JPS609797B2 - イソマルチユロ−スの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はィソマルチュロースの製造法に関する。

更に詳細には、本発明は酵素転換法により藤糖からィソ
マルチュロースを製造する方法に関する。ィソマルチュ
ロースはパラチノースとして知ら＊れる還元性ジサッカ
ラィドである。

その構造はでありト系統的には６一〇−（Ｑ−Ｂ−グル
コピラノシル）−Ｑ−フラクトフラノースとして知られ
る。歴史的には「ィソマルチュロースは醗酵性微生物、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓ■ｃ ｍｅｓｅｎ企ｒｏｉｄｅｓの副
産物として初めて文献（０．Ａ。

Ｃ。Ｓ。７４も３２０２（１９５２））に登場した。

１９５＆王とｉ９６０軒こ発行されたその後の研究（そ
れぞれＪ．ＡＣ。

Ｓ。７８へ２５１４（１９５６）とＪ。

折ｇＣｈｅｍ．２ふ１０６２（１９６０））はＬｍｅｓ
ｅｎにｒｏｉｄｅｓにより熊糖からデキストラン合成の
副産物としてィソマルチュロースの生成を確認した。ド
イツ特許第１０４９８０び言明細書（１９５９年公告）
もＳｕｄｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｚｕｃｋｅｒ−Ａｋｔｉｅ
ｎ鉾ｓｅｌｌｓｃｈａｆｔもこはＰｒｏｔａｍｊｎｏｂ
ａｃ企ｒて肋ｍｍを使って微生物学的方法によりィソマ
ルチュロースを競健から如何に得ることができるかにつ
いて開示されている。

熊糖をィソマルチュロースに転換するのに他のバクテリ
アを使用することができるこも知られており〜英国特許
第１４２９３３４号明細書（ドイツ特許第２２１７６２
８号に相当）にはトＳｅｒｒａｔｊａｐｉｙｍｕｉｈｉ
ｃａが適当であると記述してある。英国特許第１４２９
３３４号明細書は主として接触的水素添加によりィソマ
ルチュロースからィソマルチトール（Ｑ−Ｄ−グリコピ
ラノシル−１岬６−ソルビトール）の製造に関している
。

実際この水素化は。−Ｄ−グリコピラノシルー１＄６−
マンニトールを含む混合物を生ずる。この混合物は「Ｐ
ａｌａｔｉｎｉｔ」の名で低カロリー甘味剤として入手
できる。ドイツ特許第１０４９８００号明細書の記述に
続いて、英国特許第１４２９３３４号明細書には、サッ
カロース（熊糖）をィソマルチュロースに転換するのに
も１５％から４０％Ｗ′Ｗト望ましくは２０％から２５
％ＷゾＷの熊糖を使って醗酵法により適当に行なわれる
ことが開示されている。

激しい擁洋と空気の連続的導入を行なっている。この英
国特許明細誓には更に転換を回分式に又は連続式に行な
うことができも両方の技術について夫々の実施例を開示
している。醗酵の後にもィソマルチュロース溶液を分別
しも炉週やイオン交換クロマトグラフィに続いて結晶化
させることができる。１９７＄手３月２１印こ公告され
た欧州特許第１０９ｙ号明細書もＢａｙｅｒＡＧ。

にばち孫糖のィソマルチュロースの同時転換でト微生物
例えばＲｏｔａｍ言ｎｏｂａｃにｒ ｍｂｒ肌 又
は ＳｅｎａｔｊａｐＭｍｕｔｈｉｃａの連続的醗酵法
が開示されている。

ィソマルチュロース生産性微生物の増殖は藤糖のィソマ
ルチュロースに同時転換では連続的に行なうことができ
ることを見出しており、熊糖含有植物汁における生育中
〜ィソマルチュロース生産性微生物が同時に務糖をィソ
マルチュロースに転換することは予想外で驚異であると
述べている。藤糠含有溶液は薄い汁／濃い汁および／又
は薄い汁ノ砂糖工場から得られる精製物として「乾燥物
舎量５〜３０％「望ましくは２０〜２７％、乾燥物は９
０〜９８％藤糖として特定される。Ｐｍｔａｍｉｎｏｂ
ａｃにｒ ｒｕｂｍｍ お よ び Ｓｅｎａｔｉａ
ｐＩＭｍｕｔｈｉｃａは別として、殴州特許第１０四号
明細書はィソマルチュロース生産性微生物としてＳｅｍ
ａｔｊａｍａ岱ｃｅｓｃｅｎｓ「 Ｅｒ机ｎｉａｃｏｒ
ｏのｖｏｒａ又は皮ｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎ比ｅ
ｒｏｉｄｅｓを使用する可能性を述べている。

本発明者は藤糖をィソマルチュｏースに転換するのをも
っと有効に行なうことができる方法およびィソマルチュ
ロースの新用途の可能性を研究した。

本発明によれば、ィソマルチユロース生産性微生物の不
働化ィソマルチユロース生産性酵素系を使って、藤糖溶
液からィソマルチュロ・−スを製造する方法を供する。

本発明方法は先行技術に開示されているバクテリアによ
る好気醗酵ではなく、藤糖のィソマルチュロースに転換
における酵素系から成る酵素を支持する不鰯化を使用す
るものである。この酵素系はィソマルチュロース生産性
微生物から抽出後に使用可能であるが、抽出は必要でな
い。

例えば、酵素系のビヒクル又はキ・ャリアーとして作用
する細胞と共に、微生物の全細胞又は粉砕細胞を使用す
ることが可能である。全細胞の若干の分割が不働化後に
おきるが、不働化技術その他の変法は分割がないか最小
になるように選ぶことが望ましい。

望ましい方法では、細胞の生存性を維持するために特に
工程はとらない。この所望方法で使用が長びし、た後、
細胞を生育させようとする場合、細胞分裂は通常おきな
い。更に言えば、藤糖溶液が栄養的に不足している、ィ
ソマルチュロース生産性微生物の生育に１種以上の栄養
素が必要であるのは、本発明方法を最高に行なうための
特長である。

この方法では、不働化全細胞を使って、酢素系を供する
場合、細胞分裂を最小に望もしく行なうこと力ミ可能で
ある。栄養素がないことはより純粋な生成物を意味し、
混入する任意の微生物の生育の危険を減ずる。イソマル
チュロースを生成する酵素系は常法により、例えば溶媒
抽出により微生物の細胞から抽出することができる。抽
出を容易にするために、補助手段例えば細胞を粉砕した
りあるいは浸透ショックを使用することができる。ＥＭ
ｉｎｉａｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ（本発明方法にとって望
ましいィソマルチュロース生産性微生物）に対する我々
の実験から、酵素系は細飽のべリブラスム間隙に位置し
かつ酵素系は藤糖から誘導されたプラクトースのみを利
用し、遊離のフラクトース又は他の分子に結合したフラ
クトースを利用しない藤糖特異性のグルコトランスフェ
ラーゼであるようである。抽出した酵素系は、若し必要
なら、使用前に例えば磁気透析により精製することがで
きる。ィソマルチュロース生産性微生物の酵素系の不轍
化のために各種公知技術を使用することができる。

例えば、ゲル内の封入を使用することも可能である。封
入に対する別法として、他の不働化技術を使用すること
ができる。例えば、細胞は物理的に不活性支持体に吸着
させることができる。また不活性支持体に共有結合させ
ることもできぬ。あるいは架橋剤を使って合体させるこ
ともできる。本発明者が試みた不轍化技術のうち、ゲル
中への封入がよく、特に酵素的に活性な細胞抽出物なら
びに全細胞又は粉砕細胞の抽出物の不轍化に適している
からである。

適当なゲル材料にはアルギネート、ポリアクリルアミド
、寒天、キサンタンガムノロカストピーンガム、カッパ
ーカラゲニン又はカッパーカラゲニン／ロカストビーン
ガム、コラーゲソ又は酢酸セルロースがある。これらの
ゲル材料のうち、アルギンゲル特にアルギン酸カルシウ
ムゲルが最高の結果を生むことが分った。

他のアルギンゲン例えば他の二価金属で形成されたもの
を使用することができるが、アルギン酸カルシウムがよ
い。特に、アルギン酸カルシウムゲル中に全細胞の不働
化がよい。このように、細胞はゲル中に比較的大きな割
れ目の間隙を有する、不活性、三次元構造のポリマーに
封入する。アルギン酸カルシウムゲルに対し、藤糖の内
部拡散率は高く、また内部ゲル間隙の多くは藤糖まで達
し得る。

更に「全細胞とタン白質の外部漏出率は非常に低く、加
圧した時ゲルは僅かに変形するが大中には圧縮しない。
その他の利点は、不働化全細胞のィソマルチュロース生
産活性の安定性である。アルギン酸カルシウムゲルに封
入された細胞活性のハーフ・ライトは１００００時間に
近づき、８５０斑時間が代表数値である。一方、本発明
者が試みた他の不轍化操作の比較状況下の最長ハーフ・
ライフは１００畑時間内である。多くの通常不働化技術
とは反対に、アルギンゲルの不働化は多くの活性Ｐ２は
なかった。ァルギンゲルにおける酵素系（それ自体又は
全細胞や粉砕細胞として）の不働化に対しては、初めに
酵素系を水溶‘性のアルギン例えばアルギン酸ナトリウ
ムの水溶液と混合するのがよい。

望ましし、方法では、これは全体の細胞を可溶性アルギ
ネートでスラリー化するのを含む。スラリー中の細胞の
濃度は本発明の成功にとって臨界的ではないが、各種濃
度を試みることにより、特定の系にとって最適な点は容
易に見つけることができる。代表的には、細胞の濃度は
１から９０％湿重量／容量（ＷＷ／Ｖ）であるが、１０
から４０％ＷＷ／Ｖが望ましくｔ更に望ましくは約２０
％ＷＷ′Ｖである。同様に、可溶性ァルギネートの濃度
は臨界的でない。全体の細胞又は他の酵素系による特に
適切な使用濃度は１から１０％Ｗ′Ｖ、更には約５％Ｗ
′Ｖである。生成したァルギネート混合物を金属塩の溶
液に秤量し「 その塩で可溶性のアルギネートをゲル化
させる。

上記のように〜望ましいゲルはアルギン酸カルシウムで
あり「適切な塩には塩化カルシウムがある。特に〜 モ
ル比が０．０１から１０Ｍｔもっと望ましくは０．０５
力）ら０。９Ｍ、最高には約０４１Ｍの塩化カルシウム
溶液を使用することが望ましい。

混合物を秤量する時は〜金属塩の溶液は１５−４０℃、
更には約３０００が望ましい。また溶液を凝拝するとよ
い。金属塩溶液に更に熔存熊糖、例えば５〜４０％（Ｗ
／Ｖ）、望ましくは約２０％ＷノＶ）を含むと、不働イ
坊拷素系の安定性は促進される。スラリー又は他のアル
ギネート混合物を断続的滴下することによりｔ酵素系を
封入する球形のゲルベレツトをつくることは簡単なこと
である。べレットの大きさはいるいるであるがト取扱い
の容易さおよび使用時の有効な輸送性の為に、直径約３
〜５柵のものが望ましい。しかし、大きさと形は余り重
要でなく、ゲルブロック（使用時分割される）に、ゲル
ロープ（使用のために成形臭に巻くか切断する）に、又
は微センィ状粒子（アルギネート混合物に入れることに
より高製断条件を使う）に酵素系を不働化することは容
易にできる。他のゲル系に酵素系を不働化するために類
似の技術を使用することができる。ゲル化生成物を形成
する方法は文献により利用でき、この目的のためにその
方法を適用することも簡単なことである。次の非限定的
例により、不働化全細胞として酵素系を不働化するため
に次のものを使用した。… ｋ−カラゲニン又はｋ−カ
ラゲニン／ｏカストピーンガス。アルギネートの場合と
同じ手法を使う。但し、細胞スラリーを押し出す最も望
ましい溶液はＩＭＣａＣ１２とＩＭＫＣＩの混合物、２
０ｑ○であった。（ｉｉ〕 寒天。

脱イオン水に３％Ｗ／Ｖ寒天をボイルし、生成したゲル
を５０ｑｏに冷却し、細胞のスラリーを加え、そして得
られたサスベンジョソを氷−冷水中に滴下押出す。（ｉ
ｉｉ） キサンタン／ロカストビーンガム。

寒天の場合と同じ手法を使用する。但し、ガムは８０ｏ
Ｃに加熱するだけで、細胞を加える前にゲルを６０００
に冷却した。Ｍ ポリアクリルアミド。

千畑等の方法を使う（Ｍｅｔｈｏ船ｉｎＥｍｙｍｏｌｏ
幻．４も（１９７６）７３９）。ィソマルチュロース生
産性微生物の全細胞又は粉砕細胞を不働化するためにゲ
ルを使用することは必須ではない。非限定的例により再
び「ＤＥＡＥーセルロースに全細胞の吸着を成功させた
。細胞２のま「トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン塩酸塩、即ちトリスーＨＣＩでｐＨ７に調整したＤＥ
ＡＥーセルロースの非常に濃い水性スラリー１０の上と
混合した。このスラリーは室温で３び分間保持しト使用
に供した。更にｔ架橋法により細胞を不働化させた。

この方法は、脱イオン水１０の‘に懸濁させた細胞２夕
を架橋剤も２５％Ｖ′Ｖグルタールアルデヒド１０の‘
と反応させて行なった。骨炭への不鰯化も成功した。

細胞２夕と未筋骨炭２夕を使い「 それを脱イオン水１
０地に３び分間懸濁させた。その後〜 １５０の９タン
ニン酸と１３０の９グルタールアルデヒドのアセトン２
．２の‘溶液を添加した。混合物は室温に保持し、不働
化を完了させた。酵素系の不勧化はゲル系を使用しなり
やり方でも行なうことができることは上記の記述から分
る。

不漣性担体に物理的に吸着させる場合、吸着細胞のモノ
レァー又は多レァーを形成することが望ましい。不活性
担体に共有結合させる場合にも同じことが言える。架橋
剤で凝集体を形成する場合、凝集度はその凝集体が丁度
見えるようにするのが望ましい。一般的に「ィソマルチ
ュロース生産性酵素系をアルギン酸カルシウムゲル中に
封入させる以外の方法により不働化させる場合、活性の
保持と活性の安定性は通常劣る。

しかし、不働化の他の態様は時に別の特性を示し、望ま
しいものにする。一例として、ＤＥＡＥーセルロースへ
の細胞の吸着は次のような利点を有する。転換後に得ら
れる液体は代表的には外見上結晶であり、どの不純物も
ＤＥＡＥーセルロースにより吸着される。更に一般には
、不働化の別法技術は特定の状況に合うように選ぶこと
ができ、本発明に使用される。粉砕細胞又は酵素系の溶
媒抽出物の不働化は使用中におこる細胞分裂の可能性を
回避するから、不働化全細胞がアルギン酸カルシウムゲ
ルベレット内で分裂する時往々にしておこるべレツトの
破壊や孔の目詰まりを防ぐ。

更に、不働化した粉砕細胞又は溶媒抽出物では、最初の
活性は高く、茂糖とィソマルチュロースの拡散に対しキ
ャリア一として作用する全細胞壁膜の欠如に影響する。
粉砕は全細胞をポールミルにかけ又はその他の処理によ
り行なうことができる。不働化に使用する酵素源はＥｒ
Ｗｎｉａ属のィソマルチュロース生産性微生物が望まし
い。

他の属のバクテリア例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍ
ｕｌ′ｈｉｃａ又はＰｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃにてｒ血
ｒｕｍを使用できるが、前者は人間病原性であり、後者
は望ましくない低分子量赤色色素を生成しがちである。
天然由来菌の変異株、突然変異株あるいはその他の人為
株も必要なら使用することができる。例えば、突然変異
株は化学的物理的手段により誘導することができる。Ｆ
ｒｗｉｎｉａ属に属する種のうち、Ｅ．ｒｍａｐｏｔｉ
ｃｉが特に望ましい。

Ｅ．ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉの特に適切な菌株は英国のＮ
ａｔｉｏ肌ＣｏｎｅｃｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔｆ）ａｔ
ｈｏ袋ｎＩＣ舷ｃｔｅｒｉａに寄託番号ＮＣＰＰＢ１５
７８、１３９および１７３９として寄託されているもの
を含む。ＮＣＰＰＢ１５７８株はＡＴＣＣ２９２８３と
しても寄託されている。本明細書で言うすべてのＮＣＰ
ＰＢ菌株はＵｎｉｔｅｄＫｉｎ史ｏｍＭｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆＡ鱗ｉｃ山ｔｕｒｅ、Ｆｏｏｄ ａｎｄＦｉｓｈｉ
ｒｉｅｓにより１９７７年に刊行された「Ｃａｔａｌｏ
製ｅｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＰｌａｎｔＰａ
ｔｈｏｇｅｎｉｃＢａｃｔｅｒｉａ」の第１版に掲載さ
れており、第３者に入手可能である。ＮＣＰＰＢ１５７
８、１３９および１７３９株はＥＭｉｎｉａの他の菌株
又は他の属の菌株と比較した場合、生成物の特異性、初
期活性および安定性は高く、非常に将来性がある。

本発明方法は連続法として、不働化酵素系をカラムに詰
め、基質燕糖を溶液でカラムに通すことにより行なうの
が望ましい。

望ましい配列では、いくつかのカラムを平行に、例えば
回転式で使う。カラムの大きさは望み通り選ぶことがで
きるが、２０の‘以上が望ましい。不働化全細胞を使用
した場合、藤糖からィソマルチュロースへの転換中若干
の二酸化炭素が普通生成される。液体をカラム上方に通
す場合、この二酸化炭素を置き換えることは容易である
。液体の上方通過は不鰯イ雄酵素系の床を流動化するの
に役立ち、下方通過におこるようなコンパクト化を回避
する。醗酵によるィソマルチュロースの公知製造方法は
約２５重量％の茂糠溶液を使って行なうのがよい。

高濃度例えば基質として少なくとも３０％、望ましくは
少なくとも４０％、さらには少なくとも５０％Ｗ／Ｖ）
の茂糖溶液を使って行なった場合、本方法はさらによい
結果を生む。不働化細胞におけるィソマルチュロース合
成酵素系の安定性（ハーフ・ライフとして測定）は、転
化液中のィソマルチュロース濃度の様に、礎糖濃度の増
加につれて増す。これらの効果は全く著しく、不働化さ
せたＥ．ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉＮＣＰＰＢ１７３９のア
ルギン酸カルシウムベレットを使って得た実験データに
基づく図１と２に表示される。

特に、茂糖濃度が３０〜４０％に上ると、安定性と生産
性は顕著に上る。

この効果は、不轍化技術の場合よりむしろ不轍化ィソマ
ルチュロース生産性酵素系の性質に主としてあるようで
ある。アルギン酸カルシウムを使用する不働化技術はさ
らにより安定性を付与することである。更に、高度糖濃
度は不働化細胞の分割を阻止しかつ微生物のコンタミを
防止する傾向があり、また同時に生成物の回収を容易に
し、処理すべき液体の容量を減少させる。

高濃度の競糖を使用してかなりの利点が得られるが、実
際唯一の制限は通常溶液の粘度である。

通常の場合、上限粘度は１００から１００比ｐで、普通
５０比ｐである。アルギン酸カルシウムゲルベレットに
封入した細胞を使用する望ましい方法については、出発
材料中の藤糖濃度は約５５％Ｗ／Ｖがよい。

基質は純粋の藤糖溶液である必要はない。

例えば、１５％Ｖ／Ｖまでの糖密を蕗糠の代りに添加す
ることができる。この方法には回収ハウス材料又は「ア
フィネーション シラツプ」を利用できトこれらは通常
精糖工業にみられる不純の糠流の２つのタイプである。
本発明によれば、藤糖をィソマルチュロースに転換する
のに１５から４０００、さらには２０から３５００で行
なうのが望ましく「約３０００の温度が特に適している
。

競糖溶液のｐＨは特に重要でないが、５〜９〜特に約７
がよい。

ィソマルチュロースへの転換は通常若干の酸生成を伴な
うがも実際ｐＨを５〜９の範囲に維持させるのは通常不
必要である。どの場合にも、基質濃度が増すと、酸生成
は通常減少する。本発明方法は調整した程度に蕗糖をィ
ソマルチュロースおよび付随する生成物に転換させるの
に使うことができる。

不働化酵素系と接触している茂糖の保持時間が増すとも
転換度は実際的最大（藤糖の転換８５〜１００％）に増
大する。しかし〜最大生産性は最高転換度では必ずしも
達成されない。と言うのはちより短かし、保持時間によ
る生産額の多さと活性の高さが最大転換率で作動しない
ことの埋合せであるからである。実際〜最大生産性は最
大転換率以下でも通常？０〜９５％の転換で行なうこと
により得られることが分った。

本発明方法は最大生産性に要する転換度かあるいはその
近くで行なうことが望ましい。最高生産性を達成するた
めに必要な転換な組織的実験により容易に見出すことが
できる。一例として、不働化ＥＭｊｎｊａ細胞のアルギ
ン酸カルシウムベレットに対して、８０から９０％転換
率で行なったとき、通常生産性は最大である。この最大
の生産性の存在は図３に示されており、不働イ比。

ｒｈａｐｏｎｔ三ｃｉＮＣＰＰＢ１７３９のァルギン酸
カルシウムベレットを使って得られた実験デー夕に基づ
いている。茂糖のイソマルチュロースおよび随伴する生
成物への約８５から９０％転換率で生産性の顕著なピー
クがある。

藤糖の転換度は不働化細胞のィソマルチュロース生産性
酵素系の安定性に顕著な影響を及ぼす。本発明者の実験
によれば、濃縮競糖溶液の転換度につれて安定性は指数
的に増大しうろことを示す。この効果は、図４に示す。
不働化ＥｒｈａｐｏｎｔｉｃｉＮＣＰＰＢ１７３９のア
ルギン酸カルシウムべレットを用いて得られた実験デー
タに基づく。

図＆のデー外ま５５％藤糖溶液の転換に対して得られた
。安定曲ま９０％転換で約８５０畑時間の値に指数的に
増える。この劇的な結果は最も予期できないものでも再
度、本発明で得られる利点を示す。一般に〜本発明方法
は未転換藤糖と共にトィソマルチュロースその他のサッ
カラィドを含む溶液を生成する。各種不純物をすべて単
離することができなかったが、蕗糖、グルコースおよび
フラクトースの存在を測定し〜他のサッカラィドの存在
を感じた。ィソマルチュロースが生成した後」結晶化あ
るいは別のやり方で精製することができるが、これは本
発明にとって必須なことではない。

結晶化に対してはｔ溶液を濃度６０％ＷＪＶ）あるいは
望ましくは約６５％又は７０％（ＷＷ）まで濃縮し〜種
を入れｔ輝拝しながら２０ｏＣ！こ冷却するのがよい。

濃縮は６５ｏｏ以下で蒸発して行なうのがよくも着色化
に最小になる。濃縮溶液に種を入れるとも小さな結晶の
生長を助長し「必要なら大きな結晶も成長しうる。９０
％ィソマルチュロースを含む結晶の初期クロッブを得る
のに困難はなくｔ続く結晶化により純度１００％に上げ
られる。

イソマルチユロースの結晶はエタノールその他の沈澱剤
（例えば燕糠）を転手奥溶液に添加しても得ることがで
きる。このようにしてｔ結晶は好収率で速かに生産され
るが「純度は上記濃締結晶化方法で得られるものよりい
よいよ劣る。エタノールを添加して生成した結晶は代表
的には約８０％ィソマルチュロースト主な不純物として
熊糖を含む。アフィネーション シラップの如き不純の
熊糖溶液を転換する場合、濃縮−結晶化操作により得ら
れる結晶は通常淡褐色で比較的不純である。

液体生成物中に存在する全ィソマルチュロースの９５％
又はそれ以上は容易に結晶として回収できも実際の数値
は使用される結晶化技術および続く結晶化の回収に基づ
く。結晶を粉砕して、主としてイソマルチュロースであ
る自由流動性粉末が得られる。結晶化による精製の別法
として、液体生成物をアンバーライトＩＲＡ−６８（酸
を除くためにトアンバーラィトは登録商標そしてグルコ
ース、フラクトースおよび燕糖を除くために不働イ技酵
母細胞による）の如き塩基性交換樹脂と接触させて精製
することができる。

更に、凍結乾燥その他の技術を使って固形物を得ること
ができる。ィソマルチュロースは藤糖と類似した物理的
性質を有するが、甘味度ははるかに低い（水中７％Ｗ／
Ｖで茂糖甘味度の３７％）「驚くことに、ィソマルチュ
ロースは食料又は飼料製造用の成分として熊糖の代りに
特に使用に適するようにする、容易に定量できる性質を
もっていないことが分った。このような製品に競糖の代
りにィソマルチュロースを使用するのは、１９７ｇ王１
１月７日の優先権を有する別の特許出願の目的である。
その特許出願の明細書に開示されているが、イソマルチ
ユロースはバルク性、構造、テクスチャーその他の望ま
しい効果を与える調理食品製造に特に有用である。熊糖
の代りにィソマルチュロースを使うと、フレーバは増進
され、焔暁製品は通常濃い豊かな色になる。トッフィー
、ビスケット、プリン、ケーキ、ジャムを含む実施例が
ある。食品および関連の製品に使用するために、本発明
により供される結晶化ィソマルチュロースを使用するこ
とができ、ィソマルチュロースは純粋である必要でなく
、ある用途には、未結晶不純生成物を使用することがで
きる。

本発明は次の非限定的実施例により説明する。細胞の重
量のま湿重量（ＷＷ）を意味し、乾燥重量に対する大体
の転換は５で割って行なうことができる。細胞の活性は
湿細胞夕当りで表わす。例１Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａ
ｐｏｎｔｉｃｊ （ ＮＣＰＰＢ１５７８ 、ＡＴＣＣ
２９２８３）の培養物からとった細胞をリン酸塩緩衝塩
水１０ｍ‘で希釈した。

生成したサスベンジョンの０．１０のと試料を便して、
５００叫殺菌した振顔フラスコに生育培地２００の上試
料に接種ｌした。培地は表１に示す通りである。表１生
育培地 接種したフラスコは３０ｏｏで７畑時間、１分間当り１
２咳振動で振溢し、採取した。

細胞はこの場合に静暦生育相にて採取したが、同様に対
数的生育相又は死相にて採取できる。細胞は３ぴ０で１
庇ご間１５０００夕で遠心することにより、培地１００
机上当り約１タＷＣＴ細胞を得た。（多量の培地を処理
した場合、連続操作遠０ローターを使用し、１００Ｍ／
分で培地を注入した。）採取したパック細胞は脱イオン
水中アルギン酸ナトリウム（５％乾燥Ｗ′Ｖ）溶液に直
ぐに懸濁させ、２０％湿Ｗ／Ｖ細胞サスベンジョンを得
た。ついで細胞サスベンジョンは３ぴ０に維持されかつ
細胞のィソマルチュロース合成活性を安定化効果のある
１５％Ｗ／Ｖ藤糖を含有する塩化カルシウム（０．１Ｍ
）の縄梓溶液に、１０狐の高さから通下押出した。生成
したべレツトを１時間鷹拝し、ジャケット付きカラム（
高さ３０加、直径５肌）に詰めた。脱イオン水の茂糖５
５％Ｗ／Ｖ）溶液を調製し、１．０ＭＮａＯＨでｐＨ７
．０に調整した。

簾糖溶液をカラムに吸み上げ、３０００に保った。大体
０．０１空カラム容量／時間（ｅｃｖ／ｈ）の茂糖流速
では、簾糖のィソマルチュロースその他の生成物への転
換は平衛に達した。定常状態は２独特間後に達した。

この時間では不働化細胞の活性は約０．２多生成物／夕
湿細胞／ｈであった。ハーフ・ライトとして表わした細
胞の安定性は約１年であった。茂糠流速を８０％転換ま
で減少させるために増したとき、活性は約０．３２５タ
生成物／夕湿細胞／ｈであった。力ラム溶出液を集め、
６０００で約７０％Ｗ／Ｖ）に三瀦しついで放冷するか
又は蝿梓下強制冷却して、小さな白色結晶を得た。

実用上、冷却溶液に小量の乾燥ィソマルチュロースを接
種して結晶をさらに速かに回収することもできる。結晶
は炉過や遠沈により集取し、４０ｏ０７００奴Ｈｇ真空
オーブンで乾燥した。生成物は分析・試験した。結晶は
９４．５％イソマルチユロースであり、イソマルチユロ
ース１分子当り結晶水１分子を有し、残りはその他の糖
類であった。再結を３回行ない、純粋のィソマルチュロ
ースを得た。基質がィソマルチュロースおよび随伴生成
物に８０％転換されると、結晶生成物８８夕が藤糖基質
１００夕当り得られ、カラムの生産性は乾燥結晶生成物
／カラム容量／ＸＯ．３トンであった。

使用中、不轍化細胞の生活力のある細胞量は急速に減っ
た。約５０加持間の処理使用後、生活力のある細胞量は
ゼロになった。この期間の後、生活力のある細胞は残存
せず、細胞の退化形がみられた。比較的急速に生活力の
ロスがあったにも拘らず、不働化細胞のィソマルチュ。
ース合成活性は独立に一層ゆっくり、３５４日のハーフ
。ライフで減少した。生活力のある細胞はィソマルチュ
ロース生成に対し必要でないことをこの知見は示してお
り、また顔糖をィソマルチュロースに転換し、共因子の
再遼還又はエネルギー源の再生を必要としない単一の安
定酵素が多分いることを示すものである。

タン白合成を抑制するクロラムフェニコール０．１夕／
夕を基質として使用する５５％Ｗ／Ｖ）藤糖に含ませた
時、この仮説は確認された。ィソマルチュロース合成活
性は変らないが、細飽分裂は栄養を供給した時でもおき
なかった。細胞は長時間カラム内で継続的に使用された
後でも、ＥｒＷｎｊａ細胞はその場での新たな成長は新
鮮な無菌培地に栄養を供給することにより誘導できる。

したがって、ィソマルチュロース合成活性はその最初の
値の小さなフラクションに落ちた。これらの実験では、
培地は０．０１ｅｃｖ／ｈでカラムに吸い上げた。相当
量のＣ０２が不轍化細胞べレットにより発生し、カラム
から溶出した消費培地のｐＨはｐＨ４．４に落ち、ベレ
ット中および消費培地両方に生活細胞の増大があった。
そして消費培地と紬砲べレット双方の窒素分析は細胞の
成長がおきたことを示した。最も重要なことは、基質と
して５５％廉糖に変えた後、ベレツトのィソマルチュロ
ース生産活性はどの場合にも最初の活性より大きく増大
した。最初の細胞における酵素の誘導について証拠はな
いが、再生は全く細胞の成長によることが分った。べレ
ットの活性の再活性度は栄養供給直前に残っている生活
細胞の数に比例し、すべての封入細胞が非生活体になっ
た（５００ｈ）非常に長時間使用されたべレットでも再
活性は得られなかった。さらに再生細胞の実用的使用後
、カラムの活性は少なく３サイクルのようなやり方で再
活性された。

不働化細胞カラムの再生館はカラムの安定性を理論的に
不定のものにし、不働化細胞の寿命を基質の生産とは独
立のものにさせる。べレットを一定時間使用した後、栄
養を間けつ的に供給するよりも、培地は不働化後直ぐに
カラムに供給する。

これらの実験では、ＥｒＭｎｉａ細胞の遅い成長がその
場でおきた。１％（ＷＷ′Ｖ稀棚包べレット接種物を不
働化したとき、生活細胞数の３０著の増加が得られたと
き、実験前に６蝿時間の倍加時間に成長する細胞は、ア
ルギネートゲル構造の全体の弱化により終了した。

細胞の成長をおこさせることにより度々の活性の再生に
より、細胞をこのやり方で使用した場合、酵素系の固有
の安定性は細胞の成長がおきなかった時以下であった。
したがって、細胞を分割させた時より擬似休止状態又は
維持状態にある時の方が酵素はずっと安定のようである
。例２ 例１の基本的操作を使用し、更にＥＭｉｎｉａｒｈａｐ
ｏｎｔｉｃｉの収穫した細胞を不働化する前に８０℃／
９０分間ボールミルして粉砕した。

べレットの初期活性は、ハーフライフが約１７０日であ
る以外は、例１の全細胞を使った場合に類似していた。
例３他のィソマルチュロース生産性微生物菌株、即ちＥ
Ｍｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｊｃｉ（ＮＣＰＰＢ１５７
８、１３９、１７３９、ＡＴＣＣ２９２８４）、ＥＭｉ
ｎｉａｃａｒａｔｏｖｏｒａｖａｒａｔｒｏｓｅｐｔｉ
ｃａ ＮＣＰＰＮ１３９、 Ｅれｉｎｉａ ｄｉｓｓｏ
ｌｖｅｎｓ（ＮＣＰＰＢ１８６２と２２０９）、Ｐｒｏ
ねｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｒｕｂｒｍｍ（ ＣＢＳ５７４
、 ７７ ）、 Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍｅ岱ｃｅｓｅ
ｎｓ（ＮＣＩＢ８２８５）お よ びＳｅｒｒａｔｉａ
ｐｌのｍｕｔｈｉｃａ（ＡＴＣＣＩ５９２８）を使っ
て、例１の操作を行なった。

不働化菌株の特異性、活性および安定性を測定した。つ
いで、本微生物の病原性を考慮し、またポリマー又は色
素生成傾向を考慮することにより「試験菌株（例１のも
のを含む）を例１の方法においてその適合性について試
験した。その試験結果は表２の通りである。表２ 菌株
の適合性 例４ 各種競糖濃度１２．５〜６０％Ｗ／Ｖ）を使って例１の
操作を行なった。

４％の生成物に対する初期転換率％について活性とハー
フライフを測定した。

その結果は表３に示す。表３ 麓機濃度 基質の藤糖濃度の変化は、不轍化かラムの性能に対し多
くの重要な影響をもっている。

最初に、藤糖濃度は不働化細胞の活性に影響を及ぼし、
約４０％Ｗ／Ｖ）以上の濃度では阻止的である。他方、
藤糖濃度が従来の研究者により使用された濃度以上にな
ると、不働化細胞の安定性（すなわちハーフ・ライフ）
は非常に顕著に増大した。藤糖濃度が増すにつれ不働化
細胞の安定性の増大が活性の減少を償う。またカラムの
生産性は藤糖濃度の増大につれ増える。平衡生成物：藤
糖は基質として使う燕糖濃度により大いに変ることが分
った。

最高平衡値は５５％Ｗ／Ｖ）藤糖を使用した場合に得ら
れる。すなわち、５５％熊糖では、生成物：廉糖平衡比
は約１３．２であり、９３％の転換率に相当する。例５ この明細書で初めに特定化した他の不働化技術により不
働化させたＥｒＷｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉＮＣＰ
ＰＢ１５７８の細胞を使って、例１の操作を行なった。

活性とハーフ・ライフは表４に記載の通りである。表４
不働化技術 例６ Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（
１００ムタ′地）を３７０／２び分間水浴中におくこと
により〜 ０．１０Ｍクエン酸塩緩衝液剤６．０も２５
叫に溶解した。

ついでこの溶液を、大体１夕の新たに採取したＥ。ｒｈ
ａｐｏＭｃｉＮＣＰＰＢ１５７８細胞を含む炉過した栄
養ブロス５０のとに添加した。この細胞を水浴中３７０
／３船ご培養し採取しト １晩４００で４％燕糖培地（
表１）に懸濁させた。ｐＨ７．０に調整した競糖４％Ｗ
′Ｖ）〜トリプトン（０，４％Ｗ′Ｖ）およびべプトン
１％（Ｗ〆Ｖ）を含有する１．５％Ｗ〆Ｖ頁寒天プレー
トに試料（０．Ｗ【）をおきも３０ｏｏで４報時間培養
した。各コロニーを振縁フラスコに接種し〜 １２印ｐ
ｍで振溢させながら３０００ノ４鞘時間培養し「ついで
採取し、細胞を試験分析した。突然変異株は最初の細胞
より特異的でなかったが、ィソマルチュロースを生産し
た。例７ フロック状にまた断片に切断してゲル化又は連続ストラ
ンドにゲル化させかつロッド；こ巻くかセグメントに切
断して使用する封入ＮＣＰＰＢ細胞を含有するアルギネ
ートゲルを使用して〜例１の操作を行なった。

カラムに使用する場合「 これらの不轍化細胞は、球形
べレットに不働化した細胞と比較したとき、安定性又は
活性に顕著な差異は認められなかった。例８ Ｅ。

ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ株は特に適切であることを例３は
示している。アルギン酸カルシウムで不働化した３つの
Ｅ。ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ株の各々を用いて標準条件下
で更に比較を行なった。結果は表５の通りである。表
５例９ 藤糖をィソマルチュロースに転換させる酵素系は、４種
の技術すなわちミックル振縁法、浸透ショック、ソニケ
ーション法又は洗剤処理法を使って、Ｅｒｗｉｎｊａｒ
ｈａｐｏｎｔｉｃｉＮＣＰＰＢ１５７８の細胞から溶媒
抽出した。

ミックル振濠法では、新しく採取した細胞試料２夕を、
最大ジャィロ回転振動にセットしたミックルシェーカー
を使って「室温で２び分、乾燥砂２夕と蒸留水２の‘と
一緒に振渇させた。

浸透ショック技術では、細胞試料１．５夕を１℃３雌ン
間脱ィオン水１０のに懸濁させた。

ソニケーション法では、２夕の細胞試料を１５の‘の脱
イオン水に懸濁させ、２．５肌のチップ直径のソニケ−
夕−を使って３０分間処理した。

洗剤処理法では、０．５夕（Ｖ′Ｖ）ＴｒｉのｎＸ−１
００水溶液で３時間処理した。

（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は登録商標）。各処理後、生
成したサスベンジョンを３０ｏｏ／３０分〜 １７００
０夕で遠心分離した。

細胞又は砕片（ｄｅｌｌｄｅｂｒｉｓ）および上燈液は
例１の手法を使って「アルギン酸カルシウムのべレット
に別々に不働化させた。

べレットはィソマルチュロース合成活性について５５％
ＷノＶ）藤糖に対し試験し、表６の結果を得た。

表中し「ＩＭ」はィソマルチュロースと随伴生成物を意
味する。表 ６ 表６に示した結果から、ミックル振鰹法は細胞活性の約
５％を上燈液に放出し、残りの活性の全部は細胞破砕物
と関連している。

可溶性酵素抽出物すなわち上燈液は０．０扱タ生成物ノ
泌／ｈの活性、０．００２９タ生成物／雌タン白質／ｈ
の特異活性を有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した時、１２個の各種タン白バンドを有した。
酵素系は細胞の浸透ショックにより更に有効に抽出した
。この方法により、大体９％の細胞活性が抽出され、抽
出物は０．２５３多生成物／の‘／ｈの活性と０．０８
４４タ生成物／雌タン白質／夕の特異活性を有する。更
に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりわずか１の
固のタン白質バンドを示した。比較的高純度のこの酵素
抽出物は、細胞が浸透ショックにより破壊されなかった
からであろう。これらの結果から、酵素系は細胞に関係
しかつ／又は区画された膜のようである。最も可能性の
ある位置はべりプラスム間隙である。特に、浸透ショッ
ク法は最良の抽出法であり、かつ酸ホスフアターゼの如
きべリブラスム間隙マーカー酵素は浸透ショック処理に
より共抽出されたことが分ったからである。表６におい
て、浸透ショックを与えた細胞、ミックル−振浸させた
細胞および未処理細胞を考慮して、粉砕細胞が最高活性
を有していた。

このことは、完全な細胞壁と膜によりおこる基質移動に
対する拡散制限の除去によるのであろう。しかし、浸透
的ショックを与え、非生活細胞と、新鮮な生活細胞の活
性に有意な差異はなかった。競糖が細胞にとられるため
の活性輸送系は動いていないことを証明している。と言
うのはそのような系は全細胞の総合代謝によるからであ
り、また細胞が浸透的にショックを受けたとき、失なわ
れることが予期されるからである。浸透ショックにより
得た細胞のない酵素抽出物に関する別の研究はｐＨ７．
０の最適解と３０℃の最適温度を有し、３５％Ｗ／Ｖ沫
客液で最大活性を有することが分った。

可溶性酵素系に適する基質はフリーの細胞又は不轍化細
胞の場合（５５％）より少ないことは驚くに値せず、そ
のべリプラスム位置により課される酵素系の固有の性質
の変形に反映する。ミツクル−振糧抽出酵素系は５５％
Ｗ／Ｖ）鷲糖について使用し、不働化酵素は０．００６
７タ生成物／タベレット／ｈの初期活性と６２餌時間の
ハーフ・ライフを有し「 ８１．５％の初期転換度を達
成した。一般にかつ特定的にラベルした藤糖、フラクト
ースおよびグルコースを抽出酵素系の基質として使用し
、その系が藤糖基質グルコトランスフヱラーゼを含むこ
とが分った。本酵素は熊糖由来のフラクトースのみとし
て受容体部分に特異的であり、外部的に添加したフラク
トースではちがう。グルコース又はグルコースとフラク
トースはィソマルチュロースに付加するために利用可能
である。多分藤糖由来のグルコースとフラクトースはど
の場合にも「活性化」される。例えば、それはもっと有
利な環境に存在しうる。酵素系は全細胞を使って得た場
合より一層純粋な生成物を供さなかつた。

【図面の簡単な説明】

図１は茂糖溶液の濃度に対して不轍化酵素の安定性の変
化を示す。 図２は不働イ技酵素の生産性に及ぼす薦糖濃度の影響を
示す。図３は初期の転換率に対し不働化細胞の生の変化
を示す。図４は初期転換率に対し不働化細胞のハーフラ
イフの変化を示す。ＦＩＧ．１． ＦＩＧ．２． ＦＩＧ．３． ＦＩＧ．４． 第１部門（）） 年寺寮牛淳Ｅ亘昏６ ４葺き００親軍
司亘Ｃこｄに（平成ｉ 年ら月ｚｃ日）る補正の掲載公
告特許番号 功−？７’ 昭和５５年特許願第１５６７８６号（特公昭６０−９７
９７号、昭６０．３．１３発行の特許公報１（１）−１
３〔３４１〕号掲載）については特許法第６４条の規定
による補正があったので下記のとおり掲載する。 特許第１４９４４４６号 ｌｎｔ．ＣＩ．４ 識別記号 庁内整理番号ＣＩ
２Ｐ Ｉ９／１２ ７２３６−４ＢＣ１
２ＮＩＩ／０２ ７３２９一４Ｂ記１
第５欄１２〜１３行「必要でない。 」を「必要とは限らない。」と補正する。２ 第５欄２
７行「酢素系」を「酵素系」と補正する。 ３ 第６欄３９〜４０行「多く・・・・・・なかった。
」を「通常認めうる程の活性ロスは生じなかった。」と
補正する。４ ９頁「表２」の文字を「表２−１」と補
正する。 ５ ９頁第１７機から１８欄１行「表２菌株の適合性」
の次に「尚４種の固定化イソマルチユロース生産性微生
物の活性および安定性は例ｌの手順に従って測定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ イソマルチユロース生産性微生物の少なくともイソ
   マルチユロース−生産性酵素系を固定化し、ついでこの
   固定化酵素系を４０％（Ｗ／Ｖ）以上の蔗糖を含有する
   蔗糖溶液と接触させ、少なくとも蔗糖の一部をイソマル
   チユロースに転換させることを特徴とする、イソマルチ
   ユロースの酵素的製造法。 ２ イソマルチユロース生産性微生物の全細胞として、
   酵素系を固定化させる、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ イソマルチユロース生産性微生物の全あるいは粉砕
   細胞の酵素系溶媒抽出物を固定化させる、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４ 固定化はゲル内に封入する、特許請求の範囲第１、
   ２又３項記載の方法。 ５ ゲルはアルギネートゲルである、特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６ イソマルチユロース生産性微生物はＥｒｗｉｎａ属
   のものである、特許請求の範囲第１項から第５項のいず
   れか１項に記載の方法。 ７ 微生物はＥ．ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ種である、特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 微生物はＥ．ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ株ＮＣＰＰＢ１
   ５７８である、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 蔗糖溶液は約５５％（Ｗ／Ｖ）の蔗糖を含有する、
   特許請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載
   の方法。 １０ 蔗糖の７０から９５％をイソマルチユロースおよ
   び付随の生成物に転換させる、特許請求の範囲第１項か
   ら第９項のいずれか１項に記載の方法。 １１ イソマルチユロースを転換溶液から精製する、特
   許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項に記載
   の方法。 １２ イソマルチユロースを転換溶液から結晶化させ、
   イソマルチユロースを９０％以上含有する結晶を得る、
   特許請求の範囲第１１項に記載の方法。