DE2603599B2 - Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen - Google Patents
Verfahren zum Immobilisieren von EnzymenInfo
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- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
Description
Der wichtigste Vorteil von immobilisierten Enzymen liegt in ihrer Möglichkeit zur Wiederverwendung.
Ferner eignen sie sich zur kontinuierlichen Durchführung von enzymatischen Reaktionen in Säulen. Ein
dritter Vorteil besteht darin, daß sich die Umsetzungen genau kontrollieren lassen, da die Reaktionsprodukte
leicht vom jeweiligen Enzym abgetrennt werden können. Schwierigkeiten, die auf Verunreinigungen der
Endprodukte mit dem Enzym oder anderen Produkten zurückzuführen sind, lassen sich bei Verwendung von
immobilisierten Enzymen vermeiden. Ferner wird die Stabilität der Enzyme gesteigert, was deren Einsatz
erleichtert. Schließlich ermöglichen immobilisierte Enzyme die automatisierte Durchführung von enzymatischen
Reaktionen, was zu einer Kostensenkung führt.
Es ist daher verständlich, daß bisher zahlreiche Versuche zur Herstellung immobilisierter Enzyme
angestellt wurden. Die Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme lassen sich hauptsächlich in
folgende drei Gruppen einteilen: Adsorptionsverfahren, Einschlußverfahren und chemisches Bindungsverfahren.
Beim Adsorptionsverfahren werden die Enzyme an der Oberfläche eines unlöslichen Feststoffs adsorbiert
und immobilisiert. Die Durchführung ist einfach, jedoch ist die Adsorbierbarkeit der Enzyme so gering, daß sie
durch hohe Salz- oder Substratkonzentrationen leicht desorbiert werden. Aus diesem Grund erreicht man
durch das Adsorptionsverfahren in der Regel keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Es ist nur anwendbar,
wenn Träger mit einer besonders starken Affinität für die Enzymmoleküle zur Verfügung stehen. Gegenwärtig
wird hauptsächlich Diäthylaminoäthylcelluiose als Trä
ger verwendet.
Beim Einschlußverfahren werden die Enzyme in Poiymergele eingeschlossen. Gegenwärtig werden als
Gele Copolymerisate von Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid
verwendet. Da aber die Enzyme selbst nicht chemisch an die das Gel bildenden Polymerisate
gebunden sind, neigen die Enzyme zum Abfließen, wenn das Gelgitter zu groß ist. Bei einer Verkleinerung des
Gitters verringert sich aber die enzymatische Reak-ο tionsgeschwindigkeit. Deshalb ist bei derartigen Verfahren
die Einstellung der Gittergröße sehr wichtig.
Beim chemischen Bindungsverfahren werden die Enzymmoleküle durch Ausbildung kovalenter Bindungen
unter Einbeziehung von funktionellen Gruppen der Enzyme an die Trägeroberfläche gebunden und somit
immobilisiert. Durch die chemische Umsetzung wird zwar die Enzymaktivität geringfügig vermindert, jedoch
ist die Stabilität der Enzyme ausgezeichnet und der Waschverlust bleibt gering. Aus diesem Grund stellt das
chemische Bindungsverfahren das wirksamste Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen dar. Jedoch gibt
es auch bei diesem Verfahren noch eine Reihe ungelöster Probleme. Beispielsweise sind komplizierte
Verfahrensschritte und teure Reagenzien notwendig, um die Enzymmoleküle an die Trägeroberfläche
chemisch zu binden. Häufig müssen dazu drastische Reaktionsbedingungen angewendet werden. Aufgrund
der unterschiedlichen Umsetzungen kann eine Einteilung in folgende vier Verfahrensarten vorgenommen
werden: (A) Ausbildung von Peptidbindungen, (B) Alkylierung, (C) Diazo-Kupplung und (D) Bildung einer
Schiff-Base.
Unter das Verfahren (A) fallen beispielsweise die Bildung von Azid-, Isocyanat-, Carbodiimid- oder
Iminocarbonatgruppen am Träger und die anschließende Umsetzung dieser Gruppen mit Aminogruppen der
Enzyme. Aus der DEOS 18 15 332 ist es beispielsweise bekannt, Enzyme durch Reaktion mit einem reaktionsfähigen
Derivat eines Polymeren, das durch Umsetzung des Polymeren mit einer Cyanatgruppen enthaltenden
Verbindung erhalten worden ist, zu binden. Zur Herstellung dieser Verbindungen mit Cyanatgruppen
werden entsprechende Ausgangsprodukte mit Bromcyan umgesetzt. Gemäß Seite 2, zweiter Absatz, der
genannten DE-OS hat jedoch das Arbeiten mit Bromcyan den Nachteil, daß dieses Reagenz sehr
toxisch ist und daher zum Arbeiten in technischem Maßstab ungeeignet ist.
Bei den Verfahren gemäß (B) werden beispielsweise
so die Hydroxylgruppen von Cellulose unter Verwendung von Cyanurchlorid aktiviert.
Gemäß (D) können beispielsweise Aminoalkylsilane an die Oberflächen von porösen Glaskörnern gebunden
werden. Anschließend wird unter Verwendung von Glutaraldehyd das Schiff-Salz gebildet. Da die Bildung
des Schiff-Salzes jedoch eine Gleichgewichtsreaktion ist, werden die Enzyme wie beim Adsorptionsverfahren
allmählich freigesetzt.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß bei den herkömmlichen Verfahren komplizierte Verfahrensschritte, aufwendige Reagenzien und die genaue
Einhaltung bestimmter Reaktionsbedingungen notwendig sind, um den Träger zu aktivieren.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und billiges Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen zur Verfügung zu stellen, bei dem die vorgenannten Nachteile vermieden werden und eine feste Bindung der Enzyme an den Träger gewährleistet ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und billiges Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen zur Verfügung zu stellen, bei dem die vorgenannten Nachteile vermieden werden und eine feste Bindung der Enzyme an den Träger gewährleistet ist.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen
definiert.
Es ist bekannt, daß N-Halogenamide als Zwischenprodukte
beim Hoffmann-Abbau von Säureamiden gebildet werden. Beim Hoffmann-Abbau wird ein
Säureamid unter stark alkalischen Bedingungen mit Hypohalogenitionen (OX -) umgesetzt. Dabei wird nach
folgender Reaktionsgleichung ein N-Halogenamid und dann ein Amin gebildet:
OX"
R-CONH2
stark alkalisch
R-CONHX
R-NH,
Bezüglich des Hoffmann-Abbaus wurden zahlreiche Untersuchungen über die Beziehung zwischen der
chemischen Struktur der Amide und der Aminausbeute durchgeführt. Bisher liegen jedoch keine Versuche über
die chemische Reaktivität der als Zwischenprodukte auftretenden N-Halogenamide in wäßriger Lösung vor.
Bei Untersuchungen über die N-Halogenierung von verschiedenen Amiden wurde überraschenderweise
festgestellt, daß N-Halogenamidreste unter schwach
alkalischen Bedingungen nur langsam in die entsprechenden Amine umgewandelt werden. Die N-Halogenamidreste
reagieren vielmehr mit Gruppen, die aktive Wasserstoffatome enthalten, wie NH2-, OH- und
—CONH2-Gruppen, wobei beispielsweise Ureide, Urethane
oder Acylharnstoffe gebildet werden.
R'—NH,
OX"
schwach alkalisch
R-CONH2
R-CONHX
R'—OH
R'—CONH2
R—NHCONHR'
(Ureid)
(Ureid)
R—NHCOOR'
(Urethan)
R—NHCONHCOR'
(Acylharnstoff)
Es wurde festgestellt, daß N-Halogenamidreste besonders auf Aminogruppen reagieren und auch bei
milden Reaktionsbedingungen, beispielsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und einer Temperatur von 30 bis
400C, sehr reaktiv sind.
Erfindungsgemäß erhält man stabile, immobilisierte Enzyme durch Umsetzung eines Enzyms mit einem
einen N-Chloramidrest enthaltenden Produkt in einer wäßrigen Lösung.
Als Produkte mit N-Chloramidresten eignen sich wasserlösliche, niedermolekulare, mehrwertige Chloramide
(im folgenden als Produkt A bezeichnet), wasserlösliche, hochmolekulare, mehrwertige Chloramide
(im folgenden als Produkt B bezeichnet) und feste Träger mit N-Chloramidresten (im folgenden als
Produkt C bezeichnet). Die Produkte A, B und C lassen sich folgendermaßen herstellen.
Herstellung von A
Diese Verbindungen werden erhalten, indem man Verbindungen mit mehreren Amidgruppen, beispielsweise
Amide von Polycarbonsäuren, wie Adipinsäureamid und Bernsteinsäureamid, carbamoylisierte, mehrwertige
Alkohole und carbamoylisierte Zucker, an den Stickstoffatomen chloriert.
Beispiele für mehrwertige Alkohole, die der Carbamoylisierung
unterworfen werden können, sind Glycerin, Polyäthylenglykol und Polypropylenglykol. Beispiele
für entsprechende Zucker sind Glucose, Fructose, Saccherose, Pentaerythrit, Sorbit und Mannit.
Die Chlorierung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise lassen sich
N-Chloramide durch Umsetzung eines Amids mit einem Hypochlorit wie Natriumhypochlorit bei einer Temperatur
von -10 bis 5° C herstellen. Die Carbamoylisierung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt
werden. Beispielsweise erhält man carbamoylisierte, mehrwertige Alkohole oder Zucker, indem man die
mehrwertigen Alkohole oder Zucker mit Acrylnitril umsetzt und anschließend das erhaltene Reaktionsgemisch
mit Wasserstoffperoxid behandelt.
Herstellung von B
Die Verbindungen B werden hergestellt, indem man wasserlösliche, mehrwertige Alkohole carbamoylisiert
und anschließend auf die vorgenannte Weise chloriert.
Beispiele für entsprechende mehrwertige Alkohole sind Cellulose, Stärke, Agar, Alginsäure, Konjak
(Asafoetida) und Polyvinylalkohole. Ferner eignen sich Homopolymerisate und Pfropfpolymerisate von Acrylamid
oder Methacrylamid oder deren Copolymerisate mit anderen polymerisierbaren Vinylpolymerisaten als
Carbamoylverbindungen.
Herstellung von C
Feste Träger mit Chloramidresten werden durch Carbamoylisierung und Chlorierung eines entsprechenden
festen Materials hergestellt.
Als Ausgangsmaterial können alle natürlichen oder synthetischen Produkte verwendet werden, die sich
carbamoylisieren lassen. Beispiele dafür sind Cellulose, Holzprodukte, wie Pulpe, Wolle, Seide, Baumwolle,
Polymerisate, wie Nylon, Polyvinylalkohol und schwach
so basische Anionenaustauscherharze.
Diese festen Produkte können in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Pulver, Granulat, Fasern,
Gewebe, Membranpapier oder Platten. Besonders bevorzugt sind hydrophile und poröse, aber nicht steife
Träger, da die enzymatischen Reaktionen im allgemeinen in wäßrigen Lösungen durchgeführt werden und
somit der hydrophile Träger die Diffusion des Substrats und die Wechselwirkung zwischen Substrat und Träger
nicht beeinträchtigt. Stärker hydrophile Träger führen zu einer größeren Stabilität der immobilisierten
Enzyme. Durch die Verwendung von porösen Trägern wird die Oberfläche der Träger und somit die Menge an
gebundenem Enzym größer. Relativ weiche Träger, wie Cellulose, werden gegenüber starren Trägern, wie Glas,
bevorzugt, um eine Deformation der Enzymmoleküle zu verhindern und eine höhere Stabilität der Enzyme zu
gewährleisten.
Die Immobilisierung der Enzyme wird vorzugsweise
bei Temperaturen von 15 bis 4O0C in einer wäßrigen
Enzymlösung durchgeführt.
Die N-Chloramidgruppen vernetzen dabei mit den Aminogruppen der Enzyme, wodurch die Enzyme
immobilisiert werden.
Bei Verwendung von B reagiert der N-Chloramidrest mit den beim Hoffmann-Abbau teilweise gebildeten
Aminogruppen. Es ergibt sich somit nach folgender Reaktionsgleichung eine Kondensation und Gelbildung
unter den N-Chloramidgruppen selbst.
CONHCl + NH2
NHCONH
Gleichzeitig reagieren die N-Chloramidgruppen mit Aminogruppen des Enzyms.
In diesem Fall wird das Enzym physikalisch und chemisch immobilisiert.
Die Stärke des Gels und die Gittergröße kann je nach
der Art der polymerisierten, mehrwertigen Chloramide, der Konzentration und der Dichte der Chloramidreste
eingestellt werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können gereinigte oder rohe Enzyme, Enzymgemische oder
Enzymsysteme tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs innerhalb dieser Organismen oder nach
Isolation immobilisiert werden. Es können ganze Zellen, intakte intrazelluläre Teilchen oder rohe Enzymextrakte
verwendet werden.
Beispiele für entsprechende Enzyme sind proteolytische Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin und Papain,
Hydrolasen, wie a-Amylase, Invertase, jS-Galactosidase,
Ribonuclease, alkalische Phosphatase, Amyloglucosidase, und Dextranase, Dehydrogenase, wie Creatin-Phos-
20
25
30
35 phokinase und Pyruvatkinase, Oxidasen, wie Glucose-Oxidase,
und Amidasen, wie Amidase und Peniciliin-Amidasen.
Die Konzentration der Er.zymlösungen unterliegt keinen Beschränkungen, jedoch werden Lösungen mit
einer Enzymkonzentration von 0,01 bis 10 Prozent bevorzugt.
Bei der erfindungsgemäßen Immobilisierung ist der Enzymverlust sehr gering, da die Immobilisierungsreaktion
in einer wäßrigen Enzymlösung unter sehr milden Reaktionsbedingungen durchgeführt wird.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen immobilisierten Enzyme sind gegen Waschen sehr
stabil. Beispielsweise zeigt immobilisierte a-Amylase, die kovalent an N-Chlorcarbamoyläthyl-Pulpe, die
durch Carbamoyläthylierung von Pulpe und anschließende N-Chlorierung hergestellt worden ist, eine
ausgezeichnete Stabilität gegen Waschen; vgl. Tabelle I von Beispiel 3.
In Tabelle I ist zu VergJeichszwecken auch die
Stabilität von durch Adsorption an Kationen-Pulpe, die aus dem gleichen Pulpenmaterial hergestellt worden ist,
immobilisierter a-Amylase angegeben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
140 ml einer l.Oprozentigen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid und 5,3 g (0,1 Mol) Acrylnitril werden
zu 21 g(0,l Mol) handelsüblicher Hydroxyäthylcellulose (HÄC) gegeben. Das Gemisch wird 60 Minuten unter
Rühren bei 500C umgesetzt. Anschließend werden 23 g (0,2 Mol) einer 30prozentigen Lösung von Wasserstoffperoxid
in zwei oder drei Portionen zugegeben. Die Lösung wird 90 Minuten bei 200C umgesetzt. Die
Umsetzung läßt sich durch folgende Gleichung erläutern:
cell-OH
(HAC)
Acrylnitril
Alkali
Alkali
* CeIl-O-CH2-CH2
CN (Cyanoäthyl-HÄC) 2H2O2
CeIl-O-CH2-CH2 + O2
CONH2
(Carbamoyläthyl-HÄC)
(Carbamoyläthyl-HÄC)
Die erhaltene wäßrige Lösung von Carbamoyläthyl-HÄC wird mit Wasser auf das zweifache Volumen
verdünnt. 10 g (0,0027 Mol in bezug auf die Carbamoylgruppe) der verdünnten Carbamoyläthyl-HÄC-Lösung
werden mit 2,7 ml (0,0027 Mol) 1 m wäßriger Natriumhypochloritlösung
versetzt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 0 bis 2° C N-chloriert und anschließend mit
1 η-Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9 neutralisiert. Die erhaltene Lösung wird mit 2,0 ml einer
wäßrigen a-Amylaselösung mit einem Gehalt von 250 mg/100 ml versetzt. Anschließend wird das Gemisch
gründlich gerührt, langsam auf 300C erwärmt und
sodann 20 Minuten stehengelassen. Man erhält «-Amylase,
die im Gel von Carbamoyläthyl-HÄC immobilisiert ist. Dieses Enzym ist nicht nur physikalisch immobilisiert,
sondern auch chemisch an die HÄC-Ketten gebunden, so daß es auch bei wiederholtem Waschen
nicht ausgewaschen wird.
10,0 g (0,007 Mol) einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Polyacrylamid werden mit 2,9 ml (0,0056
Mol) einer 2 m wäßrigen Natriumhypochloritlösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei
— 5 bis 00C N-chloriert und anschließend mit 1 n-Essigsäure
auf einen pH-Wert von etwa 9 neutralisiert. Anschließend werden 2,0 ml einer wäßrigen a-Amylaselösung
mit einem Gehalt von 250 mg/100 ml zugegeben. Nach gründlichem Rühren wird das erhaltene Gemisch
langsam auf 3O0C erwärmt und 20 Minuten stehengelassen.
Man erhält im Polyacrylamidgel immobilisierte a-Arnylase. Auch hier tritt nicht nur eine physikalische
Immobilisierung, sondern auch eine chemische Bindung an die Polyacrylamidkette ein, so daß das Enzym auch
bei wiederholtem Waschen nicht ausgewaschen wird.
5,0 g Acrylnitril werden in 250 ml einer 0,5prozentigen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid gelöst. In
die erhaltene Lösung werden 16,2 g (0,1 Mol) Pulpe eingebracht. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 500C
umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch abfiltriert. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen
und in 200 ml einer 0,5prozentigen wäßrigen Natriumhydroxidlösung, die 5,0 ml 30prozentiges Wasserstoffperoxid
enthält, gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde
bei 20°C umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch abfiltriert. Der Rückstand wird mit Wasser
gewaschen. Man erhält Carbamoyläthyl-Pulpe. 1,0 g
dieser Carbamoyläthyl-Pulpe wird in 100 ml Wasser dispergiert. Sodann werden 2,0 ml einer 1 m wäßrigen
Natriumhypochloritlösung zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0 bis 2°C N-chloriert. Nach
beendeter Umsetzung wird die Pulpe gründlich mit Eiswasser gewaschen und anschließend in 100 ml 0,1 m
Calciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg a-Amylase enthält, eingebracht. Zur Immobilisierung
des Enzyms wird das Gemisch 3 Stunden bei 40° C umgesetzt. Die Beständigkeit des so immobilisierten
Enzyms gegen Waschen wird untersucht (Versuch 1). Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Die Enzymaktivität wird in mg Amylase angegeben, d. h. dem Volumen (ml) einer 0,1 prozentigen Amylaselösung,
die die blaue Jodfarbe (Blauwert) innerhalb von 30 Minuten bei 30° C um 10 Prozent vermindert.
Das Waschen wird durchgeführt, indem mam 100 mg
immobilisiertes Enzym in 150 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer 30 Minuten bei 3O0C heftig rührt.
Zu Vergleichszwecken wird die Stabilität eines durch Adsorption an einer Kationen-Pulpe immobilisierten
Enzyms festgestellt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I (Versuch 2) angegeben. Die Kationen-Pulpe
wird hergestellt, indem man die Carbamoyläthyl-Pulpe auf die vorgenannte Weise N-chloriert und anschließend
chemisch an Polyäthylenimin (Polymerisationsgrad 100) bindet.
Die Aktivität des erfindungsgemäß immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht
vermindert.
Enzymaktivität (mg) | Bei | Versuch 1 | Versuch 2 |
Anzahl der Waschvorgänge | 300 | 470 | |
0 | 260 | 390 | |
1 | 255 | 330 | |
2 | 255 | 280 | |
3 | 255 | 240 | |
4 | 255 | 148 | |
10 | spiel 4 | ||
35
40 Wasser gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 500C
stehengelassen und zum Abtrennen von öligen Produkten in der unteren Phase in einen Scheidetrichter
gegeben. Die öligen Produkte werden 3 Stunden bei 2O0C mit einer Lösung von 100 g (0,88 Mol) 30prozentigem
Wasserstoffperoxid in einer 0,1 n-Natriumhydroxidlösung hydrolisiert. Durch Zusatz von Aceton erhält
man 16,8 g Tetracarbamoyläthylpentaerythrit (80% der Theorie).
4,2 g (10 mMol) dieses Produkts werden mit 50 ml Wasser und 10 ml einer 2 m wäßrigen Lösung von
Natriumhypochlorit versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 60 Minuten N-chloriert. Anschließend werden
1,2 g (20 mMol) Aceton zugegeben. Sodann wird das Gemisch mit Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9,0
gebracht und mit 100 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg a-Amylase enthält, versetzt.
Das Gemisch wird 50 Minuten bei 25° C umgesetzt. Man erhält die immobilisierte Λ-Arnylase als weißen
Niederschlag. Die Aktivität dieser immobilisierten «-Amylase wird auch durch wiederholtes Waschen nicht
vermindert.
2 g Cellulose-Pulpe werden mit 70 ml Wasser, 187 mg
Cernitrat, 0,7 ml 1 η-Salpetersäure und 0,5 g Acrylamid versetzt. Sodann wird das Gemisch eingefroren und
entlüftet. Nach zweimaliger Stickstoffverdrängung wird das Gemisch 10 Minuten bei 35° C der Pfropfpolymerisation
unterworfen. Die Homopolymerisate von Acrylamid werden durch Waschen mit Wasser entfernt. Die
Cellulose-Pulpe weist ein Acrylamid-Pfropfverhältnis von 7,9 Prozent auf.
1 g dieses Pfropfpolymerisats wird mit 100 ml einer 0,5 m wäßrigen Natriumhypochloritlösung versetzt. Das
Gemisch wird unter Eiskühlung 30 Minuten N-chloriert und anschließend viermal mit einer lOprozentigen
wäßrigen Natriumchloridlösung von O0C gewaschen
Das erhaltene Polymerisat wird in 100 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg
Λ-Amylase enthält, eingebracht. Das Gemisch wird
60 Minuten bei 2O0C umgesetzt. Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird auch durch
wiederholtes Waschen nicht vermindert.
45
50
1,44 g (10 mMol) Adipinsäureamid werden mit 50 ml Wasser und 10 ml (20 mMol) 2 m wäßriger Natriumhypochloritlösung
versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 60 Minuten N-chloriert. Das erhaltene
Reaktionsgemisch wird mit 1,2 g (20 mMol) Aceton versetzt. Anschließend wird die Lösung mit Essigsäure
auf einen pH-Wert von etwa 9,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird mit 30 ml einer 1 prozentigen
Enzymlösung (λ-Amylase, Papain, Trypsin oder Invertase)
versetzt. Die Lösung wird 50 Minuten bei 18°C stehengelassen, um das immobilisierte Enzym auszufällen.
Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht
vermindert.
6,8 g (0,05 Mol) Pentaerythrit, 10,6 g (2 mMol) Acrylnitril und 0,4 g Natriumhydroxid werden zu 7,0 ml
55
60
65
6,46 g (20 mMol) schwach basisches Anionenaustau scherharz werden mit 14,0 g (200 mMol) Acrylamid unc
20 ml 0,1 n-Natriumhydroxid versetzt. Das Gemiscl wird 2 Stunden bei 400C der Carbamoyläthylierung dei
Aminogruppen des Harzes unterworfen. Das nich umgesetzte Acrylamid wird durch Waschen mit Wasse
entfernt. Man erhält 8,40 g carbamoyläthyliertes Anio nenaustauscherharz (100% der Theorie).
1,0 g dieses carbamoyläthylierten Anionenaustau scherharzes wird mit 10 ml einer 0,5 m wäßrigen Lösunj
von Natriumhypochlorit versetzt. Das Gemisch wir« 60 Minuten unter Eiskühlung N-chloriert. Nach beende
ter Umsetzung wird das Harz gründlich mit Eiswasse gewaschen und anschließend in 100 ml 0,1 m Calcium
acetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg «-Amylasi enthält, eingebracht. Das Gemisch wird 3 Stunden be
4O0C umgesetzt. Man erhält ein an das Harzgranula gebundenes, immobilisiertes Enzym. Die Aktivitä
dieses immobilisierten Enzyms wird auch durcl wiederholtes Waschen nicht vermindert.
Claims (8)
1. Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Enzym mit einem einen Chloramidrest enthaltenden Produkt bei einem pH-Wert von 7 bis 11 und bei
Temperaturen von -10 bis 50° C umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man a-Amylase, Papain, Trypsin oder
Invertase umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in Wasser lösliche,
mehrwertige Chloramidverbindung verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein festes Material mit Chloramidresten verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung verwendet, die
durch Umsetzung eines wasserlöslichen, mehrwertigen Amids mit Natriumhypochlorit erhalten worden
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit Adipinsäureamid,
Tetracarbamoyläthylpentaerythrit, Carbamoyläthylhydroxyäthylcellulose oder Polyacrylamid vorgenommen
worden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein schwach basisches Anionenaustauscherharz
mit Chloramidresten verwendet.
8. Immobilisiertes Enzym, herstellbar gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1.
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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