DK150310B - Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose Download PDFInfo
- Publication number
- DK150310B DK150310B DK434981A DK434981A DK150310B DK 150310 B DK150310 B DK 150310B DK 434981 A DK434981 A DK 434981A DK 434981 A DK434981 A DK 434981A DK 150310 B DK150310 B DK 150310B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- isomaltulose
- sucrose
- cells
- immobilized
- solution
- Prior art date
Links
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 33
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 6
- RJPPRBMGVWEZRR-WTZPKTTFSA-N (3s,4r,5r)-1,3,4,5-tetrahydroxy-6-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O RJPPRBMGVWEZRR-WTZPKTTFSA-N 0.000 title 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 title 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 title 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 32
- PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-fructofuranose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)C(O)(CO)O1 PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 241001622809 Serratia plymuthica Species 0.000 claims description 7
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- -1 cyanuric acid halide Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 claims description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 claims description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 claims 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 claims 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001747 Cellulose diacetate Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 101150006061 neur gene Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i isos ro
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af isomaltulose (6-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose) ved enzymatisk omdannelse af saccharose og påfølgende krystallisation af den således dannede iso-5 maltulose.
Isomaltulose er et mellemprodukt ved fremstilling af glu-copyranosido-1,6-mannit (DE fremlæggelsesskrift nr.
2 520 173) og glucopyranosido-1,6-sorbit (isomaltit, DE patentskrift nr. 2 217 628). Begge disse stoffer meta-10 boliseres og resorberes ikke i organismen og er derfor velegnede som erstatningsstoffer for sukker, f.eks. som sødemiddel og strukturgivende fyldstoffer i nærings- og nydelsesmidler til diabetikere.
Fra DE patentskrift nr. 1 045 800 er dét kendt, at feaccha-15 rose kan omlejres enzymatisk til isomaltulose. De herved virksomme enzymer er af mikrobiel oprindelse. Virksomme ved denne omlejring er foruden Protaminobacter rubrum andre bakterier, såsom Erwinia carotovora, Serratia marcescens, Serratia ply-muthica og Leuconostoc mesenteroides (S. Schmidt-Berg-Lorenz, U. Mauch, Zeitschrift fur die Zuckerindustrie 14, 625 - 627 (1964); F.H. Stodola, 126th Meeting, Amer. Chem. Soc., Sept.
1954, Abstracts of papers, S. 5 D; W. Mauch, 5. Schmidt-Berg-Lorenz, Zeitschrift fϋr die Zuckerindustrie 14, 309 -25 315 og 375 - 383 (1964).
Fra .DE patentskrift nr. 2 217 628 og det tilsvarende GB patentskrift nr. 1 429 334 er det endvidere kendt, at man kan gennemføre den enzymatiske omdannelse af saccharose til isomaltulose batchvis eller kontinuert i en 15 - 40 ?ή' ig 30 opløsning under kraftig omrøring og under aerobe betingelser ved 20 - 37 °C.
Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2 806 216 er det kendt, at man kan gennemføre kontinuerlig dyrkning af isomaltu-lose-dannende mikroorganismer under samtidig omdannelse af saccharose til isomaltulose.
2 150310
De ovenfor omtalte fremgangsmåder er behæftet med en række ulemper, bl. a.: a) at de levende cellekulturer under deres formering udnytter en del af den tilsatte saccharose til deres 5 egen livsvirksomhed (vækst og formering), hvorved denne del af saccharosen går tabt for omsætningen til isomaltulose; b) at omdannelsen af saccharose til isomaltulose og den samtidigt forløbende celleformering kræver en fermen- 10 tering under kraftig omrøring og beluftning, hvilket igen er forbundet med et højt energiforbug; c) at koncentrationen af næringssubstratet på 25£ (DE offentliggørelsesskrift nr. 2 806 216), henholdsvis på 15 - 40 % (DE offentliggørelsesskrift nr. 2 217 15 628) er for ringe til påfølgende indvinding af isomal- tulosen ved direkte krystallisation; idet den omdannede saccharoseopløsning efter fraseparering af cellemassen skal inddampes, før den kan underkastes krystallisation, således at man ud fra 100 kg omsat sac- 20 charoseopløsning ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 2 806 216 må afdampe ca. 67 kg vand, før isomal-tulosen udkrystalliserer; d) at cellemassens formering ikke alene kræver en egenet carbonkilde, men ligeledes nitrogenkilder 25 og næringssalte.
Ved de ovenfor omtalte fremgangsmåder sker tilførselen af nitrogen og næringssalte ved, at man i stedet for rene saccharoseopløsninger anvender sukkeropløsninger af ringere renhed, således som de forekommer i en sukker- 30 fabrik. Disse forureninger (ikke-sukkerstoffer) er på den ene side ubetinget nødvendige for cellevæksten, og på den anden side forårsager de tab af isomaltulose gennem dannelse af melasse ved krystallisationen.
150310 3
De ovennævnte ulemper kan principielt undgås, når det lykkes, at adskille omdannelsen af saccharose til isomaltulose fra celleformeringen og at stabilisere den over længere tid.
5 Til den kendte teknik hører endvidere immobilisering af hele celler, jfr. f.eks. I. CHIBATA (Immobilized Enzymes, John Wiley and Sons, Neur York, London, 1978).
Det har nu overraskende vist sig, at det er muligt i rene saccharoseopløsninger at omdanne saccharo-10 sen til isomaltulose ved hjælp af immobiliserede celler af isomaltulose-dannende mikroorganismer, under i det følgende nærmere beskrevne betingelser.
Opfindelsen angår således en fremgangsmåde, af den ovenfor angivne art, som er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
15 Denne løsning repræsenterer et overraskende teknisk .
fremskridt, idet man ikke kunne forvente, at isomaltulose-dannende mikroorganismer, f.eks. Protamino-bacter rubrum (CBS 574.77) var i stand til at omdanne saccharosen til isomaltulose i død tilstand.
20 Det er endvidere overraskende, at man kan arbejde med rene saccharoseopløsninger med en sådan høj koncentration og derved frembringe isomaltulose med høj renhedsgrad.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udviser bl.a.
25 følgende fordele: a) Den isomaltuloseholdige opløsning kan straks uden forudgående inddampning bringes til krystallisation, hvorved man opnår en betydelig energibesparelse.
4 150310 b) Anvendelsen af døde celler forhøjer udbyttet af iso-maltulose, eftersom der ikke længere behøves saccharose til bakteriemassens metabolismer.
c) Isomaltulose-udbyttet forøges yderligere derigennem, 5 at man kan anvende rene saccharoseopløsninger, og dermed i meget stort omfang undgå dannelsen af melasse.
d) Eftersom saccharoseopløsninger med koncentrationer på mere end 65 vægt-Si er mikrobiologisk stabile, 10 kan man give afkald på en sterilisation af sub stratet.
e) På grund af de højere koncentrationer af substratet skal man behandle mindre rumfang og derved kan man klare sig med mindre apparatur.
15 f) Formeringen af bakteriemassen til fremstilling af immobiliserede celler kan gennemføres under optimale vækstbetingelser, og man behøver således ikke længere at gå ind på et kompromis mellem de optimale betingelser for omdannelse til isomaltulose 20 og for bakterievæksten.
g) Man kan anvende et billigt næringssubstrat, f.eks. fortyndet melasseopløsning, til fremstilling af bakteriemassen.
I beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4760/80 25 og dansk patentansøgning nr. 3700/81, som begge først er blevet offentligt tilgængelige efter den foreliggende ansøgnings prioritetsdag, omtales fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose ved hjælp af immobiliserede celler af isomaltulose-dannende' mikro-30 organismer, men kun gennemført ved temperaturer under 40 °C.
150310 5
Til indvinding af de celler, der skal immobiliseres til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, gennemføres en optimal celleformering i et næringssubstrat, der kun indeholder ca. 5 vægt-% tørstofindhold.
5 Næringssubstratet kan indeholde tyksaft (et mellemprodukt i sukkerindustrien), majsstøbevand og (NH^^HPO^. Fordelagtig er dog anvendelsen af et betydeligt billigere næringsmedium, som kun består af sukkerroemelasse og (NH^^HPO^. Til fremstilling af dette næringssubstrat 10 fortyndes melassen med destilleret vand til et tørstofindhold på 5 vægt-%. Som yderligere nitrogenkilde og· phosphatkilde tilsættes 0,1 kg (NH^^HPO^ til 100 kg af denne opløsning. pH-Værdien indstilles på 7,2 ved hjælp af NaOH, Κ0Η eller HC1.
15 Celler fra en podning med en isomaltulose-dannende mikroorganisme, f.eks. Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), bortskylles med 10 ml sterilt næringssubstrat af ovennævnte sammensætning og dyrkes i 200 ml af det samme næringssubstrat ved 20 °C. Så snart kimtallet 20 i rystekolbekulturen har nået 5 x 10 kim/ml, overføres kulturen til en mini-fermentor med næringssubstrat af ovenfor beskrevne sammensætning, og den videreforme-res ved 20 °C med højst mulig beluftningshastighed og omrøringshastighed. Kontrollen med formeringen sker 25 ligesom ved rystekolbekulturen ved bestemmelse af kim- 9 tallet. Så snart kimtallet har nået 5 x 10 kim/ml, kan man indhøste fermentorens indhold.
Til immobilisering af de således opnåede celler egner sig principielt alle de metoder til immobilisering af 30 hele celler, der er omtalt af I. CHIBATA (Immobilized Enzymes, John Wiley and Sons, New York, London 1978).
Særligt egnede er følgende metoder: 6 150310 a) Fermentorens indhold tilsættes enten i selve fermentoren eller i en anden beholder en Ι/ό-ig opløsning af kation-aktivt flokkuleringsmiddel. Den nødvendige mængde flok-kuleringsmiddelopløsning må fastlægges i et forudgående 5 forsøg. Man lader den udflokkulerede cellemasse sedimen tere, fraseparerer den ovenfor værende væske, vasker bundfaldet 2 gange med phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0). Derpå afvandes cellemassen til en pasta, der lader sig ekstrudere. Den ekstruderes til stænger, tørres, formales og 10 sigtes.
b) Til 10 liter af fermentor-væsken tilsætter man under langsom ; oprøring 0,5 - 2,0 liter af en 0,2%-ig opløsning af chito- san. Den udflokkulerede cellemasse vaskes med phosphat-puffer (0,1 M, pH 7,0), afvandes i en centrifuge, f.eks.
15 en bægercentrifuge eller en kappecentrifuge, ekstruderes til stænger, tørres, formales og sigtes.
c) Cellemassen separeres fra fermentorvæsken i en centrifuge.. 5 - 20 g af denne cellesuspension (tørstofindhold ca. 10¾) bringes i suspension i 45 - 60 ml Na-algi- 20 natopløsning (8 g i 100 ml), og tildryppes gennem en kanyle (tværsnit 0,55 mm) til en 2%-ig CaCl2-opløsning. De således opståede perler omrøres yderligere ca. 15 min. i CaCl2-opløsningen og udvaskes derpå med vand. Perlerne tørres ca. 20 timer ved stuetemperatur.
25 d) Cellemassen frasepareres fra fermentorvæsken i en centrifuge, vaskes med phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) og lyo-philiseres. 1 2 3 4 5 6 g cellulosediacetat opløses i en blanding af dime- 2 thylsulfoxid og acetone (6 : 4) ved 90 °C under tilbage- 3 30 svaling. Efter afkøling til 30 °C tilsætter man 3 - 30 g 4 lyophiliserede celler. Denne suspension tildryppes ved hjælp 5 af en injektionsprøjte (kanyle 0,8 mm) til vand ved stue 6 temperatur. De dannede perler tørres.
150310 7 e) Cellemassen separeres fra fermentor-væsken i en centrifuge.
5 g af denne cellemasse bringes i suspension i 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning ved 45 - 50 °C. 1,7 K-carrageenan (opløseligt polysaccharid-thioester) opløses i 34 ml fy- 5 siologisk kogsaltopløsning ved 45 - 60 °C. De 2 opløs ninger blandes og holdes i 30 min. ved 10 °C. Den således dannede gel hærdes i kold 0,3 molær KCl-opløsning og brækkes derpå i ca. 3 mm store stykker.
f) Til fermentor-væsken ssettes enten i selve fermentoren el- 10 ler i en anden beholder først en 1%-ig opløsning af et kat ionaktivt flokkuleringsmiddel og derpå en l?i-ig opløsning af et anionaktivt flokkuleringsmiddel. De nødvendige mængder flokkuleringsmiddel må fastlægges i et forudgående forsøg. Den udflokkulerede cellemasse får lov til 15 at sætte sig, vaskes med phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), ekstruderes til stænger, tørres, formales og sigtes.
De præparater, som er fremstillet ved de ovenfor anførte metoder, skal som nævnt tværbindes for at undgå en udblødning af cellerne.
2ø Hertil anvendes bifunktionelle reagenser, såsom f.eks. glutaraldehyd. Man kan imidlertid ikke arbejde med de sædvanligvis anvendte koncentrationer af glutaraldehyd på 2,5 - 5,0/ό ved en kontakttid på 30 - 45 min., idet det har vist sig, at alle immobiliserede præparater 25 under sådanne betingelser blev fuldstændig inaktivere-de. Som optimale tværbindingsbetingelser ved den foreliggende fremgangsmåde har man fastlagt en koncentration på 0,1¾ glutaraldehyd og en behandlingstid på 10 min. 1
De ved en af de ovenfor beskrevne metoder immobiliserede og tværbundne celler kan fyldes på en egnet søjlereaktor.
Denne reaktor må kunne temperaturreguleres og udvise et forhold mellem diameter og tykkelse på 1 : 1 til 1 : 20, for- 8 150310 trinsvis 1 : 1 til 1 : 10, især 1 : 1,5 til 1 : 5. Rene saccharoseopløsninger (65 - 75 vægt-?i) pumpes gennem søjlen ved en temperatur på 40 - 60 °C enten ovenfra og nedefter eller nedefra og opefter. Herved indstilles strømningsha-5 stigheden således, at man opnår en kontakttid på 1 - 10, fortrinsvis 4-7 timer (dette svarer til 0,2 - 0,8 g saccharose, fortrinsvis 0,4 - 0,6 g saccharose, pr.g immobiliserede celler (tør tilstand) pr. time). Den tilførte saccharose bliver herved fuldstændig omdannnet, hvorved der opstår ca. 1¾ glu-10 cose, 4¾ fructose, 82¾ isomaltulose og 13¾ 1-G-a-D-glucopy-ranosido-D-fructose.
En del af isomaltulosen kan udvindes krystallinsk ved simpel afkøling af opløsningen. Ved inddampning og afkøling kan man fra moderluden udkrystallisere en yderligere mængde isomal-15 tulose, således at man alt i alt kan indvinde 91,5¾ af den dannede isomaltulose krystallinsk.
En fordelagtig udformning af fremgangsmåden består i, at man leder saccharoseopløsninger hurtigere gennem søjlen, således at kun ca. 75 - 80¾ af saccharosen omdannes. Ud fra produkt-20 strømmen kan. man udkrystallisere en del af isomaltulosen ved afkøling og efter supplerende tilsætning af frisk saccharose-opløsning lede resten endnu en gang igennem søjlen. Fordelen ved denne fremgangsmåde består i, at man gennem den kortere kontakttid undertrykker dannelsen af 1-0-a-D-gluco-25 pyranosido-D-fructose, og at man som totaleffekt kan opnå et højere udbytte af det ønskede produkt isomaltulose.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af to eksempler: EKSEMPEL 1 30 a) Man bortskyller celler fra en podning af stammen Protami-nobacter rubrum (CBS 574.77) med 10 ml af et sterilt næringssubstrat , som består af 8 kg tyksaft fra en sukkerfabrik (tørstofindhold = 65¾), 2 kg majsstøbevand, 0,1 kg 9 150310 (NH^^HPO^ og 89,9 kg destilleret vand, efter behov indstillet på pH 7,2. Denne suspension tjener som podemateriale for en forkultur i rystemaskine i 1 liter kolber med 200 ml næringsopløsning af ovenfor beskrevne sammen-5 sætning.
Efter 30 timers dyrkning ved 29°C.podes 16 1 næringsopløsning af ovennævnte sammensætning i en 30 1 mini-fer-mentor med indholdet af 20 kolber (4 1), og der fermenteres ved 29 °C med 20 1 luft pr. min. og en omrøringshastighed på 10 350 omdr./min. Det tiltagende kimtal bestemmes mikrosko-
O
pisk. Efter man har opnået et kimtal på 5 x 10' kim/ml overføres fermentorens indhold til en anden beholder, hvortil tilsættes et kationaktivt flokkuleringsmiddel (som f.eks. "Primafloc" c 7 fra firmaet Rohm & Haas, Phi-15 ladelphia/USA). Man lader de udflokkede celler sætte sig, fradekanterer, vasker med 0,1 M phosphatpuffer- pH 7,0 og fjerner vandet ved centrifugering. Massen ekstruderes derpå til stænger, lufttørres og formales.
b) Sigtefraktionen 0,3 til 0,8 mm af det ovenfor ud-20 vundne præparat omrøres i en 0,l?o-ig glutar aldehydop løsning i 10 min., vaskes med phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) og fyldes under vand på en søjle, hvis temperatur kan reguleres. Søjlen opvarmes derpå til 50 °C og gennemstrømmes kontinuerligt med en 70 vægt-?o-ig saccharoseop-25 løsning. Strømningshastigheden afpasses derved således, at man ved søjlens udløb ikke længere kan påvise nogen saccharose. Den på denne måde indvundne isomaltuloseop-løsning overføres til en nedkølingskrystallisator, køles til 20 °C, og den udkrystalliserede isomaltulose frase-30 pareres fra moderluden i en sigtekurvscentrifuge.
EKSEMPEL 2
Man bortskyller celler fra et podemateriale af stammen Prot-aminobacter rubrum (CBS 574.77) med 10 ml af et stetilt næringssubstrat, som består af 6,25 kg roemelasse (tør- 150310 ίο stqfindhold 80?□), 0,1 kg (NH^^HPO^ og 93,65 kg destilleret vand (om nødvendigt indstillet til pH 7,2 ved hjælp af HC1).
Denne suspension tjener som podemateriale for en forkultur i rystemaskine i 1 liter kolber med 200 ml næringsopløsning af 5 den ovenfor beskrevne sammensætning. Efter en dyrkningstid på 30 timer ved 29 °C podes 16 1 nsringsepløsning af den oven* for beskrevne sammensætning med indholdet af 20 kolber (4 1) i en 30 1 mini-fermentor,og der fermenteres ved 29 °C med 20 1 luft pr. min. og en omrøringshastighed på 350 omdr./min.
. 10 Man går videre analogt med fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 a) og 1 b).
Claims (4)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af isomaltulose (6-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose) ved enzymatisk omdannelse af saccharose og påfølgende krystallisation 5 af den således dannede isomaltulose, kendetegnet ved, at den enzymatiske omdannelse gennemføres ved, at man ved 40 - 65 °C kontinuerligt fører rene saccha-roseopløsninger med koncentrationer på 45 - 75 vægt-%, fortrinsvis 65 - 75 vægt-%, gennem en med immobiliserede 10 celler af isomaltulose-dannende mikroorganismer fyldt reaktor, hvilke mikroorganismeceller, eventuelt efter indeslutning i en matrix, er blevet tværbundet med et bifunktionelt reagens i en mængde, der ikke bevirker inaktivering af præparatet.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de anvendte mikroorganismer er Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), Serratia plymuthia (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285) eller Leuconostoc me-senteroides [NRRL B-51F (ATCC 10830a)], fortrinsvis 20 Protaminobacter rubrum (CBS 574.77).
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de anvendte immobiliserede celler tværbindes med glutaraldehyd eller cyanursyrehalogenid.
4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene- 1-3, k e n -25 detegnet ved, at de anvendte celler immobilise- res ved flokkulering med et kationaktivt eller et anionaktivt flokkuleringsmiddel eller med en kombination af disse.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3038219 | 1980-10-09 | ||
| DE19803038219 DE3038219A1 (de) | 1980-10-09 | 1980-10-09 | Verfahren zur herstellung von isomaltulose (6-o-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose) mit hilfe von immobilisierten bakterienzellen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK434981A DK434981A (da) | 1982-04-10 |
| DK150310B true DK150310B (da) | 1987-02-02 |
| DK150310C DK150310C (da) | 1987-09-28 |
Family
ID=6114020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK434981A DK150310C (da) | 1980-10-09 | 1981-10-01 | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4640894A (da) |
| EP (1) | EP0049742B1 (da) |
| JP (1) | JPS5794298A (da) |
| AT (1) | ATE16406T1 (da) |
| DD (1) | DD201695A5 (da) |
| DE (2) | DE3038219A1 (da) |
| DK (1) | DK150310C (da) |
| ES (1) | ES505364A0 (da) |
| FI (1) | FI70926C (da) |
| IE (1) | IE51455B1 (da) |
| SU (1) | SU1512489A3 (da) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3213107A1 (de) * | 1982-04-07 | 1983-10-13 | Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von isomaltulose (6-o-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose) mit hilfe von immobilisierten bakterienzellen |
| DE3241788A1 (de) * | 1982-11-11 | 1984-05-17 | Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von 1-0-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose und verwendung als suessungsmittel |
| DE3528752A1 (de) * | 1985-04-27 | 1986-10-30 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Kontinuierliches verfahren zur enzymatischen herstellung von isomaltulose |
| JPH01199592A (ja) * | 1987-07-27 | 1989-08-10 | Showa Denko Kk | イソマルツロースの製造方法 |
| JPH02273192A (ja) * | 1989-04-13 | 1990-11-07 | Meito Sangyo Kk | イソマルチユロースの製造方法 |
| CU22292A1 (es) * | 1991-05-07 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion a escala industrial de licores de fructosa-glucosa a partir de sacarosa e instalacion para el mismo |
| FI104563B (fi) * | 1996-05-17 | 2000-02-29 | Xyrofin Oy | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla |
| FI105048B (fi) * | 1997-05-22 | 2000-05-31 | Xyrofin Oy | Menetelmä isomaltuloosin ja muiden tuotteiden valmistamiseksi |
| DE19747642B4 (de) * | 1997-10-29 | 2004-12-23 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Verfahren zur Herstellung von Isomelezitose-haltigen Süßungsmitteln, von Isomelezitose und von Isomaltulose |
| FR2928817B1 (fr) * | 2008-03-19 | 2010-12-17 | Ecopsi | Procede et unite de production de dreches de betteraves et de jus sucre a partir de betteraves |
| DE102011100772A1 (de) | 2011-05-05 | 2012-11-08 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose aus Pflanzensäften |
| EP3299458A1 (en) | 2012-04-17 | 2018-03-28 | Petiva Private Limited | A method of production of rare disaccharides |
| DE102012216955A1 (de) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren umfassend eine kontinuierliche Kristallisation von Isomaltulose |
| DE102014203964A1 (de) | 2014-03-05 | 2015-09-10 | Evonik Degussa Gmbh | Granulat enthaltend Isomaltulose Synthase |
| WO2019175634A1 (en) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Petiva Private Limited | Novel whole-cell biocatalyst for the production of isomaltulose |
| CN113481257B (zh) * | 2021-07-09 | 2022-11-29 | 东北师范大学 | 一种重组酶在合成含有α-(1,4)糖苷键的果糖衍生物中的应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1049800B (de) * | 1957-10-11 | 1959-01-29 | Süddeutsche Zucker-Aktiengesellschaft, Mannheim | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PALATINOSE (6-a-GLUCOSIDO-FRUCTOFURANOSE) |
| US3779869A (en) * | 1971-05-13 | 1973-12-18 | Miles Lab | Enzyme stabilization |
| USRE29130E (en) * | 1971-07-09 | 1977-02-01 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Enzymatic process using immobilized microbial cells |
| US3974036A (en) * | 1974-09-03 | 1976-08-10 | Miles Laboratories, Inc. | Process for conditioning bacterial cells containing glucose isomerase activity |
| US4208482A (en) * | 1976-04-23 | 1980-06-17 | Anheuser-Busch, Incorporated | Immobilization of glucose isomerase |
| US4167447A (en) * | 1976-07-19 | 1979-09-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method for insolubilizing enzymes on chitosan |
| EP0001099B1 (de) * | 1977-09-13 | 1980-08-20 | Bayer Ag | Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Saccharose zu Isomaltulose mit Hilfe von Mikroorganismen |
| US4251632A (en) * | 1978-09-11 | 1981-02-17 | Miles Laboratories, Inc. | Preparation of a bacterial cell aggregate |
| EP0028900B1 (en) * | 1979-11-07 | 1984-02-08 | TATE & LYLE PUBLIC LIMITED COMPANY | Production of isomaltulose |
-
1980
- 1980-10-09 DE DE19803038219 patent/DE3038219A1/de active Granted
-
1981
- 1981-07-21 DE DE8181105743T patent/DE3172822D1/de not_active Expired
- 1981-07-21 EP EP81105743A patent/EP0049742B1/de not_active Expired
- 1981-07-21 AT AT81105743T patent/ATE16406T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-24 IE IE1670/81A patent/IE51455B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-08-19 FI FI812560A patent/FI70926C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-09-10 SU SU813335150A patent/SU1512489A3/ru active
- 1981-09-10 ES ES505364A patent/ES505364A0/es active Granted
- 1981-09-10 DD DD81233191A patent/DD201695A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-10-01 DK DK434981A patent/DK150310C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-10-01 JP JP56154935A patent/JPS5794298A/ja active Pending
-
1985
- 1985-10-30 US US06/793,005 patent/US4640894A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK434981A (da) | 1982-04-10 |
| ES8206623A1 (es) | 1982-08-16 |
| DE3038219C2 (da) | 1988-05-11 |
| ES505364A0 (es) | 1982-08-16 |
| SU1512489A3 (ru) | 1989-09-30 |
| FI70926C (fi) | 1986-10-27 |
| JPS5794298A (en) | 1982-06-11 |
| FI70926B (fi) | 1986-07-18 |
| US4640894A (en) | 1987-02-03 |
| FI812560L (fi) | 1982-04-10 |
| IE811670L (en) | 1982-04-09 |
| DE3172822D1 (en) | 1985-12-12 |
| DD201695A5 (de) | 1983-08-03 |
| DK150310C (da) | 1987-09-28 |
| ATE16406T1 (de) | 1985-11-15 |
| EP0049742B1 (de) | 1985-11-06 |
| EP0049742A1 (de) | 1982-04-21 |
| IE51455B1 (en) | 1986-12-24 |
| DE3038219A1 (de) | 1982-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1259939A (en) | Production of isomaltulose | |
| DK150310B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose | |
| US3616221A (en) | Enzyma method for converting glucose in glucose syrups to fructose | |
| FI64641B (fi) | Foerfarande foer kontinuerlig framstaellning av isomaltulos fron sackaros med tillhjaelp av isomaltulosbildande mikroor gaismer | |
| DK167366B1 (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose (6-o-alfa-d-glucopyranosido-d-fructose) ved omdannelse af saccharose med immobiliserede bakterieceller | |
| US4788145A (en) | Process for preparing 1-O-alpha-D-glucopyranosido-D-fructose | |
| US6479657B1 (en) | Crystalline 1-kestose and process for preparing the same | |
| FI105048B (fi) | Menetelmä isomaltuloosin ja muiden tuotteiden valmistamiseksi | |
| KR830000546B1 (ko) | 말투로오스함유 시럽 제조방법 | |
| DK147409B (da) | Fremgangsmaade til hydrolysering af inulin ved hjaelp af et aspergillus ficuum-inulinasepraeparat | |
| DE2741197A1 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen fermentation von mikroorganismen mit gleichzeitiger umsetzung von saccharose in isomaltulose | |
| DE2806216A1 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen fermentation von mikroorganismen mit gleichzeitiger umsetzung von saccharose in isomaltulose | |
| JPH04211341A (ja) | 甘味剤 | |
| JPH0117672B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |