DE3020614A1

DE3020614A1 - Verfahren zur gewinnung von cyclodextrinen

Info

Publication number: DE3020614A1
Application number: DE19803020614
Authority: DE
Inventors: Koki Horikoshi; Masanobu Kawano; Nobuyuki Nakamura; Mikio Yamamoto
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1980-05-30
Publication date: 1981-01-29
Also published as: BE883579A; FR2457900B1; DE3020614C2; FR2457900A1; GB2053923B; US4303787A; JPS56805A; GB2053923A; JPS609524B2

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen.

Cyclodextrine sind Hydrolysate, die durch Umsetzung von einigen gelatinisierten oder verflüssigten Stärken mit Cyclodextringlycosyltransferase erhalten werden. Im allgemeinen werden sie unter Verwendung von durch Mikroorganismen, wie Bacillus macerans, Bacillus circulans und dergleichen, oder durch alkalophile Bakterien gebildeterCyclodextrin-glycosyltransferase erhalten; vgl. Enzyme Handbook, Hrsg. Shiro Akabori, Asakura Shoten, 1966, JA-PS 886 853, JA-AS 31223/1978, US-PS 3 923 598, GB-PS 1 459 654 und FR-PS 74.37001. Cyclodextrine sind nicht-reduzierende Dextrine mit einer kronenartigen Struktur, wobei 6 bis 12 Glucoseeinheiten cyclisch untereinander durch oC-1,4-glucosidische Verknüpfung verbunden sind. Es wurde kürzlich berichtet, dass einige dieser Cyclodextrine verzweigte Strukturen aufweisen, wobei die Glucoseeinheiten durch o(-1,6-glucosidische Ver-

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knüpfung unter Bildung von verzweigten Cyclodextrinen miteinander verbunden sind.

α -Cyclodextrin, ß-Cyclodextrin und J^-Cyclodextrin, die aus 6, 7 bzw. 8 Gluooseeinheiten bestehen, eignen sich für industrielle Zwecke. Das Cyclodextrinmolekül weist eine ringähnliche Gestalt auf. In dem durch das Molekül gebildeten Hohlraum im Innern herrschen hydrophobe Bedingungen. Andererseis bestehen an der Aussenseite und an der Öffnung des Hohlraums hydrophile

Ό Bedingungen. Diese spezielle Struktur des Cyclodextrinmoleküls steht in engem Zusammenhang mit der Bildung von Einschlüssen.Die Hohlräume der Moleküle vonoi-, ß- und /"-Cyclodextrin weisen Grossen von etwa 6 2, 8 2 bzw. 10 2 auf. Wie vorstehend erwähnt, kann das Cyclodextrinmolekül bestimmte Moleküle, deren Grosse dem jeweiligen Hohlraum entspricht, einschliessen. Demzufolge werden Cyclodextrine in grossem Umfang für Nahrungsmittel, Arzneimittel, Kosmetika, landwirtschaftliche Chemikalien und dergleichen verwendet. Es ist zu erwarten, dass weitere Anwendungsgebiete aufgefunden werden.

Es gibt verschiedene Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinen. Bei herkömmlichen Verfahren werden bestimmte gelatinisierte oder verflüssigte Stärken mit Cyclodextrin-glycosyltransferase umgesetzt. Die die Cyclodextrine enthaltenden Stärke-

hydrolysate werden mit einem organischen Lösungsmittel versetzt, um die Cyclodextrine auszufällen. Die in den Hydrolysaten enthaltenen gewünschten Cyclodextrine werden von acyclischen Dextrinen getrennt. Bei derartigen Verfahren ist die Verwendung von schädlichen organischen Lösungsmitteln, wie Trichloräthylen,

Tetrachloräthan, Brombenzol, Toluol oder dergleichen, unvermeidlich. Aus diesem Grund sind derartige Verfahren im Hinblick auf die immer strenger werdenden Umweltbestimmungen unerwünscht. Ausserdem ergeben sich bei diesen Verfahren wirtschaftliche und

technische Nachteile.
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Bei einem weiteren Verfahren werden die vorerwähnten Stärkehydrolysate, die die Cyclodextrine enthalten, mit einem saccha-

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rifizierenden Enzym, wie Glucoamylase, das Cyclodextrine kaum hydrolysiert, unter Hydrolyse der in den Hydrolysaten enthaltenen acyclischen Gemische zu Glucose umgesetzt. Anschliessend wird die ein Zuckergemisch enthaltende Lösung mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Aceton oder dergleichen, versetzt, um die Cyclodextrine selektiv zu fällen. Die so ausgefällten Cyclodextrine werden anschliessend abgetrennt; vgl. Starch Science, (DENPUNKAGAKU), Bd. 22, Nr. 1 (1975), S. 6 bis 10.

Um eine wirksame.Abtrennung von Cyclodextrinen zu erreichen, ist es erstrebenswert, dass das Enzym auf in hohen Konzentra-· tionen vorliegende Stärke einwirkt. Jedoch ist es unter diesen Bedingungen schwierig, eine homogene Stärkegelatinisierung zu erreichen. Ausserdem bereitet die Aufarbeitung aufgrund der hohen Viskosität grosse Schwierigkeiten. Andererseits treten bei Verwendung von geringen Stärkekonzentrationen ebenfalls viele Nachteile auf, die darauf zurückzuführen sind, dass zur Fällung und Abtrennung der Cyclodextrine komplizierte Vorrichtungen und teure Reagentien erforderlich sind. Ferner entstehen beträchtliche Kosten bei der Konzentrierung der Zuckerlösungen. Zur Überwindung dieser Nachteile wurde ein Verfahren zur Herstellung und Abtrennung von Cyclodextrinen vorgeschlagen, bei dem Cyclodextrin-glycosyltransferase mit einer verflüssigten Stärkelösung hoher Konzentration, die durch Ver-

flüssigung von Stärke nach einem herkömmlichen Verfahren, beispielsweise durch Reaktion einer geringen Menge an <X-Amylase oder einer Säure mit einer Ausgangsstärkelösung, erhalten worden ist, umgesetzt wird; vgl. JA-AS 2380/1971.

In sämtlichen vorerwähnten Verfahren werden zur Fällung der gebildeten Cyclodextrine organische Lösungsmittel verwendet. . Somit lassen sich die erhaltenen Cyclodextrine aufgrund der Toxizität nicht für Arzneimittel, Nahrungsmittel und dergleichen verwenden. Dies stellt einen grundlegenden Nachteil derartiger

Verfahren dar.

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Es wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem Cyclodextrin ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln entwickelt; vgl. JA-PS 914 137, JA-AS 43 897/1977, US-PS 4 135 97' GB-PS 1 459 654 und FR-PS 74.37001. Bei diesem Verfahren lässt man Cyclodextrin-glycosyltransferase, die durch Bacillus sp. gebildet ist und ein pH-Optimum im alkalischen Bereich aufweist, auf Stärke einwirken. In diesem Reaktionsgemisch werden sodann acyclische Dextrine hydrolysiert und das so behandelte Gemisch eingeengt, wodurch man ein Konzentrat mit einem Gehalt an mindestens 40 Prozent Cyclodextrinen erhält. Das Konzentrat wird sodann zur Ausfällung der Cyclodextrine mit einer geringen Cyclodextrinmenge angeimpft.

Es wurde auch ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen ohne Verwendung organischer Lösungsmittel bereitgestellt; vgl. JA-OS 136 889/1976. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung mit einem Gehalt an Cyclodextrinen und reduzierenden Zuckern in Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz vom OH-Typ gebracht, um nur die reduzierenden Zucker daran zu adsorbieren. Die nicht-adsorbierten Cyclodextrine werden dadurch von den reduzierenden Zuckern getrennt. Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass Cyclodextrine ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln gewonnen werden. Die erhaltene Lösung weist jedoch eine geringe Cyclodextrinkonzentration auf, so dass zur Fällung und Isolierung der Cyclodextrine ein Konzentrationsschritt erforderlich ist, wodurch die Ausbeuten an Endprodukt gering werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein in hohen Ausbeuten verlaufendes Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen bereitzustellen, bei dem keine organischen Lösungsmittel verwendet werden.

Beim erfindungsgemässen Verfahren geht man von einer Lösung aus, die Cyclodextrine sowie Stärken, Dextrine, reduzierende Zucker und dergleichen enthält. Beispielsweise werden Stärkehydrolysate · mit einem Gehalt an Cyclodextrinen, ein durch Filtration einer

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ß-Cyclodextrin enthaltenden Lösung erhaltenes Filtrat oder eine Zuckerlösung verwendet, die durch enzymatische Behandlung der Stärkehydrolysate oder des Filtrats erhalten worden ist und die hauptsächlich Cyclodextrine und reduzierende Zucker enthält. Die erfindungsgemäss verwendete Lösung wird in Kontakt mit einem synthetischen Adsorptionsharz gebracht, das ein poröses, nur Cyclodextrine adsorbierendes Polymerisat enthält. Die auf diese Weise adsorbierten Cyclodextrine werden anschliessend durch Elution mit Wasser unter Erwärmen abgetrennt.

Auf diese Weise werden hochreines tx-, ß- oder ^Cyclodextrin oder andere Cyclodextrine und gegebenenfalls ausschliesslich ' c£ -Cyclodextrin in hohen Ausbeuten erhalten. Beim erfindungsgemässen Verfahren werden keine organischen Lösungsmittel verwendet.

Somit entfallen die Schwierigkeiten, die boi herkömmlichen Verfahren durch die Verwendung von schädlichen organischen Lösungsmitteln auftreten.

Wie erwähnt, geht das erfindungsgemässe Verfahren von einer Lösiing aus, die Cyclodextrine sowie Stärken, Dextrine, reduzierende Zucker und dergl. enthält. Z.B. werden folgende Lösungen verwendet: Hydrolysate, die durch Umsetzung von bestimmten gelatinisierten oder verflüssigten Stärken mit Cyclodextrin-glycosyltransferase erhalten worden sind und Cyclodextrin enthalten; Filtrate, die durch Filtration dieser Hydrolysate mit einem Gehalt an ß-Cyclodextrin erhalten worden sind; oder Zuckerlösungen, die durch Umsetzung der Hydrolysate oder der Filtrate mit einem saccharif!zierenden Enzym, das Cyclodextrine nicht oder kaum hydrolysiert, unter Hydrolyse von darin enthaltenen acyclischen Dextrinen erhalten worden sind und hauptsächlich Cyclodextrine und reduzierende Zucker enthalten. Diese Lösungen werden mit einem synthetischen Adsorptionsharz, das ein poröses Polymerisat, das nur Cyclodextrine adsorbiert, in Kontakt gebracht. Die auf diese Weise adsorbierten Cyclodextrine werden, sodann zur Abtrennung von den reduzierenden Zuckern mit Wasser eluiert.

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Beispiele für als Ausgangsmaterialien verwendete STärken sind Kartoffelstärke, Stärke aus Süsskartoffeln, Maisstärke und entsprechende handelsübliche Produkte, sowie verschiedene andere stärkehaltige Materialien.

Vor der Umsetzung mit Cyclodextrin-glycosyltransferase wird die in Wasser suspendierte Stärke durch Umsetzung mit bakterieller oc-Amylase oder Säuren oder durch Rühren mit Wasser unter Erhitzen verflüssigt. Im allgemeinen eignen sich Stärkekonzentrationen in der Flüssigkeit von 2 bis 40 Gewichtsprozent. Es ist erforderlich, den pH-Wert der verflüssigten Stärke auf das pH-Optimum von Cyclodextrin-glycosyltransferase einzustellen. Wird beispielsweise ein aus Bacillus macerans erhaltenes Enzym verwendet, so kann der pH-Wert der verflüssigten Stärke 5,0 bis 7,0 und vorzugsweise 5,5 bis 6,0 betragen. Bei Verwendung eines Enzyms aus alkalophilen Bakterien kann der pH-Wert 5,0 bis 10,5 und vorzugsweise 7,0 bis 9,0 betragen.

Beispiele für entsprechende Cyclodextrin-glycosyltransferasen sind Enzyme, die durch Bacillus macerans, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermofilus, Klebsiella pneumoniae oder dergleichen oder durch alkalophile Bakterien, wie Bacillus sp. Nr. 38-2 (ATCC 21783), Bacillus sp. Nr. 135 (ATCC 21595), Bacillus sp. Nr. 169 (ATCC 21594), Bacillus sp.

Nr. 13 (ATCC 31006) und Bacillus sp. Nr. 17-1 (ATCC 31007) gebildet .worden sind. Sämtliche vorerwähnten Mikroorganismenstämme sind der Öffentlichkeit ohne Beschränkungen zugänglich. Diese Enzyme können in reiner Form oder in Form von Rohprodukten eingesetzt werden.

Erfindungsgemäss wird die verflüssigte Stärke mit Cyclodextringlycosyltransferase unter Bedingungen umgesetzt, die für die vorwiegende Bildung von oC-, ß- und ^Cyclodextrin ein pH-Optimum darstellen. Das Gemisch wird sodann gegebenenfalls konzentriert.

Die auf diese Weise erhaltenen, Cyclodextrine enthaltenden Hydrolysate oder Filtrate, die durch Filtration einer ß-Cyclodextrin enthaltenden Lösung gemäss dem vorerwähnten Verfahren ohne

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1 organische Lösungsmittel (vgl. JA-PS 91^ 137) erhalten worden sind, können direkt für die nachfolgende Abtrennung eingesetzt werden. Ferner kann ein Reaktionsgemisch verwendet werden, das durch Umsetzung der Hydrolysate oder Filtrate mit einem saccharifizierenden Enzym, das Cyclodextrine nicht oder kaum hydrolysiert und acyclische Dextrine in reduzierende Zucker verwandelt, erhalten worden ist. Es kann auch ein Reaktionsgemisch verwendet werden, das durch Umsetzung der Hydrolysate oder Filtrate mit einem saccharifizierenden Enzym, das «-Cyclodextrin nicht oder kaum hydrolysiert und ß- und ^-Cyclodextrin und acyclische Dextrine in reduzierende Zucker verwandelt, erhalten worden ist. Als saccharifizierende Enzyme werden beim orfindungsgemässen Verfahren im erstgenannten Fall saccharifizierende Enzyme vom Exo-Typ verwendet, wie Glucoamylase, ß-Amylase und Pullulanase sowie bakterielle, verflüssigende oC-Amylase. Im letztgenannten Fall können bakterielle, saccharifizierende ct-Amylase, sowie Amylase aus Pilzen und dergleichen verwendet werden. Unter diesen saccharifizierenden Enzymen bewirken Glucoamylase, #-Amylase und Pullulanase überhaupt keine Hydrolyse von Cyclodextrinen, wählend bakterielle, saccharifizierende od-Amylase Λ-Cyclodextrin kaum hydrolysiert und dagegen ß- und /"-Cyclodextrin vollständig, zu reduzierenden Zuckern hydrolysiert.

Zur Abtrennung von Cyclodextrinen aus den auf diese Weise erhaltenen Hydrolysaten oder Filtraten oder aus gemischten Zuckerlösungen mit einem Gehalt an Cyclodextrinen und reduzierenden Zuckern, die durch enzymatische Umsetzung der Hydrolysate oder Filtrate erhalten worden sind, werden die Hydrolysate und Filtrate direkt über eine mit einem synthetischen Adsorptionsharz gepackte Säule gegeben. Vorzugsweise wird jedoch die Viskosität der Hydrolysate und Filtrate verringert, um den Betrieb der mit dem Harz gepackten Säule zu erleichtern. Zur Verringerung der Viskosität wird vorzugsweise eine Behandlung mit einem der vorstehend erwähnten saccharifizierenden Enzyme durchgeführt. Dabei werden Glucoamylase oder bakterielle, verflüssigende «.-Amylase zur vorwiegenden Gewinnung von CX-, ß- und ^Cyclodextrin sowie bakterielle, saccharifizierende oC-Amylase zur

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ausschliesslichen Gewinnung von tf-Cyclodextrin verwendet. Bei der Behandlung mit der letztgenannten bakteriellen, saccharifizierenden ex -Amylase ist es erforderlich, ß- und ^-Cyclodextrin vollständig zu hydrolysieren, während es nicht notwendig ist, die verbleibenden linearen und verzweigten Dextrine vollständig in reduzierende Zucker zu verwandeln.

Erfindungsgemäss werden die die Cyclodextrine enthaltenden Lösungen, beispielsweise die Hydrolysate, Filtrate oder die durch eine enzymatische Behandlung derselben erhaltenen gemischten Zuckerlösungen, die Cyclodextrine und reduzierende Zucker enthalten, in Kontakt mit einem synthetischen Adsorptionsharz gebracht, das ein zur ausschliesslichen Adsorption von Cyclodextrinen geeignetes poröses Polymerisat enthält. Beispielsweise kann die Lösung kontinuierlich von oben nach unten über eine mit dem Harz gepackte Säule gegeben werden. Durch diesen Kontakt werden die in Abwärtsrichtung beförderten Cyclodextrine selekti ' und vollständig am Kunstharz adsorbiert. Andererseits werden die in der gleichen Richtung beförderten reduzierenden Zucke · und verbleibenden acyclischen Dextrine überhaupt nicht adsorbiert, sondern befinden sich quantitativ in der von der Säule abströmenden Flüssigkeit. Anstelle der vorstehend erläuterten Strömungsrichtung von oben nach unten kann die Säule selbstverständlich auch in Aufwärtsrichtung betrieben werden.

Die Lösung wird kontinuierlich über die Säule gegeben, bis das synthetische Adsorptionsharz gesättigt ist. Anschliessend wird anstelle der Lösung Wasser über die Säule gegeben, um die nicht an der Säule adsorbierten reduzierenden Zucker auszuwaschen.

Nach Sättigung des Adsorptionsharzes kann eine gemischte Fraktion aus Cyclodextrinen und reduzierenden Zuckern, die nicht adsorbiert worden sind, gewonnen und zurückgeleitet werden. Ferner kann die Anfangsfraktion zur Gewinnung von reduzierenden Zuckern oder als eine Lösung mit einem Gehalt an reduzierenden Zuckern verwendet werden.

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Die Strömungsgeschwindigkeit steht in enger· Beziehung mit der Diffusionsgeschwindigkeit von Cyclodextrin in das Innere der in der Säule befindlichen Teilchen des Adsorptionsharzes, d.h. mit der Cyclodextrinkonzentration in der Nähe der Teilchen des Adsorptionsharzes pro Zeit- und Volumeneinheit. Somit kann die Cyclodextrinkonzentration einer über die Säule gegebenen Lösung umso höher sein, je geringer die Strömungsgeschwindigkeit der Lösung ist. Wird beispielsweise ein Filtrat, das durch Filtration einer ß-Cyclodextrin enthaltenden Lösung erhalten worden ist und 30 Prozent Gesämtzucker und 20 Prozent Cyclodextrine, bezogen auf das Gesamtzuckergewicht, enthält, über die Säule gegeben, so kann SV praktisch etwa 1 sein.

Theoretisch kann die Dicyclodextrine enthaltende Lösung, die über die mit dem Adsorptionsharz gepackte Säule gegeben wird, eine hohe Konzentration aufweisen. Unter Berücksichtigung von Kanalbildungserscheinungen innerhalb der Säule aufgrund der hohen Viskosität der Lösung und des spezifischen Gewichts des Adsorptionsharzes und der Lösung beträgt die Konzentration der Lösung vorzugsweise weniger als 30 Prozent Gesamtzucker.

Das Adsorptionsharz weist keine funktionellen Gruppen, wie sie in Ionenaustauscherharzen vorliegen auf, so dass keine Nebenreaktionen auftreten. Demzufolge ist die Temperatur, bei der die Lösung über die Säule gegeben wird, nicht besonders begrenzt. Im allgemeinen werden die adsorbierten Cyclodextrine unter Erwärmen, vorzugsweise auf weniger als 50⁰C, eluiert.

Wie bereits erwähnt, werden nur Cyclodextrine selektiv aus den Hydrolysaten, Filtraten oder gemischten Zuckerlösungen, die durch enzymatisehe Behandlung der Hydrolysate oder Filtrate erhalten worden sind und Cyclodextrine und reduzierende Zucker enthalten, an dem in der Säule befindlichen Adsorptionsharz adsorbiert. Die am Adsorptionsharz adsorbierten Cyclodextrine werden sodann mit Wasser unter Erwärmen eluiert und damit abgetrennt.

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Nachdem das Kunstharz mit Cyclodextrinen gesättigt ist, werden die verbleibenden, nicht am Kunstharz adsorbierten Zucker mit Wasser bei Raumtemperatur ausgewaschen. Anschliessend wird warmes Wasser auf die Säule aufgesetzt oder es wird Wasser über die Säule gegeben und die Temperatur innerhalb der Säule erhöht, indem man heisses Wasser oder Wasserdampf durch einen um die Säule gelegten Mantel leitet. Dadurch werden die adsorbierten Cyclodextrine eluiert. Bei Anwendung eines Temperaturgradienten werden zunächst oC- und ^-Cyclodextrin und anschliessend ß-Cyclodextrin getrennt eluiert. Die Reihenfolge, in der ot- und J^- Cyclodextrin eluiert werden, sowie die Temperatur, bei der die einzelnen Cyclodextrine eluiert werden, hängen von den Eigenschaften des verwendeten Adsorptionsharzes ab. Wie vorstehend erwähnt, lassen sich die am Adsorptionsharz adsorbierten Cyclodextrine leicht mit heissem Wasser oder Wasserdampf eluieren und abtrennen. Das Adsorptionsharz kann daher ohne ein Regenerationsverfahren, das bei Ionenaustauscherharzen erforderlich ist, wieder verwendet werden. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens dar.

Nachstehend werden das erfindungsgemässe Adsorptionsverfahren und die dabei verwendeten Adsorptionsharze näher erläutert.

Im allgemeinen ist unter einer Adsorptionserscheinung an einem Feststoff zu verstehen, dass eine Kraft auf eine zu adsorbierende Substanz ausgeübt wird und dadurch diese Substanz an der Oberfläche des Feststoffs festgehalten wird. Es gibt verschiedene Arten von Wechselwirkungen zwischen zu adsorbierender Substanz und dem Feststoff, z.B. eine hydrophobe Bindung,.eine Dipol-Wechselwirkung und eine Wasserstoffbrückenbindung. Es ist auch bekannt, dass hydrophobe oder nicht-polare Moleküle oder entsprechende Reste leicht von hydrophoben Oberflächen angezogen werden, während hydrophile oder polare Substanzen leicht durch hydrophile oder polare Oberflächen angezogen werden. Erfindungsgemäss wurde nach Adsorptionsharzen gesucht, die aus Cyclodextrinen enthaltenden Lösungen selektiv nur Cyclodextrine adsorbieren. Dabei wurde auch genau auf die allgemeinen Eigen-

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schäften eines hydrophoben Adsorptionsmittels, das zur Abtrennung von hydrophoben organischen Substanzen aus Lösungen mit einem Gehalt an hydrophilen Substanzen, die nicht durch das Harz adsorbiert werden, in der Lage ist, geachtet. Erfindungsgemäss wurde erstmals experimentell bestätigt, dass bei Kontakt einer Cyclodextrin enthaltenden Lösung mit einem hydrophoben Adsorptionsmittel, das ein poröses Polymerisat mit Poren, in die flüssiges Wasser nicht eintreten kann, enthält, Cyclodextrine, die eine hydrophobe innere Oberfläche aufweisen, die adsorbierende Oberfläche durch die Poren erreichen und dort adsorbiert werden. Ferner wurde festgestellt, dass sich eine ausgezeichnete Adsorbierbarkeit erreichen läßt, wenn man die Porengrösse und die Oberfläche des ein poröses Polymerisat enthaltenden Adsorptionsmittels in entsprechender Weise wählt.

Es wird vermutet, dass das Cyclodextrinmolekül nach Erreichen der Harzoberfläche eine lipophile Gruppe auf der Harzoberfläche aufgrund seiner hydrophoben Natur im Innern des Moleküls aufnimmt und dabei eine Einschlussverbindung (Klathrat) bildet, so dass die Cyclodextrine an der Harzoberfläche adsorbiert werden.

Im erfindungsgemässen Verfahren wird als synthetisches Adsorptionsharz ein synthetisches Adsorptionsmittel verwendet, das eine grosse Netzstruktur aufweist und ein poröses Polymerisat in Form von Kugeln oder Platten oder in amorpher Form enthält. Bei diesem Kunstharz handelt es sich um ein hydrophobes organisches poröses Harz, z.B. Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate, Äthylen-Vinylbenzol-Copolymerisate, Fluorkunststoffe, Silikonharze und Polyolefinharze. Besonders geeignet sind Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate.

Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate in Kugelform lassen sich beispielsweise erhalten, indem man Styrol und Divinylbenzol (Vernetzungsmittel) in Wasser suspendiert und polymerisiert, wodurch man ein poröses Polymerisat mit einer grossen Anzahl von Mikroporen erhält. Im erfindungsgemässen Verfahren erweisen sich poröse Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate mit einer

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spezifischen Oberfläche von mehr als etwa 100 m /g als besonders wertvoll.

Derartige Copolymerisate weisen eine sehr geringe Polarität und eine grosse interne Oberfläche auf. Ferner besitzen sie die Eigenschaft, dass Wasserdampf adsorbiert werden kann, während Wasser in flüssiger Form nicht in die Poren eintreten kann.

Bezüglich der Zusammensetzung des Copolymerisats und der spezifischen Oberfläche bestehen beim erfindungsgemässen Verfahren keine besonderen Beschränkungen. Im allgemeinen werden Polymerisate mit einer spezifischen Oberfläche von weniger als et-

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wa 1000 m /g bevorzugt. Die Porosität des Polymerisats beträgt vorzugsweise 40 bis 90 Prozent. Eine Porosität von weniger als 35 Prozent führt zu einer Verringerung der Oberfläche und einer Gewichtszunahme, während bei einer Porosität von mehr als 95 Prozent sich eine Deformation der Polymerisatteilchen beim Pakken der Säule ergibt, was schliesslich zu einem Anstieg im Wasserdruckverlust führt. Somit sind Porositäten oberhalb und unterhalb des angegebenen Bereichs nicht wünschenswert.

Ferner können die vorerwähnten Copolymerisate in Form von hydrophoben Derivaten, die durch Behandlung mit Silan oder dergleichen erhalten worden sind, eingesetzt werden. Bezüglich der Oberfläche des Adsorptionsmittels ist die Porengrösse wichtig. Die Anwesenheit von Öffnungen mit ausreichender und geeigneter Grosse ist erforderlich, damit die Cyclodextrine durch die Öffnungen zur Adsorptionsoberfläche gelangen und adsorbiert werden können.

Zwischen der Oberfläche und der Porengrösse besteht eine umgekehrt proportionale Beziehung. Je geringer die Porengrösse des Adsorptionsmittels ist, desto grosser wird die Oberfläche. Deshalb werden unter Berücksichtigung der Molekulargewichte (tf : 973, β : 1135, y: 1297) und Grossen der Cyclodextrine Adsorptionsmittel mit einer spezifischen Oberfläche von 100 bis 1000 m /g und einer entsprechenden Grosse gewählt.

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•j Beispiele für adsorbierende poröse Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate, die die vorerwähnten Eigenschaften aufweisen, sind Araberlite XAD-2 und -4 (Rohm & Haas Co., V.St.A.) Diaion-HP (Mitsubishi Chemical Ind., Ltd., Japan) und Porapak-N, -P, -Q,

5-R und Porapak-QS (Waters Associates, Inc.).

Wie vorstehend erwähnt, wird die Elution mit Wasser unter Erwärmen durchgeführt. Bei herkömmlichen Verfahren wird der Grossteil der adsorbierten Substanz im allgemeinen mit entsprechenden organischen Lösungsmitteln, Basen oder Säuren, die in Wechselwirkung mit der Oberfläche des Adsorptionsmittels treten, durchgeführt. Demgegenüber lässt sich beim erfindungsgemässen Verfahren die Elution der adsorbierten Cyclodextrine leicht und einwandfrei mit heissem Wasser oder Wasserdampf ohne jegliche Verwendung von organischen Lösungsmitteln als Elutionsmittel durchführen.

Wie bereits mehrfach erwähnt, werden in keinem Verfahrensschritt organische Lösungsmittel verwendet, weder zur Herstellung der Ausgangsmaterialien, noch zur Durchführung der Adsorptions- oder Elutionsvorgänge. Somit kommt dem erfxndungsgemässen Verfahren bei der grosstechnischen Gewinnung von Cyclodextrin eine besondere Bedeutung zu.

Wie bereits erwähnt, wird beim erfindungsgemässen Verfahren ein gewünschtes Cyclodextrin von der das Cyclodextrin enthältenden Lösung abgetrennt und ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln direkt gewonnen. Bemerkenswert ist auch, dass das erfindungsgemässe Verfahren in hohen Ausbeuten abläuft, ohne dass zusätzliche Behandlungsschritte erforderlich sind.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Cyclodex-• trine können nach üblichen Verfahren weiter behandelt werden.

Bei Verwendung von anderen Adsorptionsharzen, die reduzierende Zucker, nicht aber Cyclodextrine adsorbieren, erhält man reineres Cyclodextrin.

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Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Vergleichsbeispiel· 1

15 Liter einer 4-prozentigen (Gew./Vol.) Lösung von Kartoffelstärke (Stärkegehalt 600 g) werden auf den pH-Wert 5,5 eingestellt und 30 Minuten bei 125°C homogen gelatinisiert und sodann rasch abgekühlt.

Ein Züchtungsmedium mit einem Gehalt an 1 Prozent Maisquellflüssigkeit, 1 Prozent löslicher Stärke, 0,5 Prozent Ammoniumsulfat und 0,5 Prozent Calciumcarbonat wird zur Sterilisation 30 Minuten auf 12O⁰C erhitzt und sodann gekühlt. Anschliessend wird das Medium mit Bacillus macerans (IAM 1243; IAM = Institute of Applied Microbiology, Universität Tokyo) beimpft und 2 Tage bei 37 C unter Schütteln gezüchtet. Das Medium wird sodann zur Entfernung der Mikroorganismen filtriert oder zentrifugiert, wodurch man eine rohe Enzymlösung (15 Einheiten/ml) erhält. Die Enzymlösung (800 ml) wird zur gelatinisierten Stärkelösung gegeben, die sodann zu einer 2-prozentigen Stärkelösung (Ges imt-

volumen 30 Liter) verdünnt wird. Das Gemisch wird 70 Stunder: bei 40°C belassen und sodann zur Inaktivierung des Enzyms 5 Minuten auf 100⁰C erwärmt. Das Gewicht der gebildeten Cyclodextrine beträgt 32 Prozent, bezogen auf die Stärke.

Vergleichsbeispiel 2

15 Liter einer 4-prozentigen (Gew./Vol.) Lösung von Kartoffelstärke (Stärkegehalt 600 g) wird mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 9,0 eingestellt und 30 Minuten bei 125°C homogen gelatinisiert. Nach Abkühlen auf 60°C wird das von Bacillus sp. Nr. 38-2 (ATCC 21783) gebildete Enzym (600 mg, 6000 Einheiten/ml, Meito Sangyo Co., Ltd.) zur gelatinisierten Stärkelösung gegebenund 30 Stunden bei 60°C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsgemisch zur Inaktivierung des Enzyms 5 Minuten auf 100⁰C erwärmt. Hierauf wird auf 55°C gekühlt und der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Das Gemisch wird mit 900 mg Glucoamylase (2000 Einheiten/g GSA-1, Amano

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Pharm. Co., Ltd.) versetzt und 20 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird sodann auf herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, entsalzt und auf einen Feststoffgehalt von 50 Prozent eingeengt. Anschliessend werden 500 mg ß-Cyclodextrin zum Konzentrat gegeben. Das Gemisch wird über Nacht in einem Kühlraum stehengelassen. Das ausgefällte ß-Cyclodextrin wird abfiltriert.

Beispiel 1

Das gemäss Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Filtrat (mit einem Gehalt an 20 Gewichtsprozent Cyclodextrin, bezogen auf das Zuckergesamtgewicht) wird auf eine Konzentration von 20 Prozent (Gew./Vol.) eingestellt. 30 ml der so eingestellten Lösung werden von oben nach unten über eine mit 100 ml Amberllte XAD-2 gepackte Säule mit einer Geschwindigkeit SV = 1 bei 20⁰C gegeben. Anschliessend werden 500 ml Wasser über die Säule gegeben, um nicht adsorbierte Substanzen auszuwaschen.

Die ausströmende Flüssigkeit wird zu etwa 80 ml einer Zuckerlösung mit einem Gehalt an etwa 6 Prozent Zucker eingeengt. Die Zuckerlösung wird flüssigkeitschromatographisch (du Pont 83O, Säule: Waters μ Bondapak CH (4 mm Durchmesser χ 30 cm), Lösungsmittel: Acetonitril: Wasser =70 : 30, Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/min, Temperatur: 4O⁰C) analysiert. Demnach weist die Zuckerlösung 4,7 g Glucose, Maltose, Maltotriose und Maltooligosaccharid auf. Die Ausbeute beträgt 97,9 Prozent, bezogen auf reduzierende Zucker in der tatsächlich strömenden Lösung.

Anschliessend wird die Säule auf etwa 85 C gebracht und mit Wasser mit einer Geschwindigkeit SV = 0,5 eluiert. Man erhält 45 ml einer Fraktion mit einem Gehalt an etwa 2 Prozent Cyclodextrinen. Die Fraktion wird flüssigkeitschromatographisch analysiert. Sie enthält oC-, ß- und ^-Cyclodextrin. Es ergeben sich keine Peaks von reduzierenden Zuckern. Der Feststoffgehalt in dieser Fraktion beträgt 1,1 g. Die Ausbeute beträgt 91,7 Prozent, bezogen auf Cyclodextrine in der durch die Säule strömenden Lösung.

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Beispiel2

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene Fraktion mit einem Gehalt an 2 Prozent Cyclodextrinen (<x.: 34,8 Prozent, ß: 46,1 Prozent, /~ : 19,1 Prozent) (1250 ml) wird auf eine etwa 50-prozentige Konzentration eingeengt und zur Kristallisation gebracht. Mari erhält etwa 7,5 g ß-Cyclodextrin. Das Filtrat wird sodann auf etwa 30 Prozent-eingeengt, auf den pH-Wert 5,0 eingestellt und in einer Menge von 0,5 Prozent, bezogen auf das Feststoffgewicht im Filtrat. mit bakterieller, saccharifizierender o(-Amylase ^;

(Daiwa Kasei Ind. Co., Ltd.) versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 40 C belassen. Die saccharifizierte Lösung enthält reduzierende Zucker, hauptsächlich oC-Cyclodextrin, Glucose, Maltose und Maltotriose. Nach beendeter Umsetzung wird die saccharifizierte Lösung erwärmt. Sodann wird die Lösung mit Aktivkohle entfärbt und filtriert. Man erhält 60 ml einer 25-prozentigen (Gew./Vol.) Lösung mit einem Gehalt an ^-Cyclodextrin. Die Zuckerzusammensetzung der saccharifxzierten Lösung beträgt 45 Prozent reduzierende Zucker und 55 Prozent «-Cyclodextrin.

Anschliessend wird die saccharifizierte Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und über eine mit 1 Liter Amberlite XAD-4 gepackte Säule von oben nach unten mit einer Geschwindigkeit SV = 0,75 gegeben. Zum Auswaschen von nicht-adsorbierten Substanzen

werden 3 Liter Wasser über die Säule gegeben. Anschliessend 25

wird das aus beiden Eluaten erhaltene Lösungsgemisch zu etwa 90 ml einer Lösung mit einem Gehalt an etwa 7,5 Prozent reduzierenden Zuckern eingeengt. Der Feststoffgehalt dieser Lösung beträgt 6,7 g. Die Ausbeute beträgt 99,3 Prozent, bezogen

auf reduzierende Zucker in der saccharifizierten Lösung. 30

Anschliessend wird die Säule auf etwa 80 C gebracht und mit einer· Geschwindigkeit SV = 0,5 mit Wasser eluiert. Man erhält 300 ml einer Fraktion mit einem Gehalt an etwa 2,5 Prozent

oi-Cyclodextrin- Der Feststoffgehalt in der Fraktion beträgt 35

7,5 g. Die Ausbeute beträgt 90,9 Prozent, bezogen aufcX-Cyclodextrin in der durch die Säule strömenden Lösung.

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Beispiel3

1 Liter eines geraäss Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Hydrolysate mit einem Gehalt an Cyclodextrinen (2 Prozent (Gew./Vol.), 32 Prozent Cyclodextrine, bezogen auf das Gesamtzuckergewicht) wird bei 2O⁰C von oben nach unten über eine mit 500 ml Amberlite XAD-2 gepackte Säule mit einer Geschwindigkeit SV = 1 gegeben. Die Säule wird mit 2 Liter Wasser gewaschen. Das Eluat wird zu 150 ml mit einem Reststärkegehalt von etwa 9 Prozent eingeengt. Der Feststoffgehalt dieser Lösung beträgt 13,5 Prozent. Die Ausbeute beträgt 99,3 Prozent, bezogen auf den Stärkegehalt der durch die Säule strömenden Lösung.

Anschllessend wird die Säule auf etwa 85°C gebracht und mit . Wasser mit einer Geschwindigkeit SV = 0,5 eluiert. Man erhält 300 ml einer Fraktion mit einem Gehalt an 2 Prozent Cyclodextrinen. Der Feststoffgehalt dieser Fraktion beträgt 6,0 g. Die Ausbeute beträgt 93,8 Prozent, bezogen auf Cyclodextrine in der durch die Säule strömenden Lösung.

Die Fraktion mit einem Gehalt an Cyclodextrinen wird, wie vorstehend erwähnt, flüssigkeitschromatographisch mit folgendem Ergebnis analysiert: oi : 68,4 Prozent, ß: 24,4 Prozent, /*-: 7,2 Prozent.

Beispiel4

500 ml einer 1 Prozent lösliche Stärke enthaltenden Lösung (10 millimolar Calciumcarbonat, pH-Wert 7,5) wird bei 5O⁰C mit 20 mg Enzym (600 Einheiten/g) aus Bacillus sp. Nr. 38-2 (ATCC 21783) versetzt und 1 Stunde umgesetzt. Anschliessend wird die Reaktionslösung mit einer Geschwindigkeit SV = 0,5 über eine mit 250 ml Amerblite XAD-4 gepackte Säule, die auf 5O⁰C gehalten wird, gegeben. Das Eluat wird in die Reaktionslösung zurückgeführt. Diese Verfahrensweise wird 48 Stunden aufrecht-

35»erhalten. Anschliessend wird die Säule zum vollständigen Auswaschen von Stärkebestandteilen mit Wasser gewaschen. Sodann wird die Wäule auf 85⁰C gebracht, indem man heisses Wasser

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] durch einen Säulenmantel leitet. Hierauf wird Wasser über die Säule gegeben. Man erhält 160 ml einer Fraktion mit einem Gehalt an 2 Prozent Cyclodextrinen. Der Feststoffgehalt der Fraktion beträgt 3,2 g. Die Ausbeute beträgt 64 Prozent, bezogen auf das Zuckergesamtgewicht der durch die Säule strömenden Lösung.

Die die Cyclodextrine enthaltende Fraktion wird, wie vorstehend erläutert, flüssigkeitschromatographisch untersucht.oc: 27,0 Pro.zent, ß: 57,1 Prozent, y: 15,9 Prozent.

Beispiel5

250 ml einer 4-prozentigen gelatinisierten Lösung von Kartoffelstärke, die gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist, wird mit 15 ml einer rohen Enzymlösung (15 Einheiten/ml), gebildet durch Bacillus macerans (IAM 1243) (gemäss Vergleichsbeispiel 1)^ versetzt. Der pH-Wert wird auf 5,5 eingestellt. Das Gesamtvolumen wird auf 500 ml gebracht. Anschliessend wird eine mit 250 ml Amberlito XAD-2 gepackte Säule verwendet und 72 Stunden bei 4O⁰C gemäss Beispiel 4 eingesetzt. Nach dem Waschvorgang wird Wasser über die Säule gegeben. Man erhält 210 ml einer Fraktion mit einem Gehalt an etwa 2 Prozent Cyclodextrinen. Der Feststoffgehalt dieser Fraktion beträgt 4,2g. Die Ausbeute beträgt 42 Prozent, bezogen auf das Zuckergesamtgewicht in der

durch die Säule strömenden Lösung.

Die die Cyclodextrine enthaltende Fraktion wird, wie vorstehend erläutert, flüssigkeitschromatographisch analysiert, oc: 74,7 Proznet, ß: 19,1 Prozent, y : 6,2 Prozent. °

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Claims

VOSSIUS- VO SS IUS TA UCHNER · H £ ÜN EMAN Kl··; RAUH

PATENTANWÄLTE

30206U

SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (O89) 47 4Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN · TELEX B-29 453 VOPAT O

u.Z.: P 654 30. Mai 1980

Case: OP 80050-03

RIKAGAKU KENKYUSHO, Wako-shi, Japan
NIHON SHOKUHIN KAKO CO., LTD.,
Tokyo, Japan
.

"Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen"

Priorität: 1. Juni 1979, Japan, Nr. 68589/1979 ν

Patentansprüche ^_n

( 1. verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen, dadurch gekenn- ^—^zeichnet, dass man eine Lösung, die Cyclodextrine sowie Stärken, Dextrine, reduzierende Zucker und dergleichen enthält in Kontakt mit einem hydrophoben, synthetischen Ad-

sorptionsharz, das ein poröses, nur Cyclodextrine adsorbierendes Polymerisat enthält, bringt und anschliessend die adsorbierten Cyclodextrine elüiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

das synthetische Adsorptionsharz ein poröses Styrol-Divinyl· benzol-Copolymerisat mit einer spezifischen Oberfläche von

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mehr als 100 m /g enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 35

man den Elutionsschritt mit Wasser unter Erwärmen durchführt.

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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass
man den Elutionsschritt mit Wasser unter Erwärmen durchführt, um die einzelnen darin enthaltenen Cyclodextrine
zu erhalten.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine der folgenden Lösungen verwendet:

eine Lösung mit einem Gehalt an Stärkehydrolysaten, erhalten durch Umsetzung von gelatinisierten oder verflüssigten Stärken mit Cyclodextrin-glycosyltransferase,

ein durch Filtrieren derartiger Hydrolysate zur Entfernung von ß-Cyclodextrin erhaltenes Filtrat oder

eine Lösung mit einem Gehalt an saccharifizierten Produkten, die Cyclodextrine und reduzierende Zucker enthalten, wobei diese Produkte durch Umsetzung der genannten Hydrolysate
oder des genannten Filtrats mit einem saccharifizierenden Enzym, das Cyclodextrine nicht oder kaum hydrolysiert, unter Hydrolyse der im Gemisch enthaltenen acyclischen Dextrine erhalten worden sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass
man ein Filtrat verwendet, das aus Stärkehydrolysaten nach Kristallisation von ß-Cyclodextrin ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln erhalten worden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärkehydrolysate enthaltende Lösung oder als Filtrat eine Lösung verwendet, die als saccharifizierte Produkte

hauptsächlich ^-Cyclodextrin und reduzierende Zucker enthält, wobei diese Produkte durch Umsetzung der Hydrolysate oder des Filtrats mit einem saccharifizierenden Enzym, das • oC-Cyclodextrin nicht oder kaum hydrolysiert, unter Hydrolyse der im Gemisch enthaltenen Cyclodextrine mit Ausnahme von <X -Cyclodextrin und der acyclischen Dextrine erhalten worden sind.

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