FI64641B - Foerfarande foer kontinuerlig framstaellning av isomaltulos fron sackaros med tillhjaelp av isomaltulosbildande mikroor gaismer - Google Patents

Description

kki*·»·! Γαΐ f11) KUULUTUSjULKAlSU

^ 11 UTLÄGGN,NGSSKRlFT 64 641 C (4S) ratonlti r.yjr.:..t‘y 12 12 1933 ' * Patent Eeddelat (51) Ky.ik.^nt.a.3 c η 2 P 19/12 // C 07 H 3/04-SUOMI — FINLAND (21) P*tenttlh»lt«mu« — Pttentveökntnj 782?68 (22) H*lceml*p»lvl — Antöknln(td«| 11.09.78 (23) Alkupllvi—Giltl|head«f 11.09.78 (41) Tullut Julkiseksi — Blivlt offontllg 03.79

Patentti- ja rekisterihallitus .... ..... ...

Ä . . (44) Nihtlvlkilpanon ja kuuLjulkatsun pvm. — ,, πο o,

Patent· och registerstyrefsen Antflkan utltgd och ucl.*krift«n pubticend jx. υο. o j (32)(33)(31) pyydetty etuolkeu» — Begird prlorltet 13.09.77 lU.02.78 Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) P 27U1197-8, p 2806216.0 (71) Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) (72) Wulf Crueger, Erkrath, Lore Drath, Worms am Rhein, Mohammed Munir,

Obrighcim, Saksan Liittotaimvolta-Förbundsrepubliken Tyskland(DK) (7U) Qy Kolster Ab (5U) Menetelmä isomaltuloosin jatkuvatoimiseksi valmistamiseksi sakkaroosista isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien avulla -Förfarande för kontinuerlig framställning av isomaltulos frän sackaros med tillhjälp av isomaltulosbildande mikroorganismer

Keksinnön kohteena on menetelmä isomaltuloosin jatkuvatoimiseksi valmistamiseksi sakkaroosista isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien avulla, joita viljellään sakkaroosipitoisessa ravintoliemessä, joka sisältää kasvismehuja.

Isomaltuloosi on välituote valmistettaessa glukopyranosido- 1,6-mannitolia (DE-OS 2 520 173) ja glukopyranosido-1,6-sorbitolia (isomaltitoli, DE-PS 2 2X7 628). Molempia aineita voidaan käyttää sokerin korvikkeina.

Saksalaisesta patenttijulkaisusta 1 049 800 on tunnettua, että sakkaroosi muuttuu entsymaattisesti isomaltuloosiksi. Tarvittava entsyymi on peräisin mikro-organismeista. Protaminobacter rubrumin ohella sakkaroosia muuttavat isomaltuloosiksi muutkin bakteerit, kuten Ervinia carotovora, Serratia marcescens, Serratia plymuthica ja 2 64641

Leuconostoc mesentheroides (s. Schmidt-Berg-Lorenz, W. Mauch, Zeit-schrift fur die ZuckerIndustrie, 14, 625-627 (1964); F.H. Stodola, 126th Meeting Amer. Chem. Soe ., Sept. 1954> Abstracts of Papers, s.

5D; W. Mauch, S. Schmidt-Berg-Lorenz, Zeitschrift fur die Zuckerin-dustrie, 14, 309-315 ja 375-383 (1964).

Lisäksi tunnetaan saksalaisesta patenttijulkaisusta 2 217 628, että sakkaroosin entsymaattinen muuttaminen isomaltuloosiksi voidaan suorittaa panoksittaan tai jatkuvatoimisesti 15-40-%:isella liuoksella voimakkaasti sekoittaen aerobisissa olosuhteissa lämpötilassa 20-37°C. Entsymaattisen reaktion päätyttyä eristetään mainitun patenttijulkaisun mukaan bakteerisuspensio lingon avulla ja käytetään kuusikin kertaa uudelleen. Saman patenttijulkaisun mukaan toimitaan sakkaroosin jatkuvatoimisessa muuttamisreaktiossa siten, että bakteereita viljellään erikoisravinnealustalla ja poistetaan jatkuvatoimisesti. Entsymaattinen reaktio tapahtuu toisessa kattilakaskadisysteemissä, jossa on bakteeriviljelmää ja sokerinvalmistuksesta saatua paksumehua tai muuta sokeripitoista liuosta.

Mutta mikro-organismien kasvattaminen erillään sakkaroosin ent-symaattisesta muuttamisreaktiosta on monista syistä epätyydyttävää: a) Mikro-organismeja kasvatetaan omassa väliaineessa, mikä lisää kustannuksia.

b) Reaktorikattilasysteemistä riippumatta on viljelyliuos ja myös fermentori, jossa entsymaattinen reaktio tapahtuu, steriloitava ja pidettävä steriilinä.

c) Mikro-organismien viljely myöhemmästä reaktial'iuoksesta poikkeavassa ravinneliuoksessa aiheuttaa vaaran, että fermentoinnin mikro-organismit valitaan muiden kriteerien kuin maksimireaktiosuhteen mukaan.

d) Mikro-organismien eristämiseen ja uudelleenkäyttöön entsy-maattisessa jatkokäsittelyssä liittyy suuri infektoitumisvaara.

Nyt on havaittu, että isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien viljely ja sakkaroosin samanaikainen muuttaminen isomaltuloosiksi voidaan suorittaa jatkuvatoimisesti.

Isomaltuloosia muodostavilla mikro-organismeilla tarkoitetaan tässä ennen kaikkea Protaminobacter rubrumia ja lisäksi Serratia olymuthicaa, Serratia marcescensia, Erwinia carotovoraa ja Leuconostoc mesentheroidesia.

3 64641

Oli yllättävää ja odottamatonta, että käytettäessä isomaltuloo-sia muodostavia mikro-organismeja, esim. Protaminobacter rubrum (CBS 574 77), jotka muuttavat kasvunsa aikana sakkaroosia isomaltuloosiksi, sakkaroosipitoisissa kasvimehuissa, joita muodostuu välituotteena esim. ruoko- ja juurikassokerin valmistuksessa ja jotka siten ovat halvempia kuin puhdas sakkaroosiliuos, saadaan erikoisen hyviä saantoja tietyillä laimennusnopeuksilla. Tällöin organismien kasvu ja reaktionopeus ovat kytkeytyneet toisiinsa siten, että kokonaisprosessia eli mikro-organismien kasvua ja sakkaroosin muuttumista isomaltuloosiksi voidaan tarkkailla erilaisten kriittisten parametrien avulla, kuten esim. poistoilman CC^-pitoisuuden ja viljelyliuoksen hapen osapaineen avulla, erikoisesti kuitenkin reaktionopeuksien avulla.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sen jälkeen kun on saavutettu riittävä solutiheys, viljelyä jatketaan edelleen jatkuvatoimisena, jolloin sakkaroosipitoisia liuoksia lisätään samalla jatkuvasti laimennusnopeuksien ollessa 0,05-0,3 h "*, edullisesti 0,2 h ja samansuuruinen määrä viljelyliuosta poistetaan jatkuvasti, sakkaroosin isomerisoitumisen tapahduttua mikro-organismimassa erotetaan liuoksesta ja liuos puhdistetaan ja/tai kiteytetään tunnetulla tavalla.

Menetelmään liittyy seuraava lisäetu. Sakkaroosin muuttuessa isomaltuloosiksi muodostuu pieniä määriä fruktoosia ja glukoosia, jotka toimivat mikro-organismien aineenvaihdunnan hiilihydraattiläh-teenä. Samalla nämä ei-toivotut sivutuotteet pilkkoutuvat edelleen.

Jatkuvassa isomaltuloosifermentoinnissa käytetään lähtöliuok-sena sokeritehtaan ohutmehu/paksumehu- ja/tai ohutmehu/kirkasteseok-sia, joiden kuiva-ainepitoisuus on 5-30 %, edullisesti 20-27 %. Kuivapainosta laskettu sakkaroosipitoisuus on 90-98 %, edullisesti 94-96 %.

Bakteeriviljelmän optimikasvun saavuttamiseksi lisätään fosfaatti-ioneja suolojen, esim. (NH^^HPO^rn tai ^HPO^sn muodossa konsentraation ollessa 0,05-1 g/1, edullisesti 0,1-0,5 g/1. Normaalisti sokerinvalmistuksen sivutuotteet sisältävät mehupuhdistuksen jälkeen vielä jäännöskalsiumoksidia 40-150 mg/100 g kuiva-ainetta.

3-

Lisättäessä P04 -ioneja tämä jäännöskalsiuxnoksidi saostetaan kai- 4 64641 siumfosfaattina ja siten osa lisätystä fosfaatista kuluu solujen lisääntymiseen.

Siten on edullista poistaa kovuus fermentointiin joutuvasta 3- sokeriliuoksesta emäsioninvaihtimella, jolloin lisättävien PO^ ionien määrää voidaan vähentää.

Ravinneliuos steriloidaan panoksittaan tai jatkuvatoimisesti. pH:ta ei tarvitse säätää, koska käytetyn sokeriliuoksen pH-arvo on 7,5-8,5.

Fermentoriin siirrostetaan 0,1-10 % ymppiainetta, jota on viljelty samassa ravinneliuoksessa erlenmeyerkolveissa ravistelu-koneessa ja inkuboidaan lämpötilassa 18-32°C, edullisesti 30°C, ilmastussuhteessa 0,2-1,0, edullisesti 0,4 tilavuusosaa ilmaa/tila-vuusosa ravinneliuosta x minuutti riittävästi sekoittaen.

9

Kun on saavutettu riittävä bakteerisolupitoisuus, esim. 10 bakteeria/ml, fermentointi suoritetaan jatkuvatoimisesti, so. aikayksikköä kohti poistetaan viljelyliuosta ja lisätään sama määrä uutta, steriiliä ja ymppäämätöntä ravinneliuosta varastotankista. Laimennusnopeuden ollessa keksinnön mukaisesti 0,05-0,3, edullisesti 0,2 tuntia kohti, bakteerit eivät huuhtoudu pois. Bakteerit kasvavat "steady state"-tilassa niin nopeasti, että sakkaroosi muuttuu 90-100-%:isesti isomaltuloosiksi. Yleensä pH-arvon stabiloiminen reaktion aikana ei ole tarpeen.

Laimennusnopeutta ja siten viljelyliuoksen poistumista jatkuvatoimisesta fermentoinnista säädetään mm. steriloitavilla happielektrodeilla määrittämällä viljelyliuoksen hapen osapaine tai poistoilman CC^-pitoisuuden tai muiden fysiologisten muuttujien avulla. Jatkuvatoimisen fermentoinnin säädön lisämahdollisuutena on tarkkailla sakkaroosin muuttumista isomaltuloosiksi määrittämällä fermentointiliuoksen pelkistyskykv. (Tunnetusti isomaltuloosin pelkistyskyky on 52 % glukoosin arvosta, ja sakkaroosilla ei ole lainkaan pelkistäviä ominaisuuksia). Sakkaroosin muuttumista isomaltuloosiksi voidaan tarkkailla myös osoittamalla isomaltuloosi kvantitatiivisesti sakkaroosin ohella korkeapainenestekromatografi-sesti.

Tämän jälkeen fermentorista poistetusta ravinneliuoksesta eristetään mikro-organismit esim. linkoamalla ja käsitellään edelleen. Linkoamalla eristetty bakteerimassa lietetään toisen kerran veteen ja lingotaan. Sitä voidaan käyttää mm. karjanrehuna.

5 64641

Mikäli fermentorista poistetun viljelyliuoksen on annettu reagoida vain esim. 90 %:sesti, suoritetaan mikro-organismeilla täydellinen reaktio lisäämättä enää happea linkoon johtavaan johtosystee-miin.

Esillä olevan keksinnön olennaiset edut käyvät ilmi tarkasteltaessa tarvittavan raaka-aineen määrän perusteella laskettuja saantoja sekä tilavuus/aika-saantoja: DE-patenttijulkaisun 2 217 628 palstalta 5, riveiltä 12 ja 42 käy ilmi, että 4 kg:sta sakkaroosia saadaan 1,8 kg isomaltuloosia. Tämä vastaa 45,0 %:n saantoa laskettuna syötetyn sakkaroosimäärän mukaan.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä 4 kg:sta sakkaroosia saadaan 2,6 kg isomaltuloosia. Tämä vastaa 65,0 %:n saantoa syötetyn sakkaroosimäärän perusteella laskettuna, eli saanto on huomattavasti korkeampi kuin edellisessä menetelmässä.

DE-patenttijulkaisun 2 217 628 menetelmän mukaan valmistettaessa 1,8 kg isomaltuloosia tähän tarvittava aika on 12 tuntia (palsta 5, rivit 11-42) . Fermentoitavan sokeriliuoksen määrä on 20 kg, mikä konsentraation ollessa 20 paino-% vastaa 18,47 litran tilavuutta (tiheys 1,083). Tällöin saadaan tilavuus/aika-saannoksi 8,1 g x 1 ^ x h"1.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti fermentoidaan esimerkiksi 200 1 sakkaroosiliuosta, jossa kuiva-ainepitoisuus on 25 paino-% ja puhtausaste 96 %. Fermentorista poistetaan jatkuvasti 40 litraa tuotetta tunnissa, ja samanaikaisesti fermentoriin syötetään sama määrä tuoretta sakkaroosiliuosta (laimennusnopeus 0,2 h ^). Tämä merkitsee, että tunnissa käsitellään 40 litraa sakkaroosiliuosta. Mainitulla konsentraatiolla ja puhtausasteella syötettävän sakkaroosin määräksi saadaan 10,6 kg x h Tämä vastaa 6,8 kg kiteytettyä isomaltuloosia, jonka puhtausaste on 99,9 %, tunnissa. Tällöin tilavuus/aika-saannok- -1 -1 si tulee 34 g x 1 x h . Tämä on noin 4 kertaa suuremoi kuin kysei- 6 64641 sen De-patenttijulkaisun mukaisella menetelmällä saatu tilavuus/aika-saanto.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetun isomaltuloosin puhtausaste on juuri sama kuin DE-patenttijulkaisun 2 217 628 mukaisesti valmistetun tuotteen.

Esimerkki 1 a) Protaminobacter rubrum Z 12-kannan (CBS 574 77) ympistä lie-tettiin soluja 10 ml:11a steriiliä liuosta, jossa oli 1 osa paksume-hua (65 % kuiva-ainetta, josta 92-98 % oli sakkaroosia ja loput muita sokerijuurikkaasta peräisin olevia sokereita tai epäpuhtauksia) ja 2 osaa vesijohtovettä sekä 0,5 g/1 (NH^)2^Ρ04;ää (tarvittaessa säädetty kloorivetyhapolla pH-arvoon 7,2). Tämä suspensio toimii ymppi-aineena ravistelu-esiviljelmälle 1 litran kolveissa, joissa oli 200 ml yllä mainitun koostumuksen omaavaa ravinneliuosta (steriloitu 20 minuuttia 121°C:ssa). Kolmikymmentuntisen inkubointiajan jälkeen 29°C:ssa siirrettiin 20 kolvin sisältö (4 1) 16 litraan yllä olevan koostumuksen omaavaa ravinneliuosta 30 litran pienoisfermentorissa ja fermentoitiin 18°C:ssa ilmamäärällä 20 1/min ja sekoittaen 350 kierr./min. Sakkaroosin muuttumista isomaltuloosiksi seurattiin määrittämällä kvantitatiivisesti pelkistyminen ravinneliuoksessa Mtille-rin liuoksen avulla (Zeitschrift Wirt. Zuckerind. Techn. T.f 86, s. 130 ja s. 322 (1936) ja Zeitschrift Wirt. Zuckerind. Techn. T., 88, s. 280 (1938)). Bakteerimäärä määritettiin mikrobiologisesti. Kun oli 9 saavutettu 1 x 10 bakteeria/ml, sakkaroosi oli muuttunut 100 %:ises-ti isomaltuloosiksi laimennusnopeudella 0,09/h.

b) Valmistettiin esimerkin a) mukaan Protaminobacter rubrum-kannan ymppi ja esiviljelmä 30 litran mittakaavaan saakka kulloinkin lämpötilassa 29°C. Kaksikymmentä litraa kasvuvaiheessa olevaa ravinneliuosta siirrettiin pienoisfermentorista 300 litran fermentoriin, jossa oli 180 litraa ravinneliuosta (paksumehusakkaroosi-vesiseos, kuiva-ainepitoisuus 25 % ja puhtaus 96 % kuiva-painosta laskettuna). Fermentorin ilmastussuhde oli 200 1 ilmaa/min., lämpötila 29°C ja 7 64641 sekoitusnopeus 200 kierr./min. Seitsemäntuntisen kasvuvaiheen jälkeen sakkaroosi oli muuttunut 100 % risesti isomaltuloosiksi laimennus-nopeudella 0,09/h.

c) Protaminobacter rubrum Z 12-kannan (CBS 574 77) ympistä uutettiin soluja 10 ml:11a steriiliä liuosta, joka sisälsi yhden osan paksumehua (65 % kuiva-ainetta) ja kaksi osaa vesijohtovettä sekä 0,5 g/1 (NH^^HPO^ (tarvittaessa liuoksen pH säädettiin arvoon 7,2). Tämä suspensio siirrettiin ympiksi ravistelu-esivil-jelmään 1 l:n viljelypulloihin, joissa oli 200 ml edellä mainitun koostumuksen omaavaa ravinneliuosta (sterilisoitu 20 minuutin ajan 121°C:ssa). Viljelmiä inkuboitiin 30 tuntia 29°C:ssa, minkä jälkeen kunkin 20 keittopullon (41) sisältö siirrettiin 16 litraan edellä mainitun koostumuksen omaavaa ravinneliuosta 30 litran pienoisfer-mentorissa ja fermentoitiin 29°C:ssa ilmamäärällä 20 1/min ja sekoittaen 350 kierr./min.

Viisitoistatuntisen kasvuvaiheen jälkeen laimennusnopeuden ollessa 0,2/h sakkaroosi oli muuttunut 100-%risesti isomaltuloosiksi.

d) Valmistettiin esimerkin a) mukaan Protaminobacter rubrum-kannan ymppi ja esiviljelmä ravisteluviljelmäksi. Siirrettiin esimerkin b) mukaan 0,2 1 ymppiä (0,1 %) fermentoriin. Fermentoimis-olosuhteet olivat kuten esimerkissä b). Kaksikymmentäkolmetuntisen kasvuvaiheen jälkeen sakkaroosi oli muuttunut 90-%risesti isomaltuloosiksi laimennusnopeudeila 0,25/h. Kun poistettu ravinneliuos tämän jälkeen siirrettiin linkoon, reaktio jatkui ilman lisäilmas-tusta, ja siten bakteereista erotetuissa ravinneliuoksissa ei enää voitu osoittaa sakkaroosia korkeapainenestekromatografisesti.

e) 3000 litran fermentoriin, joka sisälsi 1800 1 ravinne-liuosta (paksumehusakkaroosi-vesiseos, 25 % kuiva-ainetta, puhtaus 98 %), lisättiin 200 1 ymppiä, joka oli saatu esimerkin 2 c mukaisesti suoritetusta fermentoinnista 20 litraa viljelypullossa, ja suoritettiin fermentointi. Kun tämä fermentointi on loppuunsuoritettu (noin 20 tunnin kuluttua), ravinneliuosta voidaan käyttää ymppinä seuraavaan fermentointiin (3000 1). Fermentointilämpötila oli 30°C. Ilmastussuhde oli 0,4 tilavuusosaa ilmaa/tilavuusosa ravinneliuosta x minuutti ja sekoitusnopeus 140 kierr./min. Fermentointia seurattiin poistoillaan CC^-pitoisuuden avulla. Kun oli saavutettu poisto-ilman CC^-pitoisuus 2,6 %, käytettiin laimennusnopeutta 0,13/h, jolloin , vj ' 64641 8 poistuvassa viljelyliuoksessa ei voitu osoittaa sakkaroosia, vaan ainoastaan isomaltuloosia.

Esimerkki 2 a) Serratia plymuthica-kannan (ATCC 15 928) ympistä luetettiin solut 10 ml:11a paksumehuliuosta (kuiva-ainepitoisuus 25 %, puhtaus 96 %, lisätty 0,5 g/1 (NH^)2ΗΡ04:ää). Tämä suspensio toimi ymppinä ravisteluesiviljelmälle 1 litran kolvissa, jossa oli 200 ml vastaavan koostumuksen omaavaa steriiliä ravinneliuosta. Kolme-kymmentätuntisen inkubointiajan kuluttua 29°C:ssa siirrettiin 20 kolvin sisältö (4 1) 16 litraan ylläolevan koostumuksen omaavaa ravinneliuosta 30 1 pienoisfermentorissa ja fermentoitiin 29°C:ssa ilmamäärällä 20 1/min ja sekoitusnopeudella 350 kierr./min. Mainituissa olosuhteissa Serratia plymuthica-kanta lisääntyy. Kun

Q

oli saavutettu bakteerimäärä 4 x 10 bakteeria/ml, sakkaroosi oli muuttunut 100-%:isesti isomaltuloosiksi laimennusnopeudella 0,14/h.

b) Valmistettiin esimerkin 2a) mukaan Serratia plymuthica-kannan ymppi ja esiviljelmä ravinneliuoksen puhtauden ollessa 98 %. Samoissa fermentointiolosuhteissa kuin esimerkissä 2a) sakkaroosi muuttui 100-%risesti isomaltuloosiksi laimennusnopeudella 0,09/h.