣＡＺｙの分類でＧＨ３に分類されるキシロシダーゼ（カビ由来）では、アラビノース側鎖を有するオリゴ糖の非還元末端キシロースの結合が切れないという報告がある（非特許文献１）。
しかしながら、ＧＨ３に分類される酵素は作用させる際に酵素を大量に用いると、アラビノース側鎖を有するオリゴ糖の非還元末端キシロースの結合を切ってしまうことが知られている。更に、ＧＨ３に分類される酵素はアラビノフラノシダーゼ活性をサイドアクテビティーとして有するため、多量の酵素を使う、または反応時間が長い場合には、アラビノース側鎖を遊離し、主鎖を分解するという反応も起こってしまう。
Carbohydrate Research Volume249,Issue2,3,Pages355-367(1993)
従って、本発明では低分子化キシランから分岐オリゴ糖を得るに当たり、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からの分岐オリゴ糖の分離が容易で、かつ、得られた分岐オリゴ糖を分解させずに保持できる技術を提供することを課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＣＡＺｙの分類で特定のカテゴリーに分類される酵素を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。また、この低分子化キシランから分岐オリゴ糖を得る際に、同時にキシロースも得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする分岐オリゴ糖の製造方法である。
また、本発明は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることでキシロースを得ることを特徴とするキシロースの製造方法である。
本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からの分岐オリゴ糖の分離が容易で、かつ、得られた分岐オリゴ糖を分解させずに保持できる。
そのため、本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、分岐オリゴ糖を大量に製造することができるため、これまで不明であった分岐オリゴ糖の種々の性質の探索に貢献できる。
また、本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを単離することができるため、キシロースの製造方法としても有用である。
本発明の分岐オリゴ糖の製造方法（以下、「本発明製法」という）は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする。なお、本明細書において分岐オリゴ糖とは、糖の重合度が２〜１０のものをいう。
本発明製法において用いられる低分子化キシランは、分子量が２０００以下、好ましくは２８０〜１５００のものである。なお、この分子量の測定法は特に限定されるものではなく、例えば、質量分析やゲル濾過法で測定することができる。また、この分子量は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等で低分子化キシランを構成する糖の数から推測することもできる。このような低分子化キシランは、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させたり、酸を作用させたりすること等により得られるが、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させることが分岐オリゴ糖の構造を制御する点から好ましい。キシランを含む原料は、植物細胞壁を有するものであれば特に限定されず、例えば、バガス、イナワラ、コーンストーバー、木粉等が挙げられる。これらの中でもバガス、イナワラ、コーンストーバーが好ましい。
また、上記キシラナーゼは、特に限定されず、例えば、ＣＡＺｙの分類でファミリー分類されるＧＨ８キシラナーゼ、ＧＨ１０、ＧＨ１１に分類されるβ−キシラナーゼ等が挙げられる。これらキシラナーゼの中でも非還元末端から２番目のキシロースに分岐を持つオリゴ糖を主生産物とすることから、ＧＨ１１に分類されるβ−キシラナーゼが好ましい。なお、キシラナーゼの種類により、得られる分岐オリゴ糖の種類も変化させることができる。
更に、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させる条件は特に限定されないが、例えば、キシランを含む原料１に対して、キシラナーゼを０.０５〜５質量％（以下、単に「％」という）、好ましくは０.１〜０.５％添加し、３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃、ｐＨが５.５〜９.５、好ましくは５.５〜７で、１〜９６時間、好ましくは３〜４８時間保持する条件である。
また、上記酸は、特に限定されず、例えば、硫酸、塩酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。これら酸の中でも硫酸、塩酸が好ましい。
更に、キシランを含む原料に酸を作用させる条件は特に限定されないが、例えば、キシランを含む原料１に対して、０．１〜５％、好ましくは０．５〜１％の酸を添加し、８０〜２００℃、好ましくは１００〜１２０℃、０．１〜２４時間、好ましくは２〜３時間保持する条件である。
なお、キシランを含む原料を低分子化キシランにする時期は、後記するβ−キシロシダーゼの添加と同じでも、前でもよい。
本発明製法において用いられるＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼは特に限定されず、例えば、ＣＡＺｙのホームページ（http://www.cazy.org/）でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを検索し（検索結果：http://www.cazy.org/GH52_all.html）、これを産生する微生物を入手し、これを培養してＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを産生させ、それを必要により精製等したものや、ＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼのアミノ酸配列やこれをコードする塩基配列、遺伝子を利用して大腸菌等でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを産生させ、それを必要により精製等したもの等が挙げられる。
なお、ＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼの一般的な性質は以下の通りである。
・ｐＨ６付近に反応の至適がある。
・分子量は８万弱程度。
・アノマー保持型の反応機構であり、大量に使用すると糖転移反応を触媒する。
・キシロビオース、キシロトリオースを最も良く分解し、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオースと鎖長が長くなるにつれ活性が低下する。
・アラビノース側鎖、グルクロン酸側鎖いずれの場合も非還元末端にキシロースを１つ有する分岐オリゴ糖を分解しない。
・ｐＨ６付近に反応の至適がある。
・分子量は８万弱程度。
・アノマー保持型の反応機構であり、大量に使用すると糖転移反応を触媒する。
・キシロビオース、キシロトリオースを最も良く分解し、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオースと鎖長が長くなるにつれ活性が低下する。
・アラビノース側鎖、グルクロン酸側鎖いずれの場合も非還元末端にキシロースを１つ有する分岐オリゴ糖を分解しない。
これらＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５株（JCM9153株：理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室（http://jcm.brc.riken.jp/ja/）から入手可能）由来のものが好ましい。このＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５株由来のＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼのアミノ酸配列のアクセッションナンバーはBAB05833.1（配列番号１）である。そして、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子としては、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５株の全ゲノム配列（アクセッションナンバーはNC002570）を利用することができる。
低分子化キシランに、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを作用させる条件は特に限定されないが、例えば、低分子化キシラン１に対して、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを０.０００００５〜０.０００５、好ましくは０.００００１〜０.００００５％で添加し、３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃、ｐＨが５.５〜９.５、好ましくは５.５〜７で、１〜９６時間、好ましくは３〜４８時間である。
低分子化キシランに、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを作用させた後は、キシロースと分岐オリゴ糖の混合物が得られる。なお、この分岐オリゴ糖は、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖を含むものである。非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖としては、例えば、キシラナーゼとしてＧＨ１１に分類されるβ−キシラナーゼを用いた場合には、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl-(l→2)]-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose等が得られる。
本発明製法においては、上記で得られるキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離することが好ましい。キシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離する方法は特に限定されず、例えば、活性炭クロマトグラフィーや膜分離法等の方法が挙げられる。
また、本発明製法においては、上記分離の後に、更に、精製、乾燥等の処理を行ってもよい。
斯くして得られる分岐オリゴ糖は、例えば、腸内細菌、腸内細菌の増殖作用、整腸作用等を有する。そのため、この分岐オリゴ糖は、そのまま、または各種飲食品に利用することにより健康の増進に役立つ。
また、この分岐オリゴ糖は、従来は入手が困難で有り、その機能の解明もあまり進んでいなかったため、その機能の解明にも役立つ。
なお、上記した低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離することでキシロースを得ることができる。
キシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離する方法は特に限定されず、例えば、活性炭クロマトグラフィーや膜分離法等の方法が挙げられる。
上記分離の後には、更に、精製、乾燥等の処理を行ってもよい。
斯くして得られるキシロースは、例えば、甘味料、焼き色改良、風味改善、矯臭作用、テリの付与、酸化防止等を有する。そのため、このキシロースは、そのまま、または各種飲食品の製造に役立つ。また、キシロースは、キシロースを炭素源として多糖等を産生する微生物の発酵原料としても役立つ。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実 施 例 １
β−キシロシダーゼの製造：
（１）酵素の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５のゲノム（アクセッションナンバーNC002570）において、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼと推定されるタンパク（アクセッションナンバーBAB05833.1：配列番号１）をコードする遺伝子を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
β−キシロシダーゼの製造：
（１）酵素の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５のゲノム（アクセッションナンバーNC002570）において、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼと推定されるタンパク（アクセッションナンバーBAB05833.1：配列番号１）をコードする遺伝子を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
・forwardプライマー（配列番号２）：CATATGAATCGAGGAGAAACTGGTTATGAAACATG
・reverseプライマー（配列番号３）：GCGGCCGCTATCGGATAAATGGTT
・reverseプライマー（配列番号３）：GCGGCCGCTATCGGATAAATGGTT
上記で得た増幅物をpET28a(NcoI-HindIII)の間に挿入してpET28-bhxyl52プラスミドを得た。このプラスミドを用いたエレクトロポレーション法でEscherichia coli BL21（DE3）（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）を形質転換した。形質転換体はKanamycineを含むLuria-Bertani培地を使用し37℃で振盪（200rpm）しながら増殖させた。培養液のOD600nmが0.2に達したときにイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.1mMで培養液に添加し、その後、培養液を25℃で振盪(200rpm)しながら22時間酵素を発現させた．遠心分離（6,000rpm,15min,4℃）によって細胞を回収し，50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁して5分間超音波破砕した後、遠心分離（10,000rpm,30min,4℃）により不溶物を取り除いた。回収した上清もHisTrap HP（GE Healthcare,USA）を添加し、C末端の6xヒスチジンタグを利用して活性画分を精製した。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析して得られた溶液を精製酵素とした。得られた精製酵素の純度はSDS-PAGEで確認した。
pET28にクローニングしBL21(DE3)に形質転換したbhxyl52をIPTGにより誘導し発現させ、金属アフィニティークロマトグラフィーによりBhXyl52を精製した。精製酵素の純度をSDS-PAGEで確認したところ、電気泳動的に単一なバンドを得た（図１）。SDS-PAGEの結果から計算した精製酵素の分子量はおよそ76,382であり、アミノ酸配列から想定される分子量(78,580)と一致した。得られた精製酵素の活性と安定性に対するpHと温度の影響を調べた。本酵素の諸性質を図２に示す。本酵素の至適はpH6.2、50℃であった。pHに対する酵素の安定性では30℃、30分の処理でpH6.0〜8.0の間、40℃以下で安定だった。
（２）酵素と基質の反応
PNP-基質（Sigma）に対する活性は、2mM基質25μl、McIlvaine buffer(pH6.2)20μLを混ぜたものを5分プレインキュベーションし、酵素5μL（36nM）を添加して50℃、10分反応した後、0.2M Na2CO350μLを添加して反応を停止した。発色はA405nmを測定して行った。
PNP-基質（Sigma）に対する活性は、2mM基質25μl、McIlvaine buffer(pH6.2)20μLを混ぜたものを5分プレインキュベーションし、酵素5μL（36nM）を添加して50℃、10分反応した後、0.2M Na2CO350μLを添加して反応を停止した。発色はA405nmを測定して行った。
キシロオリゴ糖に対する活性は、表１に記載の基質を用い、基質濃度100μM 30μL、0.005% fucose35μL、McIlvaine budffer（pH6.2）100μL、DW73μL、enzyme100μL（final 5.5nM for GH52）を混ぜたものを0、10、20、40、60、80、100、150、200分インキュベーションした後、100℃で10分加熱することにより失活させた。反応停止液はDionex社HPLC装置によって分析した。分析条件は既報の通り（S. Kaneko, H. Ichinose, Z. Fujimoto, A. Kuno, K. Yura, M. Go, H. Mizuno, I. Kusakabe, and H. Kobayashi: Structure and function of a family 10 β-xylanase chimera of Streptomyces olivaceoviridis E-86 FXYN and Cellulomonas fimi Cex. J. Biol. Chem., 279, 26619-26626(2004).）。オリゴ糖のピークの減少を定量し、分解率を得た。
なお、基質のうち、キシロビオース(X2)、キシロトリオース(X3)、キシロテトラオース(X4)、キシロペンタオース(X5)、キシロヘキサオース(X6)は先の報告に従い調製した（Kusakabe et al. xylooligosaccharide）。また、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose (A1X4)とO-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl-(l→2)]-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose (MeGlcA3Xyl4)は先の報告に従い調製した（I. Kusakabe, S. Ohgushi, T. Yasui, and T. Kobayashi: Structures of the arabinoxylo-oligosaccharides from the hydrolytic products of corncob arabinoxylan by a xylanase from Streptomyces. Agric. Biol.Chem.,47,2713-2723(1983).）。
BhXyl52はPNP-基質に対してはPNP-Xylにのみ反応した。多糖には作用させた場合、還元力の増加は見られなかった(結果は省略)。直鎖状のキシロオリゴ糖に作用させたところ、X2とX3をもっとも早く分解した。X2=X3>X4>X5>X6と、X2とX3の分解速度はほぼ同じであり、主鎖が長くなるにつれて反応速度が低下した（表１）。また、分岐した基質には作用しなかった。分岐した基質に酵素量を1000倍に増やして作用させたが、結果は同じであった（結果は省略）。
以上の結果から、BhXyl52は、β−キシロシダーゼであり、直鎖状のキシロオリゴ糖は分解するものの、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖は分解しないことが分かった。また、BhXyl52は酵素量を多くしても非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖は分解しないことが分かった。
実 施 例 ２
バガスを原料とした分岐オリゴ糖の製造：
図３のスキームに従って、バガスを原料として、これにβ−キシラナーゼ（SoXyn11B）を作用させて、低分子化キシラン（ＴＬＣの結果から低分子化キシランが５糖以下で構成されていることを確認した（分子量は７００以下）。）を得て、それに更にβ−キシロシダーゼ（GhXyl52）を作用させて分岐オリゴ糖（Ａ１Ｘ４）を得た。なお、β−キシラナーゼは文献（https://www.jstage.jst.go.jp/article/jag/66/1/66_jag.JAG-2018_0008/_article）に基づいて調製したものを用いた。また、β−キシロシダーゼは、実施例１で得られたものを用いた。
バガスを原料とした分岐オリゴ糖の製造：
図３のスキームに従って、バガスを原料として、これにβ−キシラナーゼ（SoXyn11B）を作用させて、低分子化キシラン（ＴＬＣの結果から低分子化キシランが５糖以下で構成されていることを確認した（分子量は７００以下）。）を得て、それに更にβ−キシロシダーゼ（GhXyl52）を作用させて分岐オリゴ糖（Ａ１Ｘ４）を得た。なお、β−キシラナーゼは文献（https://www.jstage.jst.go.jp/article/jag/66/1/66_jag.JAG-2018_0008/_article）に基づいて調製したものを用いた。また、β−キシロシダーゼは、実施例１で得られたものを用いた。
低分子化キシラン（Ｃ５を８１０ｍｇ含む）にβ−キシロシダーゼを作用させることにより分岐オリゴ糖（Ａ１Ｘ４）が６４０ｍｇ（乾燥後）得られた。また、同時にキシロースも得られた（結果は省略）。
本発明製法は健康の増進に役立つ分岐オリゴ糖や飲食品の製造に役立つキシロースを大量に製造することができる。
Claims (9)
- 低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする分岐オリゴ糖の製造方法。
- β−キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離することで分岐オリゴを得るものである請求項１記載の分岐オリゴ糖の製造方法。
- 分岐オリゴ糖が、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖を含むものである請求項１または２記載の分岐オリゴ糖の製造方法。
- 低分子化キシランが、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させたものである請求項１〜３の何れか１に記載の分岐オリゴ糖の製造方法。
- ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５株由来のβ−キシロシダーゼである請求項１〜４の何れか１に記載の分岐オリゴ糖の製造方法。
- 低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼを作用させることでキシロースを得ることを特徴とするキシロースの製造方法。
- β−キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離することでキシロースを得るものである請求項１記載のキシロースの製造方法。
- 低分子化キシランが、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させたものである請求項６または７記載のキシロースの製造方法。
- ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ−キシロシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５株由来のβ−キシロシダーゼである請求項６〜８の何れか１に記載のキシロースの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020087827A JP7497858B2 (ja) | 2020-05-20 | 2020-05-20 | 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020087827A JP7497858B2 (ja) | 2020-05-20 | 2020-05-20 | 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021180640A true JP2021180640A (ja) | 2021-11-25 |
| JP7497858B2 JP7497858B2 (ja) | 2024-06-11 |
Family
ID=78605808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020087827A Active JP7497858B2 (ja) | 2020-05-20 | 2020-05-20 | 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7497858B2 (ja) |
-
2020
- 2020-05-20 JP JP2020087827A patent/JP7497858B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7497858B2 (ja) | 2024-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10364449B2 (en) | Fermentative production of oligosaccharides | |
| WO2015016544A1 (ko) | 알돌레이즈, 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법과 생산용 조성물 | |
| KR101480422B1 (ko) | 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물 | |
| JP6165872B2 (ja) | 単糖類の製造方法 | |
| Van Balken et al. | Production of 1-kestose with intact mycelium of Aspergillus phoenicis containing sucrose-1 F-fructosyltransferase | |
| Nakajima et al. | Practical preparation of D-galactosyl-β1→ 4-L-rhamnose employing the combined action of phosphorylases | |
| JP2016518135A (ja) | サイコースエピマー化酵素変異体及びこれを用いたサイコースの製造方法 | |
| US9885030B2 (en) | Polynucleotide for recombinant expression of sucrose isomerase | |
| US5516666A (en) | Alginate oligosaccharide and method for producing the same | |
| CN113544264A (zh) | 甘露糖的酶法生产 | |
| KR101883351B1 (ko) | 과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 | |
| DE60035801T2 (de) | Bakterielle stämme von genus klebsiella und deren gen kodierend für isomaltulose synthase | |
| CN109415747B (zh) | 一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用 | |
| JP2021180640A (ja) | 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法 | |
| JP3559609B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3650632B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素 | |
| JPH06506107A (ja) | キシラナーゼ、キシラナーゼを産生するバチルス株およびその利用 | |
| Chao et al. | Cloning and characterization of an alginate lyase from marine Vibrio. sp. QD-5 | |
| Al-Rmedh et al. | Curdlan Gum, Properties, Benefits and Applications | |
| EP3415631A1 (en) | Methods of producing 5-ketofructose | |
| JP7348675B2 (ja) | α－及びβ－１，４－グリコシド結合を全て切断する酵素の用途 | |
| JP7210626B2 (ja) | 酵素的方法を使用してレバウディオサイドｊを調製するための方法 | |
| KR102100958B1 (ko) | 가야도모나스 주비니에게 g7 유래 알파-네오아가로올리고당 가수분해효소의 이용 | |
| KR20180105623A (ko) | 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속 유래 탈분지 효소를 이용한 전분당으로부터 포도당의 생산 방법 및 그 포도당 | |
| Flores-Gallegos et al. | Fungal Inulinases: An Interesting Option for Food Sweetener Production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240123 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240311 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240520 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240523 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7497858 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |