DE2625255A1

DE2625255A1 - Traegersubstanz fuer biologisch aktives material, verfahren zu deren herstellung und daraus hergestellte biologisch aktive matrix

Info

Publication number: DE2625255A1
Application number: DE19762625255
Authority: DE
Inventors: William Edward Hornby; David Lindsey Morris
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1975-06-04
Filing date: 1976-06-04
Publication date: 1976-12-23
Also published as: US4115305A; JPS523648A; GB1550819A

Description

MÜLLER-BORE · GROENING · DEUFEL · SCHÖN · HER

PATENTAN^-WaI-TE

W25255

N 1236 DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE

(PATENTANWAUT VON 1927 - 1975) HANS W. GROENING, D1PL.-ING. DR. PAUL DEUFEU, DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, DIPL.-PHYS.

1978

NATIONAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION
London SW1, England

Trägersubstanz fur biologisch aktives Material, Verfahren zu deren Herstellung und daraus hergestellte biologisch aktive

Matrix

609852/0937

MtfNCnEN 80 · SIEnEKTSTR. -4 · POSTFACH 880730 · KABEL·: SIUEI1OPAT · TEL. (089) 471079 · TEiEX 5-22659

NACHGEREICHT

Trägersubstanz für biologisch aktives Material, Verfahren zu deren Herstellung und daraus hergestellte biologisch aktive

Matrix

Die Erfindung betrifft aus Polymerisaten bestehende Trägersubstanzen für biologisch aktive Materialien und stellt eine Verbesserung und Weiterentwicklung der in der DT-OS 24 37 870 beschriebenen Erfindung dar.

In der angegebenen deutschen Patentanmeldung wird ein organisches Polymer beschrieben, das sich als Trägersubstanζ für ein biologisch aktives Material eignet und Imidatgruppen aufweist, die zur Eingehung einer Bindung mit einem biologisch aktiven Material befähigt sind, und es wird dort ferner ein Verfahren ' zur Herstellung eines derartigen Polymeren beschrieben, zu dessen Durchführung ein Polymer mit sekundären Amido- und anderen Gruppen umgesetzt wird, um zumindest einige der Amidogruppen in Imidatgruppen zu überführen ohne wesentliche Aufspaltung des Polymergrundgerüsts. Die Imidatgruppen reagieren mit Bisaminen unter Bildung einer Trägersubstanz aus einem Amidingruppen enthaltendem Polymer, das, wie sich zeigte, eine merkliche Tendenz zur Bindung von Protonen aufweist, wenn es sich im Kontakt mit Lösungen bei physiologischen pH-Werten befindet. Dies kann in bestimmten Fällen ein Nachteil sein, z.B. dann, wenn die positiv geladene Trägersubstanz ein biologisch aktives Material trägt zur Verwendung als ein Immunoadsorbens oder zur Verwendung in einer unter kontinuierlichem Durchfluss betriebenen Analysenapparatur. In beiden diesen Anwendungsarten können die positiven Ladungen auf der Trägersubstanz zusammenwirken mit in dem Reaktionsmedium vorliegenden Stoffen, was zu einer unerwünschten nicht-spezifischen Adsorption im Falle der Immunoadsorbentien, und zur Übertragung von entweder Reaktionspartnern oder Reaktionsprodukten im Falle der kontinuierlich durchflossenen Ana-

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- s 3

lysatoren führen kann,

Aufgabe der Erfindung ist es, ein organisches, als Trägersubstanz für ein biologisch aktives Material bestimmtes Polymer, in dem die Tendenz zur Bindung eines Protons vergleichsweise stark vermindert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polymeren anzugeben.

Die erfindungsgemäße Trägersubstanz für ein biologisch aktives Material ist gekennzeichnet durch ein organisches Polymer, das Amidingruppen aufweist, deren Kohlenstoffatome an Seitenketten gebunden sind, von denen jede eine funktioneile, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigte Gruppe aufweist, sowie eine Oarbonylgruppe oder eine Enolform derselben, die vom Kohlenstoffatom einer Amidingruppe getrennt ist durch deren am Polymergerüst gebundenes Stickstoffatom und höchstens durch ein weiteres Stickstoffatom in der Seitenkette.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer derartigen Trägersubstanz für ein biologisch aktives Material ist dadurch gekennzeichnet, daß man Imidatgruppen eines organischen Polymeren mit einer organischen Verbindung umsetzt unter Einführung von Seitenketten in das Polymer, die eine Garbonylgruppe oder eine Enolform derselben aufweisen, welche vom Polymergerüst durch ein oder zwei Stickstoffatome der Seitenkette entfernt ist, und danach die Seitenketten modifiziert unter Erzeugung von funktionellen, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigten Gruppen.

Organische Polymere mit Imidatgruppen sind herstellbar durch Umsetzung von primäre oder sekundäre Amidogruppen aufweisenden Polymeren mit einem Alkylierungsmittel, durch Umsetzung von aminosubstituierte aromatische Gruppen aufweisenden Polymeren mit einem ortho-Ester oder durch Unterwerfung von Nitrilgruppen aufweisenden Polymeren einer Kondensationsreaktion mit einem

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Alkohol in Gegenwart einer Säure. Diese Methoden werden in der angegebenen britischen Patentanmeldung ausführlich beschrieben. Ein bevorzugtes organisches Polymer zur "Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Trägersubstanz ist herstellbar durch Umsetzung von Nylon mit einem Alkylierungsmittel, z. B. einem Triäthyloxoniumsalz.

In den bevorzugten Trägersubstanzen nach der Erfindung trägt das Polymergerüst eine Seitenkette, die eine Gruppe A der

1 2
Formel -N H-N H-GO- aufweist, die in einer tautomeren Form vor-

1 2 liegen kann, z. B. in einer Form der Formeln =N -N H-GO-,

-N¹H-N²=C(0H)- oder =N¹-N²=C(OH)-, wobei N¹ das am Polymergerüst gebundene Stickstoffatom einer in dem Polymer vorliegenden Amidingruppe darstellt. Die Gruppe A ist in der Regel direkt an die Gruppe der Formel -R-GO- gebunden, wobei R einen organischen Rest darstellt. Trägersubstanzen, deren Seitenketten eine Gruppe der Formel -CO-R-CO-, wobei die Acylgruppe einer Dicarbonsäure entspricht, aufweisen, sind herstellbar durch Umsetzung von in einem Polymer vorliegenden Imidatgruppen mit Verbindungen, die eine Säurehydrazidgruppe aufweisen, insbesondere die Alkyl- und Arylhydrazide und -dihydrazide, z. B. Bernsteinsäuredihydrazid, Adipinsäuredihydrazid, Phthalsäuredihydrazid, Dipicolinsäuredihydrazid, Oxalsäuredihydrazid und Dihydrazide, die von Polysacchariden abgeleitet sind und weiter unten näher beschrieben werden. Das erhaltene Produkt wird sodann in solcher Weise behandelt, daß die Seitenkette mit einer geeigneten aktiven funktionellen Gruppe, die eine Bindung mit einem biologisch aktiven Material einzugehen vermag, versehen wird, ζ« Bo durch Modifikation der freien -C0-NH-NH₂-Gruppen in eine Säuredihydrazid-Seitenkette.

Die Umsetzung zwischen einem Imidatgruppen tragenden Polymer und einem Säurehydrazid oder -dihydrazid kann bei Raumtemperaturen in einem inerten organischen Lösungsmittel, z. B. Formamid, das das Polymergrundgerüst nicht merklich abbaut, durchgeführt

^werden· 609862/0937

NACHQEREICHT

Das Hydrazid oder Dihydrazid ist vorzugsweise ausreichend löslich, um in Formamid bei Raumtemperatur eine Konzentration von mindestens 50 inMolar zu ergeben. Obwohl die Kupplungsreaktion vorzugsweise in einem vorwiegend nicht-wässrigen Lösungsmittel durchgeführt wird, kann sie in einigen Fällen unter wässrigen Bedingungen bei Temperaturen unter Raumtemperatur, vergleichsweise höheren pH-Werten und vergleichsweise erhöhten Konzentrationen an Hydrazid oder Dihydrazid durchgeführt werden.

Die zur Eingehung einer Bindungsreaktion mit einem biologisch aktiven Material befähigte funktioneile Gruppe kann eine Aldehydgruppe sein, die an das biologisch aktive Material nach einer Standardmethode gekuppelt werden kann, z.B. nach der GIutaraldehydmethode oder nach einer in den JA-OS 30 9 81/75 und DT-OS 2 4 37 870 beschriebenen Methode, wobei jedoch erforderlichenfalls auch andere funktionelle Gruppen, z.B. Adipimidat, Suberimidat, Malonimidat und Succinimidat, verwendbar sind. Die Umsetzung von in dem Polymer vorliegenden Imidatgruppen mit Sauredihydraziden führt zur Bildung eines Zwischenprodukts mit Seitenketten, die eine Saurehydrazidgruppe aufweisen, von denen -CO-NH-NH₂ leicht umwandelbar ist in eine Aldehydgruppe -CHO durch Oxidation unter milden alkalischen Bedingungen. Die Gruppe -CO-NH-NH₂ kann wahlweise umgewandelt werden in eine Säureazidgruppe der Formel -CON,,, zweckmässigerweise durch Umsetzung mit Natriumnitrit und Salzsäure, und die gebildete Azidgruppe kann direkt an das biologisch aktive Material gekuppelt werden.

Gewünschtenfalls kann die Zahl der zur Bindung an das biologisch aktive Material zur Verfügung stehenden funktioneilen Gruppen im Vergleich zur Zahl der in dem Polymer vorliegenden Amidingruppen erhöht werden durch Wahl einer Seitenkette, die direkt _an eine Vielzahl derartiger funktioneller Gruppen gebunden ist. Eine Verbindung mit einer Vielzahl von reaktiven Gruppen, z.B. ein Polysaccharid oder ein Oxidationsprodukt desselben, kann umge-

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setzt werden mit einem Säuredihydrazid oder Hydrazin unter Bildung eines Polyhydrazide oder Polydihydraaidu, das durch eine der vielen am Polysaccharid vorliegenden freien Säurehydrazidgruppen oder über ein Säuredihydrazid-Zwischenprodukt an das Polymergrundgerüst gebunden wird, in der .siegel durch Umsetzung mit einer Imidatgruppe desselben. Pectin und oxidiertes Dextran, insbesondere Perjodat-oxidiertes Dextran, erweisen sich als besonders geeignet.

Ss wird angenommen, daß Verbindungen mit einer Säurehydrazidgruppe nach folgendem Reaktionsschema reagieren, z. B. mit dem Imidatester eines Nylonprodukts:

C = NH

I ₁

OR R'-CQ-NH-NH ₂ C=N

z. B. Imidatester NH.NH.CO.R¹

von Nylon

worin R ein Alkylrest und R¹ eine funktionelle, zur Eingehung einer Bindungsreaktion mit biologisch aktivem Material befähigte G-ruppe ist.

Obwohl die Erfindung nicht auf eine bestimmte Theorie abgestellt werden soll, wird angenommen, daß das angegebene Amidhydrazonderivat eine Seitenkette aufweist, die Tautomerisieren kann unter Bildung einer Struktur, die Doppelbindungen in Längsrichtungkonjugation aufweist, d. h., daß die Struktur I tautomerisiert zur Struktur II der folgenden Formeln:

-C=N- -C-NH-

I Ii

NH N

T · TT '

¹ NH II M

ι Il

C=O C-OH

ι ι

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Struktur II hat Kohlenstoff-Stickstoffbindungen mit in Längsrichtung verlaufender Konjugation und es wird angenommen, daß sie in wäßrigem Medium zu einem geringeren Grade protonisiert als Struktur I. Es wird daher angenommen, daß die letztgenannte 'fautomerie dazu beiträgt, den Aufbau lokaler positiver Ladungen auf der Trägersubstanz beim Kontakt mit einem wäßrigen Medium zu vermindern.

Eine Vielzahl biologisch aktiver Materialien und insbesondere von Proteinen kann an das erfindungsgemäße organische Polymer gebunden werden zur Bildung biologisch aktiver Matrices. Hierzu gehören z. B. Enzyme, die in tierischem und pflanzlichem Gewebe oder mikrobiologischem Material vorliegen oder daraus isoliert sind, z. B. proteolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin; Hydrolasen, z. B. ß-Galactosidase, Ribonuclease, alkalische Phosphatase, Amyloglucosidase, Dextranase, Cholesterinesterase, Urease, Penicillinase und Invertase; Dehydrogenasen, z. B. Milchsäuredehydrogenase, Leberalkoholdehydrogenase, Hefealkoholdehydrogenase, Glucosedehydrogenase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase; Kinasen, z. B. Kreatinphosphokinase, Pyruvatkinase und Hexokinase; Oxidasen, z. B. Peroxidase, Glucoseoxidase, Gholesterinoxidaseurease und -katalase; Transaminasen, z. B. Glutamat-pyruvat-transaminase und Glutamat-oxalacetattransaminasej und Amidasen, z. B. Penicillinamidase.

Ferner kann das biologisch aktive Material ein Gofaktor sein, z. B. Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (NADP) und deren reduzierte Formen, Adenosindiphosphat-ribose (ADP-Ribose), Adenosintriphosphat (ATP), Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), Pyridoxaminphosphat, Pyridoxalphosphat, ein Pterin, ein Flavin oder Coenzym A; ein Inhibitor, z. B. eine Organophosphorverbindung; oder ein Antigen oder Antikörper.

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χ - i

Die .Bindungsreaktion, bei der das biologisch aktive Material an das organische Polymer kovalent gebunden wird, wird vorzugsweise unter sehr milden Bedingungen durchgeführt. Alkalische Bedingungen werden bevorzugt und der günstigste pH-Wert zur Bindung des biologisch aktiven Materials an das organische Polymer ist der höchste pH-Wert, den das biologisch aktive Material in Lösung ohne Verlust seiner Aktivität aushalten kann. In der Hegel liegt der pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, vorzugsweise von 7,5 bis 9. Die Bindung wird zweckmäßigerweise in Phosphatpuffer durchgeführt, doch ist die Yfahl von Phosphat als Kupplungspuffer nicht obligat. Puffer, die keine freien primären Aminogruppen enthalten, sind verwendbar, z. B. N-Äthylmorpholin, Imidazol und Athylendiamintetraessigsäure. Puffer wie Tris-Puffer sind nicht empfehlenswert, da die freie Aminogruppe in diesen Verbindungen mit dem aktivierten Nylon reagiert. Die Menge an biologisch aktivem Material, das an das organische Polymer pro Gewichtseinheit Polymer gebunden wird, und die spezifische Aktivität des gebundenen biologisch aktiven Materials kann auf Maximalwerte gebracht werden durch Steuerung des pH-Werts des Reaktionsmediums, der Reaktionszeit und des Verhältnisses an biologisch aktivem Material zu organischem Polymer in dem Reaktionsgemisch. Eine angemessene Reaktionszeit liegt in der Regel zwischen etwa 15 Minuten und 1 Stunde.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiele 1 bis 4

Ein lylonschlauch wurde mit einer 10 gew.-^igen Lösung von Triäthyloxonium-tetrafluoroborat in Dichloromethan gefüllt und die O-Alkylierungsreaktion wurde 15 Minuten lang ablaufen gelassen unter Bildung eines Imidatsalzes des Nylonschlauchs, Nach Waschen mit Dichlormethan zur Entfernung von Spuren nicht-

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umgesetzten Alkylierungsmittels wurde der Schlauch in 1 Meter lange Stücke geschnitten, die gefüllt wurden mit entweder (a) einer 140 iniü-Lösung von Adipinsäuredihydrazid in Formamid oder (b) einer 140 mk-Lösung von Bernsteinsäuredihydrazid in formamid, und die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Schläuche wurden sodann ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen und aktiviert entweder (I) durch Füllen des Schlauches mit einer Lösung von Diäthyladipimidat (30 mg ml ) in 20 fö (V/V) N-ii.thylmorpholin in Methanol, 40 Minuten lan ^e Inkubation bei Raumtemperatur und anschließendes Waschen mit Methanol, oder (II) durch 15 Minuten langes Durchströmen mit einer 5 /"igen (Gr/v) Lösung von G-lutaraldehyd in 0,2M-Boratpuffer von pH 8,5 bei Raumtemperatur und anschließendes Waschen bis zur Freiheit von überschüssigem Cr Iu tar aide hyd durch 5 Minuten langes Durchströmen mit 0,1M-x'hosphatpufferlösung von pH 8,0.

SchlieiSlich wurde jeder Schlauch mit einer wäßrigen Lösung von 1 aig/ml Kaninchenmuskel-Lactatdehydrogenase in einem neutralen Phosphatpuffer gefüllt und 2 bis 3 Stunden lan_ö bei 40 kubiert.

Die Menge an immobilisiertem Enzym und die Aktivitäten der vom Nylonschiach getragenen Enzyme sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Bsp. Verfahrens-Nr. weise

1 (a) (I)

2 (b) (1)

3 (a) (II)

4 (b) (II)

Tabelle

Nylonschlauchderivat

immobilisiertes
Enzym ₁
(mg M~')

Adipinsäuredihydrazid-Adipimidat-Enzym 0,56

Bernsteinsäuredihydrazid-Adipimidat-rJnzym 0,56

Adipinsäuredihydrazid-

G-lut ar aide hyd -Enzym 0,25

Bernsteinsäuredihydrazid-Glutaraldehyd-Enzym 0,22

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Schlauch-Aktivität (Mole M ' min" )

0,37 0,19 0,61 0,52

a -

Derivate von Glucoseoxidase, Katalase und Lactatdehydrogenase wurden in ähnlicher Weise hergestellt und zu Vergleichszwecken wurden auch Derivate der gleichen Enzyme hergestellt unter Verwendung von 1,6-Diaminohexan anstelle des Säuredihydrazids. Es zeigte sich, daß in einem Kontinuierlichdurchfluß-Analysator die Säuredihydrazidderivate beträchtlich verbesserte Übertragungscharakteristika aufweisen im Vergleich mit den Diaminderivaten. So zeigt z. B. das Lactatdehydrogenase-Dihydrazidderivat beträchtlich weniger unerwünschte Übertragung aufgrund der Pyridinnucleotidbindung als das entsprechende Diaminderivat. Es zeigte sich, daß Dihydrazidderivate bei einer Durchflußrate von 70 Proben/Stunde bei akzeptablem Übertragungseffekt verwendbar sind, wohingegen die Diaminderivate in zufriedenstellender Weise nur bis zu einer Durchflußrate von 40 Proben/Stunde verwendet werden können.

Beispiel 5

A) Herstellung des Polymeren:

Ein Nylonschlauch (Typ 6-Nylon, 0,1 cm lichte Weite) wurde alkyliert durch Einfüllen einer 12 folgen (G/V) Lösung von Triäthyloxonium-tetrafluoroborat in Dichloromethan und 15 Minuten lange Inkubation bei 25 ⁰O. Der Schlauch wurde sodann freigewaschen von überschüssigem Alkylierungsmittel durch 1 Minute langes Durchströmen mit Dichloromethan bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/Min.

B) Herstellung von Bernsteinsäurehydrazid:

Eine 4 $ige (G/V) Lösung des Hydrazids in Formamid wurde hergestellt durch Suspendieren von 4 g Bernsteinsäurehydrazid in 100 ml Formamid bei 55 ⁰G unter Rühren und 10 Minuten langes Weiterrühren nach Erhalt einer Lösung.

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- ve ff

C) Kupplung von Hydrazid an das Polymer:

Der alkylierte NyI ons chi auch, (imidatsalz von Nylon) wurde mit einer Lösung des Hydrazids gefüllt und 2 Stunden lang "bei 25 ⁰C inkubiert. Danach wurde der Überschuß an Hydrazid entfernt durch Durchwaschen mit 5 1 Wasser über Nacht bei 25 C.

D) Aktivierung der Trägersubstanz für die Enzymbindung: · Der hydrazidsubstituierte Nylonschlauch wurde für die Enzymbindung mit Glutaraldehyd aktiviert durch Füllen des Schlauches mit einer 5 folgen (G/V) Lösung von Glutaraldehyd in 0,2M-Boratpuffer von pH 8,5, und 10 Minuten langes Inkubieren bei 25 ⁰O. Überschüssiger Glutaraldehyd wurde entfernt durch 3 Minuten langes Durchwaschen mit O,1M-Phosphatpuffer von pH 7,0 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Der Schlauch wurde unmittelbar danach zur Bindung des Enzyms verwendet.

E) Enzymbindung:

Der Schlauch wurde gefüllt mit einer Lösung des Enzyms (0,2 bis 2,0 mg.ml" ) in O,1M-Phosphatpuffer von pH 7,5, und 3 Stunden lang bei 4 ⁰C inkubiert. Danach wurde überschüssiges Enzym und physikalisch gebundenes Enzym entfernt durch Duidiströmen des Schlauches mit 500 ml einer 0,5M-NaCl-Lösung bei 25 °C bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min.

Beispiel 6

Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Bernsteinsäurehydrazid durch Oxalsäurehydrazid ersetzt wurde.

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Beispiel 7

Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Bernsteinsäurehydrazid durch Adipinsäurehydrazid ersetzt wurde.

Beispiel 8

Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Bernsteinsäurehydrazid durch ein polyfunktionelles Säurehydrazid, das sich vom Pectin ableitete, wie folgt ersetzt wurde:

Pectin (Polygalacturonsäure-methylester) aus Citrusfrüchten reagiert bekanntlich mit Hydrazin unter Bildung des Säurehydrazidderivats. 10 g Pectin wurden in 100 ml Methanol suspendiert und 25 ml Hydrazinhydrat wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 36 Stunden lang bei 30 ⁰G gerührt. Danach wurde überschüssiges Hydrazin entfernt durch Waschen des Produktes in 80 $igem (V/V) Methanol in Wasser wie folgt. Das Pectin-hydrazid wurde unter Rühren in 250 ml Methanol-HpO 30 Minuten lang suspendiert, worauf das Produkt durch Filtration auf einem Buchner-Trichter gesammelt wurde. Diese Prozedur wurde sechsmal wiederholt. Das erhaltene Produkt wurde schließlich in Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

Das erhaltene Säurehydrazidderivat des Pectins wurde zum Gebrauch wie folgt verarbeitet. 1 g des Derivats wurde in 25 ml 0,1M-NaHGO, von pH 9,5 gelöst durch 1 Stunde langes Rühren bei 35 °C. Die erhaltene Lösung wurde zur Umsetzung mit dem Imidatsalz des Nylons verwendet.

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Beispiel 9

Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Bernsteinsäurehydrazid durch ein oolyfunktionelles Säurehydrazid, das sich von Dextran ableitete, wie folgt ersetzt wurde: Dextran von Leuconostoc mesenteroides (Molekulargewicht 100 bis 200 000) wurde zunächst oxidativ aufgespalten mit Perjodat. 10 g Dextran wurden unter Rühren in 200 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde auf pH 6,0 titriert. 6 g Natrium-meta-perjodat (NaJO.) wurden innerhalb von 2 Stunden zugegeben und das Gemisch wurde während des gesamten Zeitraums bei 4 C" gerührt und in einer dunklen Flasche aufbewahrt. Der pH-Wert wurde immer bei 6,0 gehalten. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 ⁰G stehen gelassen. Überschüssiges Perjodat wurde entfernt durch 5 Stunden lange Dialyse gegen fließendes Wasser. Die erhaltene Lösung von perjodatoxidiertem Dextran wurde mit 1,0M-NaOH auf pH 7,5 titriert und mit 25 g Adipinsäurehydrazid versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei Raumtemneratur gerührt und während der gesamten Zeit auf einem oH-Wert von 7,5 gehalten. Überschüssiges Hydrazid wurde entfernt durch 6 Stunden lange Dialyse gegen fließendes Leitungswasser. Das als Hydrazidderivat vorliegende Dextran wurde gefriergetrocknet und in lyophilisiertem Zustand aufbewahrt. Das Säurehydrazid wurde wie in Beispiel 8 beschrieben für die Weiterverwendung präpariert.

Beispiele 10 bis 14

Die in den Beispielen 5 bis 9 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt unter Ersatz der Verfahrensstufe D durch die folgende Verfahrensweise:

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Der Schlauch wurde mit einer Lösung von entweder Diäthyladipimidat oder Dimethylsuberimidat (5 folge (G-/V) Lösung in 20 ^igem (V/V) N-Athylmorpholin in wasserfreiem Methanol) gefüllt und 2 Stunden lang bei 25 ⁰C inkubiert. Überschüssiges Imidat wurde entfernt durch 2 Minuten langes Durchwaschen mit Methanol bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Der Schlauch wurde unmittelbar danach zur Bindung des Enzyms verwendet.

Beispiele 15 bis 19

Die in den Beispielen 5 bis 9 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt unter Ersatz der Verfahrensstufe D durch folgende Verfahrensweise:

Der Schlauch wurde in Form einer geschlossenen Schlaufe mit 100 ml eiskalter 1,OM-HGl durchströmt. 1,0 g NaNO₂ wurde innerhalb von 5 Minuten zu der restlichen Säure in dem Behälter zugegeben und das Pumpen wurde weitere 5 Minuten lang fortgesetzt bei einer Fließrate von 10 ml/Min. Der Schlauch und der Säurebehälter müssen während der gesamten Zeit auf 0 ⁰G gehalten werden. Überschüssige Salpetrige Säure wurde sodann entfernt durch 2 Minuten langes Durchwaschen mit eiskalter ImM-HCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Der Schlauch wurde unmittelbar danach zur Bindung des Enzyms verwendet.

Beispiele 20 und 21

Das in den Beispielen 7 und 12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei die Trägersubstanz im letztgenannten Beispiel mit Diäthyladipimidat aktiviert wurde. Das Enzym Aldehyddehydrοgenäse (ALDH) wurde sodann an die Trägersubstanz

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gebunden wie in Beispiel 5 unter Verfahrensstufe E beschrieben.

Zur Bestimmung der Übertragungseffekte wurden ALDH-tragende Schläuche wie in Beispiel 5, Verfahrensstufe A mit 1,6-Diaminohexan hergestellt, worauf die Trägersubstanz in ein,em Falle durch Adipimidat und im anderen Falle mit Glutaraldehyd an ALDH gekuppelt wurde.

Die erhaltenen vier Schläuche wiesen den folgenden Aufbau auf:

(I) Nylon - 1,6-Diaminohexan - Glutaraldehyd - ALDH (II) " - " " - Adipimidat - ALDH

(III) " - Adipinsäurehydrazid - Glutaraldehyd - ALDH (IV) " - " - Adipimidat - ALDH

Jeder Schlauch wurde abwechselnd in ein System aus Standard Technicon-AAI Modell eingebracht. Reduziertes Nicotinamidadenindinueleotid (NADH) wurde in einer Rate von 60 Proben/Std. mit einer 2:1 (V/V) Probe durchgeschickt: Waschverhältnis bei einer Fließrate von 0,23 ml/Min, in einen Strom aus Luft bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,60 ml/Min, und 0,1M-Phosphatpuffer von pH 7,5 bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,50 ml/Min. Der Flüssigkeitsstrom wurde durch eine kleine Mischspirale bei 25 0 geschickt und danach durch den Nylonschlauch bei 25 0» worauf die NADH in einem Spectrophotometer (bei 340 nm) analysiert wurde. Die Fließrate des Abflußstroms nach Passieren des Spektrophotometers betrug 2,00 ml/ Min., und die Übertragung wurde bestimmt durch Peakhöhenanalyse der spektrophotometrischen Peaks, die von 3 NADH-Proben (1,0 mM) und anschließend von 3 NADH-Proben geringerer Konzentration (0,2 mM) erhalten wurden. Die Übertragungs-Koeffizienten K für die vier Schläuche waren wie folgt:

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(D	O	,0405
(H)	O	,0890
(III)	O	,0143

(IV) 0,0143

Die Ergebnisse zeigen, daß die mit Hydrazidverbindungen hergestellten Derivate zu einer stark verringerten Übertragung führen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist auch ein Zwischenprodukt zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung der Träger das sich auszeichnet durch ein organisches Polymer mit Amidingruppen, deren Kohlenstoffatome an Seitenketten gebunden sind, die ein Säuredihydrazid umfassen, daß das am Polymergerüst gebundene Stickstoffatom der Amidingruppe aufweist,· wobei insbesondere als Polymeres ein modifiziertes Fylon, als Säuredihydrazid das Dihydrazid von Bernsteinsäure, Oxalsäure, Adipinsäure, Phthalsäure oder Dipicolinsäure ist und die Seitenkette ein Hydrazid von oxidiertem Dextran oder Pectin auf v/eist. Weiterhin ist bevorzugtes Ergebnis der Erfindung eine biologisch aktive Matrix, die eine erfindungsgemäße Trägersubstanz umfaßt an die ein biologisch aktives Material gebunden ist, insbesondere ein Protein oder ein Enzym, ein Cofaktor, ein Inhibitor, ein Antigen oder ein Antikörper.

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Claims

Patentansprüche

' Träger subs tanz für ein "biologisch aktives Material, gekennzeichnet durch ein organisches Polymer, das Amidingruppen aufweist, deren Kohlenstoffatome an Seitenketten gebunden sind, von denen jede eine funktioneile, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigte Gruppe aufweist, sowie eine CarbonylgruDpe oder eine Enolform derselben, die vom Kohlenstoffatom einer Amidingruppe getrennt ist durch deren am Polymergerüst gebundenes Stickstoffatom und höchstens durch ein weiteres Stickstoffatom in der Seitenkette.

Trägersubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein modifiziertes Nylonprodukt ist.

Trägersubstanz nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten eine Gruppe A aufweisen, die in einer oder mehreren der tautomeren Formen -N¹H-N²H-CO-, =N¹-N²H-GO-, -N¹H-N²=0(0H)- oder =N¹-N²=C(OH)- vorliegt, wobei N¹ das gebundene Stickstoffatom einer in das Polymer eingeführten Amidingruppe darstellt.

4. Trägersubstanz nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe A direkt an die Gruppe -R-GO- gebunden ist, wobei R einen organischen Rest darstellt.

5. Trägersubstanz nach AnsOruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten die Gruppen -CORGO- aufweisen, die für Succinyl-, Oxalyl-, Adipoyl-, Phthaloyl- oder Dioicolinoylreste stehen.

B 0 9 8 5 2 / Π 9 3 7

— ψ. —

6. Trägersubstanz nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten ein Polysaccharid mit einer Vielzahl von funktionellen, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigten Gruppen aufweisen.

7. Trägersubstanz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid an das Kohlenstoffatom der Amidingruppe durch die Gruppierung -A-R-CO-NH-NH- gebunden ist, worin R einen organischen Rest darstellt.

3. Trägersubstanz nach Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ein oxidiertes Dextran ist.

9. Trägersubstanz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenketten ein Polysaccharid aufweisen, das eine Vielzahl von funktionellen, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigten Gruppen trägt und an das Kohlenstoffatom der Amidingruppen im Polymer durch die Gruppe A gebunden ist.

10. Trägersubstanz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Pectin ist.

11. Trägersubstanz nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen Aldehyd-, Azid-, Adipimidat-, Suberimidat- oder Glutaraldehydgruppen sind.

12. Verfahren zur Herstellung einer Trägersubstanz für ein biologisch aktives Material nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Imidatgruppen eines organischen Polymeren mit einer organischen Verbindung umsetzt unter Einführung von Seitenketten in das Polymer, die eine Carbonylgruppe oder eine Enolform derselben aufweisen, welche vom Polymergerüst durch ein oder zwei Stickstoff-

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-Z-

1S

atome der Seitenkette entfernt ist, und danach die Seitenketten modifiziert unter Erzeugung von funktioneilen, zur Bindung an ein biologisch aktives Material befähigten Gruppen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymer ein modifiziertes Nylon verwendet.

14. Verfahren nach Ansprüchen 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Verbindung ein Säuredihydrazid verwendet.

15· Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß man das Dihydrazid von Bernsteinsäure, Oxalsäure, Adipinsäure, Phthalsäure oder Dipicolinsäure verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Verbindung eine ein Polysaccharid aufweisende Verbindung verwendet.

17· Verfahren nach Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem zumindest überwiegend nicht-wäßrigen Lösungsmittel bei einer Verbindungskonzentration von mindestens 50 mM durchführt.

18. Verfahren nach Ansprüchen 12 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß man die Seitenkette modifiziert durch Umwandlung einer darin vorliegenden Gruppe der Formel -CO-NH-NHp in eine Azidgruppe.

19. Verfahren nach Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Seitenkette modifiziert durch Umsetzung einer darin vorliegenden Gruppe der Formel -CO-NH-NHp mit Glutaraldehyd, Adipimidat oder Suberimidat.

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20. Kittel zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 12 bis 19, gekennzeichnet durch ein organisches Polymer mit Amidingruppen, deren Eohlenstoffatome an Seitenketten gebunden sind, die ein Säuredihydrazid umfassen, das das am Polymergerüst gebundene Stickstoffatom der Amidingruppen auf v/ei st.

21. Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein modifiziertes ITylon ist.

22. Mittel nach Ansprüchen 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Säuredihydrazid das Dihydrazid von Bernsteinsäure, Oxalsäure, Adipinsäure, Phthalsäure oder Dipicolinsäure ist.

25· Mittel nach Ansprüchen 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenkette ein Hydrazid von oxidiertem Dextran oder Pectin aufweist.

24-. Verwendung der Trägersubstanz nach Anspruch 1 bis 11 in einer biologisch aktiven Matrix, an die ein biologisch aktives Material gebunden ist.

25· Verwendung nach Anspruch 24-, worin das biologisch aktive Material ein Protein ist.

26. Verwendung nach Anspruch 24-, worin das biologisch aktive Material ein Enzym, ein Cofaktor, ein Inhibitor, ein Antigen oder ein Antikörper ist.

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