DE2713858A1 - Vorrichtung und verfahren zur reaktion mit immobilisierten enzymen - Google Patents

Description

PATENTANVvALTK

Penick & Ford, Ltd. P.O.BOX 428 Cedar Eapdis Iowa 52406 U.S.A.

A. GTiUNECKER

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H. KINKELDEY

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W. STOCKMAIR

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K. SCHUMANN

DR REH NAT ■ OM.-FWVS

P. H. JAKOB

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G. BEZOLD

DR HER NAT OPl-OCM.

8 MÜNCHEN 22

MAXIMIUANSTRASSe 43

29. März 1977 P 11 415-64/ku

Vorrichtung und Verfahren zur Reaktion
mit immobilisierten Enzymen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Reaktion mit immobilisierten Enzymen.

Die Eigenschaften von ionenausgetauschten Cellulosen werden für chromatographische Trennungen und zur Immobilisierung von Enzymen untersucht, vergl. z.B. Guthrie et al., Ind. & Eng. Chem., £2, 915-916 (November 1960), Barker et al., Carbohyd. fies., ίϊ, 491-497 (1968) und Wilson et al., Biotech. & Bioeng., XI ₁ 549-361. Natürliche Cellulosen, die zur Einarbeitung kationischer Gruppen, wie z.B. tertiärer Amin- oder quaternärer Ammoniumgruppen modifiziert wurden, sind im Handel in mikrokörnigen und fasrigen Formen erhältlich. Die di- und triäthylaminoäthylierten Cellulosen werden mit DEAE-Cellulose bzw.

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TEAE-Cellulose bezeichnet, während das kationische Cellulosederivat, das durch Reaktion mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin hergestellt wurde, unter der Bezeichnung ACTAEOLA-Cellulose bekannt ist. Kationische Cellulosen für Handelszwecke haben unter anderem die folgenden Firmen hergestellt: Brown Company, New York, New York; ¥. & R. Baiston, Ltd., Kent, England und Servi Co., Heidelberg.

Soweit bekannt ist, fand die einzige kommerzielle Anwendung von auf Ionenaustausch-Cellulose immobilisierten Enzymen in Zusammenhang mit der Teilkonvertierung von aus Stärke gewonnener Glukose in Fruktose statt, wobei ein Sirup mit erhöhter Süssigkeit erhalten wurde. Zu diesem Zweck wird Glukoseisomerase an die LEAE-Cellulose (oder ähnliche kationische Cellulose) gebunden und der Glukosesirup durch eine Serie sehr dünner Betten der isomerasehaltigen Cellulose geleitet, vergl. Schnyder, B.J., "Continuous Isomerization of Glucose to Fructose on a Commercial Basis", Die Stärke, 26, 409-412 (1974) und Thompson et al., US-PS 3 788 945, erteilt am 29. Januar 197^. Diese Technologie, die kommerziell von Standard Brands Incorporated und A.E. Staley & Company angewandt wird, verwendet 2,54 - 12,7 cm dicke Kontaktbetten. Dies ist notwendig, damit der Druckabfall über jedes einzelne Bett gering ist und die Verdichtung des Betts so gering wie möglich bleibt. Wegen der geringen Dicke der Betten ist es von entscheidender Bedeutung, eine Serie solcher Betten vorzusehen, um die Effekte der Kanalbildung im Substrat zu vermeiden. Deshalb können feste Bett säulen, wie sie für Verfahren unter Anwendung von Ionenaustauschharzen verwendet werden, nicht angewandt werden. Dagegen werden Druckblattfilter verwendet. Die an die Cellulose gebundene Glucoseisomerase wird als wässrige 'Aufschlämmung so durch das Druckblattfilter ge-

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Al

pumpt, daß jedes Blatt gleichmäßig mit einer dünnen Schicht des Cellulosematerials bedeckt wird. Wie in der US-PS 5 788 94-5 offenbart, ist das Verhältnis von Tiefe zu Breite der Betten vorzugsweise auf 0,02 bis 0,05 begrenzt.

Wegen der Kosten und Unbequemlichkeit bei der Durchführung der Glucoseisomerisierung in Druckblattfiltern suchte die Vais sirupindustrie aktiv nach Alt ernat i werf ahr en, in denen die Glucoseisomerase auf einem Material immobilisiert werden kann, das in Festbettsäulen kommerzieller Größe brauchbar ist. Ein solches Säulenmaterial muß das Enzym wirksam fixieren, chemisch und physikalisch stabil sein, unter Gebrauchsbedingungen der Auflösung widerstehen und genügend porös sein, wobei Kanaleffekte so gering wie möglich gehalten werden, so daß ein angemessener und gleichmäßiger Kontakt ohne übermäßigen Druckabfall über das Bett erfolgt. Einige Mikroorganismen, die Isomerase erzeugen, enthalten dieses Enzym in der Zelle, und das Enzym ist darin gebunden oder kann durch Wärmebehandlung darin gebunden werden. Z.B. kann ein Säulenmaterial für Arthrobacter-Zellen hergestellt werden. Ein solches Verfahren wird in der US-PS 3 821 086 beschrieben. Solch natürliches Säulenmaterial ist vielversprechend und zeigt Vorteile gegenüber der Verwendung von flachen Betten aus Cellulose-immobilisierter Isomerase. Jedoch besteht ein großes Bedürfnis nach einem Säulenmaterial von allgemeiner Anwendbarkeit, das zur Fixierung löslicher Isomerase wie auch anderer löslicher Enzyme verwendet werden kann, wie z.B. derjenigen, die zur Konvertierung von Starkeoligosacchariden in Dextrose und Maltose verwendet werden. Ein solches Säulenmaterial könnte zur Immobilisierung von Alphaamylase, Glukoamylase oder Gemischen hieraus verwendet werden, um kommerziell Sirups mit einem D.E. von 40 bis 97» die aus Maisstärke stammen, zu erzeugen (D.E. =

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Dexbroseäquivalent).

Insbesondere, um Kapitalinvestitionen möglichst gering zu halten, die Betriebskapazität zu erhöhen und die Produktionskosten zu verringern, besteht ein offenkundiges Bedürfnis nach einem Säulenverfahren zur Erzeugung von Maissirupen mit mittlerem D.E., wie z.B. den Sirupen, die jetzt durch enzymatische Hydrolyse von Maisstärke hergestellt werden, um Sirupe mit einem D.E. im Bereich von etwa 40 bis 70 zu erhalten.

Soweit bekannt, wenden zur Zeit alle kommerziellen Verfahren zur Erzeugung dieses Sirputyps eine chargenweise Enzymbehandlung zum Schluß an, bei der die löslichen Enzyme in dem Sirup gelöst sind. Dies ist eine Einmal-Verwendung der Enzyme, üblicherweise wird bei der Schlußbehandlung gleichzeitig mit einer Alphaamylase und einer Glukoamylase behandelt. Deshalb besteht ein Bedürfnis nach einem Säulenmaterial, an das ein Gemisch dieser Enzyme chemisch gebunden und darauf immobilisiert werden kann. Ein solches Säulenmaterial und eine entsprechende Säule finden auch zahlreiche andere Anwendungen und könnten allgemein in den Fällen verwendet werden, in denen jetzt chargenweise Enzytnbehandlungen von Substraten mit löslichen Enzymen angewandt werden.

Gegenstand der Erfindung ist eine Säule für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen, die eine Durchfluß-Reaktionskammer zwischen dem Flüssigkeitseinlaß und dem Flüssigkeitauslaß aufweist, wobei sich die Reaktionskammer einige 30 cm in Richtung auf den Strom der Flüssigkeit erstreckt und die gekennzeichnet ist durch:

ein Bett aus Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose in

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Ak

der Reaktionskaznmer,durch, das die Flüssigkeit hindurchläuft, wobei die regenerierte Cellulose dieses Materials unter Einarbeitung einer wirksamen Menge an Enzym-immobilisierenden Gruppen chemisch modifiziert wurde, und das Bett aus Schwaram-Material dadurch gekennzeichnet ist, daß es

a) eine Länge in Stromungsrichtung von wenigstens 61 cm,

b) eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als

6 g des Schwamm-Materials (Trockenbasis) pro 18 cm Bettvolumen und

c) eine solche Wasserströmungsporosität aufweist, daß mehr als 0,204 1/min/dm Bettquerschnitt hindurchfließen, ohne daß ein wesentlicher Druckabfall der Flüssigkeit aufgrund des Strömungswiderstandes des Schwammbettes erfolgt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein "Verfahren zur Reaktion einer wasserlöslichen, Enzym-umwandelbaren Substanz mit einem Enzym, das nicht Cellulase ist, bei dem eine wässrige Lösung der Substanz durch ein poröses Bett aus Material, das darin wenigstens ein Enzym für die Reaktion immobilisiert enthält, hindurchgeleitet wird, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Bett ein Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, das chemisch unter Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzym-immobilisierenden Gruppen modifiziert wurde, wobei das Bett aus Schwamm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 61 cm und eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro 18 cm^ Bettvolumen aufweist, und die wässrige Lösung durch

das Bett mit einer Geschwindigkeit von mehr als 0,204 1/min/dm

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des Bett quer schnitt s Mndurchleitet.

Die neue Säulenapparatur und das Verfahren für Eeaktionen mit immobilisierten Enzymen gemäß der Erfindung beruht teilweise auf der Feststellung, daß aus regenerierter Cellulose in Schwammform ein wirksames und relativ billiges Säulenmaterial zum Fixieren von Enzymen hergestellt werden kann. Die physikalischen Eigenschaften des ausgewählten Cellulose-Schwamm-Materials kennzeichnet hauptsächlich die Neuheit des erfindungsgemäßen Säulenapparats und des erfindungsgemäßen Verfahrens. Obwohl bekannt ist, daß regenerierte Cellulosen wesentlich geringere Molekulargewichte und Polymerisationsgrade als native Cellulose aufweisen, wurde festgestellt, daß regenerierte Cellulose in Schwammform durch bekannte chemische Verfahren leicht modifiziert werden kann, um wirksame Mengen an Enzymimmobilisierenden Gruppen einzuarbeiten. Tatsächlich liegt eins der überraschenden Momente der vorliegenden Erfindung darin, daß die gesamte Chemie, die benötigt wird, um die Erfindung auszuführen, seit vielen Jahren wohlbekannt ist und im einzelnen in der chemischen Literatur und in vorveröffentlichen Patenten zur Anwendung auf natürliche Cellulose beschrieben wird. Z.B. kann Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose chemisch nach bekannten Verfahren zur DEAE-, TEAE-, ACTEOLA-Schwammcellulose modifiziert werden, wie an nativer Cellulose kommerziell durchgeführt worden war.

Der Schwamm au§. regenerierter Cellulose kann als Ausgangsmaterial für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden und ist leicht erhältlich, da er von zahlreichen Gesellschaften für den Verkauf als Haushalts- oder industrielle Eeinigungsschwämme hergestellt wird. Ferner können die Reste oder

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der Abfall aus der Herstellung von Cellulose-Reinigungsschwämmen verwendet werden.

Ein Typ eines solchen Abfallmaterials ist als "D-slab" bekannt. Es besteht aus den abgeschnittenen Enden der Celluloseschwamm-Tafein, wie sie vor dem Schneiden zu Schwammblöcken gebildet werden. Bis jetzt hatte dieses abgeschnittene Material relativ geringen Handelswert, obwohl es dafür eine gewisse Verwendung gab, wie z.B. als Füllung für billige Kissen und ähnliche Polsterungen. Es ist deshalb überraschend, daß D-slab-Schwammabfälle für Kolonnen mit immobilisierten Enzymen verwendet werden kann.

Die Herstellung und Eigenschaften des Cellulose-Schwamm-Materials, das in der erfindungsgemäßen Säulenvorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reaktion mit immobilisierten Enzymen verwendet werden kann, wird im folgenden im einzelnen beschrieben. Es sollen jedoch einige wichtige Gesichtspunkte hier aufgezeigt werden. Durch Auswahl und Verarbeitung des Cellulose-Schwamm-Materials, so daß es unter Gebrauchsbedingungen eine unter einem bestimmten Maximum und vorzugsweise innerhalb eines angegebenen Bereichs liegende Dichte aufweist, kann das Schwamm-Material in tiefen Betten derart, wie sie üblicherweise für Festbett-Säulen verwendet werden, angewandt werden. Ferner können hohe Durchflußraten ohne wesentlichen Druckabfall über die Betten angewandt werden. Deshalb muß man zustimmen, daß der so erhaltene Säulenapparat und das Verfahren zur Reaktion mit immobilisierten Enzymen einen großen Fortschritt gegenüber dem Stand der. Technik mit Enzym-iinmobilisierendem Cellulose-Dünnbett-Material darstellt.

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Soweit bekannt, ist es im breiten Sinne neu, Celluloseschwämiae in einer Säulenvorrichtung oder einem Verfahren zur Reaktion mit; immobilisierten Enzymen zu verwenden- Hinsichtlich eines Säulemnaterials in Schwammform beschreibt eine jüngere US-PS (3 919 048) die Verwendung von gemahlenem Naturschwamm zur Immobilisierung von Enzymen und schlägt den Naturschwamm als Säulenfüllung vor. Jedoch unterscheidet sich natürlicher Schwamm sowohl chemisch als auch physikalisch von einem Schwamm aus regenerierter Cellulose. Ein natürlicher Schwamm wird au3 Spongin gebildet, das hauptsächlich aus Protein besteht. In großen Stücken weist er weite öffnungen auf, die Kanäle darin bilden. Nach dem Mahlen ist er so dicht wie gepulverte natürliche Cellulose.

Es wurden auch Versuche mit anderem natürlichem eix^eißhaltigem Material zur Fixierung von Enzymen, nämlich mit Collagenpulver und Collagenschwamm, durchgeführt, vergl. Silraan et al., Biopolyaers, 4, 441 - 448 (1966). Der Zweck war das Studium der Wirkung auf Papain; es wurde nicht vorgeschlagen, Collagenschwamm für Enzymreaktionen vom Festbettsäulen-Typ zu verwenden.

Es ist daher überraschend und unerwartet, daß Cellulose-Schwamm, der als Bestmaterial erhältlich ist, und, soweit wie bekannt ist, bisher in keinem enzymatisehen Verfahren verwendet wurde, als Schlusselelement für eine Säulenvorrichtung und ein Verfahren zur Reaktion mit immobilisierten Enzymen verwendet werden kann.

In den Zeichnungen gibt Fig. 1 eine Festbett-Säule wieder, die erfindungsgemäß ein Bett aus Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, wobei die Vorrichtung in Ver-

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bindung mit einem bevorzugten Verfahren, nämlich der enzymatischen Umwandlung von Sirupen, abgebildet wird.

Fig. 2 ist eine starke Vergrößerung des Bettmaterials, das in der Abbildung aus einem Gemisch von rechteckigen Schwamm- und Schwammabfallstücken besteht.

Celluloseschwamm-Material, das zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist im Handel erhältlich und schließt die Celluloseschwammreste ein, die im Handel als "D-slab"-Abschni tte bekannt sind. Wenn die Celluloseschwamm-Tafeln in den Formkästen geformt werden, ist es nötig, die Enden der Tafeln abzuschneiden, bevor sie zu Schwammblocken zum Verkauf als Reinigungsschwämme geschnitten werden. Jedoch "bestehen Schwankungen in der Dichte des Cellulose-Schwamm-Katerials, wie es im Handel geliefert wird, sowohl in der Form, in der es versandt wird, als auch nach dem Anfeuchten mit Wasser, um die Schwämme auf ihr Maximalvolumen auszudehnen. Manche Schwämme werden auf ein kompakteres Volumen für den Vertrieb zusammengepreßt und können in dieser Form eine Dichte von sogar 1 g (Trockenbasis) Schwamm-Material pro 3 bis 4 cnr aufweisen. Wenn solche Schwämme feucht und vollständig ausgedehnt sind, erhöht sich ihr Volumen auf ein beständiges Volumen von etwa 25 bis 32 cnr pro g. Anderes Celluloseschwamm-Material weist in dem Zustand, in dem es vom Hersteller versendet wird, eine Dichte im Bereich von 13 bis 16 cnr/g auf und dehnt sich nach dem Anfeuchten mit Wasser auf ein maximales stabiles Volumen mit einer Dichte von nur 1 g/25 cnr aus. Wie unten näher diskutiert wird, ist es wichtig, ein Schwamm-Material auszuwählen, das die richtige Dichte unter den Anwendungsbedingungen in der Säule aufweist. Falls nötig, kann Celluloseschwamm-Material mit einer spezifischen Dichte hergestellt werden. Die Porosität

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und damit die Dichte kann durch den relativen Anteil des wasserlöslichen Salzes, das mit der Viskose vor dem Formvorgang vermischt wird, beeinflußt werden.

Das Verfahren zur Herstellung von Celluloseschwämmen geht parallel zur Herstellung von Rayon nach dem Viskoseverfahren, benötigt aber nicht die aufwendigen Endbearbeitungsstufen. Anstatt zu der Spinnmaschine gepumpt zu werden, wird die Viskose mit einem geringeren Anteil eines fasrigen Verstärkungsmaterials, das aus Baumwolle, Hanf, Ramie, Flachs, Jute, Eokos, Stapelfaser, usw. (entweder im natürlichen oder im alkalisch geschwollenen Zustand) besteht, und einem kristallinen, porenbildenden Material, das die Koagulierung der Viskose beim Erwärmen induzieren kann, gewöhnlich einem hydratisieren Salz mit einem niedrigen Schmelzpunkt wie Z.B.Glaubersalz, Na₂SO^ · 10 H^O gemischt. Das fasrige Material liegt im allgemeinen in einer Menge von 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf den Cellulosegehalt, vor.

Bas Gemisch aus Viskose, fasrigem Verstärkungsmaterial und kristallinen porenbildenden Material wird dann geformt und die Cellulose koaguliert und regeneriert. Der fertige Schwamm wird frei von Salzen und anderen Verunreinigungen gewaschen. Nach modernen Verfahren werden gefärbte Pigmente in das Viskose/Faser-Kristallgemisch eingearbeitet und im allgemeinen auch Erweichungsmittel, gewöhnlich mehrwertige Alkohole, und Bleichmittel, wie Wasserstoffperoxid, zu den Regenerierungsbädern zugegesetzt, um die physikalischen Eigenschaften des Schwamms zu verbessern und die Verkäuflichkeit des Produkts zu erhöhen. Natriumsulfat und Kohlendisulfid werden in dem Verfahren gewonnen. Pur die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist der Fasergehalt des regenerierten Celluloseschwamms er-

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wünscht*aber nicht entscheidend. Es wird angenommen, daß die physikalische Stabilität des Celluloseschwamm-MaterMs für die Verwendung in einer Säule, insbesondere, wenn das Material in unterteilter Form, wie bevorzugt, verwendet wird, durch den Gehalt an fasrigem Verstärkungsmaterial verbessert wird. Wasserlösliche Zusätze, wie z.B. Weichmacher, werden durch Waschen des Schwamms mit Wasser vor der Verwendung zum Fixieren des Enzyms entfernt. Das Waschen kann entweder vor Aufgabe des Schwamms in die Säulen oder in den Säulen erfolgen.

Ins einzelne gehende Verfahren zur Herstellung von Celluloseschwämmen werden in der Patentliteratur beschrieben«wie z.B. in den Patenten der E.I. duPont de Nemours & Company,, einem wichtigen kommerziellen Erzeuger von Celluloseschwämmen, vergl. US-PSen 2 133 810 und 3 28-4- 229· Es wurde festgestellt, daß duPont-Celluloseschwamm, wie er kommerziell für Eeinigungsschwämme verkauft wird, oder die D-slab-Äbschnittsenden des duPont-Schwamm-Materials ausgezeichnete Eigenschaften für die Zwecke der vorliegenden Erfindung aufweist. Ein anderes geeignetes Schwamm-Material wird kommerziell von einer Abteilung der General Mills, Tonawanda, New York, unter der Bezeichnung "0-Cel-0"-Celluloseschwamm vertrieben. Für solches Schwamm-Material ist Hanf eine besonders geeignete Verstärkungsfaser und kann in einer Menge von etwa 6 bis 8 Gew.-% Hanf (Trockenbasis), bezogen auf das Gewicht der regenerierten Cellulose, eingearbeitet werden. Wie jedoch oben angedeutet wurde, kann die Menge und Art des Verstärkungsmaterials in weitem Bereich schwanken, obwohl die Einarbeitung einer geringen Menge von fasrigem Verstärkungsmaterial in das Celluloseschwamm-Material erwünscht ist. Vorzugsweise liegt das Verstärkungsiaaterial in dem Bereich von 5 bis 10 Gew.-% (Trockenbasis), bezogen auf

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regenerierte Cellulose, vor, und ist selbst ein Cellulosematerial, so daß seine fasrige Form nicht durch Enzyme außer Cellulasen geschädigt wird.

Das Celluloseschwamm-Material kann in Form von großen Platten, Kissen oder Blöcken verwendet werden, vorzugsweise wird es jedoch in unterteilter Form angewandt, was das Füllen und gleichmäßige Packen der Festbettsäule erleichtert. Z.B. können D-slab-Celluloseschwamm-Reste zu einem Gemisch von Stückchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 0,263 bis 0,525 Siebgrößeneinheiten (Tyler) zerschnitten werden. Gegen zu großes Material ist nichts einzuwenden, d.h. gegen Materialstücke, die größer als 1,050 Siebgrößeneinheiten (Tyler) sind; gewöhnlich ist es jedoch erwünscht, das ultrafeine Material, das beim Zerschneiden entstehen kann, nämlich die Teilchen mit einer Größe von unter 0,185 Siebgrößeneinheiten (Tyler), abzutrennen. Alternativ oder zusätzlich können die Cellulosereste oder andere Celluloseschwamm-Ausgangsmaterialien zu kleinen, im allgemeinen rechteckigen Brocken oder Blöcken mit ungefähren durchschnittlichen Abmessungen von 6,35 x 6,35 x 6,35 rom bis zu höchstens 19»05 x 19»05 x 19»05 mm geschnitten werden. Diese Größen sind nicht kritisch, werden jedoch bevorzugt. Ferner wurde festgestellt, daß es günstig ist, die Schwammschnitzel mit den Schwammblöcken zu mischen, wie z.B. 80 bis 120 Gewichtsteile Schwammschnitzel auf 100 Teile der kleinen Blöcke.

Zweck der Erfindung ist die Herstellung eines Säulenpackungsmaterials, das unter Gebrauchsbedingungen eine solche Dichte aufweist, daß weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) 18 cm⁵ Bettvolumen oder mehr ausfüllt. Z.B. kann die Dichte des Schwamm-Materials so sein, daß 1 g des Materials (auf Trockenbasis) 20 bis 70 cm* Bettvolumen ausfüllt. Für bestimmte Ver-

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fahren sind Dichten innerhalb des Bereichs von 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro wenigstens 25 cm , wie z.B. 30 bis 60 cm-⁵ Bettvolumen, bevorzugt. Das Schwamm-Material braucht im Säulenbett nicht komprimiert zu werden; man kann es jedoch sein natürliches stabiles Volumen einnehmen lassen, nachdem es sorgfältig mit Wasser befeuchtet wurde. Wenn es erst durch Befeuchten mit Wasser ausgedehnt ist, ändert sich das Volumen des Celluloseschwamms nicht wesentlich. Ferner werden die Kontaktverfahren mit wässrigen Lösungen durchgeführt, so daß während des Kontakts das Volumen des Schwamm-Materials pro Gewichtseinheit im wesentlichen unverändert bleibt. Da das Schwamm-Material zur Einarbeitung von Enzyra-immobilisierenden Gruppen modifiziert ist, wie unten beschrieben wird, ist klar, daß die Dichte auf Basis des modifizierten Schwamm-Materials verstanden wird, wie z.B. des Schwamm-Materials in kationischer Form, jedoch alle wasserlöslichen Komponenten des Schwamms, wie er vom Hersteller geliefert wird, entfernt wurden und nicht in die Berechnung der Säulendichte eingeschlossen werden.

Mit Celluloseschwamm-Betten der beschriebenen Art erfolgt wegen des Fließwiderstandes des Schwamm-Materials wenig oder kein Druckabfall über die Betten hin. Deshalb können tiefe Betten verwendet werden. Selbst wenn eine Serie von Betten verwendet wird, beträgt die Bett-Tiefe wenigstens 61 cm (2 feet) in Strömungsrichtung und vorzugsweise wenigstens 1,52 m (5 feet), Die maximale Bett-Tiefe oder Höhe, wenn die Säule sich aufrecht erstreckt, kann bis zu 12,19 bis 15,24 m (40 bis 50 feet) reichen, obwohl typische Säulen einen Bereich von 1,52 bis 6,10 m (5 bis 20 feet) in Strömungsrichtung aufweisen. Die Betten können in Säulenvorrichtungen mit runden, quadratischen oder rechteckigen Querschnitten verwendet werden. Gewöhnlich ist die Querschnittsfläche über die ganze Säulenlänge hin

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im wesentlichen einheitlich. Es gibt keine Begrenzung der seitlichen Ausdehnung der Betten, obwohl im allgemeinen der Durchmesser oder die seitliche Ausdehnung der Betten im Bereich von etwa 1,52 bis 4,57 m (5 bis 15 feet) liegt. Eine typische Säulenvorrichtung kann deswegen eine senkrechte Säule für aufwärts- oder abwärts strömenden Kontakt mit genügender Höhe, so daß darin ein Bett mit etwas freiem Kopfraum darüber Platz hat, mit einer Höhe von 2,44 bis 6,10 m (8 bis 20 feet) und einem Durchmesser von 1,52 bis 3,05 m (5 bis 10 feet) enthalten.

Auf die beschriebene Weise hergestellte Säulen haben ein hohes Ausmaß an Flüssigkeitsporosität, vermeiden jedoch das Auftreten von Kanälen. Im einzelnen kann Wasser durch Betten von mehr als 3*05 m (10 feet) Höhe in Raten von über 0,204 l/min/ dm*und vorzugsweise über 0,407 1/min/dnf der Querschnittsfläche des Bettes hindurchströmen. Wenn die Querschnittsfläche des Bettes ungleichmäßig ist, wird der geringste Querschnitt zur Verwendung der Stromungsrate verwendet. Wenn in der Säule eine Enzymumwandlung durchgeführt wird, wird die Fließgeschwindigkeit nur durch die nötige Kontaktzeit zur Erzielung der gewünschten Umwandlung begrenzt. Aufgrund der Fließbeständigkeit des Schwamrn-Materials tritt im wesentlichen kein Flüssigkeitsdruckabfall über das Bett auf. Z.B. kann die Lösung, die übergeleitet werden soll, auf den Kopf der Säule, die einen Kopfraum über dem Festbett aus Celluloseschwamm-Material aufweist, mit einer solchen Geschwindigkeit gepumpt werden, daß der Flüssigkeitsspiegel über der Oberkante des Bettes bleibt. Entsprechend kann die Ausflußgeschwindigkeit vom Bettboden so geregelt werden, daß die.Flüssigkeit durch das Bett strömt, ohne daß irgendein Pumpendruck benötigt wird. Der Unterschied zwischen dem statischen Druck am Kopf und am Boden des Bettes

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beruht auf der Höhe der Flüssigkeitssäule und nicht auf dem Widerstand des Cellulosebetts. Alternativ dazu kann die Lösung, die in Kontakt treten soll, auf den Boden der Säule gepumpt werden, und nach oben durch das Bett fließen, so daß der Kopfraum oberhalb des Bettes im wesentlichen mit übergeleiteter Flüssigkeit gefüllt gehalten wird. Der Abfluß wird im Verhältnis zum Zufluß geregelt und der für das Verfahren benötigte Pumpendruck wird nur so hoch gehalten, wie zum Transport der Flüssigkeit über ihren eigenen statischen Druck nötig ist, nicht aufgrund des Widerstands des Schwamm-Materials selbst. Natürlich können die Betten auch so verwendet werden, daß die Stromungsrxchtung horizontal ist; im allgemeinen werden die Betten jedoch in senkrechten Säulen mit abwärtsgerichteter Strömungsrichtung verwendet.

Bei der Herstellung des Säulenmaterials stellte es sich als unerwünscht heraus, den Celluloseschwamm in einen sehr fein zerteilten Zustand zu zermahlen, indem die Schwammstruktur weitgehend zerstört ist. Wenn das Ausmaß der Zerkleinerung bis zu einem feinen Pulver wächst, erhöht sich die Dichte des gemahlenen Schwamm-Materials so weit, bis sie mit derjenigen der zur Zeit handelsüblichen kationischen Cellulosepulver, wie z.B. aus natürlicher Cellulose hergestellter DEAE-Cellulose, vergleichbar ist. Bei einem Test wurde festgestellt, daß gemahlener Celluloseschwamm eine Dichte nach dem Befeuchten und nach voller Ausdehnung besaß, die 1 g Schwamm-Material pro 18 cnr entsprach. Das Material war immer noch viel wasserdurchlässiger als natürliches Cellulosepulver, jedoch war die Porosität zur Verwendung in Tiefbettsäulen nicht so zufriedenstellend, als wenn das Schwamm-Material unter Gebrauchsbedingungen eine Dichte (Trockenbasis) von weniger als 20 cnr pro g Schwamm-Material aufweist. Im allgemeinen sind Säulenfülldich-

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ten unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 18 ca pro g (Trockenbasis) des Schwamm-Materials unerwünscht.

Pur den Zweck der vorliegenden Erfindung wird das Celluloseschwamm-Material chemisch unter Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzym-fixierenden Gruppen modifiziert. Im allgemeinen können Reagentien, die immobilisierte Gruppen an die regenerierten Celluloseketten durch Ätherbindungen binden, verwendet werden, kationische Gruppen werden bevorzugt, es sind jedoch auch Enzym-fixierende anionische Gruppen bekannt und können für manche Zwecke verwendet werden. Es kann eine breite Vielzahl von kationischen Veratherungsmitteln verwendet werden, wie z.B. in den US-PSen 3 823 133 und 3 809 605 beschrieben. Wenn dies zur chemischen Stabilisierung der Cellulose nötig ist, können ferner Quervernetzungsverfahren angewandt werden, um einen höheren Substitutionsgrad erhalten zu können und somit die Kapazität der regenerierten Cellulose zu erhöhen. Pur diesen Zweck geeignete Verfahren werden in der Literatur beschrieben, z.B. in Guthrie et al., Ind. & Engr. Chem., ^2, 915-917 (1960). Wie dem Fachmann bekannt, sind tertiäre Amin- und quaternäre Ammoniumgruppen besonders zur Fixierung von Enzymen wirksam. Die regenerierte Cellulose kann deshalb unter Einarbeitung der Di- und Triäthylaminoäthylgruppen modifiziert wei den, was DEAE-regenerierte bzw. TEAE-regenerierte Cellulose ergibt. Die regenerierte Cellulose kann nach bekannten Verfahren mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin zu ECTOLA-regenerier— ter Cellulose umgesetzt werden. Es ist zu betonen, daß alle diese Derivate gebildet werden, während das regenerierte Cellulosematerial in Schwammform bleibt.

Wenn das Celluloseschwamm-Material bei der Herstellung der

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Säulenfüllung zerteilt werden muß, kann dies zuerst getan werden, die zu kleinen Feinteile durch Absieben entfernt werden und das zurückbleibende zerkleinerte Schwamm-Material mit Wasser zur Entfernung sämtlicher löslicher Bestandteile gewaschen werden. Das zerkleinerte Schwamm-Material kann dann unter Verwendung der oben genannten Verfahren und Reagentien in seine Derivate überführt werden. Eine Vielzahl solcher Reagentien und Verfahren wird auch in den folgenden Beispielen verdeutlicht. Da die bei den Reaktionsverfahren angewandte Chemie bekannt ist, wird nicht angenommen, daß es nötig ist, sie hier weiter zu diskutieren.

Im Gegensatz zu dem, was erwartet werden konnte, wurde jetzt gefunden, daß es nötig ist, große Mengen an Enzym-immobilisierenden Gruppen in die Celluloseschwamm-Kapazität für Verwendung in Säulen einzuarbeiten. Wenn kationische Stickstoffgruppen als immobilisierende Gruppen eingeführt werden, kann die Anzahl solcher Gruppen auf Basis von zugesetztem Stickstoff im allgemeinen von 0,2 bis 2,0 Gew.-% Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entsprechen. Ferner wird für viele Zwecke eine angemessene Kapazität erhalten, wenn die kationischen Stickstoffgruppen, wie z.B. tertiäre Aoingruppen oder quateraäre Ammoniumgruppen, im Celluloseschwamm-Material in Mengen vorliegen, die nur 0,3 bis 1,0 % zugesetztem Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entsprechen.

Die erfindungsgemäße Säulenapparatur und das erfindungsgemäße Verfahren zur Reaktion mit immobilisierten Enzymen ist auf alle Enzyme anwendbar, die durch die funktioneilen Gruppen fixiert sind und die Cellulosestruktur des Schwamms nicht angreifen oder abbauen. Im allgemeinen werden Enzyme als Klasse

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durch kationische Sticks toff gruppen, wie z.B. tertiäre Amin- oder quaternäre Ammoniumgruppen, adsorbiert und immobilisiert. Cellulaseenzyme sind unerwünscht, da ihre Hauptwirkung die Verdauung von Cellulose ist. Eine Quervernetzung der Cellulose kann ihren Widerstand gegen cellulolytisehen Angriff erhöhen und deshalb können Enzyme, die Spurenmengen von Cellulasen enthalten, verwendet werden. Jedoch wird vorzugsweise Celluloseschwamm-Material nicht für Reaktionen verwendet, die die Anwesenheit von immobilisierter Cellulase erfordern; ebenso wird bevorzugt, daß die auf die Säule gegebenen Enzyme im wesentlichen cellulasefrei sind.

Für die enzymatische Umwandlung von Glukose und Glukosegemischen mit Oligosacchariden aus natürlicher Stärke, wie z.B. Maisstärke, werden die Enzyme verwendet, die bisher für solche Zwecke verwendet wurden, insbesondere Alphaamylase, Glukoamylase oder Gemische dieser Enzyme. Zur Umwandlung von Glukosesirupen in Glukose-Fruktose-Gemische kann Glukoseisomerase verwendet werden. Für diesen Zweck wird ein Ausgangsmaterial mit hohem Dextroseäquivalent, wie z.B. eine aus Stärke erhaltene Glukoselösung mit einem D.E. von 93 bis 97» bevorzugt, was anzeigt, daß sie aus großen Dextrosemengen zusammengesetzt ist. Zur Herstellung von Sirupen mit mittlerem D.E. aus Maisstärke oder anderem Stärkematerial kann das Ausgangsmaterial eine Stärke sein, die von einem Gemisch von Glukose und Oligosacchariden stammt und einen D.E. im Bereich von 15 bis 45 hat. Z.B. kann ein Gemisch von Alphaamylase und Glukoamylase auf das Cellulose-Schwamm-Material aufgebracht werden und mit einem Ausgangsmaterial der beschriebenen Art behandelt werden, was Produkte mit Dextroseäquivalenten im Bereich von 42 bis 70 gibt. Dies sind wichtige kommerzielle

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Produkte, die zur Zeit vollständig durch chargenweise Ensymumwandlung unter Einmalverwendung der Enzyme hergestellt werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Lebensdauer der Enzyme stark verlängert werden, die zur Umwandlung der 10 bis 20-fachen Menge an Substrat in handelsüblichen Maissirup von mittlerem Dextroseäquivalent gebracht werden können.

Andere Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie der Vorrichtung verwendet werden können, sind z.B. Trypsin, Papain, Chymotrypsin, Lactase, Urease, Acylase, Catalase, Penillin-Amidase, Beta-Amylase, Lipase, Glukoseoxidase, Protease, Gelatinase, Hemicellulase, Pectinase, Lysozyme, Pepsin usw.

Die folgenden experimentellen Beispiele verdeutlichen das Enzym-immobilisierende Celluloseschwamm-Material, das zur Verwendung in Verfahren und Vorrichtung gemäß der Erfindung hergestellt wurde, und gibt weitere Informationen darüber. Das Ausgangsmaterial war Celluloseschwamm oder Schwammreste (D-slab) hergestellt von E.I. duPont, Wilmington, Delaware. Der Fasergehalt des Celluloseschwamm-Materials war nicht spezifisch bestimmt; es wird jedoch angenommen, daß es etwa 6 bis 8 Gew.-% Hanffasern, bezogen auf Trockengewicht der regenerierten Cellulose, enthielt. Dieses Material stelle sich als in seinen Eigenschaften als identisch mit Celluloseschwämmen von duPont heraus, die in Einzelhandelsgeschäften verkauft wurden. Im allgemeinen hat der duPont-Celluloseschwamm, sowie er erhalten wurde, eine

■χ
Dichte von etwa 1 g pro 13 bis 16 cnr des Materials. Nach vollständigem Benetzen mit Wasser dehnt sich der Celluloseschwamm in Form von Tafeln oder Blöcken bis zu einer stabilen Dichte von durchschnittlich 1 g pro 28 cnr aus. Wenn das Celluloseschwamm-Material zerteilt wird, wie z.B. durch Schnitzeln, kann

7 0 9 8 U 0 / 1 0 0 4

die Dichte weiter verringert werden. Solch geschnitzeltes Material dehnte sich nach sorgfältigem Befeuchten mit Wasser

■χ bis zu einer stabilen Dichte von durchschnittlich etwa 51 cnr pro g (Trockenbasis) aus. Es ist anzumerken, daß die durch Befeuchten mit Wasser erhaltene Dichte nach der Expansion der Dichte entspricht, die vom Material unter gewöhnlichen Gebrauchsbedingungen erwartet wird. Jedoch steht die Dichte in Beziehung zum Trockengewicht des Celluloseschwamm-Materials, das die regenerierte Cellulose, das faserige Verstärkungsmaterial und die zugesetzten Enzym-immobilisierenden Gruppen einschließt, jedoch wasserlösliche Substanzen, die vor seiner Verwendung für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen aus dem Schwamm-Material entfernt wurden, ausschließt.

Experimenteile Beispie1e

Beispiel 1

Derivate von regeneriertem Celluloseschwamm (duPont-Celluloseschwamm) wurden durch Umsetzung mit kationisierenden Heagentien entsprechend dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt: Der Schwamm wurde zu dünnen Stücken (Schnitzeln ) geschnitzelt, die durchschnittlich 6,35 bis 19,05 mm (0,25 bis 0,75 inches) lang waren, die Schwammschnitzel wurden in heißem Wasser gewaschen, getrocknet und wieder in Wasser, das eine Menge eines Salzes aus einer starken Säure und einer starken Base enthielt und Übersättigung zeigte, suspendiert und eine starke Base, die aus einem Alkalihydroxid bestand, wurde zugesetzt. Das kationisierende Reagens wurde dann zugesetzt und die Reaktion unter Rühren bei erhöhter Temperatur etwa 2 h lang fortgesetzt. Danach wurde der kationisierte Celluloseschwamm durch Neutralisieren auf etwa pH 4 mit Mineralsäure

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gewonnen, filtriert, mit Wasser gewaschen und auf ein Feuchtigkeit sgleichgewicht in einem Luftofen getrocknet.

Unter Anwendung dieses Verfahrens auf ein spezielles Beispiel wurden 20 g (0,125 Mol) gewaschener, geschnitzelter Celluloseschwamm in 970 g Wasser, das 580 g Natriumsulfat enthielt, suspendiert. 12 g 50 %ige Natriumhydroxidlösung (0,15 Mol) und anschließend 10,3 g (0,06 Mol) Diäthylaminoäthylchloridhydrochlorid (DEC) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 130 bis 190 min bei 4-5° C gerührt. Danach wurde das Gemisch mit Salzsäure auf pH 4- eingestellt, 1 h lang gehalten, filtriert und unter Suspendieren in 6 aufeinanderfolgenden 2-1-Anteilen von Wasser gewaschen, um die Reaktionssalze und das während der Reaktion vorliegende Natriumsulfat zu entfernen. Das Endprodukt wurde bei 8O⁰C getrocknet und bei Raumtemperatur ins Gleichgewicht gesetzt; man erhielt so Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Schwammcellulose, die als Säulenmaterial für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen brauchbar ist. Stickstoff wurde auf dem Produkt bestimmt, um die zugesetzte Menge zu bestimmen (vergl. Tabelle 1).

Ferner werden in Tabelle 1 die Ergebnisse anderer Versuche wiedergegeben, in denen das Molverhältnis von Reagens zu regenerierter Schwammcellulose wie auch die Menge an zugesetztem Alkalikatalysator auf Basis von trockener Cellulose ("d.b.Cellulose") variiert wurde.

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Tabelle 1

Lauf Molverhältnis Reaktion % NaOH auf % zugesetzter DEC/Cellulose in Minu- d.b.Cellu- Stickstoff ten lose

A	1:2	120	30	1,36
B	1:2	130	60	1,20
C	1:2	130	30	1,61
L	1:5	19O	30	0,85
E	1:1	130	60	2,04

Der zugesetzte Stickstoff ist ein Maß für die an die Schwammcellulose gebundenen DEAE-Gruppen, die für die Enzym-Immobilisierung verfügbar sind.

Beispiel 2

Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens und entsprechend den Einzelheiten des Laufs A wurde ein Derivat von Celluloseschwamm-Säulenmaterial unter Verwendung von ^-Chloro-^-butenyl-trimethylamraoniumchlorid als Reagens hergestellt, wobei jedoch das Produkt auf pH 1 eingestellt wurde, 1 h gehalten wurde und wie vorher gewaschen wurde. Nach Gewinnung auf die vorgeschriebene Weise betrug die Menge an zugesetztem Stickstoff 0,66 %. Dies ist ein Maß für die kationischen Gruppen, die Trimethylammoniumbutanoyl-2-celluloseäthergruppen in Chloridform sind. Der erhaltene kationische Schwamm kann als Säulenmaterial für Reaktion mit immobilisierten Enzymen verwendet werden.

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Beispiel 3

Unter Verwendung des Verfahrens gemäß Beispiel 1 und Anwendung der Einzelheiten des Laufs A wurde ein Celluloseschwamm-Derivat unter Verwendung von 2,3-Epoxypropyl-trimethylammoniumbromid als Eeagens hergestellt. Nach der Gewinnung in der oben beschriebenen Weise wurde die Menge an zugesetztem Stickstoff mit 0,24 % bestimmt. Dies ist ein Maß für die kationischen Gruppen, die 2-I^droxypropyl-trimethylammonium-Cellulose äthergruppen in Bromidform sind. Das erhaltene kationische
Schwamm-Material kann als Säulenmaterial für Reaktionen mit
immobilisierten Enzymen verwendet werden.

Beispiel 4-

Eine Variante des in Beispiel 3 beschriebenen Eeagenses wurde auf dieselbe Weise umgesetzt, wobei 3-Chloro-2-hydroxypropyltrimethylammoniumchlorid verwendet wurde. Das gewonnene Produkt enthielt 0,35 % zugesetzten Stickstoff. Dies ist ein Maß für die kationischen Gruppen, die 2-Eydroxypropyl-trimethylammoniumcelluloseäthergruppen in Chloridform sind. Der erhaltene kationische Schwamm kann als Säulenmaterial für Reaktionen
mit immobilisierten Enzymen verwendet werden.

Beispiel 5

Unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens
und gemäß den Einzelheiten im Lauf A wurde ein Derivat des
regenerierten Celluloseschwamms unter Verwendung von 4—Bromobutyltrimethylammoniumbromid als Reagens hergestellt. Nach Gewinnung in der vorstehend beschriebenen Weise wurde die Menge an zugesetztem Stickstoff mit 0,4-5 % bestimmt. Dies ist ein
Maß für die kationischen Gruppen, die Butyltrimethylaramonium-Celluloseäthergruppen in Bromidform sind. Der erhaltene

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— Jf+ —

nische Schwamm kann als Säulenmaterial für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen verwendet werden.

Beispiel 6

Celluloseschwamm-Schnitzel, die gemäß Lauf A in Beispiel 1 mit DEC bis auf einen Gehalt von 1,26 % zugesetztem Stickstoff kationisiert worden waren, wurden als DEAE-Celluloseschwamm mit einer Enzymlösung behandelt, um das Enzym an den kationischen Schwamm zu adsorbieren.

10 g (auf Basis des Trockengewichts) kationischer Schwamm wurden mit 10 g Glukoamylase (Diazym L-100, Miles Laboratories, Elkhart, Indiana), in ionenausgetauschtem Wasser bei Raumtemperatur 4 h lang gemischt und filtriert, was ein Gemisch ergab, das 770 IGU Enzymaktivität enthielt. Der Schwamm wurde von der Flüssigkeit abfiltriert und analysiert und zeige eine Aktivität von 35*4- IGU/g. IGU bedeutet "Einheit von immobilisierter Glukoamylse" und ist die Enzymmenge, die unter den Versuchsbedingungen die Erzeugung von 1 g Glukose in 1 h katalysiert. Versuchsbedingungen stellen die Verwendung einer 30 %igen wässrigen Lösung von Maltodextrin-Fest stoff en bei pH 4,2 und 60°C während 1 h dar. Die Enzymaktivität wird durch Berechnung des Anstiegs der Glukosekonzentration gemessen.

6 g Glukoamylase enthaltender Schwamm wurden mit Wasser befeuchtet, in eine Säule von 2,45 cm Durchmesser bei Raumtemperatur gegeben und ein Ionenaustauschsirup mit 30 % Feststoffgehalt und 35 % Dextroseäquivalent (D.E.; analytische Standardverfahren der Corn Refiners Association, Methode E-26) durch die

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Säule mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min bei pH 4,2 und 58,9⁰C (138°F) hindurchfließen gelassen. Der D.E. des abfließenden Sirups wurde bei 45 % gehalten. Nach 7 Tagen war die Menge von 14.870 g Sirup (auf Basis von trockenem Feststoff) durch die Säule gelaufen.

Beispiel 7

Celluloseschwamm-Schnitzel, die gemäß Lauf A in Beispiel 1 mit DEC bis zu einem Gehalt von 0,33 % zugesetztem Stickstoff kationisiert worden waren, wurde als DEAE-Celluloseschwamm mit einer Enzymlösung von Diazyme L-100 wie in Beispiel 6 behandelt und enthielt gemäß Analyse eine Aktivität von 24,3 IGU pro g.

8 g Enzym enthaltender Schwamm wurde in eine Säule von. 2,54 cm Durchmesser bei Raumtemperatur gegeben. Ein Ienenaustauschsirup mit 30 % Feststoffgehalt und 36 % Dextroseäquivalent wurde in die Säule bei pH 45, gefüllt. Die Säule wurde fortschreitend auf 60⁰C (140⁰F) erwärmt und der mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/min abfließende Sirup ergab 62 % D.E. Bei fortlaufendem Durchfluß

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fiel der Prozentsatz an Dextroseäquivalent fortschreitend auf 51 % D.E., nachdem 7200 g Trockensubstanzprodukt gesammelt worden waren. Der Durchfluß wurde dann auf 3 ml/min verringert und der Dextroseäquivalent-Prozentsatz im erhaltenen Produkt fiel auf 60.

Die Säule wurde kurz auf 66,7° C erwämrt, wodurch, das anwesende Enzym inaktiviert wurde. Es wurde eine zusätzliche Glykoamylase-Menge (G-zyme; Enzyme Development Corp., New York, New York) zur Säule gegeben, indem man sie dem Aufgabesirup zusetzte und auf die Säule fließen ließ. Die Säule wurde auf 6O⁰C eingestellt und ionenausgetauschter Sirup von 36 % D.E. floss durch die Säule mit 3 ml/min, bis eine Menge von Sirup mit 60 % D.E., die 42 000 g Substanzsirup entsprach, während eines Zeitraums von 24 d erzeugt war.

Beispiel 8

Dieses Beispiel zeigt die Zähigkeit einer Säule mit kationisiertem Celluloseschwamm, ein Enzymgemisch zu enthalten und den Zuckergehalt des erhaltenen Sirupprodukts zu variieren. 10 g Celluloseschwamm-Schnitzel, die mit DEC gemäß Lauf Δ in Beispiel 1 bis auf einen Stickstoffgehalt von 0,85 % kationisiert waren, wurden als DEAE-Celluloseschwamm mit einem Gemisch von 1,16 g einer Pilz-Alpha-Amylase (Asperzyme; Enzyme Development Corp.) und 0,60 g G-Zyme (vergl. Beispiel 7) behandelt. Die Enzyme wurden in einem Sirup von 42 % D.E. mit 30 % Feststoff gehalt gelöst und mehrfach durch die Säure laufen gelassen, bevor ein Strom von Sirup beim pH 5»5 mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min hindurchgeschickt wurde. Der abfließende Sirup enthielt 64,1 % D.E. und besaß eine Analyse von 40,3 % Dextrose und 30,6 % Maltose.

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Nach 7 Tagen war eine Menge von 10 318 g Trockensubstanzsirup erzeugt, wobei der D.E. fortlaufend bei derselben Durchflußgeschwindigkeit auf 48 % fiel.

Beispiel 9

Dieses Beispiel zeigt ein anderes Verfahren zum Vermischen des Enzyms mit dem kationisierten Schwamm.

6 g DEAE-SChwamm-Material (identisch mit dem des Beispiels 8) wurden mit derselben Menge an Asperzyme und G-Zyme (vergl. Beispiele 7 und 8) behandelt und über Nacht in Sirup von 4-2 % D.E. mit 35 % Feststoffkonzentration und einem pH von 5,5 bei 54-,4-⁰C (130⁰F) gemischt. Die Säule wurde dann mit ionenausgetauschtem Sirup von 44 % D.E. gefüllt und bei einer Durchflußrate von 4- ml/min enthielt der abfließende Sirup 66 % D.E. Eine Analyse zeigte eine Zuckerverteilung von 4-7,6 % Dextrose und 22,3 % Maltose.

Nach Beobachtung, daß der pH des abfließenden Sirups auf 4-,7 zu sinken begann, wurde der Aufgabesirup umgeschaltet auf kohleraffinierten Sirup. Danach war der pH des abfließenden Sirups derselbe wie derjenige des aufgegebenen Sirups. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 3»4 ml/min bei pH 5,5 wurde Sirup von 62,2 % D.E. erzeugt und die Zuckerverteilung betrug 4-2,6 % Dextrose und 22,5 % Maltose.

Beispiel 10

Dies Beispiel zeigt die Wirkung, die bei Änderung des zuströmenden D.E. eines Sirups und seiner Umwandlung durch Pilz-Alphaamylase auftritt. 8 g kationisierte regenerierte Celluloseschwamm-Schnitzel (DEAE), die 0,4-8 % zugesetzten Stickstoff enthielten, wurden mit 2 g Asperzyme (vergl. Bei-

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spiel 8) einer in Wasser gelösten Pilz-Alphaamylase, "behandelt. Das Gemisch wurde auf eine Säule gegeben und kohlenstoffgereinigter Sirup von 35 % D.E., der 0,01 % Natriumbisulfit bei pH 5,5 und 35 % Feststoff enthielt, wurde bei Raumtemperatur über die Säule gegeben. Die Säulentemperatur erhöhte sich auf 54-,4°C (130⁰F).

Der bei einer Durchflußrate von 3 ml/min gesammelte ausströmende Sirup enthielt 50,7 % D.E. und eine Zuckerverteilung von 20,2 % Dextrose und 37,7 % Maltose.

Nach einem Zeitablauf wurde der einfließende Sirup geändert auf 19,4- % D.E., während alle anderen Parameter gleich, blieben. Der abfließende Sirup wies einen Zuckergehalt von 4,8 % Dextrose und 40 % Maltose auf.

Beispiel 11

Dieses Beispiel ähnelt Beispiel 8, wobei jedoch das kationisierte Schwamm-Material (DEAE) 0,38 % zugesetzten Stickstoff enthielt. Dasselbe Verhältnis von Asperzyme und G-Zyme (vergleiche Beispiel 8) wurde auf dieselbe Weise zugesetzt, wie in Beispiel 10. Der aufgegebene Sirup von 43,5 % D.E., 35 % Feststoffanteil, pH 5,5 und einem Gehalt von 0,01 % Natriumbisulfit wurde durch die Säule bei 54,4⁰C (130⁰F) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min gegeben. Der abfließende Sirup enthielt 63,6 % D.E. und wies einen Zuckergehalt von 35,5 % Dextrose und 31,5 % Maltose auf.

Beispiel 12

Regenerierter Celluloseschwamm, der mit DEC (vergl. Beispiel 1) bis auf einen Gehalt von 0,85 % an zugesetztem Stickstoff kationisiert war, wurde mit einer Enzymlösung behandelt, damit

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das Enzym auf den kationischen Schwamm absorbiert wurde.

Eine Menge von 1 g (auf Basis des Trockengewichts) kationischer Schwamm wurde mit 1 g gereinigter Invertase (Convertit, Wallerstein Company, Morton Grove, Illinois) in ionenausgetauschtem Wasser bei Raumtemperatur 4 h lang gemischt. Der Schwamm wurde von der Flüssigkeit abfiltriert und auf dem Filter mit ionenausgetauschtem Wasser gewaschen, um ungebundenes Enzym zu entfernen.

1/2 g.(auf Basis des Trockengewichts) Schwamm, der Invertase enthielt, wurde mit 50 ml einer 10 %-igen Saccharoselösung vom pH 5»0 und 55°C 30 min lang gemischt, was 86 %igen Invertzucker ergab und die Anwesenheit von Invertase-Aktivität im Schwamm zeigte.

Beispiel 13»

1 g DEAE-Celluloseschwamm, der mit dem in Beispiel 12 verwendeten identisch war, wurde mit 1 g Glukoseoxidase (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey) in ionenausgetauschtem Wasser gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 12 beschrieben wurde, gemischt und ergab einen Glukoseoxidase-haltigen Schwamm.

1/2 g (auf Basis des Trockengewichts) Schwamm, der Glukoseoxidase enthielt, wurde mit 50 ml 1 %iger Glukoselösung bei pH 7,0 und 37°C gemischt. Nach 3 h waren 95 % der Glukose oxidiert, was durch den Verlust des Eeduktionsvermögens der Lösung angezeigt war. Dieses Ergebnis beweist die Anwesenheit von Glukoseoxidase im Schwamm.

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Beispiel 14-

1 g DEAE-Celluloseschwamm, der identisch mit dem in Beispiel 12 verwendeten war, wurde mit 1 g Urease (Jackbaumfrucht, doppelt stark, J.T.Bake Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey) in ionenausgetauschtem Wasser gemäß dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren gemischt und ergab einen ureasehaltigen Schwamm.

1/2 g (auf Trockenbasis) des Urease enthaltenden Schwamms wurde mit 0,1 g Harnstoff in 250 ml ionenausgetauschtem Wasser bei pH 6,5 in. einem mit Stopfen versehenen Kjeldahl-Kolben bei Baumtemperatur 1 h lang gemischt. Eine Stickst off be Stimmung (Harnstoff- und Ammoniakstickstoff; Methods of Analysis, 11. Auflage, AOAC, Verfahren 7.027) ergab vollständige Zersetzung des Harnstoffs. Dieses Ergebnis beweist das Vorliegen von Urease-Aktivitäz im Schwamm.

Beispiel 15

1 g DEAE-Sctiwamni, der mit dem in Beispiel 12 identisch wax, wurde mit einem zellfreien Extrakt von Glukoseisomerase (erhalten aus Arthrobacterzellen, NHEL 3728) entsprechend d?m in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren gemischt, wodurch ein Glukoseisomerasehaltiger Schwamm erzeugt wurde.

Ein Glukoseisomerase-Versuch des Glukoseisomerase-enthaltenden Schwamms zeigte eine Aktivität von 2,3 x 10"** Einheiten/Gramm Schwamm (auf Trockenbasis), wobei eine Einheit definiert ist als Enzymmenge, die die Bildung von 1 g Fruktose pro min unter folgenden Bedingungen katalysiert: 60⁰C, 1,67 molare Glukose, pH 7»75» 0,4 Molar an Magnesium. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Schwamm immobilisierte Glukoseisomerase enthält. Dieser Schwamm kann für die Säulenumwandlung von Glukose in

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Ιο

Fruktose verwendet werden

Beispiel 16

1 g DEAE-Schwamra, der mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch war, wurde mit 1 g Katalase (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in ionenausgetauschtem Wasser entsprechend dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren gemischt und ergab einen Katalase enthaltenden Schwamm.

Wenn 1/2 g (auf Trockenbasis) des Katalase-haltigen Schwamms mit 50 nil 1 %igen Wasserstoffperoxid gemischt wurde, wurde das Peroxid sofort zersetzt. Dieses Ergebnis beweist die Anwesenheit von Katalaseaktivität im Schwamm. Der Schwamm kann in einer Säule zur kontinuierlichen Zersetzung von HpO^ in einem wässrigen Medium verwendet werden.

Beispiel 17

1 g DEAE-Schwamm, der mit dem in Beispiel 12 beschriebenen identisch ist, wurde mit 0,5 g Trypsin (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in ionenausgetauschtem Wasser nach dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren gemischt und ergab einen Trypsin-haltigen Schwamm.

1/2 g (auf Trockenbasis) des Trypsin-haltigen Schwamms wurde mit 50 ml 2 %iger Kaseinlösung bei pH 7»0 und 37°C gemischt. Nach 30 min wurde der Schwamm aus der Lösung genommen und Trichloressigsäure zugesetzt, um das Protein auszufällen. Fach Filtration zur Entfernung des Niederschlags zeigte eine Kjeldahl-Stickstoffbestimmung, daß der Schwamm Enzymwirksamkeit behalten hatte. Der Schwamm kann als Säulenmaterial für kontinuierliche Behandlung von löslichem Protein

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verwendet werden, wobei das Protein durch das immobilisierte Trypsin proteolysiert wird.

Beispiel 18

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines kationisierten quervernetzten Celluloseschwamms.

Ein DEAE-Celluloseschwammderivat wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung von DEC und gemäß den Einzelheiten des Laufs A hergestellt. Dann wurde die Eeaktions-Aufschlämmung auf pH eingestellt und 20 Gew.-% Formaldehyd (bezogen auf Cellulose des Schwamm-Materials auf Trockenbasis und Formaldehyd) wurde zugesetzt und das Gemisch 1 h lang gerührt. Danach wurde das Produkt auf pH 3,9 eingestellt und gewaschen, wie vorstehend beschrieben. Es enthielt 1,3 % zugesetzten Stickstoff als DEAE-Gruppen.

Eine Menge von 4- g des erhaltenen quervernetzten Schwamm-Naterials wurde mit 1,16 g Asperzyme und 0,6 g G-Zyme (vergl. Beispiele 7 und 8) die in Wasser gelöst waren, in Berührung gebracht. Das Gemisch wurde auf eine Säule gegeben und kohlegereinigter Sirup von 37 % D.E., der 0,01 % Natriumbisulfit bei pH 5,5 und 35 % Feststoff enthielt, wurde bei Raumtemperatur durch die Säule gegeben. Die Temperatur wurde auf 54-,4-⁰C (13O°F) erhöht und die Durchflußgeschwindigkeit auf etwa 3,O ml/min eingestellt.

Der ausfließende Sirup enthielt 66,6 % D.E. und eine Zuckeraufteilung von 47,6 % Dextrose und 29,2 % Maltose.

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Beispiel 19

Ein kationisiertes Celluloseschwamm-Derivat wurde wie in Beispiel 18 unter Verwendung von DEC hergestellt, wobei jedoch 100 Gew.-% Formaldehyd 1 h lang umgesetzt wurde. Das Produkt wurde auf pH 4,0 eingestellt und gewaschen, bis kein Formaldehydgeruch mehr feststellbar war. Das Produkt enthielt 1,16 % zugesetzten Stickstoff und war als kationisches Säulenmaterial für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen zu gebrauchen.

Z.B. wurde eine Menge von 40 g des erhaltenen quervernetzten kationischen Schwamm-Materials mit 5>8 g Asperzyme und 3*0 g G-Zyme (vergl. Beispiele 7 und 8), die in Wasser gelöst waren, in Kontakt gebracht. Das Gemisch wurde auf eine Säule gegeben und über Kohle gereinigter Sirup von 37 % D.E., der 0,01 % Natriumbisulfit beim ρ H 5,4 und 35 % Feststoffe enthielt, wurde in die Säule bei Raumtemperatur geleitet. Die Temperatur wurde auf 54,4°C (130⁰F) angehoben und die Flußgeschwindigkeit auf 11 ml/min eingestellt. Der abfließende Sirup besaß einen D.E. von 67 %·

Beispiel 20

Das kationische Celluloseschwamm-Material kann in verschiedenen Formen in Säulen verwendet werden; in den vorangehenden Beispielen lag der Schwamm in Form kleiner Stückchen vor, die das Ergebnis eines Schnitzelverfahrens waren. Ein anderes Verfahren verwendet Propfen, die aus der Schwamm-Masse geschnitten wurden und um ein geringes kleiner als der innere Säulendurchmesser sind. Die Pfropfen läßt man in der Säule schwellen.

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Gemäß einem spezifischen Beispiel wurden zylindrische Pfropfen (30,5 cm hoch, Durchmesser 2,38 cm (1 feet bzw. 15/16 ")) aus regeneriertem Celluloseschwamm in ihr Derivat überführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und getrocknet. 10 dieser Pfropfen wurden in eine Säule von 2,54- x 30,5 cm (1" χ 12") eingesetzt und Wasser durch die Säule von oben nach unten gegeben, bis der Schwamm sorgfältig naß und ausgedehnt, war. Er bildete dann eine dichte Abdichtung gegen die Wände und die Höhe betrug 27,9 cm (11").

5 g Diazyme L-100 (vergl. Beispiel 6) in 50 ml Wasser wurden auf die Säule gegeben. Nach Zugabe der gesamten Enzymlösung wurde der Strom gestoppt und das System 2 h lang bei 30⁰C gehalten. Dann wurde Maissirup auf die Säule gegeben, wie in Beispiel 6 beschrieben. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Im Verlauf des Säulenverfahrens wurde die Strömungsgeschwindigkeit abgeändert. Der D.E. der ausfließenden Flüssigkeit schwankte in Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit zwischen 40 und 95·

Die Dichte des Enzym-haltigen Schwamms in der Säule kann beträchtlich durch Druckanwendung auf die Oberseite der Schwammschicht mittels eines Siebs verändert werden, das entweder eine Dehnung nach oben verhindern kann, wenn Pfropfen verwendet werden, oder das scheinbare Volumen beträchtlich verringern kann, wenn Schwamm-Schni tzel verwendet werden; das Sieb wird nach unten bewegt, um das geschnitzelte Material zu komprimieren. Bei Verwendung der letztgenannten

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Technik empfiehlt es sich, das Bett so weit wie nötig, zu verdichten, um Kanalbildung zu verringern. Eine solche Bettverdichtung scheint keinen Rückdruck oder StrömungsSchwierigkeiten zu verursachen.

Andere Beispiele

Zusätzlich zu den vorgenannten Verfahren können andere Verfahren zur Herstellung von Enzym-immobilisierenden Cellulosen angewandt werden. Hierzu gehören die folgenden:

Beispiel 21

Ein Carboxymethylchloro-S-triazinylderivat von regeneriertem Celluloseschwamm kann entsprechend Beispiel 1 der US-PS 3 278 392 hergestellt werden. Es absorbiert Urease aus einer wässrigen Lösung, um sie darauf zu immobilisieren. Wenn der Enzym-haltige Schwamm in eine Säule gegeben wird und eine Harnstofflösung von oben nach unten hindurchgeleitet wird, enthält die abfließende Lösung im wesentlichen keinen Harnstoff.

Beispiel 22

Ärmliche Enzymabsorptions- und Immobilisierungsergebnisse können erhalten werden, wenn regenerierter Celluloseschwamm mit einem diazotierten Anthranilester (US-PS 3 64-7 630), einem p-Diazophenoxyhydroxypropylather (US-PS 3 702 804-), einem Bromoacetylderivat (US-PS 3 278 392) oder durch Bromcyan-Aktivierung /Biotechnology and Bioengineering, Bd. 14-, S. 1039 (1972J7 kationisch gemacht wurde. Die vorgenannten Zitate erläutern anwendbare Reaktionsverfahren.

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Beispiel 23

Ein Carbonat aus regeneriertem Celluloseschwamm kann aus Ätbylchloroformiat hergestellt werden, wie in Beispiel 1 der US-PS 3 810 321 beschrieben. Der anionische Schwamm absorbiert Amyloglukosidase aus einer wässrigen Lösung, die durch Waschen nicht mehr entfernt werden kann. Der Enzym-haltige Schwamm kann nach Einsatz in eine Säule mit Strömungsrichtung von oben nach unten verwendet werden und ergibt D.S.-Werte im Bereich von 60 bis über 90, wenn das aufgegebene Maissirup Substrat einen D.E. von 3^- bis 38 hat.

Kommerzielle Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die bevorzugte kommerzielle Praxis, wie man sie sich zur Zeit vorstellt, verdeutlichen.

Beispiel 24

Es wird eine Säulenvorrichtung der Art verwendet, die üblicherweise mit.Ionenaustauschharzen benutzt wird. Ein solcher Apparat wird schematisch in Fig. 1 abgebildet. Die senkrechte Säule ^O weist innen einen Baum zur Aufnahme des Festbettes aus Celluloseschwammpackung P auf. Oberhalb des Materials ist ein offener Kopfraum 11 vorgesehen. Säule 10 ist mit einem Heizmantel versehen (vergl. Fig. 1), durch den heißes Wasser geleitet werden kann, um eine gewählte Temperatur während der Enzymreaktion aufrechtzuerhalten. Der Kopf oder die Abdeckung der Säule 12, die entfernt werden kann, ist mit einer Eeihe von Anschlüssen versehen, wobei der größere auf der linken Seite, wie angegeben, zur Beladung des Betts mit dem Celluloseschwamm-Material, der mittlere zur Aufgabe der umzuwandelnden Lösung, wie z.B. Stärkehydrolysat, und der rechte zum Belüften

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dient. Alle Einlaßstutzen können mit geeigneten Ventilen versehen werden, wie angegeben. Der Boden des Betts wird von einem Sieb 13 gehalten, das das Cellulosematerial des Betts zurückhält, während es den Flüssigkeitsstrom in den abgeschrägten Bodenteil 14 strömen läßt, der zum Auslaß 15 hin zusammenläuft. Der Abfluß durch 15 wird, wie angegeben, mit einem Ventil gesteuert. Unmittelbar oberhalb des Siebs 13 befindet sich auf einer Seite der Säule eine Eeinigungsöffnung 16, die über ein Ventil mit einem Entfernungsrohr 17 in Verbindung steht. Bei dieser Anordnung kann das Celluloseschwamm-Material, wenn es, wie bevorzugt, in unterteilter Form vorliegt, in Form einer wässrigen Aufschlämmung auf die Säule gepumpt werden, wobei der Bettbeladungs-Einlaßstutzen am oberen Ende verwendet wird. Nach wiederholtem Gebrauch des Celluloseschwamm-Betts kann es erwünscht sein, das Bettmaterial zu entfernen und durch ein neues Celluloseschwamm-Bett zu ersetzen. Dies kann erfolgen, indem man Wasser durch den Bettbeladungs- und/oder Sirupeinlaßstutzen am oberen Ende aufgibt, wobei das Ventil am Auslaßrohr 17 geöffnet ist, und das Bettmaterial als Aufschlämmung durch Rohr 17 herauspumpt.

Eine vorteilhafte Form des Säulenmaterials wird in Fig. 2 abgebildet. Es besteht aus einem Gemisch von Schwammschnitzeln und kleinen Blöcken oder Klumpen, die ungefähr kubisch oder rechteckig sind. Die Schnitzel haben vorzugsweise eine solche Größe, daß sie durch ein Sieb Nr. 0,525 hindurchgehen und von einem Sieb Nr. 0,263 (Tyler) zurückgehalten werden. Das "würfelförmige" Material kann eine durchschnittliche Größe von 6,35 mm bis 12,7 mm (1/4 bis 1/2 inches) in jeder Dimension aufweisen. Die Blöcke oder Klumpen können etwas unregelmäßig geformt sein, da die Schwammschnitzel· die Hohlräume zwischen den größeren Stücken ausfüllen. Dies wird in Fig.2

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gezeigt, wo die größeren Stücke mit dem Buchstaben C und die dazwischenliegenden Schnitzel mit dem Buchstaben S bezeichnet sind. Günstige Anteil reichen von etwa 50 bis 60 Gewichtsteilen des geschnitzelten Materials bis 30 bis 40 Teilen des "würfelförmigen" Materials.

Bei der Verwendung des Apparats gemäß Fig. 1, z.B. für die Umwandlung eines Sirups mit einem geeigneten Enzym, wird der Sirup in den Kopf raum 11 am oberen Ende der Säule gepumpt und darin ein Flüssigkeitsspiegel oberhalb des oberen Endes des Celluloseschwamm-Materials aufrechterhalten, wie bei 18 angezeigt. Das Ventilauslaßrohr 15 wird geöffnet, um ein Ausströmen mit im wesentlichen derselben Geschwindigkeit wie das Einströmen zu ermöglichen, wobei die Säule 10 mit dem zu konvertierenden wässrigen Sirup gefüllt gehalten wird. Bei diesem Verfahren fließt der Sirup von oben nach unten durch das Bett mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um den gewünschten Umwandlungsgrad zu erreichen. Die Hohe und der Durchmesser des Bettes können abgeändert werden, wie es für das jeweilige Verfahren nötig ist. Bei den in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren kann das Bett aus Celluloseschwamm-Material z.B. eine Höhe von etwa 3»66 m (12 feet) und einen Durchmesser von etwa 2,44 m (8 feet) besitzen.

Beispiel 25

11,79 kg-(26 pounds)-Chargen von regeneriertem Celluloseschwamm (duPont) in Form geeigneter Würfel von unterschiedlicher Größe von 6,35 bis 19,05 mm (0,25 "bis 0,75 inches) werden in 227 kg (500 pounds) Wasser von 48,9°C (120⁰F) in einem 626 1-(175 gallon)-Bandmischer gemischt. Nach 20 minütigem Rühren wird das Wasser aus dem System abgelassen. Der

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Waschprozess wird dreimal \/iederholt, ohne den Schwamm aus dem Mischer zu entfernen, um einen von Verunreinigungen freien Schwamm zu erhalten.

Zu dem gewaschenen feuchten Schwamm werden dann 1665 1 (44-0 gallons) Wasser, 56,7 kg (125 pounds) wasserfreies Natriumsulfat, 5,67 kg (12,5 pounds) 4-7 %iges Natriumhydroxid und 1,13 kg (3,9 pounds) DEC · HCl zugegeben. Die Zugabenerfolgen unter Kühren und in der angegebenen Reihenfolge. Das gerührte Gemisch wird 1,5 h gerührt, während die Temperatur bei 50⁰C gehalten wird. Der pH des Gemisches wird dann mit Salzsäure auf 4 eingestellt und es wird 1/2 h gerührt. Die Flüssigkeit wird aus dem Gemisch abgelassen und dann wird sechsmal durch Zugabe von Wasser, 20 minütigem Rühren, Entwässern und Wiederholung des Verfahrens gewaschen.

Der feuchte Schwamm wird dann bei 38°C getrocknet. Die ergibt den Cellulosederivat-Schwamm in Würfelform. Der Stickstoffgehalt des Produkts beträgt 0,60 %.

Die geschnitzelte Form des Schwammderivats wird durch Mahlen der Würfelform auf einer Fitz-Mühle unter Verwendung eines 50,8 mm-Siebes (2 mesh) hergestellt.

61,69 kg (136 pounds) eines homogenen Gemisches von 65 Teilen Würfeln und 35 Teilen Schnitzeln wird auf eine Säule von 0,91 χ 3,66 m (3¹ x 12¹) gegeben (Fig. 1). Dann wird Wasser aufgegeben, um den Schwamm anschwellen zu lassen, bis das Wasser 30,5 cm (1 feet) über dem Bett steht. Das Cellulosebett ist 1,83 m (6 feet) tief.

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Dann wird eine Lösung aus 9,29 kg (20,5 pounds) Fungamyl (Novo) in 386 kg Wasser (850 pounds) durch die Säule 2 h lang im Kreislauf geleitet. Danach wird eine Lösung von 4·,64- kg (10,24-pounds, auf Trockenbasis) Glukoaraylase (G.zyme, Enzyme Development) zum Wasser gegeben und 2 h lang im Kreislauf durch die Säule geführt.

Dann wird filtriertes saurehydrolysiertes Maisstärkehydrolysat (Sirup) mit einem durchschnittlichen D.E. von 36 - 38 auf den Kopf der Säule gegeben. Die Siruptemperatur beträgt 54,4⁰C ⁰ und der pH ist auf 5,5 eingestellt.

Wenn sich der Säulenbetrieb stabilisiert hat, wird Sirup von 65 D.E. mit einem Gehalt von 36 % Dextrose und 35 % Maltose bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 17»O3 l/min (4-,5 gallons/ min) erzeugt.

Beispiel 26

Man wiederholt das Verfahren gemäß Beispiel 25, wobei jedoch nur G-zyme (11,3^ kg» 25 pounds) zum Haften an dem regenerierten Celluloseschwamm verwendet wird. Die anderen Bedingungen sind identisch, wobei jedoch der pH bei 4-,O bis 4-,5 und die Temperatur bei 6O⁰C (140⁰F) gehalten wird. Der erzeugte Sirup besitzt einen D.E. von 95·

Beispiel 27

Man wiederholt das Verfahren gemäß Beispiel 26 unter Verwendung eines zellfreien Enzyms aus Streptomyces ATCC 21175, hergestellt, wie in Beispiel 1 der US-PS 3 788 94-5 beschrieben. Bei Verwendung in einem Säulenverfahren mit einer Bett-Tiefe von 1,83 m (6¹) und einem Substratsirup von 95 D.E. beim pH 8 kann ein 4-2 % Fruktose enthaltendes Produkt mit kommerziell

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SO

annehmbaren Strömungsgeschwindigkeiten erzeugt werden.

Zusammenfassend betrifft die Erfindung einen Säulenapparat und ein Verfahren für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen, wobei ein Bett aus regeneriertem Schwamm-Material verwendet wird, das chemisch modifiziert wurde, um Enzym-immobilisierende Gruppen einzuarbeiten. Das für die Verwendung im Säulenapparat ausgewählte Schwamm-Material weist eine Länge von 0,61 bis 1,52 m oder mehr in Strömungsrichtung, eine Dichte von weniger als 1 g auf 18 cnr Bettvolumen (z.B. 1 g auf 20 bis 70 cnr Bettvolumen) und eine solche Wasser Strömungsporosität auf, daß mehr als o,20, vorzugsweise mehr als 0,4-1

1/min/dm durch das Bett fließen. Die Apparatur und das Verfahren können mit einer breiten Vielzahl von Enzymen verwendet werden, sind jedoch besonders auf die enzymatische Umwandlung von Stärkehydrolysaten anwendbar. Es können aus Stärke stammende Zuckersirupe mit D.E.-Werten von 40 bis 97 erzeugt werden. Ebenso kann die Isomerisierung von Glukosesirupen durchgeführt werden, um einen Sirup von erhöhter Süsse, der ein Gemisch von Glukose und Fruktose enthält, zu erzeugen.

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Claims (21)

Patentansprüche

1. Vorrichtung für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen, mit einer Säule, die eine Durchfluß-Reaktionskammer zwischen dem Flüssigkeitseinlaß und dem Flüssigkeitsauslaß aufweist, wobei sich die Reaktionskammer einige Mal 30 cm in Richtung des Flüssigkeitsstroms erstreckt, gekennz eichnet durch ein Bett (P) aus Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose in der Reaktionskammer, durch das die Flüssigkeit hindurchläuft, wobei die regenerierte Cellulose dieses Materials unter Einarbeitung einer wirksamen Menge an Enzyra-immobilisierenden Gruppen chemisch modifiziert wurde, und das Bett aus Schwamm-ilaterial

a) eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 61 cm,

b) eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 1 g des Schwamm-Materials (Trockenbasis) pro 18 cnr Bettvolumen und

c) eine solche Wasserströmungsporosität aufweist, daß mehr als 0,204 1/min/dm Bettquerschnitt hindurchfließen, ohne daß ein wesentlicher Druckabfall der Flüssigkeit aufgrund des

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telefon (Οββ) 9aaas?

telex os-aeseo

TELEGRAMME MONAPAT

TELEKOPIEBE«

Stromungswiderstand.es des Schvjainmbettes erfolgt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktionskammer und das Bett aus Schwamm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 1,52 m aufweisen.

3· Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2,dadurch gekennzeichnet , daß das Schwamm-Bett (P) unter Gebrauchsbedingungen eine Dichte von weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro 20 bis 70 cnr Bettvolumen aufweist.

4-, Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 * dadurch g e kenn ζ ei c h ne t, daß das Schwammbett eine solche Durchflußporosität für Wasser aufweist, daß mehr als 0,407 1 Wasser/

ρ
min/d m Bettquerschnitt ohne wesentlichen Flüssigkeitsdruckverlust über die Länge des Betts aufgrund des Strqmungswiderstands des Schwammbettes hindurchfließen.

5· Vorrichtung für Reaktionen mit immobilisierten Enzymen mit einer sich vertikal erstreckenden Säule, die eine Durchflußreaktionskammer zwischen dem Flüssigkeitseinlaß und den Flüssigkeitsauslässen, die einen vertikalen Abstand aufweisen, enthält, wobei die Reaktionskammer eine vertikale Erstreckung in der Richtung der Flüssigkeitsströmung von mehr als 1,52 m aufweist, gekennzeichnet durch ein Bett aus Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose in der Reaktionskammer, durch das die Flüssigkeit hindurchläuft, wobei die regenerierte Cellulose dieses Materials unter Einarbeitung einer wirksamen Menge an Enzym-immobilisierenden Gruppen chemisch modifiziert wurde und das Bett aus Schwamm-Material

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a) eine senkrechte Tiefe zwischen dem Einlaß und den Auslassen von wenigstens 1,52 m,

b) eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro 20 cm* Bettvolumen und

c) eine solche Wasserströmungsporosität aufweist, daß mehr

als 0,407 1 Wasser/min/dm Bettquerschnitt hindurchfließen, ohne daß ein wesentlicher Druckabfall der Flüssigkeit über das Bett in Strömunungsrichtung aufgrund des Strömungswiderstands des Schwammbettes erfolgt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzei chn e t , daß die chemisch an die regenerierte Cellulose gebundenen Enzym-immobilisierenden Gruppen kationische Stickstoffgruppen sind, wobei die Anzahl der Gruppen auf Basis von zugegebenem Stickstoff 0,2 bis 2,0 Gew.-% Stickstoff, bezogen aif Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entspricht.

7· Vorrichtung für Beaktionen mit immobilisierten Enzymen mit einer Säule, die eine Durchfluß-Reaktionskammer zwischen dem Flüssigkeitseinlaß- und Auslaßende ergibt, wobei sich die Reaktionskammer mehrere Male 30 cm in Strömungsrichtung erstreckt, gekennzeic hnet durch ein Bett aus Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose in der Reaktionskammer, durch das die Flüssigkeit hindurchläuft, wobei die regenerierte Cellulose dieses Materials chemisch gebundene kationische Stickstoffgruppen enthält, die bei der Enzym-Immobilisierung wirksam sind, die Gruppen tertiäre Amin- und/oder quaternäre Ammonium gruppen darstellen und in einer Menge, die 0,3 bis

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1,0 Prozent zugesetztem Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials entsprechen, vorliegen, wobei das Schwaimnbett eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 1,52 m und eine solche Dichte unter Gebrauchsbedingungen aufweist, daß 1 g des kationischen Schwamm-Materials (Trockenbasis) 20 bis 70 cnr Bettvolumen ausfüllt.

8. Vorrichtung für Reaktionen mit inmobilisierten Enzymen mit einer sich senkrecht erstreckenden Säule, die eine Durchfluß-Reaktionskammer zwischen dem PlussigkeitseinlaS- und -auslaß, die in senkrechtem Abstand zueinander liegen, bildet, wobei sich die Reaktionskammer mehr als 1,52 m in senkrechter Richtung des !"lüssigkeitsstroms erstreckt, gekennzeichnet durch ein flüssigkeitsdurchlässiges Bett (P) aus Schwamm-Material aus kationisch regenerierter Cellulose in der Reaktionskammer, wobei die kationischen Gruppen des Schwatnm-Materials solcherart und in einer solchen Menge im Bett vorliegen, daß sie zum Immobilisieren von Enzymen in dem Bett wirksam sind, wobei das Schwamm-Bett eine vertikale Tiefe in Fließrichtung von mehr als 1,52 m und eine solche Flüssigstromporosität aufweist, daß mehr als 0,204 1 Wasser/min/dm Bettquerschnitt hindurchfließen, ohne daß ein wesentlicher Druckabfall über das Bett hin in Strömungsrichtung aufgrund des Strömungswiderstands des Schwammbetts erfolgt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch g e k e η η zeichnet , daß das Schwammbett unter Gebrauchsbedingungen eine solche Dichte aufweist, daß 1 g kationisches Schwamm-Material (Trockenbasis) 30 bis 60 cnr Bettvolumen füllt,

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 91 dadurch gekennz eichnet, daß das Schwammbett eine solche

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Porosität für einen Flüssigkeitsstrom aufweist, daß mehr als

0,407 1 Wasser/min/dm Bettquerschnitt ohne wesentlichen Druckabfall der Flüssigkeit über das Bett hin in Strömungsrichtung aufgrund des Strömungswiderstands des Bettes hindurchfließen.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennz ei chnet, daß die kationischen Stickstoffgruppen tertiäre Amingruppen und/oder quaternäre Aamoniumgruppen sind und das Schwamm-Material des Betts eine solche Menge dieser Gruppen enthält, die 0,3 bis 1,0 Gew.-% zugesetztem Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, ent spricht.

12. "Verfahren zur Reaktion einer wasserlöslichen Enzym-umwandelbaren Substanz mit einem Enzym, da5 nicht Cellulase ist, bei dem eine wässrige Lösung der Substanz durch ein poröses Bett aus Material, das darin wenigstens ein Enzym für die Reaktion immobilisiert enthält, hindurchgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet , daß man als Bett ein Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, das chemisch unter Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzym-immobilisierenden Gruppen modifiziert wurde, wobei das Bett aus Schvrainm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 61 cm und eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger 1 g Schamm-Material (Trockenbasis) pro 18 cnr Bettvolumen aufweist und die wässrige Lösung durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von mehr als
querschnitts hindurchleitet

schwindigkeit von mehr als 0,204 1 Lösung/min/dm des Bett-

13- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bett aus Schwamm-Material verwendet, das in

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Strörnungsriciitung eine Länge von wenigstens "1,52 m und eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro 25 cnr Bettvolumen aufweist.

14-. Verfahren zur Reaktion einer wasserlöslichen, Enzymumwandelbaren Substanz mit einem Enzym, das nicht Cellulase ist, bei dem eine wässrige Lösung der Substanz durch ein poröses Bett aus Material, das darin wenigstens ein Enzym für die Reaktion immobilisiert enthält, hindurchgeleitet wird, dadurch gekennz ei chnet, daß man als Bett ein Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, das chemisch unter Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzym-immobilisierenden Gruppen modifiziert wurde, wobei das Bett aus Schwamm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 1,52 m und eine solche Dichte unter Gebrauchsbedingungen aufweist, daß 1 g Schwamm-Material (auf Trockenbasis) 20 bis 70 cnr Bettvolumen füllt, und die Lösung durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von mehr als 0,13^· 1 pro Minute pro 1 Bettvolumen hindurchleitet.

15· Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeic hne t, daß man ein solches Schwammbett verwendet, das unter Gebrauchsbedingungen eine solche Dichte aufweist, daß 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) JO bis 60 cnr Bettvolumen füllt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15» dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzym-immobilisierende Gruppen, die chemisch an die regenerierte Cellulose gebunden sind, kationische Stickstoffgruppen verwendet, wobei die Anzahl der Gruppen auf Basis von zugesetztem Stickstoff 0,2

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bis 2,0 Gew.-% Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entspricht.

17· Verfahren zur Reaktion einer wasserlöslichen, Enzym-umwandelbaren Substanz mit einem Enzym, das nicht Cellulase ist, bei dem eine wässrige Lösung der Substanz durch ein poröses Bett aus Material, das darin wenigstens ein Enzym für die Reaktion immobilisiert enthält, hindurchgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet , daß man als Bett ein Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, das chemisch unter Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzymimmobilisierenden Gruppen modifiziert wurde, wobei die regenerierte Cellulose des Materials chemisch gebundene kationische Stickstoffgruppen enthält, die bei der Enzym-Immobilisierung wirksam sind, die Gruppen tertiärer Amin- und/oder quaternäre Ammoniumgruppen darstellen und in einer Menge vorliegen, die 0,3 bi 1,0 % zugegebenem Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entsprechen, wobei das Bett aus Schwamm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 1,52 m und eine solche Dichte unter Gebrauchsbedingungen aufweist, daß 1 g des kationischen Schwamm-Materials (Trockenbasis) 20 bis 70 cm* Bettvolumen ausfüllt, und die wässrige Lösung durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von

ρ mehr als 0,407 1 Lösung pro Minute pro dm Bettquerschnitt hindurchleitet.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17» wobei man enzymatisch ein Zuckersubstrat aus der Glukose, aus Stärke stammende Oligosaccharide und Gemische von Glukose und diesen Oligosacchariden enthaltenden Gruppe wählt, bei dem man eine wässrige Lösung des Zuckersubstrate durch ein poröses Materialbett leitet, das wenigstens ein Enzym für die Umwandlung

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aus der Gruppe Alphaamylase, Glukoamylase und Glukoseisomerase darauf immobilisiert enthält, dadurch gekennz e ic h n e t , daß nan in dem Bett ein Schwamm-Material aus regenerierter Cellulose verwendet, das chemisch zur Einarbeitung einer wirksamen Menge von Enzym-immobilisierenden Gruppen modifiziert wurde, wobei das Bett aus Schwamm-Material eine Länge in Strömungsrichtung von wenigstens 1,52 m und eine Dichte unter Gebrauchsbedingungen von weniger als 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) pro 20 cnr Bettvolumen aufweist, und die Zuckerlösung durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 0,204 1

2
Lösung pro Minute pro dm hindurchleitet.

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bett aus Schwamm-Material verwendet, das in Strömungsrichtung eine Länge von wenigstens 1,52 m und unter Gebrauchsbedingungen eine solche Dichte aufweist, daß 1 g Schwamm-Material (Trockenbasis) 30 bis 60 cnr Bettvolumen ausfüllt, und die Lösung durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von über 0,407 1 Lösung pro Minute pro

ρ
dm Bettquerschnitt hindurchleitet.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym-immobilisierende Gruppen, die chemisch an die regenerierte Cellulose gebunden sind, kationische Stickstoffgruppen verwendet, deren Anzahl auf Basis von zugesetztem Stickstoff 0,2 bis 2,0 Gew.-% Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials, entspricht.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20,dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym-immobilisierende Gruppen, die chemisch an die regenerierte Cellulose gebunden sind,

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kationische Stickstoffgruppen, nämlich tertiäre Amin- und/oder quaternäre Ammoniumgruppen, verwendet, die in einer Menge vorliegen, die 0,3 bis 1,0 % zugesetztem Stickstoff, bezogen, auf
Trockengewicht des kationischen Schwamm-Materials entsprechen, und daß man ein Schwamm-Material einer solchen Dichte verwendet, daß 1 g des kationischen Schwanra-Materials (Trockenbasis) 30 bis 60 cnr Bettvolumen füllt.

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