KR20040088822A - 녹말분해효소를 코딩하는 유전자 서열, 이로부터 코딩되는녹말분해효소 및 이를 이용한 녹말로부터 말토오스 시럽의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양 DNA로부터 추출된 신규의 아밀라아제를 코딩하는 유전자, 이로부터 코딩되는 신규의 아밀라아제 및 이를 이용하여 말토오스 시럽을 제조하는 방법을 제공하는 것에 관한 것으로, 서열번호 3에 기재된 본원발명의 신규 아밀라아제는 고품질의 말토오스 시럽을 제조하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

녹말분해효소를 코딩하는 유전자 서열, 이로부터 코딩되는 녹말분해효소 및 이를 이용한 녹말로부터 말토오스 시럽의 제조방법 {Gene sequence coding starch-degrading enzyme, starch-degrading enzyme thereof and method for production of maltose syrup from starch by using it}

본 발명은 신규의 아밀라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이로부터 코딩되는 신규의 아밀라아제 및 이를 이용한 녹말로부터 말토오스 시럽의 제조방법에 관한 것이다.

지난 수십 년 간 미생물의 2차 대사물질에서 얻은 산물들은 의학, 산업 및 농업용으로 사용되어 왔고, 그 예로는 항생물질, 항암제, 항진균성 화합물, 면역억제제, 효소 억제제, 제초제, 성장 촉진제, 효소 등을 포함하여 많은 것들이 있다.

한편, 상기와 같이 현재 사용되고 있는 대부분은 토양에서 거주하는 미생물로부터 유래하였고, 주로 실험실에서 배양될 수 있는 미생물들이 생물학적 활성을 갖는 화합물의 생산을 위해 연구되어 왔다.

따라서, 1980년 대 후반에 과학자들 사이에서는 토양 미생물과 더불어 발견될 수 있는 새로운 산물은 더 이상 없다고 생각하는 것이 일반화되었다.

그러나, 1990년대 미생물 생태학자들 사이에서 토양에서 사는 총 미생물 중 약 1% 만이 액체배양될 수 있다는 가설이 제기되었으며, 이는 16s-rRNA 연구에 의해 뒷받침되었다. 이러한 견해는 배양이 불가능한 약 99%의 세포가 배양가능 유사종일 수 도 있다는 것을 암시한다고 볼 수 있는 것이다.

"메타게놈(metagenome)"이란 상기의 견해들로부터 도입된 용어로서, Handelsman 등(Handelsman, J., Rondon, M.R., Brady, S.F., Clardy, J. andGoodsman, R.M., 1998, Molecular biological access to the chemistry of unknown soil micrbes: a new frontier for natural products, Chemistry and Biology, 5 (10), R 245-249)에 의해 자연에서 발견되는 총 미생물상 중 수집가능한 게놈으로 정의되었다.

한편, 토양에 존재하는 배양불가능 미생물을 조사하기 위하여, 토양 미생물에서 분리된 DNA의 클로닝이 토양의 메타게놈 DNA에 접근하는 방법으로 제안되었다(도 1참조).

2000년에, Rondon 등(Rondon, M.R., August, P.R., Bettermann, A.D., Brady, S.F., Grossman, T.H., Liles, M.S., Loiacono, K.A., Lynch, B.A., MacNeil, I.A., Minor, C., Tiong, C.L., Gilman, M., Osburne, M.S., Clardy, J., Handelsman, J. and Goodman, 2000, Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing in the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms, Applied and Environmental Microbiology, 66 (6), p.2541-2547)은 항생물질과 효소를 찾기 위해 BAC 메타게놈의 라이브러리를 구축하였다고 보고하였는데, 상기 BAC 라이브러리 시스템은 한 개의 BAC 클론에서 전경로를 복제할 수 있으며, 항생물질 혹은 다른 복잡한 유전자 집합을 찾는 데 있어 매우 주목을 끄는 시스템이다.

그러나, 상기의 장점에도 불구하고, 일반적으로 BAC 벡터는 대장균에서 싱글 카피를 갖기 때문에 BAC 클론을 분리하기가 쉽지 않고, 복제된 BAC DNA는 다루기가 어려운 문제가 있다. 게다가, BAC 클론에서 과다발현시킨 유전자를 검출할 가능성이 고발현 벡터 시스템과 비교하여 낮다는 문제가 있는데, 효소를 코딩하는 구조 유전자의 평균 크기는 대략 1~2 kb이므로 신규한 효소를 찾기 위해서는 카피 수가 큰 플라스미드 벡터를 이용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하는 것이 바람직하다.

예를 들어, Henne 등(Henne, A., Daniel, R., Shmitz, R. and Gottschalk, G., 1999, Construction of envionmental DNA libraries inEscherichia coliand screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate, Applied and Envrionmental Microbiology, 65 (9), p.3901-3907; Henne, A., Schmitz, R.A., Beomeke, M., Gottschalk, G.and Daniel, R., 2000, Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity onEscherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, 66(7), p.3113-3116)은 pBluescriptSK+를 사용하여 토양의 DNA 라이브러리를 구축하고 3~10 kbp의 작은 DNA 단편을 이용하여 유전자와 리파아제를 이용한 4-하이드록시부틸레이트의 선별을 보고하였다.

본 발명에서는 일반적으로 클로닝에 사용하는 벡터인 pUC19을 이용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 목초지와 개울가의 토양에서 DNA를 추출하였다. 표적 효소로서, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제 및 DNase를 포함하여 5 개의 산업상 유용한 효소의 역가를 측정하였는데, 구축된 라이브러리로부터 한 개의 신규한 녹말분해 효소를 코딩하는 신규의 유전자 및 이로부터 코딩되는 신규의 녹말분해효소를 발견하고 본 발명을 완성한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 토양의 DNA로부터 추출된 신규의 녹말분해 효소 코딩 유전자, 이로부터 발현되는 신규의 녹말분해 효소 및 이를 이용한 녹말로부터 말토오스 시럽의 제조방법을 제공하는데 있다.

도 1은 메타게놈 라이브러리의 제작과정을 보여주는 모식도이다.

도 2a는 토양 DNA의 부분 분해 조사의 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진도이다.

도 2b는 DNA 분획을 위한 수크로오스 밀도 구배에 따른 초원심분리 후, 아가로오스 겔 전기영동의 결과를 나타내는 사진도이다.

도 3은 아밀라아제를 생산하는 클론을 검출하기 위한 플레이트 선별 결과를 나타내는 사진도이다.

도 4a는 pS2A4에 복제된 인서트 DNA의 개략도이다.

도 4b는 pS2A4를 포함하는 대장균(E. coli)과 음성 대조군의 세포 추출물에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다.

도 4c는 인서트 DNA의 시퀀스이다.

도 5는 과다발현 벡터의 구축 및 아밀라아제 정제과정을 나타낸 공정도이다.

도 6은 각 정제 단계에서 아밀라아제에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다.

도 7a는 칼슘 이온의 유무에 따른 가용성 녹말에 대한 메타게놈 아밀라아제의 온도 의존적 활성을 나타내는 그래프이다.

도 7b는 칼슘 이온의 유무에 따른 β-사이클로덱스트린에 대한 메타게놈 아밀라아제의 온도 의존적 활성을 나타내는 그래프이다.

도8a는 1 mM Ca²⁺첨가 시, 효소의 열적 실활에 대한 온도의 영향을 나타내는 그래프이다.

도8b는 40℃에서, 효소의 열적 실활에 대한 Ca²⁺농도의 영향을 나타내는 그래프이다.

도 9a는 녹말 및 β-사이클로덱스트린에 대한 메타게놈 아밀라아제의 활성에 있어, pH의 영향을 나타내는 그래프이다.

도 9b는 다양한 pH 조건 하에서 2시간이 지난 후의 메타게놈 아밀라아제 활성에 있어, pH의 영향을 나타내는 그래프이다.

도 10a는 다양한 기질(0.5%)에 메타게놈 아밀라아제를 처리하여 가수분해 반응을 실시한 후, TLC 분석을 실시한 결과를 나타내는 사진도이다.

도 10b는 메타게놈 아밀라아제 효소와 최종적으로 글루코오스와 갈락토오스로 분해되는 락토오스 간의 반응 결과를 나타내는 사진도이다.

도 11a는 말토펜타오스(0.5%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과를 나타내는 사진도이다.

도 11b는 p-니트로페닐 말토펜타오스(1%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과를 나타내는 사진도이다.

도 11c는 가용성 녹말(0.5%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과를 나타내는 사진도이다.

도 12a는 5%의 말토덱스트린간의 당전이반응의 TLC 분석 결과를 나타낸 사진도이다.

도 12b는 1%의 말토트리오스와 5%의 만노오스, 자일로오스, 락토오스, 셀로바이오스 및 말티톨과 α-메틸 글루코시드 간의 당전이반응의 TLC 분석 결과를 나타낸 사진도이다.

도 13a는 1% 말토테트라오스(도 13a)의 시간대별 반응을 TLC 분석한 결과를 나타내는 사진도이다.

도 13b는 5% 말토펜타오스(도 13b)의 시간별 반응을 TLC 분석한 결과를 나타내는 사진도이다.

도 14는 녹말과 메타게놈 아밀라아제의 다양한 농도에 따른 녹말 가수분해 반응의 TLC 분석 결과를 나타낸 사진도이다.

도 15는 플루라나아제가 처리된 녹말 및 플루라나아제가 처리되지 않은 녹말에 대한 본원발명 메타게놈 아밀라아제의 가수분해 결과를 TLC 분석을 통해 나타낸 사진도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 녹말분해효소를 이용하여 녹말로부터 말토오스 시럽을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 pUC19을 이용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하고 신규한 아밀라아제 유전자를 분리하였다. 토양 1 g 당 약 13.7 ~ 17.6 ㎍의 DNA가 추출되었으나, DNA 1 ㎍ 당 약 600개의 클론(목초지 토양)과 120개의 클론(서호천 토양)만이 획득되었다. 이는 Henne 등(Henne, A., Daniel, R., Shmitz, R. and Gottschalk, G., 1999, Construction of envionmental DNA libraries inEscherichia coliand screening for the presence of genes conferringutilization of 4-hydroxybutyrate, Applied and Envrionmental Microbiology, 65 (9), p.3901-3907; Henne, A., Schmitz, R.A., Beomeke, M., Gottschalk, G.and Daniel, R., 2000, Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity onEscherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, 66(7), p.3113-3116)이 보고한 DNA 1 ㎍ 당 2,000개의 클론과 비교하여 볼 때, 비교적 낮은 수율이었는데, 이는 시료 채취 장소가 다량의 휴민산(humic acid)이나 혹은 유기질을 포함하였고, 그로 말미암아 효율적인 라이게이션을 위하여 DNA가 충분히 정제되지 못하였기 때문인 것 같았다(특히, 서호천 토양에서 추출한 토양 DNA의 경우).

상기의 문제점으로 말미암아 pUC19에 복제된 DNA의 평균 크기는 예상보다 작았고, 단지 1개 만이 효소 활성을 갖는 클론으로 회수되었다.

유일한 효소 활성을 갖는 양성 클론 pS2A4의 서열을 분석한 결과 인서트 DNA의 크기는 3928 bp였다. 상기 인서트 DNA에는 2개의 완전 ORF(프럭토오스 비스포스페이트 알돌라아제로 추정와 추정 아밀라아제)와 1개의 불완전 ORF(포스포프럭토키나아제로 추정)가 발견되었으며, 이들 총 3개의 ORF는 GenBank에 등록된 기존의 것들과 달랐다.

상기 2개의 완전 ORF는 예상할 수 있는 크기의 분자량을 갖는 단백질을 발현하는 것으로 확인되었다. 이들 2개의 완전 ORF는 같은 방향에서 서로 인접해 있었는데, 이로부터 상기 2개의 ORF이 같은 오페론에 있는 것으로 추정할 수 있었다. 또한, 프로모터 부분은 ORF1의 업스트림쪽에 있는 것으로 추정되었다.

그러나, 상기 2개의 ORF에서는 둘다 Shine-Dalgano 시퀀스가 발견되지 않았고, 이는 아마도 상기 DNA가 대장균에서 계통적으로 먼 미생물에서 유래했기 때문인 것으로 판단되었다.

본 발명, 메타게놈 아밀라아제의 물리화학적 특징들은 가용성 녹말과 β-사이클로덱스트린 간에 서로 달랐는데, 특히, 상기 기질에 대한 최적 pH와 금속 이온의 효과가 구별되었다. 다수의 말토제닉 아밀라아제와 네오플루라나아제에서, 이러한 현상은 단백질의 올리고머의 상태 때문인 것으로 보고되어 졌고, N-말단에 있는 부가 구조가 그 역할을 담당하는 것으로 알려져 있지만, 본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 그러한 구조를 갖고 있지 않았다.

한편, 본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 독특한 작용 패턴을 가지고 있다. 2002년에, Ammar 등(Ammar, Y.B., Mtsubara, T., Ito, K., Iizuka, M., Limpaseni, T., Pongsawasdi, P. and Minamiura, N., 2002, New action pattern of maltose-forming α-amylase fromStreptomyces sp. And its possible application in bakery, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35 (6), p.568-575)은 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.)에서 단일분자(unimolecular)의 가수분해 시스템과 동일 시간대에 당전이반응을 포함하는 말토오스 생성 α-아밀라아제의 신규한 작용 패턴을 보고하였는데, 본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 상기와 매우 유사한 작용 패턴을 나타냈다.

본 발명의 메타게놈 아말라아제는 말토덱스트린을 가수분해하여 우세적으로 말토오스를 생산하였고, 동시에 1,4-결합을 형성하기 위해 당전이반응을 수행하였다.

기질 농도가 1% 이상일 때, 당전이반응이 초기에 우세했지만 궁극적으로는 가수분해가 더 우세하였다. 상기의 독특한 특징은 본 발명 효소의 보존 부위에 있는 특이 서열과 연관되어 있을 것으로 추정되는데, 보존 부위 IV에 있는 이소루이신-세린-세린은 다른 아밀라아제에는 발견되지 않는 독특한 것이다.

한편, 대부분의 아밀라아제에는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 이소루이신으로 치환되어 있으며, 대부분의 말토제닉 아밀라아제와 네오플루란아제에서는 루이신이 치환되어 있다.

한편, 본 발명, 메타게놈 아밀라아제의 독특한 특징은 락토오스의 β-결합이 깨져 글루코오스와 갈락토오스로 될 수 있다는 것이다. 이는 통상의 α-아밀라아제에는 발견되지 않는 것이다. 한편, 셀로바이오스의 β-결합은 깨지지 않았고, 셀룰로오스는 본 발명의 효소에 의해 분해되지 않았는데, 이로부터 본 발명의 효소는 단지 락토오스 가수분해에만 작용하는 아밀라아제라는 것을 알 수 있었다.

결론적으로, 메타게놈 아밀라아제는 말토제닉 아밀라아제, 네오플루라나아제 및 α-아밀라아제의 특징들을 복합적으로 가지고 있다 할 수 있었다. 플루란과 β-사이클로덱스트린에 대한 가수분해 패턴은 말토제닉 아밀라아제 혹은 네오플루라나아제와 매우 비슷하다는 것을 나타냈으나, 녹말에 대한 분자적 분석 및 작용 결과는 상기 효소가 α-아밀라아제에 보다 더 가깝다는 것을 보여주었다. 녹말과 말토덱스트린에 대한 가수분해 및 당전이반응 패턴은 Ammar 등(Ammar, Y.B., Mtsubara, T., Ito, K., Iizuka, M., Limpaseni, T., Pongsawasdi, P. and Minamiura, N.,2002, New action pattern of maltose-forming α-amylase fromStreptomyces sp. And its possible application in bakery, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35 (6), p.568-575)의 말토오스 생성 α-아밀라아제와 매우 유사하지만, 본원발명의 메타게놈 아밀라아제가 Ammar의 것과 같은 말토오스 생성 α-아밀라아제 군에 속한다고 결론내리기는 어려웠다.

따라서, 메타게놈 아밀라아제는 말토오스를 생성하는 α-아밀라아제와 닮은 신규한 아밀라아제라 할 수 있었다. 말토덱스트린 및 녹말에 대한 작용 패턴은 하기의 식에 의하여 간략화 될 수 있었다.

Gx →G2+G3+···+Gx-1 →G2+G3 →→G1+G2(x>2)

↕

Gm+Gn →G2+G3+···+G2m (m≥n, m>1, 농도>1%)

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 하기 실험 및 실시 예를 통해 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실험 및 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규의 녹말분해효소 코딩 유전자 발견 및 신규의 녹말분해효소 정제

(1) 메타게놈 라이브러리의 구축

2001년과 2002년 1월에 화학공장폐수로 오염된(BOD 90.6 mg/L, 수원시 통계를 참조함) 소 목초지(대한민국 수원시)와 수원의 서호천에서 토양 시료를 준비하였다. Zhou 등(Zhou, J., Bruns, M.A. and Tiedje, J.M., 1996, DNA recovery from soils of diverse composition, Applied and Environmental Microbiology, 62 (2), p.316-322)의 직접 분해(direct lysis) 방법에 따라 토양 시료에서 DNA를 분리하였다. 각각 5 g의 환경시료는 프로테인아제 K(10 mg/mL) 100 ㎕를 포함하는 13.5 mL의 DNA 추출버퍼(표 1)에 37℃, 225 rpm의 조건에서 30분 동안 수평진탕(horizontal shaking)을 함으로써 혼합되었다.

[표 1]

그 후, 1.5 mL의 20%(wt/vol) 소듐 도데실 설페이트를 첨가한 다음, 매 15분 내지 20분마다 앞뒤를 약하게 흔들어 주면서 65℃의 수조에서 2시간 동안 보관하였다. 실온에서 6,000 xg로 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 새로운 원심분리용 튜브로 옮겼다. 또한, 잔류하는 토양 침전물은 4.5 mL의 추출 완충액과 0.5 mL의 20% 소듐 도데실 설페이트에 현탁함으로써 2번 이상 더 추출되었다. 이후 계속되는 보관 및 원심분리는 상기에서 기술된 바와 같이 행해졌다.

모든 추출단계로부터 회수한 상등액이 혼합되고 같은 부피의 클로로포름:이소아밀알콜(24:1, v/v)과 혼합되었다. 액상은 원심분리에 의하여 회수되었고, DNA는 상등액 부피의 0.6배 분량의 이소프로판올 혹은 2배 분량의 에탄올로 실온에서침전되었다. 9,000 x g으로 20분 간 원심분리함으로써 핵산 조추출물의 침전물이 회수되었다. 70%(v/v) 에탄올로 세척한 후, DNA는 0.5 mL의 탈이온수로 재현탁되었다. 휴민 물질(humic substance)을 제거하기 위한 DNA의 최종 정제는 위저드 DNA 클린 업 시스템(미국 프로메가 사)으로 수행하였다.

서호천 토양과 목초지 토양에서 각각 대략 13.7 ㎍ 및 17.0 ㎍의 DNA를 추출하였는데, 이는 종래의 보고들에서 보고된 다른 토양에서 분리한 DNA와 같은 범위에 해당하였다.

정제된 토양 DNA에Sau3A1을 처리하여 부분적으로 분해하고, 크기가 매우 작은 DNA 단편이 클로닝되는 것을 피하기 위해, 26,000 x g로 24시간 동안 실온에서 수크로오스 밀도 구배에 따른 원심분리(10~40%, wt/vol)를 실시하여 크기별로 분획하였다. 그 중 3 ~ 7 kb 크기의 DNA 단편을 포함하는 분획이BamH1-절단 pUC19에 라이게이션되었고, 대장균(E. coli) DH5α로 형질전환되었다.

목초지 토양 1 ㎍ 당 대략 600개의 클론을, 그리고 서호천 토양 1 ㎍ 당 250개의 클론을 얻을 수 있었는데, 상기의 수율은 종래의 보고들과 비교하여 매우 낮았다.

구축된 M-라이브러리(목초지 토양)는 84개의 96-웰 플레이트에 8064개의 클론을 구성하였으며, S-라이브러리(소호천 토양)는 36개의 96-웰 플레이트에 3456개의 클론을 구성하였다. 라이브러리의 질을 검사하기 위해, 70개의 클론이 무작위로 선택되고 재조합 플라스미드가 제조되었는데, 인서트(insert)의 평균 크기는 3.5 kb(2~7 kb)이었으며, 인서트를 포함하는 플라스미드는 대략 85%였다.

(2) 생물학적 활성 선별

클론들의 인서트 크기는 단일 유전자용으로 적당하였고, 표적 효소로서, 산업적으로 유용한 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, DNase 및 셀룰라아제를 특정하여 그 활성을 측정하였다.

96-웰 플레이트에 구축된 토양 라이브러리는 48-레플리카 핀을 이용하여 50 ㎍/mL의 앰피실린과 적당한 기질을 포함한 LB 고체배지 위로 모사되었다. 콜로니들은 37℃에서 하루동안 배양되었고, 세포 내에 생성된 효소를 검출하기 위해 D-사이클로세린(60 ㎍/mL)을 포함한 탑 아가(0.6%) 5 mL가 그 위에 덮어졌다. 표현형 결정(phenotype determination)을 하기 전에 상기 플레이트는 이틀동안 배양되었다.

셀룰라아제 활성을 검출하기 위해, 라이브러리는 0.1%의 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 포함하는 LB 아가 플레이트에 모사되었고, 플레이트는 콩고 레드용액(1 mg/mL)에서 15분 간 유지되었다. 콩고레드용액이 제거되고, 플레이트는 1 M NaCl에서 15분간 처리한 후 이를 제거하고 다시 1M의 HCl를 가하여 발색부위를 안정화시켰다.

프로테아제 및 리파아제 활성을 검출하기 위해, 라이브러리는 1%(wt/vol) 탈지우유 및 1%(vol/vol) 트리카프릴린을 각각 포함하는 LB 아가 플레이트에 모사되었다.

아밀라아제 활성은 그람 요오드 용액(100 mL 수용액에 I₂0.203 g, KI 5.2 g을 포함)을 이용하여, 2%의 가용성 녹말을 포함한 LB 아가에서 조사되었다.

DNase 활성은 '박토 DNase 메틸 그린 아가(미국 디프코 사)'로 조사되었다.

상기의 실험을 수행한 결과, S-라이브러리 중 한 개의 클론(pS2A4)이 가용성 녹말을 포함한 LB 아가 플레이트에서 녹말분해 활성을 나타냈다. 녹말분해 활성은 D-사이클로세린을 처리하지 않고서도 측정되었으며, 대장균에서 기능을 발휘하는 시그널 시퀀스를 가지는 것으로 추정할 수 있었다.

한편, 프로테아제, 리파아제, DNase 혹은 셀룰라아제를 발현하는 클론은 발견되지 않았다.

도 2a는 토양 DNA의 부분 분해 검사의 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다. 레인 1에서는Sau3AI 1 unit를 1 ㎍의 토양 DNA에 첨가하였고, 레인 2 ~ 10에서는 효소를 2배씩 연속적으로 희석하였다.

도 2b는 DNA 분획을 위한 수크로오스 밀도 구배에 따른 초원심분리 후의 아가로오스 겔 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인의 번호는 튜브 바닥에서 용출된 분획번호를 나타낸다. 레인 M은 1 kb 플러스 래더를 의미한다.

도 3은 아밀라아제를 생산하는 클론을 검출하기 위한 플레이트 선별 결과(플레이트 S2)를 나타내는데, 96-웰 플레이트로부터 가용성 녹말 아가 플레이트로의 레플리카-플레이팅에 의하여, 하나의 클론(A4에 위치함: pS2A4)에서 요오드 용액 염색 후, 투명 할로(염색이 되지 않음)로써 활성이 확인되었다.

(3) 아밀라아제를 포함하는 예상 클론의 분자적 분석

1) pS2A4에 복제된 인서트 DNA의 분자적 분석

pS2A4를 포함하는 클론을 더 분석하였다. 인서트 DNA를 시퀀싱하고 GenBank에 있는 기존의 시퀀스와 비교하였다. 한편, 하기의 표 2는 본 발명의 PCR 및 시퀀싱에 사용된 올리고 뉴클레오타이드이다.

[표 2]

본 발명의 PCR 및 시퀀싱에 사용된 올리고 뉴클레오타이드

pS2A4 인서트 DNA의 길이는 3928 bp이었으며, 2개의 완전 오픈 리딩 프레임과 한 개의 불완전 오픈 리딩 프레임(ORFs)이 있었다(도 4a).

첫 번째 완전 ORF(ORF1, 1062 bp)는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)프럭토오스 비스포스페이트 알돌라아제 II 군과 높은 상동성(67% 동일성, 78% 염기성)을 나타냈으며, 다른 박테리아의 프럭토오스 비스포스페이트 알돌라아제와도 매우 유사하였다.

두 번째 완전 ORF(ORF2, 1551 bp)는 첫 번째 ORF에 인접해 있었으며, 페니바실러스 폴리미사(Paenibacillus polymyxa)의 네오플루라나아제와 가장 높은 상동성을 나타내었다(47% 동일성, 64% 염기성). 유사성이 30% 이상인 다른 유전자로는 다양한 박테리아 유래의 α-아밀라아제, 올리고 1,6-글루코시다아제, 트리할로오스 합성효소 및 4-α-글루카노트랜스퍼라아제였다. 따라서, 이 OFR는 아밀라아제로 추정되었고, 이하의 실험 예에서 더 분석되었다.

N-말단 단편이 제거된 불완전 ORF(ORF3)는 써모스 써모필러스(Thermus thermophilus) 포스포프럭토키나아제와 가장 높은 상동성을 나타냈다(49% 동일성, 62% 염기성).

2개의 완전 ORF는 1개의 오페론을 포함하는 것으로 예측되었는데, 전사 방향이 동일하고 두 유전자의 예상 기능이 당의 이용과 관련되기 때문이다. 대장균에서 전사될 수 있는 프로모터 시퀀스[TTGACT(-35) 및 TATATT(-10)]는 번역개시사이트에서 196 과 157 뉴클레오티드의 업스트림에 있는 것으로 예상되었다. 비록, ORF3의 추정된 기능은 당의 이용과 관련되었지만, 전사 방향은 반대였다. 2개 오페론의 발현은 세포 추출물을 이용한 SDS-PAGE을 통해, 음성 대조군과 비교함으로써 확인되었다(도 4b).

도 4a는 pS2A4에 복제된 인서트 DNA의 개략도이고, 도 4b는 pS2A4를 포함하는 대장균(레인 1)과 음성 대조군(레인 2)의 세포 추출물에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, 인서트 DNA의 시퀀스는 도 4c 및 서열번호 1에 기재되어 있다.

예상 프로모터 부위, 2개의 완전 ORF의 단백질 서열, 추정 아밀라아제(ORF2)는 4개의 보존 부위(conserved region)는 도 4c상에 나타나 있다.

2) 본 발명 추정 아밀라아제(ORF2)의 분자적 분석

본 발명 추정 아밀라아제의 유전자(ORF2)는 1551 bp이었으며, 단백질의 분자량은 59.405 kDa이었다. 상기 효소의 아미노산 서열은 α-아밀라아제 군에서 공통적으로 나타나는 4개의 보존 부위를 가지고 있었다. 표 4로서 α-아밀라아제 군에 속하는 다른 효소와 4개의 보존 부위를 비교하였다.

[표 3]

상기 표 3에서 α-아밀라아제 군의 보존 부위는 굵은 글씨체로 나타내었다. '+'는 30% 이상의 동일성을 갖는 효소, '*'는 가장 높은 동일성을 갖는 효소, 'T'는 트리할로오스 합성효소, 'IA'는 이소아밀라아제 'B'는 가지화 효소를 나타내는식별문자이다.

본 발명의 아밀라아제는 α-아밀라아제와 매우 유사한 보존 부위를 가지고 있었고, 특히 두 번째 보존 부위의 라이신 잔기는 α-아밀라아제로 결정되는 특징 중 하나이다.

본 발명의 아밀라아제와 높은 유사도를 갖는 다른 형태의 효소들로는 써모스(Thermus) 균주 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제(CGTases) 및 4-글루카노트랜스퍼라아제(GTase)가 있었다. 한편, 패니바실러스 폴리미사(Paenibacillus polymyxa)의 네오풀루라나아제는 본원발명의 메타게놈 아밀라아제와 매우 유사한 보존 부위를 가지고 있었으나, 다른 네오플루라나아제는 그렇지 않았다.

본 발명의 메타게놈 아밀라아제와 말토제닉 아밀라아제(maltogenic), 네오플루라나아제, CDase 혹은 다른 탈가지화/가지화 효소의 보존 부위에서는 어떠한 유의적인 유사성도 발견되지 않았다. 게다가 이들 효소들과 비교할 때, 본 발명 메타게놈의 아밀라아제는 N-말단에서부터 첫 번째 보존 부위의 위치가 다르며(약 100 개의 아미노산), 이는 단백질 구조가 다름을 의미하는 것이다.

본 발명 메타게놈 아밀라아제의 독특한 특징은 네 번째 보존 부위에서 발견되었는데, 이소루신 뒤에 두개의 세린이 따라 나타나는 것은 α-아밀라아제 군에 포함된 효소에서는 거의 발견되지 않는 현상이다. 이로부터 상기 잔기는 아밀라아제의 독특한 특성을 결정하는 것으로 추론되었다.

(4) 추정 아밀라아제의 정제

본 발명의 메타게놈 아밀라아제를 정제하기 위해, pET29를 사용하여 과다발현 벡터를 구축하였다. 본래, pET29는 재조합 단백질을 쉽게 정제하기 위해 C-말단에 헥사히스티딘 tag 뿐만 아니라 N-말단에 S-tag 부위를 갖고 있다.

본 발명에서, 태그(tag) 부위는 단백질의 구조적 변형을 피하기 위해 전체적으로 제외되었다. S-tag는NdeI을 이용한 절단으로 제거되었고, 헥사히스티딘 tag는 꼬리 부위 앞에 있는 종결 코돈을 둠으로써 무시하였다.

NdeI 과SalI 사이트를 포함하도록 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 아밀라아제로 추정되는 유전자를 증폭하였다. 그 후,NdeI/SalI으로 분해한 pET29에 라이게이션시키고, 과다발현 플라스미드를 제작하였고(p29-amy-w/oHis), 시퀀싱을 함으로써 인서트 DNA가 확인되었다. 상기 클론에서, 아밀라아제 유전자는 pET29 벡터 유래의 T7 프로모터 및 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS)에 의해 조절되었다.

본 발명의 추정 아밀라아제는 50 μM의 IPTG 유도에 의해 OD_600nm=1.2~1.5로 세포질에서 쉽게 발현되었고, 16℃에서 7시간 동안 추가 배양되었다. IPTG 농도를 더 높이거나 성장온도를 더 높이면 봉입체의 형성의 결과를 초래했다. p29-amy-w/oHis를 포함하는 대장균은 750 mL의 LB 배지에서 배양되었고, 효소는 초음파분해로 추출되었다.

효소 흡착을 위해 0.5%의 생옥수수의 녹말이 첨가되었으며, 20% 말토오스를사용함으로써 효소가 녹말로부터 용출되었다. 또한, 흡착을 위해 생쌀의 녹말을 선택하였는데 생옥수수의 녹말과 비교하여 흡착-용출 효능에는 차이가 거의 없었다.

생 녹말은 대략 80~90%의 아밀라아제를 흡착시키는 것으로 확인되었으나, 20% 말토오스 용출의 수율은 30~40%로 매우 낮았으며, 따라서 용출 단계는 전 정제과정 중 속도결정단계(rate limiting)로서 평가되었다.

흡착-용출 단계는 거의 배타적으로 아밀라아제를 분리했으나, 다른 흔적 단백질뿐만 아니라 녹말과 말토오스로부터 아밀라아제를 정제하기 위해 Q-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다.

한편, 도 5는 과다발현 벡터의 구축 및 아밀라아제 정제 과정을 나타낸 공정도이다. 도 6은 각 정제 단계에서 아밀라아제에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도인데, 번호 1은 p29-Amy-w/oHis를 포함하는 대장균 BL21에서 발현된 전 단백질이고, 번호 2는 과다발현 시스템으로부터의 세포 내 분획 단계 후 단백질, 번호 3은 흡착 및 용출을 거친 단계의 단백질, 번호 4는 Q-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 거친 단계의 단백질이다. 한편, M은 분자량 마커이다.

표 4는 메타게놈 아밀라아제의 정제 단계에서 단백질 양, 활성, 비활성, 팩터, 수율을 나타낸다.

[표 4]

실시예 2: 상기 실시예 1에서 추출된 녹말분해효소의 특성 조사

(1) 효소의 활성 및 안정성에 대한 온도의 효과

녹말분해활성은 환원당 측정과정인 디니트로살리실산(DNS)방법에 따라 측정되었다.

효소 반응 혼합액은 0.5% 기질(가용성 녹말, β-사이클로덱스트린, 플루란), 적당량의 효소 및 글리신-NaOH 완충용액(50 mM, pH9.5)으로 구성되어 있으며, 500 ㎕의 효소 혼합액은 42℃에서 10분 간 보관되었다. 블랭크(blank)는 효소액을 제외하고는 같은 구성성분으로 구성되었다. 반응은 500 ㎕의 DNS 용액(3,5-디니트로살리실산 10.6 g, NaOH 19.8 g, 포타슘 소듐 타르테이트 306 g, 페놀 7.6 mL, 소듐 메타바이설페이트 8.3 g, 증류수 1416 mL)를 첨가함으로써 종결되었다. 반응 혼합액은 5분 간 끓여진 후 얼음 위에 둠으로써 냉각되었다.

흡광도는 광학분광계(일본 히타치 U-1100)를 사용하여 1 cm-폴리스틸렌 큐벳에서 575 nm로 측정되었다. 가수분해 활성(U)을 위한 1 unit은 1분 동안 말토오스와 등가의 환원당 1 μmol를 생성할 수 있는 효소 양으로 정하였다.

초기 환원당을 분석한 결과, 메타게놈 아밀라아제는 가용성 녹말, β-사이클로덱스트린 및 플루란에 대해 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 최적반응온도는 녹말에 대해서는 42℃, β-사이클로덱스트린과 플루란에 대해서는 35℃였다. 최적온도에서, 녹말에 대한 활성은 β-사이클로덱스트린보다 9.22배 높았으며, 플루란 보다 27.4배 높았다.

칼슘 이온의 존재 하에서는 최적반응온도가 5℃ 더 높아졌다. 녹말에 대해, 1 mM Ca²⁺하에서, 최적온도는 대략 47℃ 였지만, 5 mM Ca²⁺에서, 활성은 전 온도 범위에서 오히려 감소하였다. 그러나, β-사이클로덱스트린에 대해, 5 mM 농도까지의 칼슘 이온은 35℃ 보다 높은 온도에서 아밀라아제 활성을 증가시켰다(도 7b). 도 7a는 칼슘 이온의 유무에 따른 가용성 녹말에 대한 메타게놈 아밀라아제의 온도 의존적 활성을 나타내는 그래프이고, 도 7b는 칼슘 이온의 유무에 따른 β-사이클로덱스트린에 대한 메타게놈 아밀라아제의 온도 의존적 활성을 나타내는 그래프이다.

한편, 본 발명 메타게놈 아밀라아제의 열적 실활은 40~55℃의 범위에서 조사되었는데, 칼슘이온은 도 8b에서 보여지는 바와 같이 열적 실활에 있어서도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 1 mM Ca²⁺첨가시, 40, 45, 50, 55℃에서 D 값은 각각 83분, 27분, 4분, 2.5분이었고, 65℃에서 5분 동안 가열시 완전히 불활성화되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 메타게놈 아밀라아제가 전형적인 중온성효소(mesophilic enzyme)임을 알 수 있었다. 도 8a 및 8b는 다양한 조건 하에서 메타게놈 아밀라아제의 열적 실활을 나타내는데, 도8a는 1 mM Ca²⁺첨가 시, 열적 실활에 대한 온도의 영향을 나타내는 그래프이고, 도8b는 40℃에서, 열적 실활에 대한 Ca²⁺농도의 영향을 나타내는 그래프이다.

(2) 효소의 활성 및 안정성에 대한 pH의 효과

본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 녹말과 β-사이클로덱스트린에 대해 pH9~9.5에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 그러나, pH7.5~10에서도 80% 이상의 활성이 조사되었다. pH5 이하 혹은 pH11.5 이상에서는 어떤 활성도 검출되지 않았다. 다양한 pH 조건 하에서 2시간이 지난 후, 효소는 산성 조건보다는 염기 조건에서 보다 안정하였다. 도 9a는 녹말 및 β-사이클로덱스트린에 대한 메타게놈 아밀라아제의 활성에 있어, pH의 영향을 나타내는 그래프이고, 도 9b는 다양한 pH 조건 하에서 2시간이 지난 후의 메타게놈 아밀라아제 활성에 있어, pH의 영향을 나타낸다.

(3) 효소 활성에 대한 금속 이온의 효과

효소 활성이 다양한 금속 이온의 존재 하에, 52℃(가용성 녹말)와 45℃(β-사이클로덱스트린)에서 조사되었다. 가용성 녹말과 β-사이클로덱스트린에 대한 금속이온의 효과는 표 5에 나타내었다.

[표 5] 메타게놈 아밀라아제에 대한 금속 이온의 효과

기보고된 자료에 의하면, Ca²⁺은 효소 안정성에 매우 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 5 mM의 Ca²⁺농도에서 활성을 비교했을 때, Ca²⁺의 농도는 녹말과 β-사이클로덱스트린에 대해 다르게 영향을 미쳤다.

EDTA 및 EGTA는 효소 활성을 크게 억제하는데 이는 아마도 칼슘 이온을 포획하기 때문인 것 같다.

효소 활성에 대해 Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺와 같은 1가 금속이온의 효과는 무시할만 하거나 혹은 오히려 증진시키는 것이었다. 한편, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Hg²⁺, Mg²⁺, Co²⁺,Fe³⁺는 효소 활성을 크게 억제하였다. 또한, Mn²⁺는 녹말의 경우에 있어서 가수분해를 억제하였으나 β-사이클로덱스트린의 경우는 가수분해에 대해서는 영향을 미치지 않았다.

(4) 가수분해 활성조사

TLC 분석에 의하면, 다양한 기질에 대한 메타게놈 아밀라아제의 가수분해 패턴을 확인할 수 있었다(도 10). 도 10a는 다양한 기질(0.5%)(α-CD: 레인 1, β-CD:레인 2, 가용 녹말: 레인 3, 플루란: 레인 4, 말토오스: 레인 5, 말토트리오스: 레인 6)에 메타게놈 아밀라아제를 처리하여 가수분해 반응을 실시한 후, TLC 분석을 실시한 결과를 나타내고, 도 10b는 메타게놈 아밀라아제와 최종적으로 글루코오스와 갈락토오스로 가수분해되는 락토오스 간의 반응을 나타낸 것이다.

아밀라아제는 가용성 녹말, β-사이클로덱스트린 및 말토덱스트린을 가수분해하였다. 또한, 메타게놈 아밀라아제는 플루란을 미량의 말토오스 및 고가지 올리고사카라이드와 함께 판노오스 단위로 가수분해하였고, 이는 HPIC(High performance ion chromatography) 분석에 의하여 확인되었다. 흥미롭게도, β-1,4-결합을 갖는 락토오스는 상기 메타게놈 아밀라아제에 의해 갈락토오스와 글루코오스로 가수분해되었으며, 이는 기존의 α-아밀라아제에서는 보고된 바 없었다. 그러나, 상기 효소는 α-사이클로덱스트린과 말토오스를 가수분해하지는 못했다.

한편, 말토펜타오스와 녹말을 시간별로 분석한 결과(도 11)는 상기 효소가처음에는 말토오스와 말토테트라오스 단위체로 가수분해를 하였으며, 이어 연속적인 가수분해에 의해, 최종 산물로서 글루코오스와 말토오스를 생성하였음을 보여준다. 도 11a는 말토펜타오스(0.5%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과이고, 도 11b는 p-니트로페닐 말토펜타오스(1%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과이고, 도 11c는 가용성 녹말(0.5%)의 가수분해 결과물에 대한 TLC 분석 결과이다. p-니트로페닐 말토펜타오스 가수분해에 대한 시간별 분석 결과는 비록 당전이반응 반응이 동시에 고려되어야 하기 때문에 그 결과의 설명이 쉽지 않다 하더라도, 상기 메타게놈 아밀라아제가 말토덱스트린의 환원성 말단보다는 오히려 비환원성 말단에서 가수분해하는 경향을 나타냄을 보여준다.

(5) 당전이반응(transglycosylation)

5% 말토덱스트린을 이용한 TLC 및 HPIC 분석 결과는 메타게놈 아밀라아제가 더 긴 말토덱스트린을 생성하기 위하여, 말토올리고뉴사카라이드를 전이하거나 압축할 수 있음을 보여주었다.

그러나, 메타게놈 아밀라아제는 단독의 글루코오스와는 반응하지 않았으며, 이는 글루코오스가 도너(donor)로서 작용할 수 없음을 뜻하는 것이었다(도 12a). TLC 및 HPIC 분석에 의해 확인되는 상기의 반응으로부터 말토덱스트린 외에 어떤 당도 검출되지 않았고, 이는 상기 효소가 단지 1,4-결합만을 만든다는 것을 의미한다.

본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 락토오스, 셀로바이오스, 말티톨, α-메틸글루코시드를 말토트리오스와 반응시킬 때, 락토오스, 셀로바이오스, 말티톨 및 α-메틸 글루코시드를 전이시켰다(도 12b). 그러나, 만노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 수크로오스, 트리할로오스, 라피노오스 및 멜리바이오스는 상기 효소에 의해 전이되지 않았다. α-메틸 글루코시드의 전이산물 형성은 아마도 글루코오스가 당전이반응에 수용체로서 참여함을 암시하는 것이다.

도 12a 및 12b는 당전이반응의 TLC 분석결과를 나타낸 것인데, 도 12a는 5%의 각 말토덱스트린과 메타게놈 아밀라아제와의 당전이반응 결과를 나타낸 것인데, 왼쪽그림은 G1-G5이고, 오른쪽 그림은 2개의 말토덱스트린간(G1+G2: 레인 2, G1+G3 : 레인 2, G2+G3: 레인 3)의 반응이다. 도 12b는 1%의 말토트리오스와 5%의 만노오스, 자일로오스, 락토오스, 셀로바이오스, 말티톨 및 α-메틸 글루코시드 간의 당전이반응 결과를 나타낸 것이고, 전이 산물은 화살표로 나타내었다.

한편 당전이반응은 기질농도가 1% 이상일 때 일어났다(도 13). 그러나, 기질 농도가 심지어 5% 수준일 때까는 당전이반응이 단지 처음 몇 시간 동안은 가수분해 반응보다 우세하였다. 궁극적으로 가수분해 반응이 우세하게 되면, 글루코오스와 말토오스가 최종 산물이 되었다. 도 13a 및 13b는 1% 말토테트라오스(도 13a)과 5% 말토펜타오스(도 13b)의 시간별 반응을 TLC 분석한 결과이다.

(6) 가용성 녹말에서 말토오스 생성

본 발명의 메타게놈 아밀라아제는 가용성 녹말에 대한 활성이 비교적 높으며, TLC 분석에 따르면 주요 최종산물로서 말토오스를 생성하는 것으로 밝혀졌기때문에, 고품질의 말토오스 시럽을 생산할 가능성이 평가되어 졌다. 0.5%~5%의 녹말을 메타게놈 아밀라아제와 반응시켰고, HPIC에 따라 말토오스대 글루코오스의 비율을 측정하였다(도 14 및 표 6). 도 14는 녹말과 메타게놈 아밀라아제의 농도에 따른 녹말 가수분해 반응에 대한 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다.

[표 6] 녹말 가수분해산물에서 얻은 글루코오스대 말토오스의 양을 HPIC로 분석한 결과

녹말은 1g 당 150 U의 효소를 처리하고 24시간이 지난 후 완전히 분해되었다. 0.5%의 녹말이 처리된 경우, 말토오스의 함량은 72.7%였고, 글루코오스는 27.3%였다. 그러나, 녹말의 농도가 높아지고 분해가 더 진행됨에 따라 말토오스의 비율은 떨어졌다. 5%의 녹말이 처리된 경우, 말토오스의 농도는 37.1%로 떨어진 반면, 글루코오스의 농도는 62.9%로 증가하였다.

분해가 완벽히 수행되면, 클루코오스와 말토오스를 제외한 어떠한 말토덱스트린도 TLC 혹은 HPIC로부터 검출되지 않았으나, 다른 분지 올리고사카라이드는 발견되었다. 이들 분지형 올리고당은 부산물이나 전이산물로 보여지기보다는 아밀로펙틴의 분해산물로 보여졌다. 상기 사실은 플루라나아제-처리 가용성 녹말이 기질로 사용되었을 때 확인되었는데, 이때 다른 어떤 분지된 올리고사카라이드도 TLC 평판에서 발견되지 않았다(도 15). 도 15는 플루라나아제가 처리된 녹말 및 플루라나아제가 처리되지 않은 녹말을 사용한 TLC 분석을 비교하였다. 상기 효소에 의한 1,6-결합의 형성을 TLC로 분석한 것이고, 플루라나아제로 처리된 녹말은 아밀로펙틴을 포함하는 통상의 녹말과 비교되었다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명인 서열번호 3에 기재된 신규의 아밀라아제는 고품질의 말토오스의 생산 및 기타 가수분해반응, 당전이반응을 수행하는 효과가 있으므로, 효소산업 및 식품산업 상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> RYU, Sang-Ryeol <120> Gene sequence coding starch-degrading enzyme, starch-degrading enzyme thereof and method for production of maltose syrup from starch by using it <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3929 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA isolated from soil directly <220> <221> -35_signal <222> (240)..(245) <220> <221> -10_signal <222> (271)..(276) <400> 1 gatctatacg agcaaaaaac ttccaactcc cgaatcgggg attttgcagg aagattttgt 60 gacctcgatt cctgaagtaa ttcctgatgg ggaatttaaa atttacccag ttccttcaaa 120 ttcaagcctt accgtggagc ttccccaaga tatgattcaa gcctcgtaca gggtgattga 180 catggcgggg agggtagtat tcgatggtca aaccgaccga ggggagcaga ttttagattt 240 tgacttaagt ggaattcagg cagggattta tatatttgag gctttcgata ccaagcgagt 300 tttacatcaa cgctttatca aagaataacc aaacctaact caaactatga aatgccccga 360 ggtaaaatca cctatatcat tgggatattt atcaaggcat tccatgtgtc catcaaaaaa 420 caaatatcaa acacatgaaa tttaaacctg gagtaaaata cggggaagag ctcagagacc 480 tttacgctta cgcaaaggaa aatgaatttg cttatcctgc agtcaacgta 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atgaaatcgg acgattctgg ttggaagaag tgggtgtgga cggatttcgg ttggacgctg 2280 ccaagcatat ttttcccgat gaccgacctt tggataatca tgccttttgg aaagaattcc 2340 gggcaaaaat ggaagtcata aagccggatg tttacttggt aggagaggtg tatgacaaaa 2400 aagaagtcgt ggctccttat cttcctgggt tgccagcctt gttcaacttt gattttcatt 2460 acactctgct tgagaccatg aataccgggg acgggatgct tttggccaag aagcagaagg 2520 agattttgga cttttatcag ggaatcacat caagctttat cgatgcgacc atttcttcta 2580 accatgatca gccccgtctg ctgaatgaat tgggatctga tccggccaaa tacaagcagg 2640 ccatcgcagt gatgctcagc atgccgggag cgccatattt gtattatggg gaagagatcg 2700 ggatgctggg tctcaagccg gacgagcata tccgggagcc tttcctttgg gatgaaaaaa 2760 gcaaggatac aggtcgcacc aagtggatca aacccaaata cagcaaagac tcaacagtaa 2820 cctcattgga ggtccaaaag aaagattcca acagctattt caatcattac aaaaacttaa 2880 ttgctcttcg taattcttat cctgctttgg ctattggttc tttggaactt ccagctgagg 2940 aattacctaa aagtgtaatg gcatatttca gaaagtctgg agatcaggaa atctttgtgg 3000 ttcacaatgt ggacaaggag gaagttgaca ttcagcttcc agagggattt gaagaagtta 3060 ttttctattt gggtgagggg aaaaacagtt caggaaaact tcagctaaaa ggcaactcga 3120 gtatggtttt tttgaaggat taaggcaaca cttctgagag tcaaacatac aaaaagggat 3180 ctgatgagga tcccttttaa tgtttaaggt tagcaacaat caggtggaaa ggatattggc 3240 cactctcaaa tcttcttcgt ccacggtttt gtcatccaca attgctttga caatgggagt 3300 gtaaacgatt ttattattga tcataccggc cattacatcg tattttccag ccatcagtcc 3360 ttcaatagcc gctacgccca tttggaaaga aagcaatcta tcgaacgaag ttggagcacc 3420 tccacgttgt aaatgaccta aaatggtcac tttgatgtcg taataaggaa gatgcttttt 3480 gactttgtcc gcgatttcct gtgcacttcc gcttttgcct ccttctgcca cgatgacaga 3540 tgttggaagt cttttttgct tttgttctgg ttttcagttt ttctaccagt gtttcgatcg 3600 gtgttttatt ttcaggaatc aagatagccg ccgctgcact tccgattccg gcattgatgg 3660 ctataaatcc agcatcccgg cccatcactt ccacaaaaaa cagtctgtcg tgagaggtag 3720 cggtgtcacg gatcttgtca atagcttcga tggcagtatt gcaggcggta tcaaatccaa 3780 tggtagaatc cgtaccggaa aggtcattat caattgttcc aggaagtccg atcgccggga 3840 ttccatattc ttgataaaag aggtgagcac ctgtcaaaga accgtcgccc ccgatcacca 3900 ccaaggcatc gattccatgg ctaatcccc 3929 <210> 2 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA isolated from soil directly <220> <221> CDS <222> (1)..(1551) <400> 2 atg aaa aaa tcc atc cta act acc tcc att ttt gca ctt gtc gct ttt 48 Met Lys Lys Ser Ile Leu Thr Thr Ser Ile Phe Ala Leu Val Ala Phe 1 5 10 15 tct tcc tgc gaa aaa aag cct gct ccg gaa gtc aaa aac tat tgg cct 96 Ser Ser Cys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Glu Val Lys Asn Tyr Trp Pro 20 25 30 caa gca gga gtg acc tat gag att ttt gtt caa tct ttt tat gat tct 144 Gln Ala Gly Val Thr Tyr Glu Ile Phe Val Gln Ser Phe Tyr Asp Ser 35 40 45 aac gga gac agt att ggg gat ttt aat ggg gtc act caa aaa ctg gac 192 Asn Gly Asp Ser Ile Gly Asp Phe Asn Gly Val Thr Gln Lys Leu Asp 50 55 60 tat gtg aag gag ttg ggg gcc aat gcc att tgg ttt atg ccg att atg 240 Tyr Val Lys Glu Leu Gly Ala Asn Ala Ile Trp Phe Met Pro Ile Met 65 70 75 80 cct tcg cca act tac cat aag tac gat gtg acg gac tac aag gcg gtt 288 Pro Ser Pro Thr Tyr His Lys Tyr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Ala Val 85 90 95 cat cca gat tac ggt acg ctg gat gat ttc aaa aag ctt ttg gac gaa 336 His Pro Asp Tyr Gly Thr Leu Asp Asp Phe Lys Lys Leu Leu Asp Glu 100 105 110 gct cac aag cgg gac atc aag att gtg atc gat ttg atc atc aat cac 384 Ala His Lys Arg Asp Ile Lys Ile Val Ile Asp Leu Ile Ile Asn His 115 120 125 acc agc aac gaa cat ccg tgg ttt ttg gaa gca aaa tcc ggt agg gat 432 Thr Ser Asn Glu His Pro Trp Phe Leu Glu Ala Lys Ser Gly Arg Asp 130 135 140 aat ccc tat cgc gat tac tac gtg tgg gcg caa aag gac acc att gct 480 Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Gln Lys Asp Thr Ile Ala 145 150 155 160 gat ttt ttg aac aaa aag acc atc acg ttt gat ttg gat aat atc cgt 528 Asp Phe Leu Asn Lys Lys Thr Ile Thr Phe Asp Leu Asp Asn Ile Arg 165 170 175 caa tgg cat gac ccg gga cag gga gaa gat ttt tac tac ggg ttt ttc 576 Gln Trp His Asp Pro Gly Gln Gly Glu Asp Phe Tyr Tyr Gly Phe Phe 180 185 190 tgg ggt gga atg cct gat ctg aac ttt gac aat cct aag gta aga gag 624 Trp Gly Gly Met Pro Asp Leu Asn Phe Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu 195 200 205 gaa atc tat gaa atc gga cga ttc tgg ttg gaa gaa gtg ggt gtg gac 672 Glu Ile Tyr Glu Ile Gly Arg Phe Trp Leu Glu Glu Val Gly Val Asp 210 215 220 gga ttt cgg ttg gac gct gcc aag cat att ttt ccc gat gac cga cct 720 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ala Lys His Ile Phe Pro Asp Asp Arg Pro 225 230 235 240 ttg gat aat cat gcc ttt tgg aaa gaa ttc cgg gca aaa atg gaa gtc 768 Leu Asp Asn His Ala Phe Trp Lys Glu Phe Arg Ala Lys Met Glu Val 245 250 255 ata aag ccg gat gtt tac ttg gta gga gag gtg tat gac aaa aaa gaa 816 Ile Lys Pro Asp Val Tyr Leu Val Gly Glu Val Tyr Asp Lys Lys Glu 260 265 270 gtc gtg gct cct tat ctt cct ggg ttg cca gcc ttg ttc aac ttt gat 864 Val Val Ala Pro Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ala Leu Phe Asn Phe Asp 275 280 285 ttt cat tac act ctg ctt gag acc atg aat acc ggg gac ggg atg ctt 912 Phe His Tyr Thr Leu Leu Glu Thr Met Asn Thr Gly Asp Gly Met Leu 290 295 300 ttg gcc aag aag cag aag gag att ttg gac ttt tat cag gga atc aca 960 Leu Ala Lys Lys Gln Lys Glu Ile Leu Asp Phe Tyr Gln Gly Ile Thr 305 310 315 320 tca agc ttt atc gat gcg acc att tct tct aac cat gat cag ccc cgt 1008 Ser Ser Phe Ile Asp Ala Thr Ile Ser Ser Asn His Asp Gln Pro Arg 325 330 335 ctg ctg aat gaa ttg gga tct gat ccg gcc aaa tac aag cag gcc atc 1056 Leu Leu Asn Glu Leu Gly Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Lys Gln Ala Ile 340 345 350 gca gtg atg ctc agc atg ccg gga gcg cca tat ttg tat tat ggg gaa 1104 Ala Val Met Leu Ser Met Pro Gly Ala Pro Tyr Leu Tyr Tyr Gly Glu 355 360 365 gag atc ggg atg ctg ggt ctc aag ccg gac gag cat atc cgg gag cct 1152 Glu Ile Gly Met Leu Gly Leu Lys Pro Asp Glu His Ile Arg Glu Pro 370 375 380 ttc ctt tgg gat gaa aaa agc aag gat aca ggt cgc acc aag tgg atc 1200 Phe Leu Trp Asp Glu Lys Ser Lys Asp Thr Gly Arg Thr Lys Trp Ile 385 390 395 400 aaa ccc aaa tac agc aaa gac tca aca gta acc tca ttg gag gtc caa 1248 Lys Pro Lys Tyr Ser Lys Asp Ser Thr Val Thr Ser Leu Glu Val Gln 405 410 415 aag aaa gat tcc aac agc tat ttc aat cat tac aaa aac tta att gct 1296 Lys Lys Asp Ser Asn Ser Tyr Phe Asn His Tyr Lys Asn Leu Ile Ala 420 425 430 ctt cgt aat tct tat cct gct ttg gct att ggt tct ttg gaa ctt cca 1344 Leu Arg Asn Ser Tyr Pro Ala Leu Ala Ile Gly Ser Leu Glu Leu Pro 435 440 445 gct gag gaa tta cct aaa agt gta atg gca tat ttc aga aag tct gga 1392 Ala Glu Glu Leu Pro Lys Ser Val Met Ala Tyr Phe Arg Lys Ser Gly 450 455 460 gat cag gaa atc ttt gtg gtt cac aat gtg gac aag gag gaa gtt gac 1440 Asp Gln Glu Ile Phe Val Val His Asn Val Asp Lys Glu Glu Val Asp 465 470 475 480 att cag ctt cca gag gga ttt gaa gaa gtt att ttc tat ttg ggt gag 1488 Ile Gln Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Val Ile Phe Tyr Leu Gly Glu 485 490 495 ggg aaa aac agt tca gga aaa ctt cag cta aaa ggc aac tcg agt atg 1536 Gly Lys Asn Ser Ser Gly Lys Leu Gln Leu Lys Gly Asn Ser Ser Met 500 505 510 gtt ttt ttg aag gat 1551 Val Phe Leu Lys Asp 515 <210> 3 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Met Lys Lys Ser Ile Leu Thr Thr Ser Ile Phe Ala Leu Val Ala Phe 1 5 10 15 Ser Ser Cys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Glu Val Lys Asn Tyr Trp Pro 20 25 30 Gln Ala Gly Val Thr Tyr Glu Ile Phe Val Gln Ser Phe Tyr Asp Ser 35 40 45 Asn Gly Asp Ser Ile Gly Asp Phe Asn Gly Val Thr Gln Lys Leu Asp 50 55 60 Tyr Val Lys Glu Leu Gly Ala Asn Ala Ile Trp Phe Met Pro Ile Met 65 70 75 80 Pro Ser Pro Thr Tyr His Lys Tyr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Ala Val 85 90 95 His Pro Asp Tyr Gly Thr Leu Asp Asp Phe Lys Lys Leu Leu Asp Glu 100 105 110 Ala His Lys Arg Asp Ile Lys Ile Val Ile Asp Leu Ile Ile Asn His 115 120 125 Thr Ser Asn Glu His Pro Trp Phe Leu Glu Ala Lys Ser Gly Arg Asp 130 135 140 Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Gln Lys Asp Thr Ile Ala 145 150 155 160 Asp Phe Leu Asn Lys Lys Thr Ile Thr Phe Asp Leu Asp Asn Ile Arg 165 170 175 Gln Trp His Asp Pro Gly Gln Gly Glu Asp Phe Tyr Tyr Gly Phe Phe 180 185 190 Trp Gly Gly Met Pro Asp Leu Asn Phe Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu 195 200 205 Glu Ile Tyr Glu Ile Gly Arg Phe Trp Leu Glu Glu Val Gly Val Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ala Lys His Ile Phe Pro Asp Asp Arg Pro 225 230 235 240 Leu Asp Asn His Ala Phe Trp Lys Glu Phe Arg Ala Lys Met Glu Val 245 250 255 Ile Lys Pro Asp Val Tyr Leu Val Gly Glu Val Tyr Asp Lys Lys Glu 260 265 270 Val Val Ala Pro Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ala Leu Phe Asn Phe Asp 275 280 285 Phe His Tyr Thr Leu Leu Glu Thr Met Asn Thr Gly Asp Gly Met Leu 290 295 300 Leu Ala Lys Lys Gln Lys Glu Ile Leu Asp Phe Tyr Gln Gly Ile Thr 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ile Asp Ala Thr Ile Ser Ser Asn His Asp Gln Pro Arg 325 330 335 Leu Leu Asn Glu Leu Gly Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Lys Gln Ala Ile 340 345 350 Ala Val Met Leu Ser Met Pro Gly Ala Pro Tyr Leu Tyr Tyr Gly Glu 355 360 365 Glu Ile Gly Met Leu Gly Leu Lys Pro Asp Glu His Ile Arg Glu Pro 370 375 380 Phe Leu Trp Asp Glu Lys Ser Lys Asp Thr Gly Arg Thr Lys Trp Ile 385 390 395 400 Lys Pro Lys Tyr Ser Lys Asp Ser Thr Val Thr Ser Leu Glu Val Gln 405 410 415 Lys Lys Asp Ser Asn Ser Tyr Phe Asn His Tyr Lys Asn Leu Ile Ala 420 425 430 Leu Arg Asn Ser Tyr Pro Ala Leu Ala Ile Gly Ser Leu Glu Leu Pro 435 440 445 Ala Glu Glu Leu Pro Lys Ser Val Met Ala Tyr Phe Arg Lys Ser Gly 450 455 460 Asp Gln Glu Ile Phe Val Val His Asn Val Asp Lys Glu Glu Val Asp 465 470 475 480 Ile Gln Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Val Ile Phe Tyr Leu Gly Glu 485 490 495 Gly Lys Asn Ser Ser Gly Lys Leu Gln Leu Lys Gly Asn Ser Ser Met 500 505 510 Val Phe Leu Lys Asp 515

Claims (3)

1. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 녹말분해효소.
2. 제 1항 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 2에 기재된 폴리뉴클레오티드.
3. 제 1항 기재의 녹말분해효소를 이용하여 녹말로부터 말토오스 시럽을 생산하는 방법.