DK148750B - Fremgangsmaade til kontinuerlig fremstilling af isomaltulose - Google Patents

Description

o i 148750

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af isomaltulose (palatinose, a-D-glucopyrano-sido-1,6-fructose) ved omdannelse af saccharose i saccha-roseholdige plantesafter ved hjælp af en isomaltulose-dan-5 nende mikroorganisme og efter omdannelsen af saccharosen oparbejdning af den opnåede isomaltuloseholdige opløsning.

Isomaltulose er et mellemprodukt til fremstilling af glucopyranosido-l,6-mannitol (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.520.173) og glucopyranosido-1,6-sorbitol (isomaltit, 10 tysk patentskrift nr. 2.217.628). Begge stoffer kan anvendes som sukkererstatningsstoffer.

Ifølge det tyske patentskrift nr. 1.049.800 er det kendt, at saccharose enzymatisk omdannes til isomaltulose.

De hertil anvendte enzymer er af mikrobiel oprindelse. Ud 15 over Protaminobacter rubrum er yderligere bakterier såsom Erwinia carotovora, Serratia marcescens, Serratia plymuthi-ca og Leuconostoc mesentheroides egnede til denne omlejring (S. Schmidt-Berg-Lorenz, W. Mauch, Zeitschrift fur die Zuc-kerindustrie, 14, 625-627 (1964), F.H. Stodola, 126 th Meet-20 ing Amer. Chem. Soc., Sept. 1954, Abstracts of Papers, side 5D, W. Mauch, S. Schmidt-Berg-Lorenz, Zeitschrift f.d. Zuckerindustrie, L4, 309-315 og 375-383 (1964)).

Endvidere er det ifølge det tyske patentskrift nr.

2.217.628 kendt, at den enzymatiske omdannelse af saccha-25 rose til isomaltulose kan gennemføres chargevis eller kontinuerligt med en 15-40%'s opløsning under kraftig omrøring og aerobe betingelser ved 20-37°C. Efter afslutning af den enzymatiske reaktion fraskiller man ifølge det ovennævnte patentskrift bakteriesuspensionen over en separator og gen-30 anvender den op til seks gange. Ved den kontinuerlige omdannelse af saccharosen dyrkes bakterierne ifølge samme patentskrift på en særlig næringsopløsning og borttages kontinuerligt. Omdannelsen foregår derefter i et andet kedelka-skadesystem, i hvilket bakteriekulturen og tyksaft fra suk-35 kerfabrikationen eller en anden sukkerholdig opløsning holdes.

148750 o 2

Den særskilte dyrkning af mikroorganismerne og den særskilte enzymatiske omdannelse af saccharosen er imidlertid utilfredsstillende af forskellige årsager: a) Mikroorganismerne dyrkes i deres eget medium, hvil-5 ket medfører høje omkostninger.

b) Kulturopløsningen og også fermenteringsbeholderen skal steriliseres og holdes steril uafhængigt af reaktor-kedelsystemet, hvori den enzymatiske omdannelse finder sted.

10 c) Dyrkningen af mikroorganismerne i en næringsopløs ning, der er forskellig fra den senere anvendte omdannelsesopløsning, frembyder den risiko, at mikroorganismerne under fermenteringen selektioneres efter andre kriterier end kriteriet for den maksimale omsætningsrate.

15 d) Fraskillelsen af mikroorganismerne og genanvendel sen til yderligere enzymatiske omdannelser er i teknisk målestok forbundet med en høj infektionsrisiko.

Det har nu vist sig, at dyrkningen af isomaltulose--dannende mikroorganismer under samtidig omdannelse af saccha-20 rose til isomaltulose kan gennemføres kontinuerligt under visse betingelser.

Som isomaltulose-dannende mikroorganismer kan der først og fremmest anvendes Protaminobacter rubrum, men også Serra-tia plymuthica, Serratia marcescens, Erwinia carotovora og 25 Leuconostoc mesentheroides.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kontinuerlig fremstilling af isomaltulose er af dén allerede angivne art og er ejendommelig ved, at man poder mikroorganismen i den saccharoseholdige plantesaft tilsat phosphationer i en kon-30 centration på 0,05 til 1 gram pr. liter, dyrker mikroorganismen indtil en tilstrækkelig celletæthed er opnået og fortsætter dyrkningen kontinuerligt ved tilsætning af den saccharoseholdige plantesaft og udtagning af lige store andele af kulturopløsningen med en fortyndingshastighed på 0,05-35 -0,3 timer o 148750 3

Ifølge opfindelsen er det i praksis særligt hensigtsmæssigt, at man som mikroorganisme anvender Protaminobacter rubrum Z 12 (CBS 574.77).

Det var overraskende og ikke at vente, at isomaltu-5 lose-dannende mikroorganismer, f.eks. Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), i saccharoseholdige plantesafter, der f.eks. fremkommer som mellemprodukt ved rør- og roesukkerfremstillingen og dermed er billigere end ren saccharoseop-løsning, under væksten samtidig omdanner saccharose til iso-10 maltulose. Herved er ifølge opfindelsen organismernes vaskst således sammenkoblet med omsætningsraten, at den samlede proces, dvs. vækst og omdannelse, kan styres kun via en kritisk parameter, f.eks. CC^-indholdet i afgangsluften, oxygenpartialtrykket i kulturopløsningen eller også via omsæt-15 ningsraten.

En yderligere fordel ved fremgangsmåden er følgende: under omlejringen til isomaltulose dannes der ringe mængder fructose og glucose, som tjener som carbonhydrater for mikroorganismerne til disses stofskifte. Der skal ved frem-20 gangsmåden ikke tilsættes nogen yderligere carbonhydratkil-der til væksten. Samtidig opnås der en vidtgående nedbrydning af disse uønskede biprodukter.

Ved den kontinuerlige isomaltulose-fermentation anvendes der som udgangsopløsning tyndsaft-tyksaft- og/eller 25 tyndsaft-klarevæske-blandinger fra en sukkerfabrik med et tørstofindhold på 5-30%, fortrinsvis på 20-27%. Saccharose-indholder, beregnet på den tørre vægt, andrager 90-98%, fortrinsvis 94-96%.

Til opnåelse af en optimal vækst af bakteriekulturen 30 tilsættes der phosphationer i form af salte såsom (NH^)2HP04 eller K2HP04 i koncentrationer på 0,05 til 1 g pr. liter, fortrinsvis 0,1-0,5 g pr. liter. Normalt indeholder mellemprodukterne fra sukkerfabrikationen efter saftrensningen endnu et rest-CaO-indhold på 40-150 mg for hver 100 g tør-35 stof. Ved tilsætningen af P04 fældes dette rest-CaO-ind- o 4 1 <68750 hold i form af calciumphosphat, og derved går en del af det tilsatte phosphat til celleformeringen tabt.

Den sukkeropløsning, der anvendes til fermenteringen, afhærdes således med fordel over en baseudbytter, hvorved 5 tilsætningen af PO^ -ioner kan nedsættes.

Næringsopløsningen steriliseres batchvis eller kontinuerligt. En pH-korrektion er ikke nødvendig, når pH-værdien for den anvendte sukkeropløsning ligger mellem 7,5 og 8,5.

Fermenteringsbeholderen podes med 0,1-10% podemateria-10 le, fremstillet i den samme næringsopløsning med Erlenmeyer-kolber på en rystemaskine, og der dyrkes under tilstrækkelig omrøring ved en temperatur på 18-32°C, fortrinsvis ved 30°C, med en beluftningshastighed på 0,2-1,0 volumen luft pr. volumen nærings opløsning pr. minut (wm) , fortrinsvis 0,4 wm.

15 Efter opnåelse af en tilstrækkelig celletæthed, f.eks.

9 10 kim pr. ml, gennemføres fermenteringen kontinuerligt, dvs. at der pr. tidsenhed udtages lige store andele fra kulturopløsningen og tilsættes frisk, steril, ikke-podet næringsopløsning fra en forrådstank. Ved fortyndingsraten, der ligger 20 mellem 0,05 og 0,3 timer fortrinsvis 0,2 timer kommer det ikke til en udvaskning af bakterierne. Bakterierne vokser i "steady state" så hurtigt, at der opnås en 90-100%'s omdannelse til isomaltulose. En stabilisering af pH-værdien under omdannelsen er i reglen ikke påkrævet.

25 Fortyndingsraten og dermed afstrømningen af kulturop løsningen fra den kontinuerlige fermentering styres blandt andet med steriliserbare oxygenelektroder via oxygenpartialtrykket i kulturopløsningen eller via CC^-indholdet i afgangsluften eller via yderligere fysiologiske parametre. En anden 30 mulighed for styring af den kontinuerlige fermentering er regulering af omsætningsraten fra saccharose til isomaltulose gennem bestemmelse af fermentationsopløsningens reduktionsevne (som bekendt er reduktionsevnen for isomaltulose 52% af glucosens reduktionsevne, medens saccharose ikke har nogen 35 reducerende egenskaber). En yderligere mulighed for regulering 5

1487 δ O

Ο af omsætningsraten er den kvantitative bestemmelse af iso-maltulose ved siden af saccharose ved hjælp af højtryksvæ-skechromatografi.

Den fra fermenteringsbeholderen fjernede næringsop-5 løsning skilles derpå fra mikroorganismerne, f.eks. ved hjælp af en separator, og oparbejdes videre. Den fracentrifugerede bakteriemasse opskylles yderligere en gang med vand, centrifugeres og kan blandt andet anvendes som kvægfoder.

Såfremt den fra fermenteringsbeholderen udtagne kul-10 turopløsning kun er omsat for f.eks. 90%'s vedkommende, gennemføres den fuldstændige omsætning ved hjælp af mikroorganismerne- uden fornyet tilførsel af oxygen i ledningssystemet frem til separatoren.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i 15 de følgende udførelseseksempler.

Eksempel 1 a) Fra et podemateriale på basis af stammen Protamino-bacter rubrum Z 12 (CBS 574.77) opslæmmes celler sammen med 20 10 ml af en steril blanding af 1 del tyksaft (tørstof = 65%) og 2 dele ledningsvand plus 0,5 g (NHj^HPO^ pr. liter, om nødvendigt indstillet på en pH-værdi på 7,2 ved hjælp af HC1. Den fremkomne suspension tjener som podemateriale til en rystemaskine-forkultur i 1 liter-kolber med 200 ml næ-. 25 ringsopløsning af den ovenfor angivne sammensætning (sterilisering i 20 minutter ved 121°C). Efter 30 timers dyrkningstid ved 29°C podes der med 20 kolber (4 liter) 16 liter næringsopløsning af ovennævnte sammensætning i en lille 30 liters fermenteringsbeholder og fermenteres ved 18°C med 20 li-30 ter luft pr. minut og en omrøringshastighed på 350 o/min.

Omdannelsen af saccharosen til isomaltulose følges ved kvantitativ bestemmelse af næringsopløsningens reduktionsevne under anvendelse af Muller's opløsning (Zeitschrift Wirt.

Zuckerind. Techn. T., 86, 130 og 322 (1936) og Zeitschrift 35 Wirt. Zuckerind. Techn. T., 88, 280 (1938)). Kimtallet be- o 6 148760 Λ stemmes mikrobiologisk. Efter opnåelse af 1 · 10 kim pr. ml opnås der med en fortyndingsrate på timebasis på 0,09 h ^ en 10%%'s omsætning.

b) Podemateriale og forkultur fra stammen Protamino-5 bacter rubrum fremstilles svarende til eksempel a) op til 30 liters målestok, dog hver gang ved temperaturer på 29°C.

20 liter dyrket næringsopløsning fra den lille fermenteringsbeholder tjener som podemateriale for en 300 liters fermenteringsbeholder med 180 liter næringsopløsning (tyk-10 saft-saccharose-vand-blanding med 25% tørstofindhold og en renhed på 96%, beregnet på tørstof). Fermenteringsbeholderen arbejder med en beluftningsrate på 200 liter luft pr. minut, en temperatur på 29°C og en omrøringshastighed på 200 o/min.

15 Efter en dyrkningsfase på 7 timer opnås der ved en fortyndingsrate på 0,09 h-^ en 100%'s omsætningsrate.

c) Podemateriale og forkultur fra stammen Protamino-bacter rubrum fremstilles svarende til eksempel a) frem til rystekulturen. En fermenteringsbeholder svarende til b) po- 20 des med 2 liter podemateriale fra rystemaskinen ( = 1%), idet fermenteringsbetingelseme svarer til eksempel b) . Efter en dyrkningsfase på 15 timer opnås der med en fortyndingsrate på 0,2 h ^ en 100%'s omsætningsrate.

d) Podemateriale og forkultur fra stammen Protamino- 25 bacter rubrum fremstilles svarende til eksempel a) frem til - rystekulturen. En fermenteringsbeholder podes svarende til eksempel b) med 0,2 liter podemateriale (0,1%). Der anvendes fermenteringsbetingelser svarende til eksempel b). Efter en dyrkningsperiode på 23 timer opnås der med en fortyndings-30 rate på 0,25 h ^ en 90%'s omsætning. Ved den påfølgende transport af den udtagne næringsopløsning til separatoren fortsætter omsætningen uden yderligere beluftning, således at der i de fra bakterierne fraskilte næringsopløsninger ikke længere kan påvises saccharose ved hjælp af væskehøj-35 trykschromatografi.

148750 0 7 e) En 3000 liters fermenteringsbeholder bringes til at arbejde med 1800 liter næringsopløsning (tyksaft-saccha-rose-vand-blanding’, 25% tørstofindhold, renhed 98%) og 200 liter podemateriale fra en yderligere 2000 liters fer-5 mentering. Temperaturen andrager 30°C. Beluftningsraten er 0,4 vvm, og omrøringshastigheden er 140 o/min. Fermenteringen følges via CO2-indholdet i afgangsluften. Efter opnåelse af 2,6% CO- i afgangsluften arbejdes der med en fortyn- £ ^ -1 dingsrate på 0,13 h , hvorved der i den bortstrømmende kul- 10 turopløsning ikke kan påvises nogen saccharose, men derimod kun isomaltulose.

Eksempel 2 a) Fra et podemateriale på basis af stammen Serratia 15 plymutica (ATCC 15.928) opslæmmes celler sammen med 10 ml af en tyksaftopløsning (25% tørstofindhold, 96%'s renhed, tilsætning af 0,5 g (NH4)2HP04 pr. liter). Den fremkomne suspension tjener som podemateriale til en rystemaskine--forkultur i en 1 liter-kolbe med 200 ml steril næringsop-20 løsning af tilsvarende sammensætning. Efter 30 timers dyrkningstid ved 29°C podes der med 20 kolber (4 liter) 16 liter næringsopløsning af ovennævnte sammensætning til en lille 30 liters fermenteringsbeholder og fermenteres ved 29°C med 20 liter luft pr. minut og en omrøringshastighed på 25 350 o/min. Efter opnåelse af et bestemt kimtal, f.eks.

4 · 10 kim pr. ml, opnås der med en fortyndingsrate på timebasis på 0,14 h-^ en 100%'s omsætning.

b) Der fremstilles podemateriale og forkultur fra stammen Serratia plymuthica svarende til eksempel 2 a), men 30 med en næringsopløsning med 98%'s renhed. Under de samme fermenteringsbetingelser som anført under 2 a) opnås der med en fortyndingsrate på timebasis på 0,09 h en 100%'s omsætning.

35