JPS6091993A - アミノ基転移によるｌ−アミノ酸類の製造方法 - Google Patents
アミノ基転移によるｌ−アミノ酸類の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアルファアミノ酸類及びその誘導体の製造、特
にＬ−アスパラギン酸及び所望のアミノ酸のアルファー
ケト酸化合物と、の間のアミン基転移によるＬ−アミノ
酸類及びその誘導体に関するものである。本発明はまた
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いてＤ−アミノ酸を２−
ケトカルボン酸に変換し、しかる後その２−ケトカルボ
ン酸＝ｉＬ−アミノ酸へ変換するためトランスアミナー
ゼを用いる単一工程によるり、Ｌ−アミノ酸のＬ−アミ
ノ酸への変換にも関するものである。
にＬ−アスパラギン酸及び所望のアミノ酸のアルファー
ケト酸化合物と、の間のアミン基転移によるＬ−アミノ
酸類及びその誘導体に関するものである。本発明はまた
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いてＤ−アミノ酸を２−
ケトカルボン酸に変換し、しかる後その２−ケトカルボ
ン酸＝ｉＬ−アミノ酸へ変換するためトランスアミナー
ゼを用いる単一工程によるり、Ｌ−アミノ酸のＬ−アミ
ノ酸への変換にも関するものである。
発明の背景技術
アミノ酸は現在動物飼料への添加物、ヒトの食糧の栄養
付加剤、点滴液剤の成分そして医薬及び農業用化学品の
製造のための合成中間体としての応用性を有している。
付加剤、点滴液剤の成分そして医薬及び農業用化学品の
製造のための合成中間体としての応用性を有している。
Ｌ−グルタミン酸は年間十億ドルを超える世界市場を持
つ食品風味増強剤として使用されている。Ｌ−リジン及
びメチオニンは動物飼料に対する大量の添加物であシ、
さらにＬ−）リプトファン及びＬ−スレオニンは同様の
潜在的応用性を有している。Ｌ−フェニルアラニン及び
Ｌ−アスパラギン酸は甘味料アスパルテーム製造におけ
る重要成分として非常に重要な市場を持つ。点滴液剤は
ヒトの食事に必須のものを含めた広範なアミノ酸類を必
要とする。
つ食品風味増強剤として使用されている。Ｌ−リジン及
びメチオニンは動物飼料に対する大量の添加物であシ、
さらにＬ−）リプトファン及びＬ−スレオニンは同様の
潜在的応用性を有している。Ｌ−フェニルアラニン及び
Ｌ−アスパラギン酸は甘味料アスパルテーム製造におけ
る重要成分として非常に重要な市場を持つ。点滴液剤は
ヒトの食事に必須のものを含めた広範なアミノ酸類を必
要とする。
アミノ酸製造に現用されている方法には抽出、化学合成
と光学異性体分割、発酵及び酵素的合成（生物触媒）が
ある。多くの応用性に対してはアミノ酸のＬ−型が要求
されるが、ある種のアミノ酸ではＬ−型よシもラセミの
り、Ｌ 型にてよシ容易に製造されるものがある。抽出
法では蛋白質加水分解物からの対象とするアミノ酸の大
規模な精製が必要である。化学合成法では通常ラセミ混
合物が形成され、その光学活性生成物製造のだめの分割
は往々にして費用がかかり、また不充分なことがある。
と光学異性体分割、発酵及び酵素的合成（生物触媒）が
ある。多くの応用性に対してはアミノ酸のＬ−型が要求
されるが、ある種のアミノ酸ではＬ−型よシもラセミの
り、Ｌ 型にてよシ容易に製造されるものがある。抽出
法では蛋白質加水分解物からの対象とするアミノ酸の大
規模な精製が必要である。化学合成法では通常ラセミ混
合物が形成され、その光学活性生成物製造のだめの分割
は往々にして費用がかかり、また不充分なことがある。
発酵法は、上述の方法に固有の多くの欠点全解決するも
のであるが低変換速度、希釈溶液、費用がかかる精製そ
して非常に高い資本原価という問題をかかえている。バ
イオキャタリシス（生物触媒）は主にかなシ低い資本要
求性、製品の流れにおける副生物のないことによるよシ
低い精製費用そして、少数の酵素法工程が関わることに
よる生成物への基質の高変換率などによシ多くの場合に
おいて潜在的なより低費用製造法を提供するものである
。
のであるが低変換速度、希釈溶液、費用がかかる精製そ
して非常に高い資本原価という問題をかかえている。バ
イオキャタリシス（生物触媒）は主にかなシ低い資本要
求性、製品の流れにおける副生物のないことによるよシ
低い精製費用そして、少数の酵素法工程が関わることに
よる生成物への基質の高変換率などによシ多くの場合に
おいて潜在的なより低費用製造法を提供するものである
。
いくつかの生物触媒法が現在用いられている。
゛例えば、Ｌ−アスパラギン酸は酵素アスパルターゼの
存在下におけるフマル酸のアンモニアとの反応によシ市
湯量製造されている。トサ（Ｔｏ ｓａ ）ら、２７．
８８６−９（１９７４）参照。Ｌ−フェニルア２ニンハ
酵素フェニルアラニン−アンモニアリアーゼを用い桂皮
酸及びアンモニアから酵素的合成によシ製造できる。Ｌ
−アラニンはＬ−アスパラギン酸から酵素的脱炭酸によ
シ合成できる。アメリカ合衆国特許屑３．４５８．４０
０及び３，４６３，７０４参照。これらの方法は挙げた
個々のアミノ酸の製造に対して有用である。しかしなが
ら、これらの方法はいずれも多数のアミノ酸の製造に対
し広い応用性含有する一般的な酵素工学に基ずくもので
はない。
存在下におけるフマル酸のアンモニアとの反応によシ市
湯量製造されている。トサ（Ｔｏ ｓａ ）ら、２７．
８８６−９（１９７４）参照。Ｌ−フェニルア２ニンハ
酵素フェニルアラニン−アンモニアリアーゼを用い桂皮
酸及びアンモニアから酵素的合成によシ製造できる。Ｌ
−アラニンはＬ−アスパラギン酸から酵素的脱炭酸によ
シ合成できる。アメリカ合衆国特許屑３．４５８．４０
０及び３，４６３，７０４参照。これらの方法は挙げた
個々のアミノ酸の製造に対して有用である。しかしなが
ら、これらの方法はいずれも多数のアミノ酸の製造に対
し広い応用性含有する一般的な酵素工学に基ずくもので
はない。
多くのアミノ酸の製造に広く応用し得る一つの酵素的方
法が米国特許３．１８３．１７０に記載されている。そ
の特許３１８３１７０の方法においてｑＬ−グルタミン
酸及び一種のケト［１１ｔ）ランスアミナーゼと共に混
合し、アル７アーケトグルタール酸及びＬ−アミノ酸金
製造する。そのアルファーケトゲルタール酸は多酵素系
、水素ガス及び無機アンモニウム塩、有機アンモニウム
塩、水酸化アンモニウム、アンモニアガス或いは尿素の
ような窒素源の存在下Ｌ−グルタミン酸に連続的に還元
される。斯様にして製造したＬ−グルタミン酸は再循環
することによシ少量のＬ−グルタミン酸にて大量のＬ−
アミノ酸の製造を可能ならしめるのである。しかしなが
ら、この多酵素系は、高価で加水分解に不安定であり、
酸素及び光に対し感受性である補因子ＮＡＤ／ＮＡＤＨ
を必要とするため商業的規模での操業は困難である。
法が米国特許３．１８３．１７０に記載されている。そ
の特許３１８３１７０の方法においてｑＬ−グルタミン
酸及び一種のケト［１１ｔ）ランスアミナーゼと共に混
合し、アル７アーケトグルタール酸及びＬ−アミノ酸金
製造する。そのアルファーケトゲルタール酸は多酵素系
、水素ガス及び無機アンモニウム塩、有機アンモニウム
塩、水酸化アンモニウム、アンモニアガス或いは尿素の
ような窒素源の存在下Ｌ−グルタミン酸に連続的に還元
される。斯様にして製造したＬ−グルタミン酸は再循環
することによシ少量のＬ−グルタミン酸にて大量のＬ−
アミノ酸の製造を可能ならしめるのである。しかしなが
ら、この多酵素系は、高価で加水分解に不安定であり、
酸素及び光に対し感受性である補因子ＮＡＤ／ＮＡＤＨ
を必要とするため商業的規模での操業は困難である。
Ｄ、Ｌ−アミノ酸の分割については商業規模の方法が、
今月存在する（Ｔ、 ） ｆ （Ｔ、Ｔｏｓａ） 、バ
イオテ（１９７６）参照）。この方法ではり、Ｌ−アミ
ノ酸金無水酢酸と反応させてり、Ｌ−Ｎ−アシル−アミ
ノ酸を製造する。豚腎臓あるいは糸状菌、アスペルギル
ス オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
） 由来の酵素Ｌ−アミノ酸アシラーゼとの反応は特異
的にり、−Ｎ−アシルアミノ酸のみを加水分解し、所望
のＬ−アミノ酸と未反応のり、−Ｎ−アシルアミノ酸と
のｌ＝１混合物を製造する。これらの生成物は分離し、
そして未反応のＤ−Ｎ−７シルアミノ酸欠ラセミ化し、
さらに本法を通して再循環する。Ｎ−アシルアミノ酸に
て出発し、本法では不連続の三工程二すなセち、Ｌ−Ｎ
−アシルアミノ酸の酵素触媒加水分解、Ｄ−Ｎ−アクル
アミノ酸からのＬ−アミノ酸の物理的分離、そして工程
再循環のためのＤ−Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ化を必
要とする。
今月存在する（Ｔ、 ） ｆ （Ｔ、Ｔｏｓａ） 、バ
イオテ（１９７６）参照）。この方法ではり、Ｌ−アミ
ノ酸金無水酢酸と反応させてり、Ｌ−Ｎ−アシル−アミ
ノ酸を製造する。豚腎臓あるいは糸状菌、アスペルギル
ス オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
） 由来の酵素Ｌ−アミノ酸アシラーゼとの反応は特異
的にり、−Ｎ−アシルアミノ酸のみを加水分解し、所望
のＬ−アミノ酸と未反応のり、−Ｎ−アシルアミノ酸と
のｌ＝１混合物を製造する。これらの生成物は分離し、
そして未反応のＤ−Ｎ−７シルアミノ酸欠ラセミ化し、
さらに本法を通して再循環する。Ｎ−アシルアミノ酸に
て出発し、本法では不連続の三工程二すなセち、Ｌ−Ｎ
−アシルアミノ酸の酵素触媒加水分解、Ｄ−Ｎ−アクル
アミノ酸からのＬ−アミノ酸の物理的分離、そして工程
再循環のためのＤ−Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ化を必
要とする。
発明の要約
本発明は容易に入手可能なＬ−アスパラギン酸（或いは
Ｌ−アスパラギン酸塩）から多くのアルファアミノ酸を
製造しうる酵素的方法を提供するものである０本発明の
方法においては、Ｌ−アスパラギン酸及びアルファーケ
トｉｔ）？ンスアミナーゼの存在下反応してＬ−アミノ
酸とオキザロ酢酸を形成し、次いでそのオキザロ酸の脱
炭酸によジビルビン酸を生成する。オキザロ酢酸の脱炭
酸はその反応を完結に導く。９５％あるいはそれ以上と
いう所望のアミノ酸の収率が容易に達成される。その副
生物であるピルビン酸はＬ−アミノ酸から容易に分離さ
れまた高度に売却可能である。
Ｌ−アスパラギン酸塩）から多くのアルファアミノ酸を
製造しうる酵素的方法を提供するものである０本発明の
方法においては、Ｌ−アスパラギン酸及びアルファーケ
トｉｔ）？ンスアミナーゼの存在下反応してＬ−アミノ
酸とオキザロ酢酸を形成し、次いでそのオキザロ酸の脱
炭酸によジビルビン酸を生成する。オキザロ酢酸の脱炭
酸はその反応を完結に導く。９５％あるいはそれ以上と
いう所望のアミノ酸の収率が容易に達成される。その副
生物であるピルビン酸はＬ−アミノ酸から容易に分離さ
れまた高度に売却可能である。
本発明はまたり、Ｌ−アミノ酸類のＬ−アミノ酸への一
工程での変換の方法をも提供するものである。本発明の
方法においては酵素Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて
そのり、Ｌ−混合物中のＤ−アミノ酸を対応する２−ケ
ト酸へと変換する。その２−ケト酸は次いで酵素的に同
一混合物中にて対応するＬ−アミノ酸にアミ７基転移す
る。この二つのｔ＃素が触媒する反応全一工程にて行な
い、Ｄ、Ｌ−アミノ酸類からＬ−アミノ酸を直接且つ高
収率で製造するものである。
工程での変換の方法をも提供するものである。本発明の
方法においては酵素Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて
そのり、Ｌ−混合物中のＤ−アミノ酸を対応する２−ケ
ト酸へと変換する。その２−ケト酸は次いで酵素的に同
一混合物中にて対応するＬ−アミノ酸にアミ７基転移す
る。この二つのｔ＃素が触媒する反応全一工程にて行な
い、Ｄ、Ｌ−アミノ酸類からＬ−アミノ酸を直接且つ高
収率で製造するものである。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いるＤ−アミノ酸の２−
ケト酸への変換はニルンン （Ｎｎｓｏｎ）ら４７−９
（１９８２） に記載されている。さらに、Ｂｉｏｔｅ
＋：］１ｎｏ１．ｅ ６ 、２９３−３０８ （１９８
１） 及びフインク（Ｆｉｎｋ）ら、 ＡＩＣｈＥシン
ポジウム シリーズ７４．１８−２４（１９７８） 参
照。しかしながら、Ｄ、Ｌ−アミノ酸混合物を直接Ｌ−
アミノ酸に変換するためにトランスアミナーゼと組合せ
たＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いることに関してはこ
れｌで全く示唆されていない。
ケト酸への変換はニルンン （Ｎｎｓｏｎ）ら４７−９
（１９８２） に記載されている。さらに、Ｂｉｏｔｅ
＋：］１ｎｏ１．ｅ ６ 、２９３−３０８ （１９８
１） 及びフインク（Ｆｉｎｋ）ら、 ＡＩＣｈＥシン
ポジウム シリーズ７４．１８−２４（１９７８） 参
照。しかしながら、Ｄ、Ｌ−アミノ酸混合物を直接Ｌ−
アミノ酸に変換するためにトランスアミナーゼと組合せ
たＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いることに関してはこ
れｌで全く示唆されていない。
３、発明の詳細な説明
本発明に従いトランスアミナーゼ類（アミ′ノド２ンス
フエラーゼ類）として知られる一群の酵素は一般反応： を触媒する。
フエラーゼ類）として知られる一群の酵素は一般反応： を触媒する。
適当な２−ケト酸前駆体Ｂを選択することにょシ、他の
Ｌ−アミノ酸Ａｌアミノ供与体として用いるアミノ基転
移によシ所望のＬ−アミノ酸Ｂを製造することができる
。その反応の制生物として所望のアミノ酸Ｂと共に第二
の２−ケト酸Ａが生成する。このアミノ基転移法の利点
は：１、Ｌ−アミノ酸が特異的に製造される。
Ｌ−アミノ酸Ａｌアミノ供与体として用いるアミノ基転
移によシ所望のＬ−アミノ酸Ｂを製造することができる
。その反応の制生物として所望のアミノ酸Ｂと共に第二
の２−ケト酸Ａが生成する。このアミノ基転移法の利点
は：１、Ｌ−アミノ酸が特異的に製造される。
２ その２−ケト酸前駆体は化学合成から容易に入手出
来る。
来る。
３、その反応速度は比較的急速である。
４、その資本原価は発酵法よシも低い。
５、様々な選択性のトランスアミナーゼ類、例えば芳香
族アミノ酸トラノスアミナーゼ、分校鎖状アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ、酸側鎖を有するアミノ酸に対し特異的
なトランスアミナーゼなど、が入手可能であるからその
技術は一般的である。
族アミノ酸トラノスアミナーゼ、分校鎖状アミノ酸トラ
ンスアミナーゼ、酸側鎖を有するアミノ酸に対し特異的
なトランスアミナーゼなど、が入手可能であるからその
技術は一般的である。
そのようなトランスアミナーゼ類は例えば以下の微生物
：エシエリチア コリＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ） ｏバチルス サゾチリスＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ。
：エシエリチア コリＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ） ｏバチルス サゾチリスＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ。
アクロモバクタ−エラリブイセＡｃｈｒｏｍｏ ｂａｃ
ｔｅｒｅｕｒｙｄｘｃｅ ｅクレブシェラ エアロゲ
ネスＫｌｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓ等々、か
ら調製できる。本発明の実施に有用なトランスアミナー
ゼ類は）Ｉ、Ｅ、ウムバーガ４７、ｐｐ ５３３−６０
６（１９７８）にも記載されている。
ｔｅｒｅｕｒｙｄｘｃｅ ｅクレブシェラ エアロゲ
ネスＫｌｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓ等々、か
ら調製できる。本発明の実施に有用なトランスアミナー
ゼ類は）Ｉ、Ｅ、ウムバーガ４７、ｐｐ ５３３−６０
６（１９７８）にも記載されている。
この一般的な方法の唯−最大の欠点は上述のアミノ基転
移反応に関する平衡定数が約１．０であることである。
移反応に関する平衡定数が約１．０であることである。
その結果、上述の反応についての所望のアミノ酸の収率
は決してｔｔｙ５０％を超えないであろう。アミノ酸製
造のための商業的に成功するアミノ基転移法の開発の鍵
は、２−ケト酸Ｂの所望のアミノ酸Ｂへの不完全変換の
問題を克服することである。
は決してｔｔｙ５０％を超えないであろう。アミノ酸製
造のための商業的に成功するアミノ基転移法の開発の鍵
は、２−ケト酸Ｂの所望のアミノ酸Ｂへの不完全変換の
問題を克服することである。
この問題は本発明により、アミノ供与体（Ｌ−アミノ酸
Ａ）としてＬ−アスパラギ／酸を使用しそしてその副生
物（２−ケト酸Ａ）すなわちオキザロ酢ｒＩＩ’ｔ−不
可逆反応である脱炭酸によｐピルビン酸に変換すること
により解決された。
Ａ）としてＬ−アスパラギ／酸を使用しそしてその副生
物（２−ケト酸Ａ）すなわちオキザロ酢ｒＩＩ’ｔ−不
可逆反応である脱炭酸によｐピルビン酸に変換すること
により解決された。
望ましいのはそのオキザロ酢酸の不可逆的脱炭酸をアミ
ン基転移反応に共役させることである。
ン基転移反応に共役させることである。
すなわち、そのアミノ基転移反応を次に示すように完結
に至らしめるのである。
に至らしめるのである。
本発明によりオキザロ酢酸の脱炭酸會アミノ基転移に結
合することにより、高収率なＬ−アミノ酸の製造を生物
触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）法によ）達成できる
。この方法を用いて、１００％に達する収率にて２−ケ
ト酸前駆体Ｂの所望のアミノ酸Ｂへの変換が達成されて
いる。
合することにより、高収率なＬ−アミノ酸の製造を生物
触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）法によ）達成できる
。この方法を用いて、１００％に達する収率にて２−ケ
ト酸前駆体Ｂの所望のアミノ酸Ｂへの変換が達成されて
いる。
オキザロ酢酸の脱炭酸は加熱により、様々な金属イオン
、アミン類及び／または酸類によシ化学的に；あるいれ
望ましくは酵素オキザロ酢酸デカルボキシラー−ｔ２
（ＯＡＤ）Ｅ、Ｃ，４，Ｌｌ、３によシ酵素的に触媒す
ることができる。如伺なる材料からのオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼを用いてもよ１／）。
、アミン類及び／または酸類によシ化学的に；あるいれ
望ましくは酵素オキザロ酢酸デカルボキシラー−ｔ２
（ＯＡＤ）Ｅ、Ｃ，４，Ｌｌ、３によシ酵素的に触媒す
ることができる。如伺なる材料からのオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼを用いてもよ１／）。
本発明の実施に有用なオキザロ酢酸デカルＨ（キシラー
ゼの材料０例には例えばミクロコツカス １ノゾデイク
テイカス Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｙｓｏｄｅｉｋ
ｔｉｃｕｓから再命名されたミクロコツカス ルテウス
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ （参考文献と
して弓１用するメンツヅ イン エンザイモロジイ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ １ｎ２−關■■■−■甲−一一■−―−
■−１−■−−−噌一−ｎ唖＆ｚｙｍｏｌｏｇ７１ 、
７５３−７ （１９５５）参照）、シュードモナス プ
チダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ （本文３
８１−３（１９６４）参照）、そしてアゾトノぐクタ−
ビネンンデイ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｐｒ ｖｉｎａｌａ
ｎｄｉｉ （本文１３（１９４９）参照）等々がある。
ゼの材料０例には例えばミクロコツカス １ノゾデイク
テイカス Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｙｓｏｄｅｉｋ
ｔｉｃｕｓから再命名されたミクロコツカス ルテウス
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ （参考文献と
して弓１用するメンツヅ イン エンザイモロジイ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ １ｎ２−關■■■−■甲−一一■−―−
■−１−■−−−噌一−ｎ唖＆ｚｙｍｏｌｏｇ７１ 、
７５３−７ （１９５５）参照）、シュードモナス プ
チダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ （本文３
８１−３（１９６４）参照）、そしてアゾトノぐクタ−
ビネンンデイ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｐｒ ｖｉｎａｌａ
ｎｄｉｉ （本文１３（１９４９）参照）等々がある。
また、オキザロ酢酸ブカルボキシラーゼ活性を有するが
通常５オキザロ酢酸デカルボキシ２−ゼと考えられ七い
ない例えばピルビン醒ギナーゼリンゴ酸酵素（Ｍａｌｉ
ｃ Ｅｎｚｙｍｅ）等々のようないずれの他の酵素を用
いてもよい。そのオキザロ酢酸デカルボキシラーゼの活
性は例えばＭｎ、Ｃａ 、ＣＣＩ 、Ｍｇ 。
通常５オキザロ酢酸デカルボキシ２−ゼと考えられ七い
ない例えばピルビン醒ギナーゼリンゴ酸酵素（Ｍａｌｉ
ｃ Ｅｎｚｙｍｅ）等々のようないずれの他の酵素を用
いてもよい。そのオキザロ酢酸デカルボキシラーゼの活
性は例えばＭｎ、Ｃａ 、ＣＣＩ 、Ｍｇ 。
Ｎ１″１ＨＺｎ＋＋＋ Ｆｅ＋ｊＣＩＩ ＋Ｃ’ｊ々の
ような金属イオンの添加によシ堆強することができる。
ような金属イオンの添加によシ堆強することができる。
本発明の方法は従って、適当な２−ケト酸前駆体及びＬ
−アスパラギン酸によりそれにアミノ基転移し得る酵素
を選択することによシ広範なＬ−アミノ酸類の製造に使
用できるものである。例えば、甘味料アスパルテーム製
造における重要成分であるアミノ酸し−フェニルアラニ
ンはフェニルピルビン酸及びＬ−アスパラギン酸から、
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉから単離したトランスアミナーゼ及
びシュードモナス プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎｓｓ ｐ
ｕｔｉｄａあるいはミクロコツカス ルテウスＭｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓのいずれかから単離した
オキザロ酢酸デカルボキシラーゼを使用して本方法によ
シ高収率にて製造されている 同様にこれらと同一の酵
素類を使用してｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸はＬ
−チロシンへ変換された、インドール−３−ピルビン酸
或いは３−（３−インドリル）ピルビン酸はＬ−トリプ
トファンに変換され、また２−オキソ−４−メチルはン
タン酸はＬ−ロイシンにてして、４−フェニル−２−オ
キシプタン酸はＬ−４−フェニル−２−アミノブタン酸
に変換されている。
−アスパラギン酸によりそれにアミノ基転移し得る酵素
を選択することによシ広範なＬ−アミノ酸類の製造に使
用できるものである。例えば、甘味料アスパルテーム製
造における重要成分であるアミノ酸し−フェニルアラニ
ンはフェニルピルビン酸及びＬ−アスパラギン酸から、
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉから単離したトランスアミナーゼ及
びシュードモナス プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎｓｓ ｐ
ｕｔｉｄａあるいはミクロコツカス ルテウスＭｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓのいずれかから単離した
オキザロ酢酸デカルボキシラーゼを使用して本方法によ
シ高収率にて製造されている 同様にこれらと同一の酵
素類を使用してｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸はＬ
−チロシンへ変換された、インドール−３−ピルビン酸
或いは３−（３−インドリル）ピルビン酸はＬ−トリプ
トファンに変換され、また２−オキソ−４−メチルはン
タン酸はＬ−ロイシンにてして、４−フェニル−２−オ
キシプタン酸はＬ−４−フェニル−２−アミノブタン酸
に変換されている。
異なる特異性を有するトランスアミナーゼ類を使用する
ことによシ２−オキシー３−メチルはンタン酸はアミノ
基転移されてＬ−インロイシンへ、２−オキシー３−メ
チルブタン酸１．ｊ：Ｌ−バリンへ、ピルビン酸はＬ−
アラニンへ、３−ヒドロキシピルビン酸はＬ−セリンへ
、グリオキシル酸はグリシンへ、そして２−オキソ−４
−チオメチルメタン酸はＬ−メチオニンへ変換された。
ことによシ２−オキシー３−メチルはンタン酸はアミノ
基転移されてＬ−インロイシンへ、２−オキシー３−メ
チルブタン酸１．ｊ：Ｌ−バリンへ、ピルビン酸はＬ−
アラニンへ、３−ヒドロキシピルビン酸はＬ−セリンへ
、グリオキシル酸はグリシンへ、そして２−オキソ−４
−チオメチルメタン酸はＬ−メチオニンへ変換された。
すなわち、ケト酸出発物質ＲＣＯＣ０２ＨにおけるＲは
例えば水素、置換及び非置換低級アルキル、置換及び非
置換低級アリール及び複素環基を含む広範な糧類の置換
基から選択することができる。
例えば水素、置換及び非置換低級アルキル、置換及び非
置換低級アリール及び複素環基を含む広範な糧類の置換
基から選択することができる。
本文中で使用する用語１低級アルキル１は、１から約６
個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖状アルキル基を意
味するものである。置換低級アルキル基は天然アミノ酸
に見出される様なヒドロキシ、メルカプト、カルバモイ
ル、カルボキシ、アミノ、アミジノ及びＲ１−チオ（こ
こでＲ１は低級アルキルとする）基にて置換された低級
アルキル基を意味する。
個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖状アルキル基を意
味するものである。置換低級アルキル基は天然アミノ酸
に見出される様なヒドロキシ、メルカプト、カルバモイ
ル、カルボキシ、アミノ、アミジノ及びＲ１−チオ（こ
こでＲ１は低級アルキルとする）基にて置換された低級
アルキル基を意味する。
本文中で使用する用語“低級アリール１はフェニル及び
ばｙジル基を意味する。置換低級アリール基には上述の
低級アルキルについて列挙した様な基にて置換されたフ
ェニル及びベンジル基金含むものとする。
ばｙジル基を意味する。置換低級アリール基には上述の
低級アルキルについて列挙した様な基にて置換されたフ
ェニル及びベンジル基金含むものとする。
本文中にて用いている複素環基は４−イミダゾイルメチ
ル、３−インドイルメチル等々を意味する。
ル、３−インドイルメチル等々を意味する。
本発明の実施に適したその様なＲ基の例には：水素、メ
チル、インプロピル、インブチル、５ｅｃ−ブチル−ベ
ンジル、フェニル−１−（メチルチオ）エチル、ヒドロ
キシメチル、メルカプトメチル、ｐ−ヒドロキシインジ
ル、ｐ−ヒドロキシフェニル、カルバモイルメチル、カ
ルバモイルエチル、アミノ基転移、ノ′ミジノアミノプ
ロピル、インドリル、３−インドリルメチル、イミダゾ
イル、４−イミダゾリルメチル等々がある。
チル、インプロピル、インブチル、５ｅｃ−ブチル−ベ
ンジル、フェニル−１−（メチルチオ）エチル、ヒドロ
キシメチル、メルカプトメチル、ｐ−ヒドロキシインジ
ル、ｐ−ヒドロキシフェニル、カルバモイルメチル、カ
ルバモイルエチル、アミノ基転移、ノ′ミジノアミノプ
ロピル、インドリル、３−インドリルメチル、イミダゾ
イル、４−イミダゾリルメチル等々がある。
オキザロ酢酸の脱炭酸副生物ピルビン酸は貴重な商業良
品であり、酸性化及び蒸製、イオン交換、溶媒抽出等々
のような従来の当分野で記載されているいずれの方法に
よっても生成物の流れから回収することができる。
品であり、酸性化及び蒸製、イオン交換、溶媒抽出等々
のような従来の当分野で記載されているいずれの方法に
よっても生成物の流れから回収することができる。
本発明の他の具体例においてはＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ（Ｅ、Ｃ，ｉ、 ｔ ３．３． ）として知られる一
群の酵素は式ｌに示す一般反応を触媒する。
ゼ（Ｅ、Ｃ，ｉ、 ｔ ３．３． ）として知られる一
群の酵素は式ｌに示す一般反応を触媒する。
Ｄ−アミノ酸 ２−ケト酸
この酵素反応は次の反応式：
〔Ｌ−アミノ酸） （Ｌ−アミノ酸〕
に従い、Ｄ、Ｌ−アミノ酸の２セミ混合物からＬ−アミ
ノ酸類を製造するために上述のトランスアミナーゼ反応
と結合させることができる。上記反応式においては分子
状酸素がＤ−アミノ酸オキシダーゼに対する水素受容体
として図示されておシ、副生物として過哉化水素を形成
する。
ノ酸類を製造するために上述のトランスアミナーゼ反応
と結合させることができる。上記反応式においては分子
状酸素がＤ−アミノ酸オキシダーゼに対する水素受容体
として図示されておシ、副生物として過哉化水素を形成
する。
しかしながら、色素類のような他の水素受容体もまた使
用することができる。
用することができる。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは本発明における使用のため
いずれの材料から得てもよい。例としては豚腎臓、トリ
ゴノプシス ヴアリアビリスＴｏｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｌｉｓ、カンジダ属のカビ等々があ
る。豚腎臓由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼはよく性質
が明らかにされており、この酵素の性質に関する記事は
Ａ。マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ）及びり、ライルナ−
（Ｗｉｌｌｎｅｔ） ＃ジ エンザイムズ ＴｈｅＥｎ
ｚｙｍｅｓ＋ １ 、６３４ （１９６３）に見出すこ
とができる。本発明の実施において有用な他の酵素はＤ
−アスノξラギン酸オキシダーゼ（Ｅ、Ｃ，１４３，１
）及びＤ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｅ、Ｃ，１，４
，３，７）のようなより基質特異性金持ったものである
。その様な酵素類鉱ここではよシ特別な酵素を用いない
限シ集約的にＤ−アミノ酸オキシダーゼとして示すこと
とする。豚腎臓由来の酵素はそれが酸性及び塩基性側鎖
を有するものを除き全てのＤ−アミノ酸に作用するとい
う広い基質特異性を持つ故に本発明における使用に望ま
しいものである。それは、基質として選んだＤ−アミノ
酸に依り、蛋白質ミリグラムあたシー分間につき２０−
６０マイクロモルのホ包囲の生成物を生成するという比
活性を有している。酸素が最も効果的な電子受容体であ
るがまたある種の色素類も低効率ながら使用することが
できる。その酵素はＬ−アミノ酸類あるいはアミノ酸ア
ミン類により阻害されることはないが、２−ケト酸類及
び２−ヒビロキシ酸類では様々な程度に競争的に阻害さ
れる。
いずれの材料から得てもよい。例としては豚腎臓、トリ
ゴノプシス ヴアリアビリスＴｏｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｌｉｓ、カンジダ属のカビ等々があ
る。豚腎臓由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼはよく性質
が明らかにされており、この酵素の性質に関する記事は
Ａ。マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ）及びり、ライルナ−
（Ｗｉｌｌｎｅｔ） ＃ジ エンザイムズ ＴｈｅＥｎ
ｚｙｍｅｓ＋ １ 、６３４ （１９６３）に見出すこ
とができる。本発明の実施において有用な他の酵素はＤ
−アスノξラギン酸オキシダーゼ（Ｅ、Ｃ，１４３，１
）及びＤ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｅ、Ｃ，１，４
，３，７）のようなより基質特異性金持ったものである
。その様な酵素類鉱ここではよシ特別な酵素を用いない
限シ集約的にＤ−アミノ酸オキシダーゼとして示すこと
とする。豚腎臓由来の酵素はそれが酸性及び塩基性側鎖
を有するものを除き全てのＤ−アミノ酸に作用するとい
う広い基質特異性を持つ故に本発明における使用に望ま
しいものである。それは、基質として選んだＤ−アミノ
酸に依り、蛋白質ミリグラムあたシー分間につき２０−
６０マイクロモルのホ包囲の生成物を生成するという比
活性を有している。酸素が最も効果的な電子受容体であ
るがまたある種の色素類も低効率ながら使用することが
できる。その酵素はＬ−アミノ酸類あるいはアミノ酸ア
ミン類により阻害されることはないが、２−ケト酸類及
び２−ヒビロキシ酸類では様々な程度に競争的に阻害さ
れる。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応に結合したアミ７基転移
反応に対する適したアミン基供与体はＬ−グルタミン酸
及びＬ−アスパラギン酸である。
反応に対する適したアミン基供与体はＬ−グルタミン酸
及びＬ−アスパラギン酸である。
これらのアミノ酸はいずれも各局に入手できかつ低にで
ある。Ｌ−アスパラギン酸がそのアミ７基供与体（Ｌ−
アミノ酸Ａ）としての使用に望ましく、その副生成物（
２−ケト酸Ａ）、すなわちオキザロ酢酸は不可逆反応、
脱炭酸にょルビルピン酸へ変換する。
ある。Ｌ−アスパラギン酸がそのアミ７基供与体（Ｌ−
アミノ酸Ａ）としての使用に望ましく、その副生成物（
２−ケト酸Ａ）、すなわちオキザロ酢酸は不可逆反応、
脱炭酸にょルビルピン酸へ変換する。
過酸化水素の蓄積は酵素類を不活性化することが知られ
てお９（グリーンフィールドＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、
Ａｎｎｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ６５． ｌ Ｏ’９
（１９７５））−また２−ケト酸類の分解をも引き起こ
すことがある。
てお９（グリーンフィールドＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、
Ａｎｎｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ６５． ｌ Ｏ’９
（１９７５））−また２−ケト酸類の分解をも引き起こ
すことがある。
この結合触媒系における活性酵素の半減期を引き延ばし
、且つケト酸の分解を防止するためにＤ−アミノ酸オキ
シダーゼに、よシ触媒される工程にて生成する旦２０２
は当分野の専門家には周知のＨ２Ｏ２分解のいくつかの
方法のいずれかにより除去することができる。
、且つケト酸の分解を防止するためにＤ−アミノ酸オキ
シダーゼに、よシ触媒される工程にて生成する旦２０２
は当分野の専門家には周知のＨ２Ｏ２分解のいくつかの
方法のいずれかにより除去することができる。
一つの方法は酵素カタラーゼの使用でアル、それは反応
； Ｈ２０□−イケら七シー（１”→Ｈ２０＋−０２に示す
ようにＨ２０□の分子状酸素及び水への不均化を触媒す
る。
； Ｈ２０□−イケら七シー（１”→Ｈ２０＋−０２に示す
ようにＨ２０□の分子状酸素及び水への不均化を触媒す
る。
カタラーゼは唱乳類肝Ｒあるいはアスペルギルス ニガ
ーＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからの市販品が
入手可能でアシ、アスはルギルス ニガー 力タラ−ゼ
が良好な安定性會示す。カタラーゼの使用は、その不均
化が生成した二分子のＨ２Ｏ２に対し一分子の０２ を
形成するというさらに利点をも有するものである。０２
はＤ−アミノ酸オキシダーゼの当初の電子受容体である
から、カタラーゼによるＨ２Ｏ２の不均化によるその生
成はＤ−アミノ酸の酸化に必要な酸素の供給を助けまた
部分的には気液界面を横断する空気からの酸素移入の問
題をも軽減する。カタラーゼはしかしながらＨ２Ｏ２に
よっても徐々に不活性化される。Ｈ２Ｏ２除去のための
第二の方法は数種の金属酸化物のいずれかによるその分
解がある。金属酸化物の使用は、Ｍｎ２Ｏ３の様な醇化
マンガン類が望ましいが、カタラニゼの存在の有無に依
らず本発明の実施に使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼ
、トランスアミナーゼ及びその他の酵素のかなシの安定
化をもたらす。
ーＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからの市販品が
入手可能でアシ、アスはルギルス ニガー 力タラ−ゼ
が良好な安定性會示す。カタラーゼの使用は、その不均
化が生成した二分子のＨ２Ｏ２に対し一分子の０２ を
形成するというさらに利点をも有するものである。０２
はＤ−アミノ酸オキシダーゼの当初の電子受容体である
から、カタラーゼによるＨ２Ｏ２の不均化によるその生
成はＤ−アミノ酸の酸化に必要な酸素の供給を助けまた
部分的には気液界面を横断する空気からの酸素移入の問
題をも軽減する。カタラーゼはしかしながらＨ２Ｏ２に
よっても徐々に不活性化される。Ｈ２Ｏ２除去のための
第二の方法は数種の金属酸化物のいずれかによるその分
解がある。金属酸化物の使用は、Ｍｎ２Ｏ３の様な醇化
マンガン類が望ましいが、カタラニゼの存在の有無に依
らず本発明の実施に使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼ
、トランスアミナーゼ及びその他の酵素のかなシの安定
化をもたらす。
すなわち、Ｄ、Ｌ−アミノ酸出発物質におけるＲ基は例
えばすでに定義したような水素、置換及び非置換低級ア
ルキル、置換及び非置換低級ア１７−ル、さらに複素環
基を含む広範な種類の置換基かその酵素類は完全細胞、
粗細胞分解物、あるいは部分精製酵素や精製酵素にて反
応混合物中に加えることがズきる。酵素単位量あ７”Ｃ
Ｄの変換率がよシ高くなるから、それが固定化あるいは
溶液内のいずれにも精製酵素を用いることが望ましい。
えばすでに定義したような水素、置換及び非置換低級ア
ルキル、置換及び非置換低級ア１７−ル、さらに複素環
基を含む広範な種類の置換基かその酵素類は完全細胞、
粗細胞分解物、あるいは部分精製酵素や精製酵素にて反
応混合物中に加えることがズきる。酵素単位量あ７”Ｃ
Ｄの変換率がよシ高くなるから、それが固定化あるいは
溶液内のいずれにも精製酵素を用いることが望ましい。
その酵素類は当分野の専門家には周知の方法にょ」
ｂｍ製できる。ミクロコツカス ルテウスＭｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ及びシュードモナス プチダ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼの精製の例はバーバート（Ｈｅ
ｒｌ）ｅｒｔ）。
ｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ及びシュードモナス プチダ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼの精製の例はバーバート（Ｈｅ
ｒｌ）ｅｒｔ）。
メンツヅ イン エンザイモロジイ Ｍｅｔｈｏｄ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １ ｅ ｐｐ ７５３−５７
（１９５５） 及び３８１−８３（１９６４）によシ
記載されている。
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １ ｅ ｐｐ ７５３−５７
（１９５５） 及び３８１−８３（１９６４）によシ
記載されている。
酵素は本発明の実施に於いて前記の通シ溶液にであるい
は固定化酵素として使用できる。固定化酵素系の一例は
ウィートオール（Ｗｅｅｔａｌｌ）らメンツゾ イン
エンザイモロジイ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ工ｙｎｎ
ｌｏｇｙ３４、 ｐｐ５９−７２（１９７４）に記載さ
れておシ、それは本文中に参考文献として取〕入れるも
のとする。
は固定化酵素として使用できる。固定化酵素系の一例は
ウィートオール（Ｗｅｅｔａｌｌ）らメンツゾ イン
エンザイモロジイ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ工ｙｎｎ
ｌｏｇｙ３４、 ｐｐ５９−７２（１９７４）に記載さ
れておシ、それは本文中に参考文献として取〕入れるも
のとする。
ウイートオールらはダルタールアルデヒド活性化した孔
径制御したガラス ビーズ（コーニングＣｏｒｎｉｎｇ
）上への酵素の固定化に関する方法を記述している。
径制御したガラス ビーズ（コーニングＣｏｒｎｉｎｇ
）上への酵素の固定化に関する方法を記述している。
水沫ではトランスアミナーゼは７．０のｐＨｋ有すＦン
酸緩衝液中にて２時間０−５℃で活性化ガラス粒子とそ
の酵素を反応させることによりガラス粒子と結合させた
。その結合した酵素鉱直接使用してもよく、あるいは先
ず１％水素化ホウ素ナトリウムと反応してその酵素と活
性化ガラスとの間の共有結合全安定化してもよい。
酸緩衝液中にて２時間０−５℃で活性化ガラス粒子とそ
の酵素を反応させることによりガラス粒子と結合させた
。その結合した酵素鉱直接使用してもよく、あるいは先
ず１％水素化ホウ素ナトリウムと反応してその酵素と活
性化ガラスとの間の共有結合全安定化してもよい。
本発明の実施のための酵素の固定化に対するその他の適
当する基質には多孔性セラミック、セファローズ、ジエ
チルアミノエチルセルロース等々がある。これらの物質
は必要なら当分野にて周知の方法により活性化してもよ
い。
当する基質には多孔性セラミック、セファローズ、ジエ
チルアミノエチルセルロース等々がある。これらの物質
は必要なら当分野にて周知の方法により活性化してもよ
い。
オキザロ酢酸デカルボキシラーゼは個々に固定化するか
あるいは先ずトランスアミナーゼと混合し、その混合物
を同時固定化する。前述の方法によルそれに酵素類を共
有結合させたグラス ビーズ’ｔ”１０ｍＭフェニルピ
ルビン酸、１０ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸、１ ｍＭ
ＭｇＣｅｚまたはＭｎ５０４ｔ−含有し、４．０−１０
．０の範囲、最も望ましくは５．５から＆５の間に調整
したｐＨ’ｉｔ有する溶液中に懸濁した。そのフェニル
ピルビン酸の全てが消費された時にその溶液をそのグラ
ス ビーズからＦ取しその生成物Ｌ−フェニルア２ニン
及びピルビン酸は従来の方法により単離精製した。
あるいは先ずトランスアミナーゼと混合し、その混合物
を同時固定化する。前述の方法によルそれに酵素類を共
有結合させたグラス ビーズ’ｔ”１０ｍＭフェニルピ
ルビン酸、１０ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸、１ ｍＭ
ＭｇＣｅｚまたはＭｎ５０４ｔ−含有し、４．０−１０
．０の範囲、最も望ましくは５．５から＆５の間に調整
したｐＨ’ｉｔ有する溶液中に懸濁した。そのフェニル
ピルビン酸の全てが消費された時にその溶液をそのグラ
ス ビーズからＦ取しその生成物Ｌ−フェニルア２ニン
及びピルビン酸は従来の方法により単離精製した。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びトランスアミナーゼもま
た個々に固定化し、あるいは先ず共に混合し、混合物と
して同時固定化してもよい。同様の方法にて、カタラー
ゼ及び／またはオキザロ酢酸デカルボキシラーゼもまた
個々に固定化し、あるいは他の酵素類と混合し、そして
その混合惣ヲ同時固定化してもよい。
た個々に固定化し、あるいは先ず共に混合し、混合物と
して同時固定化してもよい。同様の方法にて、カタラー
ゼ及び／またはオキザロ酢酸デカルボキシラーゼもまた
個々に固定化し、あるいは他の酵素類と混合し、そして
その混合惣ヲ同時固定化してもよい。
それに酵素類を連結せしめている固定化支持体はり、Ｌ
−アミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸が望ましいがアミノ基
供与体、そしてピリドキサルリン酸（トランスアミナー
ゼに対する補因子として）を含有し、２．０から１２．
０の範囲、殊に望ましくは５．５から８，５０間に調整
したｐＨヲ有する溶液中に懸濁すればよく、その溶液は
４℃から５０℃の間、最も望ましくは１５℃及び４０℃
の間の温度にてインキュベートする。その反応は旋光度
測定かあるいはＬ−アスパラギン酸の消費の測定によシ
監視できる。その溶液の旋光度の変動が停止あるいは更
なるＬ−アスパラギン酸の消費を認めなくなった時、そ
の溶液を固定化酵素から炉取しそして、Ｌ−アミノ酸を
沈澱、結晶化、イオン交換クロマトグラフィー等々の様
な従来からの方法のいずれかにて単離、精製する。
−アミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸が望ましいがアミノ基
供与体、そしてピリドキサルリン酸（トランスアミナー
ゼに対する補因子として）を含有し、２．０から１２．
０の範囲、殊に望ましくは５．５から８，５０間に調整
したｐＨヲ有する溶液中に懸濁すればよく、その溶液は
４℃から５０℃の間、最も望ましくは１５℃及び４０℃
の間の温度にてインキュベートする。その反応は旋光度
測定かあるいはＬ−アスパラギン酸の消費の測定によシ
監視できる。その溶液の旋光度の変動が停止あるいは更
なるＬ−アスパラギン酸の消費を認めなくなった時、そ
の溶液を固定化酵素から炉取しそして、Ｌ−アミノ酸を
沈澱、結晶化、イオン交換クロマトグラフィー等々の様
な従来からの方法のいずれかにて単離、精製する。
Ｌ−アミノ酸類及びピルビン酸を製造するためのＬ−ア
スパラギン酸の反応は必要なら監視できる。使用する２
−ケト酸前駆体にかかわらずアミノ基供与体としてアス
パラギン′ｒ！Ｉｔ含使用する全てのアミン基転移反応
の検定に適用できる一般検定法は次の様である：Ｌ−ア
スパラギン酸、２−ケト酸、トランスアミナーゼ、 Ｎ
ＡＤＨ及び酵素リンゴ酸デヒドロダナーゼ（市販品入手
可能） ’ｋ ６．０ないし９．０の間のｐＨであるリ
ン酸緩衝液中に溶解する； ３４０ｎｍ（Ａ３４ｏ）
における吸光度の時間による変化を測定する。３４０ｎ
ｍ における吸光度のこの変化はアミノ基転移反応の間
にＬ−アスパラギン酸から形成するオキザロ酢酸の還元
の間のＮＡＤＨの消費に相当するものである。
スパラギン酸の反応は必要なら監視できる。使用する２
−ケト酸前駆体にかかわらずアミノ基供与体としてアス
パラギン′ｒ！Ｉｔ含使用する全てのアミン基転移反応
の検定に適用できる一般検定法は次の様である：Ｌ−ア
スパラギン酸、２−ケト酸、トランスアミナーゼ、 Ｎ
ＡＤＨ及び酵素リンゴ酸デヒドロダナーゼ（市販品入手
可能） ’ｋ ６．０ないし９．０の間のｐＨであるリ
ン酸緩衝液中に溶解する； ３４０ｎｍ（Ａ３４ｏ）
における吸光度の時間による変化を測定する。３４０ｎ
ｍ における吸光度のこの変化はアミノ基転移反応の間
にＬ−アスパラギン酸から形成するオキザロ酢酸の還元
の間のＮＡＤＨの消費に相当するものである。
別法として例えばフェニルピルビン酸のＬ−フェニルア
ラニンへの変換は例えばトランスアミナーゼ、フェニル
ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、オキザロ酢酸デカル
ボキシラーゼ及び金属イオン類を含有する反応混合物か
ら一部を採取し、それ全２．５％水酸化ナトリウム水溶
液（ｗ／ ｖ ）中に希釈しそして３２０ｎｍにて吸光
度を測定することによシ都合よく検定できる。水酸化ナ
トリウム中への希釈はフェニルピルビン酸のケト及びエ
ノール型の間の平衡の急速な達成をもたらす。平衡混合
物に対する３２０ｎｍ の吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉ
ｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は１７５００Ｍ−”ｃｍ
−”である。すなワチフェニルピルビン酸のＬ−フェニ
ルア２ニンヘの変換は速やかに定量できる。この検定は
イーパークロマトグラフィーによる定性的なそしてアミ
ノ酸分析計を用いて定量的にＬ−フェニルアラニンを測
定することによシ確認できる。
ラニンへの変換は例えばトランスアミナーゼ、フェニル
ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、オキザロ酢酸デカル
ボキシラーゼ及び金属イオン類を含有する反応混合物か
ら一部を採取し、それ全２．５％水酸化ナトリウム水溶
液（ｗ／ ｖ ）中に希釈しそして３２０ｎｍにて吸光
度を測定することによシ都合よく検定できる。水酸化ナ
トリウム中への希釈はフェニルピルビン酸のケト及びエ
ノール型の間の平衡の急速な達成をもたらす。平衡混合
物に対する３２０ｎｍ の吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉ
ｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は１７５００Ｍ−”ｃｍ
−”である。すなワチフェニルピルビン酸のＬ−フェニ
ルア２ニンヘの変換は速やかに定量できる。この検定は
イーパークロマトグラフィーによる定性的なそしてアミ
ノ酸分析計を用いて定量的にＬ−フェニルアラニンを測
定することによシ確認できる。
同様の方法を、他の２−ケト酸の相当するＬ−アミノ酸
への変換に対する検定に使用することができる。ｐ−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸のＬ−チロシンへのアミ７
基転移はその反応混合物から採取した一部全２．５％Ｎ
ａ ＯＨ中に希釈し、そして３３１ｎｍ（吸光係数１９
９００ｍ ｃｍ ） における吸当度を測定することに
より監視でき、またインドール−３−ピルビン酸のＬ−
トリプトフγンへの変換も同様に３２８ｎｍ（吸光係数
ｉｏｏｏｏＭ−’Ｃｍ−１） の吸光度を測定すること
によシ追跡できる。
への変換に対する検定に使用することができる。ｐ−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸のＬ−チロシンへのアミ７
基転移はその反応混合物から採取した一部全２．５％Ｎ
ａ ＯＨ中に希釈し、そして３３１ｎｍ（吸光係数１９
９００ｍ ｃｍ ） における吸当度を測定することに
より監視でき、またインドール−３−ピルビン酸のＬ−
トリプトフγンへの変換も同様に３２８ｎｍ（吸光係数
ｉｏｏｏｏＭ−’Ｃｍ−１） の吸光度を測定すること
によシ追跡できる。
本発明を以下の実施例によシさらに例示しようとするも
のであるがそれは例示の目的のためだけでここに挙げる
ものであり、範囲の限定を意図するものではない。
のであるがそれは例示の目的のためだけでここに挙げる
ものであり、範囲の限定を意図するものではない。
Ｌ−培地平板に維持した大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２
を下記に挙げる培養基５００ｍＪｅ含有する２、 ０１
Ｊツトル容振盪フラスコに接種した： ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／リットル に２ＨＰＯ４５，５６ｇ／リットル （ＮＨ４）２８０４ ２９／リットル ＭｇＳＯ４７５ｍｖ′’） ッ）＃ クエン酸ナトリウム３・２Ｈ２０’ １ｇ／リットル０
微量金属類 ３ｍｌ／リットル グルコース ｌＯｇ／リットル ※ 微量金属溶液の調製 ＦｅＣｌ３ ＠ ６Ｈ２０２７Ｊ９ ／ ｅ ３００μ
ＭＺｎＣ１２Ｌ３９７１ ３０μＭ ｃｏＣ１２・６Ｈ２０２ｇ／ｌ ２５１ＩＭＮａ ２Ｍ
０Ｏ４０２Ｈ２０２ｇ ／ ｌ ２５μＭＣａＣ１２−
２ｎ２ｏ １ ｇ ／ ｅ ２０ ／’ＭＣｕＣ１２・
２ＨｚＯ１，２７ｇ／ １３ ２２μＭＨ３ＢＯ３０，
５ｇ／６ ２４μＭ 濃塩酸 １００／ＷＬｌ／１３．６μＭ生育は３７℃に
て１５時間行なった。これらのフラスコは次に示す７リ
ツトルの生育培地：ｘａ２ｐｏ４ ２．Ｏ９／’） ッ
トルに２ＨＰ０４ ３．６ｇ／リットル （ＮＨ４）２Ｓ０４ ７５ｏＩｎ９／リツトルクエン酸
Ｎａ３”２Ｈ２０１ｆｊ／’）ットｈ微量金属類 ３１
／リツトル 必要に従ってグルコースを注入 全含有する１４リツトル容のバイオラフイツト（Ｂｉｏ
ｌａｆｉｔｔｅ）発酵槽（７リツトル中に１１の振盪７
ラスコ培養）に接種するために使用した。
を下記に挙げる培養基５００ｍＪｅ含有する２、 ０１
Ｊツトル容振盪フラスコに接種した： ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／リットル に２ＨＰＯ４５，５６ｇ／リットル （ＮＨ４）２８０４ ２９／リットル ＭｇＳＯ４７５ｍｖ′’） ッ）＃ クエン酸ナトリウム３・２Ｈ２０’ １ｇ／リットル０
微量金属類 ３ｍｌ／リットル グルコース ｌＯｇ／リットル ※ 微量金属溶液の調製 ＦｅＣｌ３ ＠ ６Ｈ２０２７Ｊ９ ／ ｅ ３００μ
ＭＺｎＣ１２Ｌ３９７１ ３０μＭ ｃｏＣ１２・６Ｈ２０２ｇ／ｌ ２５１ＩＭＮａ ２Ｍ
０Ｏ４０２Ｈ２０２ｇ ／ ｌ ２５μＭＣａＣ１２−
２ｎ２ｏ １ ｇ ／ ｅ ２０ ／’ＭＣｕＣ１２・
２ＨｚＯ１，２７ｇ／ １３ ２２μＭＨ３ＢＯ３０，
５ｇ／６ ２４μＭ 濃塩酸 １００／ＷＬｌ／１３．６μＭ生育は３７℃に
て１５時間行なった。これらのフラスコは次に示す７リ
ツトルの生育培地：ｘａ２ｐｏ４ ２．Ｏ９／’） ッ
トルに２ＨＰ０４ ３．６ｇ／リットル （ＮＨ４）２Ｓ０４ ７５ｏＩｎ９／リツトルクエン酸
Ｎａ３”２Ｈ２０１ｆｊ／’）ットｈ微量金属類 ３１
／リツトル 必要に従ってグルコースを注入 全含有する１４リツトル容のバイオラフイツト（Ｂｉｏ
ｌａｆｉｔｔｅ）発酵槽（７リツトル中に１１の振盪７
ラスコ培養）に接種するために使用した。
生育は３７℃にて３００ ｒｐｍで通気しながら行ない
、そのｐＨは水酸化アンモニウムによる滴定で６．９に
維持した。その細胞は４０００ｒｐｍＫて遠心分離によ
勺収穫し、要時迄−１０’Ｃに凍結した。
、そのｐＨは水酸化アンモニウムによる滴定で６．９に
維持した。その細胞は４０００ｒｐｍＫて遠心分離によ
勺収穫し、要時迄−１０’Ｃに凍結した。
芳香族酸トランスアミナーゼの精製
全ての工程は４℃にて行なった。遠心分離はンルウアー
ル（Ｓｏｒｖａｌｌ） ＲＣ２Ｂ遠心機にて行なった。
ル（Ｓｏｒｖａｌｌ） ＲＣ２Ｂ遠心機にて行なった。
Ｌ 大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２細胞（湿潤重量ｓｏ
ｇ）’２２００ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭエチＬ／７
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）二ナトリウム塩、１ｍＭ
ベーターメルカプトエタノール、１ｍＭ ピリドキサー
ルリン酸、及び０．０２％（重量／体積）アジ化ナトリ
ウムを含有する緩衝水溶液、ｐＨ７０，２ｏｏ７ｎｌ中
に再懸濁した。その細胞をヒートシステムズーウルトラ
ンエックス細胞破砕機（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕ
ｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ａｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ
） ｆ用いて強度セット９にて１分間照射を回度の超音
波処理を行なった。その細胞破砕物は１２，０００ｒｐ
ｍにて２０分間遠心分離することによシ分離した。
ｇ）’２２００ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭエチＬ／７
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）二ナトリウム塩、１ｍＭ
ベーターメルカプトエタノール、１ｍＭ ピリドキサー
ルリン酸、及び０．０２％（重量／体積）アジ化ナトリ
ウムを含有する緩衝水溶液、ｐＨ７０，２ｏｏ７ｎｌ中
に再懸濁した。その細胞をヒートシステムズーウルトラ
ンエックス細胞破砕機（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕ
ｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ａｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ
） ｆ用いて強度セット９にて１分間照射を回度の超音
波処理を行なった。その細胞破砕物は１２，０００ｒｐ
ｍにて２０分間遠心分離することによシ分離した。
２、その粗抽出物（第１工程の上清液）に、第一工程の
緩衝液中に調製した４０％硫酸ストレプトマイシン溶液
の適当量を添加することによシ硫酸ストレプトマイシン
１２５％重量／体積とした。
緩衝液中に調製した４０％硫酸ストレプトマイシン溶液
の適当量を添加することによシ硫酸ストレプトマイシン
１２５％重量／体積とした。
その混合物をゆつく９２０分間攪拌し、その後２０分間
１２．００Ｏｒｐｍにて遠心分離した。その沈澱は廃棄
した。
１２．００Ｏｒｐｍにて遠心分離した。その沈澱は廃棄
した。
３、第２工程からの上清液の蛋白質は硫酸アンモニウム
の添加によシ分画した。結晶硫酸アンモニラムラ４０％
飽和濃度が達成されるまで攪拌しつつ加えそしてその蛋
白質沈澱物を遠心分離し廃棄した。さらに７０％飽和の
濃度に達するまで攪拌しつつ硫酸アンモニウムを添加し
、その蛋白質沈澱物を遠心分離にて集め、さらに、０．
０３Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム塩、１ｍＭベーターメルカプトエタノー
ル、及び０．０２％（重量／体積）アジ化ナトリウムを
含有する緩衝液、ｐＨ６，５、の最少量中に再溶解した
。この溶液全２リットルの同一緩衝液に対しく１８時間
、緩衝液二度交換）透析した。
の添加によシ分画した。結晶硫酸アンモニラムラ４０％
飽和濃度が達成されるまで攪拌しつつ加えそしてその蛋
白質沈澱物を遠心分離し廃棄した。さらに７０％飽和の
濃度に達するまで攪拌しつつ硫酸アンモニウムを添加し
、その蛋白質沈澱物を遠心分離にて集め、さらに、０．
０３Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム塩、１ｍＭベーターメルカプトエタノー
ル、及び０．０２％（重量／体積）アジ化ナトリウムを
含有する緩衝液、ｐＨ６，５、の最少量中に再溶解した
。この溶液全２リットルの同一緩衝液に対しく１８時間
、緩衝液二度交換）透析した。
４、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマンＷｈａｔ
ｍａｎ ＤＥ−５２，１，６Ｘ３０ｃｍ ） ｋ第３工
程の緩衝液にて平衡化した。試料會のせ、０Ｄ２８ｏ（
〈０．０２）によシ測定して流出液に蛋白質が感知され
なくなるまで洗滌した。全容２５０−１流速−４ｍＪ／
ＩＱ分／分画にて０−０．５Ｍ Ｎａ０６線形濃度勾配
溶出を行なった。トランスアミナーゼ活性は０．０９及
び０．２ＭＮａＣ６の間に溶出され、それを集めて、０
．０３Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ エチルジアミン四
酢酸二ナトリウム塩、１ｍＭベーターメルカプトエタノ
ール、０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む緩衝液
、ｐＨ６，５，２！Ｊットルに対し二度透析した。
ｍａｎ ＤＥ−５２，１，６Ｘ３０ｃｍ ） ｋ第３工
程の緩衝液にて平衡化した。試料會のせ、０Ｄ２８ｏ（
〈０．０２）によシ測定して流出液に蛋白質が感知され
なくなるまで洗滌した。全容２５０−１流速−４ｍＪ／
ＩＱ分／分画にて０−０．５Ｍ Ｎａ０６線形濃度勾配
溶出を行なった。トランスアミナーゼ活性は０．０９及
び０．２ＭＮａＣ６の間に溶出され、それを集めて、０
．０３Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ エチルジアミン四
酢酸二ナトリウム塩、１ｍＭベーターメルカプトエタノ
ール、０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む緩衝液
、ｐＨ６，５，２！Ｊットルに対し二度透析した。
５、そのトランスアミナーゼ溶液をヒドロキシアパタイ
トのカラム（２，６Ｘ３０ｃｍ ）にのせ、第４工程の
透析緩衝液にて平衡化した。トランスアミナーゼ活性は
そのカラムに保持されず、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限
外濾過装置を用いてＹＭ３Ｑ 膜ではソ４ＷＬｌに濃縮
した。
トのカラム（２，６Ｘ３０ｃｍ ）にのせ、第４工程の
透析緩衝液にて平衡化した。トランスアミナーゼ活性は
そのカラムに保持されず、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限
外濾過装置を用いてＹＭ３Ｑ 膜ではソ４ＷＬｌに濃縮
した。
６、前段からの濃縮トランスアミナーゼを０．０５Ｍト
リスｐＨ８，０，０，０２ｍＭピリドキサールリン酸、
１ ｍ Ｍ ＥＤ’Ｉ’Ａ及び１ｍＭ ベーターメルカ
プトエタノールの溶液にて七フアクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ）Ｓ−２００のカラム、２．６ Ｘ９０ｃｍにの
せた。同一緩衝液にて溶出すると排除体積（ｖｏｉｄ
ｖｏｌｕｍｅ）の直後に溶出するトランスアミナーゼ活
性のノ２ンドを与えた。この物質を４℃にて保存したが
、少なくとも４ケ月間は安定であった。
リスｐＨ８，０，０，０２ｍＭピリドキサールリン酸、
１ ｍ Ｍ ＥＤ’Ｉ’Ａ及び１ｍＭ ベーターメルカ
プトエタノールの溶液にて七フアクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ）Ｓ−２００のカラム、２．６ Ｘ９０ｃｍにの
せた。同一緩衝液にて溶出すると排除体積（ｖｏｉｄ
ｖｏｌｕｍｅ）の直後に溶出するトランスアミナーゼ活
性のノ２ンドを与えた。この物質を４℃にて保存したが
、少なくとも４ケ月間は安定であった。
オキザロ酢酸デカルボキシラーゼはミクロコツカス ル
テウム Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ、シュ
ードモナ７ プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ等々から、当分野で周知のものと同様の方法にて調
製できる。
テウム Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ、シュ
ードモナ７ プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ等々から、当分野で周知のものと同様の方法にて調
製できる。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１２．５ｍＭフェニル
ピルビン醒、２５ｍＭＬ−アスパラギン酸、１．２５ｍ
Ｍ１酸マンガン、５ｍＭ ピリドキサールリン酸及びＬ
５国国際年のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼから成る
ｐＨ７，０の溶液０．８ ｄに、０．３国際年位（ＩＵ
）のトランスアミナーゼを含有するｐＨ７−０の溶液０
．２１１Ｌ１７ｊ−加えた。その直後、及び２２℃にて
１２時間インキュば−ジョン後それぞれ反応混合物中の
フェニルピルビン酸へ検定した。
ピルビン醒、２５ｍＭＬ−アスパラギン酸、１．２５ｍ
Ｍ１酸マンガン、５ｍＭ ピリドキサールリン酸及びＬ
５国国際年のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼから成る
ｐＨ７，０の溶液０．８ ｄに、０．３国際年位（ＩＵ
）のトランスアミナーゼを含有するｐＨ７−０の溶液０
．２１１Ｌ１７ｊ−加えた。その直後、及び２２℃にて
１２時間インキュば−ジョン後それぞれ反応混合物中の
フェニルピルビン酸へ検定した。
その変換水準は変換されたフェニルピルビン酸の量に基
すき９８．５％と算出した。その反応混合物のアミノ酸
分析はＬ−フェニルアラニン及び未反応Ｌ−アスパラギ
ン酸に相当するわずか二つのピークを示した。その他の
アミノ酸生成物は検知しなかった。
すき９８．５％と算出した。その反応混合物のアミノ酸
分析はＬ−フェニルアラニン及び未反応Ｌ−アスパラギ
ン酸に相当するわずか二つのピークを示した。その他の
アミノ酸生成物は検知しなかった。
実施例３ トランスアミナーゼ及びオキザロ酢酸１．５
単位のトランスアミナーゼ及びミクロコツカス ルテウ
スＭｉｃｒｏｃｏｃｃｔＬｓ １ｗｔｅｕ、ｓから単離
しり５．４単位のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼを含
む５０ｍＭ１ｊン酸カリウム、７）Ｈ８，０の水溶液２
．０コを予め５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液中にてｐＨ８，０
に平衡化した５ ｍ、ｌのＤＥＡＥ−セルロースゲル（
ワットマンＷＡαｔｒｎａルＤＥ−５２）に加えた。緩
やかに５分間攪拌の後、トランスアミナーゼ及びオキザ
ロ酢酸デカルボキシラーゼの両者を検定すると、それら
酵素がＤＥＡＥ−セルロース上に吸着されていることを
示したので、残る溶液をゲルから傾斜廃棄した。
単位のトランスアミナーゼ及びミクロコツカス ルテウ
スＭｉｃｒｏｃｏｃｃｔＬｓ １ｗｔｅｕ、ｓから単離
しり５．４単位のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼを含
む５０ｍＭ１ｊン酸カリウム、７）Ｈ８，０の水溶液２
．０コを予め５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液中にてｐＨ８，０
に平衡化した５ ｍ、ｌのＤＥＡＥ−セルロースゲル（
ワットマンＷＡαｔｒｎａルＤＥ−５２）に加えた。緩
やかに５分間攪拌の後、トランスアミナーゼ及びオキザ
ロ酢酸デカルボキシラーゼの両者を検定すると、それら
酵素がＤＥＡＥ−セルロース上に吸着されていることを
示したので、残る溶液をゲルから傾斜廃棄した。
実施例３の固定化酵素調製物に５０ ｍＭ 、 ｐＨ１
、ｏｍｔｔ加えた。１２時間インキュベーションの後、
検定によシ９６％のフェニルピルビン酸のＬ−フェニル
アラニンへの変換水準が示された。これは几−ブタノー
ル：アセトン：水酸化アンモニウム：水５：３：に１と
いう溶出溶媒を用いるｖ５ｍクロマトグラフィーにてＬ
−フェニルアラニンを検知することによ）確認した。グ
イオネツクス（ＤｉｏｔＬｅｘ）アミノ酸分析計による
反応混合物中のアミノ酸含量の分析ではＬ−フェニルア
ラニン及びＬ−アスパラギン酸に相当する唯二つの検知
可能なピークを示した。
、ｏｍｔｔ加えた。１２時間インキュベーションの後、
検定によシ９６％のフェニルピルビン酸のＬ−フェニル
アラニンへの変換水準が示された。これは几−ブタノー
ル：アセトン：水酸化アンモニウム：水５：３：に１と
いう溶出溶媒を用いるｖ５ｍクロマトグラフィーにてＬ
−フェニルアラニンを検知することによ）確認した。グ
イオネツクス（ＤｉｏｔＬｅｘ）アミノ酸分析計による
反応混合物中のアミノ酸含量の分析ではＬ−フェニルア
ラニン及びＬ−アスパラギン酸に相当する唯二つの検知
可能なピークを示した。
そのＬ−フェニルアラニンはバイオラッド（Ｂ乙Ｏγα
ｄ） ＡＧ５ｏ ＩＸｓ ２０−５０メツシユの混合床
イオン父換樹脂を用いてａ製した。ｐ Ｈ８，０にてそ
の粗反応混合物を予め同−ｐＨに平衡化した樹脂のカラ
ムを通過させ、先ずカラ人容量の２倍の水、次いで５０
ｍＭ’Ｊン咳カリウム緩衝液、ＰＨ８，０にて溶出した
。フェニルアラニンはその溶出液から凍結乾燥あるいは
酸性化及び結晶化によ）回収できる。
ｄ） ＡＧ５ｏ ＩＸｓ ２０−５０メツシユの混合床
イオン父換樹脂を用いてａ製した。ｐ Ｈ８，０にてそ
の粗反応混合物を予め同−ｐＨに平衡化した樹脂のカラ
ムを通過させ、先ずカラ人容量の２倍の水、次いで５０
ｍＭ’Ｊン咳カリウム緩衝液、ＰＨ８，０にて溶出した
。フェニルアラニンはその溶出液から凍結乾燥あるいは
酸性化及び結晶化によ）回収できる。
実施例５ Ｌ−フェニルアラニン調製の別法０、５ ｍ
Ｍのピリド５キサールリフ酸、１ｍＭＭ ｎ Ｓ Ｏ、
ｓ ＋大腸菌Ｅ、 ｃｏハから単離したトラン国際年チ
ー４５国際単位、ミクロコツカス ルテウスＭｉｃｒｏ
ｃｏｃｃａｓ １ａｔｅｔｂｓ から単離したオキザロ
酢酸デカルボキシラー４１０国際年位、５０ｍＭフェニ
ルピルビン酸及び６５ｉＭＬ−アスパラギン酸を含有す
る５ ０ ｒｎＭ リン酸カリウムの溶液１９ｒｉｌを
２４ｔＺ’にて１２時間インキュベートした。この終了
時に、その５０マイクロリツトル量を採９２、５ ％
ＮａＯＨにて１． □ ｍｌに希釈し３２０＋Ｌｍにお
ける光学密度を読みとることによシフエニルピルヒ／敵
の量ヲ定景したところ、フェニルピルビン酸は全てＬ−
フェニルアラニンに変換されたことを示した。溶出液と
してメタノール：アセトン：水酸化アンモニウム：水
５：３：に１を用いたワットマン（ ＷｈａｔｎａｒＬ
） ３ ＭＭによる濾紙クロマトグラフィーと続くアセ
トンに溶解した５％ニンヒドリンによる染色（発色）で
は、未反応のＬーアスノラギン酸とＬ−フェニルアラニ
ンに相当する唯二つのニンヒトゝリン陽性スフ）ソツＩ
ｆ示した。
Ｍのピリド５キサールリフ酸、１ｍＭＭ ｎ Ｓ Ｏ、
ｓ ＋大腸菌Ｅ、 ｃｏハから単離したトラン国際年チ
ー４５国際単位、ミクロコツカス ルテウスＭｉｃｒｏ
ｃｏｃｃａｓ １ａｔｅｔｂｓ から単離したオキザロ
酢酸デカルボキシラー４１０国際年位、５０ｍＭフェニ
ルピルビン酸及び６５ｉＭＬ−アスパラギン酸を含有す
る５ ０ ｒｎＭ リン酸カリウムの溶液１９ｒｉｌを
２４ｔＺ’にて１２時間インキュベートした。この終了
時に、その５０マイクロリツトル量を採９２、５ ％
ＮａＯＨにて１． □ ｍｌに希釈し３２０＋Ｌｍにお
ける光学密度を読みとることによシフエニルピルヒ／敵
の量ヲ定景したところ、フェニルピルビン酸は全てＬ−
フェニルアラニンに変換されたことを示した。溶出液と
してメタノール：アセトン：水酸化アンモニウム：水
５：３：に１を用いたワットマン（ ＷｈａｔｎａｒＬ
） ３ ＭＭによる濾紙クロマトグラフィーと続くアセ
トンに溶解した５％ニンヒドリンによる染色（発色）で
は、未反応のＬーアスノラギン酸とＬ−フェニルアラニ
ンに相当する唯二つのニンヒトゝリン陽性スフ）ソツＩ
ｆ示した。
ＭｙＳ０４１ｍＪＰ−ヒドロキシフェニルピルビン２１
０ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸１０ｍＭ；）７ンスアミナ
ーゼ０．１ｍｇ／ｍｌ；及びシュードモナスプチダｐｚ
ｅｕ、ｄ、ｏｍｏｎαｚ ｐｕ、ｔｉｃｌα（ＡＴＣＣ
９５０）から単離したオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ
０．１１を含有し、５０ ｍＭ リン酸カリウムにより
ｐ Ｈ７−０に緩衝化された溶液を２４０にて１時間イ
ンキュベートした。この終了時における検定ではｐ−ヒ
）’ Ｄ キシフェニルピルビン酸の残存はなかった。
０ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸１０ｍＭ；）７ンスアミナ
ーゼ０．１ｍｇ／ｍｌ；及びシュードモナスプチダｐｚ
ｅｕ、ｄ、ｏｍｏｎαｚ ｐｕ、ｔｉｃｌα（ＡＴＣＣ
９５０）から単離したオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ
０．１１を含有し、５０ ｍＭ リン酸カリウムにより
ｐ Ｈ７−０に緩衝化された溶液を２４０にて１時間イ
ンキュベートした。この終了時における検定ではｐ−ヒ
）’ Ｄ キシフェニルピルビン酸の残存はなかった。
ダイオネツクスＤｉ ｏｎｅｓアミノ酸分析計に一部を
注入することによる製造されたＬ−チロシン量の定量は
Ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からモル基準で９９
％の収率を与えた。斯様にして製造したＬ−チロシン及
びピルビン酸は実施例４にてＬ−フェニルアラニンに対
して用いたと同様の方法あるいは当分野で周知の他の方
法により精製できる。
注入することによる製造されたＬ−チロシン量の定量は
Ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸からモル基準で９９
％の収率を与えた。斯様にして製造したＬ−チロシン及
びピルビン酸は実施例４にてＬ−フェニルアラニンに対
して用いたと同様の方法あるいは当分野で周知の他の方
法により精製できる。
実施例７ Ｌ−トリシトファンの調製
５ＴｒＬＭトリスーヒドロキシメチルアミノメタン塩酸
塩（トリス）にてｐＨ７，０に平衡化したインド５−ル
ー３−ピルビン酸２０ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸２０
ｍＭ ｐ Ｍｙ Ｃ１２１，５ｍＭ ｙ Ｆランスアミ
ナーゼ０．３ ｍ９７ｍ１；オキザロ酢酸デカルボキシ
ラーゼｏ、３ ｍｙ／ｍｌの溶液をゆつく９２時間攪拌
した。
塩（トリス）にてｐＨ７，０に平衡化したインド５−ル
ー３−ピルビン酸２０ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸２０
ｍＭ ｐ Ｍｙ Ｃ１２１，５ｍＭ ｙ Ｆランスアミ
ナーゼ０．３ ｍ９７ｍ１；オキザロ酢酸デカルボキシ
ラーゼｏ、３ ｍｙ／ｍｌの溶液をゆつく９２時間攪拌
した。
この時点で反応は完結する。生成したＬ −ト！Ｊブト
ファン及びピルビン酸は当分野にて周知の方法によシＮ
製できる。
ファン及びピルビン酸は当分野にて周知の方法によシＮ
製できる。
実施例８ Ｌ−ロイシンの調製
ＭｇＧ１１２２．５ ｍＭｐ ２− オキ７ ４− ）
ｆ ルヘンタン酸１００ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸１
００ ｍＬトランスアミナーゼ １． Ｏｍ９／ｍｌ
；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ１．０ ｍｅ／ｍｌ
を含有し、ｐＨをＮａＯＨにて７．０に調整した溶液を
３０ｔＴにて４時間ゆつくシ攪拌した。生成したＬ−ロ
イシン及びピルビン酸は当分野にて周知のいずれの方法
でも精製できる。
ｆ ルヘンタン酸１００ｍＭ；Ｌ−アスパラギン酸１
００ ｍＬトランスアミナーゼ １． Ｏｍ９／ｍｌ
；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ１．０ ｍｅ／ｍｌ
を含有し、ｐＨをＮａＯＨにて７．０に調整した溶液を
３０ｔＴにて４時間ゆつくシ攪拌した。生成したＬ−ロ
イシン及びピルビン酸は当分野にて周知のいずれの方法
でも精製できる。
実施例９ Ｌ−バリンの調製
Ｍ！１（４２，２，５ｍＭ ； ２−オキソ−３−メチ
ルブタン酸、１００ ＲＭｐ ”−アスノξラギン酸、
１００ｍＭ；トランスアミナーゼ、 ｌ、 Ｏｎｑ／ｍ
ｌ ；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ、１．０〜／ｍ
ｌを含有し、ｐＨをＮＯ，ＯＨにて７，０に調整した溶
液を３０Ｃにて４時間ゆつくシ撹拌する。生成するＬ−
バリン及びピルビン酸は当分野で周知のいずれの方法に
ても精製できる。
ルブタン酸、１００ ＲＭｐ ”−アスノξラギン酸、
１００ｍＭ；トランスアミナーゼ、 ｌ、 Ｏｎｑ／ｍ
ｌ ；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ、１．０〜／ｍ
ｌを含有し、ｐＨをＮＯ，ＯＨにて７，０に調整した溶
液を３０Ｃにて４時間ゆつくシ撹拌する。生成するＬ−
バリン及びピルビン酸は当分野で周知のいずれの方法に
ても精製できる。
実施例１０ Ｌ−セリンの調製
Ｍ！Ｉ Ｃ１２１２，５ｍＭ ；３−ヒドロキシピルビ
ン酸１００ 、Ｍ ； Ｌ−アスパラギンＭ、 １００
ｍＭ ； ）ランスアミナーゼ＋ １． Ｏｍｆ／、
Ａｎｌ；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ、 ｌ、 Ｑ
ｍ９／ｒｒｄ！；を含有し、ｐＨをＮＱＯＨにて７．
０に調製した溶液を３０Ｃにて４時間ゆつ〈シ攪拌する
。生成したし一セリン及びピルビン酸は当分野で周知の
いずれの方法でも精製できる。
ン酸１００ 、Ｍ ； Ｌ−アスパラギンＭ、 １００
ｍＭ ； ）ランスアミナーゼ＋ １． Ｏｍｆ／、
Ａｎｌ；オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ、 ｌ、 Ｑ
ｍ９／ｒｒｄ！；を含有し、ｐＨをＮＱＯＨにて７．
０に調製した溶液を３０Ｃにて４時間ゆつ〈シ攪拌する
。生成したし一セリン及びピルビン酸は当分野で周知の
いずれの方法でも精製できる。
実施例１１ Ｌ−メチオニンの調製
Ｍ！Ｉ Ｃ１２２，２，５ｍＭ ＋ ２−オキソ−４−
チオメチルブタン酸＋ １００ ｍＭｓ Ｌ−アスパラ
ギン酸。
チオメチルブタン酸＋ １００ ｍＭｓ Ｌ−アスパラ
ギン酸。
１１００ｔｒｔ；トランスアミナーゼ’１．０□ｍｌｐ
オキザロ酢酸デカルボギシラーゼ、 １．０ ＃ｌｌ１
ｉ’／７ｄ ’ｒ金含有、ｐＨをＮ、ｚＯＨにて７．０
に調整した溶液を３０Ｕにて４時間ゆつくシ攪拌する。
オキザロ酢酸デカルボギシラーゼ、 １．０ ＃ｌｌ１
ｉ’／７ｄ ’ｒ金含有、ｐＨをＮ、ｚＯＨにて７．０
に調整した溶液を３０Ｕにて４時間ゆつくシ攪拌する。
生成するＬ−メチオニン及びピルビン酸は当分野で周知
のいずれの方法でもＮ製できる。
のいずれの方法でもＮ製できる。
実施例１２ 大腸菌Ｆ、、 ｃｏハに−１２）ランスア
ミナーゼによるＬ−４−フェニル−２− アミノブタン酸の調製 ４−フェニル−２−オキシゾタン敵エチル（ケミカル
ダイナミックス Ｃｈｅｍｉｃａｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ
）（２０６１１１ｐ、１ｍモル）を０．１ Ｍ Ｎα
ＯＨ１０ミリリツトルに懸濁し、そのエチルエステルの
完全な加水分解を示す８．６以下にｐＨが低下するまで
その混合物を３０分間にわたり攪拌した。その混合物を
短時間遠心分離し、そして４−フェニル−２−オキソブ
タン酸ナトリウム塩を含有する無色の上清液を傾斜採取
した。０．７００７ｄのｐＨ８，０５０１ｒＬＭリン酸
カリウム緩衝液、０．ＩＱｍの上述の４−フェニル−２
−オキシブクン酸溶液、０．０５０ｄの５００ｍＭＬ−
アスパラギン酸二ナトリウム。
ミナーゼによるＬ−４−フェニル−２− アミノブタン酸の調製 ４−フェニル−２−オキシゾタン敵エチル（ケミカル
ダイナミックス Ｃｈｅｍｉｃａｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ
）（２０６１１１ｐ、１ｍモル）を０．１ Ｍ Ｎα
ＯＨ１０ミリリツトルに懸濁し、そのエチルエステルの
完全な加水分解を示す８．６以下にｐＨが低下するまで
その混合物を３０分間にわたり攪拌した。その混合物を
短時間遠心分離し、そして４−フェニル−２−オキソブ
タン酸ナトリウム塩を含有する無色の上清液を傾斜採取
した。０．７００７ｄのｐＨ８，０５０１ｒＬＭリン酸
カリウム緩衝液、０．ＩＱｍの上述の４−フェニル−２
−オキシブクン酸溶液、０．０５０ｄの５００ｍＭＬ−
アスパラギン酸二ナトリウム。
１．０国際車位のリンゴ酸デヒト８０ゲナーゼ、０．１
国際年位の大腸菌Ｅ、ｃｏｌＬＫ−１２から精製したア
スパラギン酸トランスアミナーゼ、 ’Ｑ、ｌ−ｒイク
ロモルのビリドキサルリン酸（シグマｓｉｇｍａ）ＥＣ
び０．２５７Ｖの還元型ニコチンアミド アデニンジヌ
クレオチド（７ダマＳｉｇｍａ）を含有する溶液を調製
した。この溶液の３６０ｎｒｎＪＣおける吸光度の減少
により反応が起ったことが示された。この変化はトラン
スアミナーゼ、リンゴｍｆヒドロゲナーゼ４Ｌ−アスパ
ラギン酸、あるいは４−フェニル−２−オキソブタン酸
のみを除去成分とした対照では観察されなかった。その
反応の割合は４−フェニル−２−オキソブタン酸の代り
にフェニルピルビン酸を用いる相当する反応のはｙ１６
−１８％であった。
国際年位の大腸菌Ｅ、ｃｏｌＬＫ−１２から精製したア
スパラギン酸トランスアミナーゼ、 ’Ｑ、ｌ−ｒイク
ロモルのビリドキサルリン酸（シグマｓｉｇｍａ）ＥＣ
び０．２５７Ｖの還元型ニコチンアミド アデニンジヌ
クレオチド（７ダマＳｉｇｍａ）を含有する溶液を調製
した。この溶液の３６０ｎｒｎＪＣおける吸光度の減少
により反応が起ったことが示された。この変化はトラン
スアミナーゼ、リンゴｍｆヒドロゲナーゼ４Ｌ−アスパ
ラギン酸、あるいは４−フェニル−２−オキソブタン酸
のみを除去成分とした対照では観察されなかった。その
反応の割合は４−フェニル−２−オキソブタン酸の代り
にフェニルピルビン酸を用いる相当する反応のはｙ１６
−１８％であった。
大腸ｍｇ Ｃｏ１ｔ Ｋ−１２からのトランスアミナー
ゼ及びシュードモナス プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕ、ｔｉｄａ、 ＡＴＣＣ９５０からのオキザロ酢酸
デカルボキシラーゼをウィートオール”ｌｉｅ ｅ ｔ
α１１ により記載されたカルボシイ゛ミド法を用いる
共有結合によシコハク酸アミノプロピル多孔性ガラス（
コーニングＧｏｒｎｉｎｇ）に同定化する。その固定化
酵素をガラスカシムにのせる。５０ ｍＭ リン酸カリ
ウムによｐｐＨ７，１に緩衝化された２−ケト−４−フ
ェニルメタン酸（１８ｇ／リットル）、Ｌ−アスパラギ
ン酸（１５，９／リンドル）、ピリドキサールリン酸（
０，０５，９／リツトル）、ＭｇＯ２・６Ｈ２０（２，
０３１１／リツトル）の溶液をそのカラムに搬送通過さ
せ、そしてその流出液を分画採取する。変換の度合は乳
酸デヒドロゲナーゼを用いてピルビン酸について検定す
ることによシ監視する。
ゼ及びシュードモナス プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕ、ｔｉｄａ、 ＡＴＣＣ９５０からのオキザロ酢酸
デカルボキシラーゼをウィートオール”ｌｉｅ ｅ ｔ
α１１ により記載されたカルボシイ゛ミド法を用いる
共有結合によシコハク酸アミノプロピル多孔性ガラス（
コーニングＧｏｒｎｉｎｇ）に同定化する。その固定化
酵素をガラスカシムにのせる。５０ ｍＭ リン酸カリ
ウムによｐｐＨ７，１に緩衝化された２−ケト−４−フ
ェニルメタン酸（１８ｇ／リットル）、Ｌ−アスパラギ
ン酸（１５，９／リンドル）、ピリドキサールリン酸（
０，０５，９／リツトル）、ＭｇＯ２・６Ｈ２０（２，
０３１１／リツトル）の溶液をそのカラムに搬送通過さ
せ、そしてその流出液を分画採取する。変換の度合は乳
酸デヒドロゲナーゼを用いてピルビン酸について検定す
ることによシ監視する。
そのＬ−４−フェニル−２〜アミノズタン酸及びピルビ
ン酸生成物はイオン交換クロマトグラフィーによシ精製
し、純粋なＬ−４−フェニル−２−アミノズタン酸（〔
α〕ゎ＝−４７°）及びピルビン酸を得る。
ン酸生成物はイオン交換クロマトグラフィーによシ精製
し、純粋なＬ−４−フェニル−２−アミノズタン酸（〔
α〕ゎ＝−４７°）及びピルビン酸を得る。
実施例１４Ｄ、Ｌラセミ混合物からのＬ−フェニルアラ
ニンの調製 り、Ｌ−フェニルアラニン（１，６５，Ｐ／リットル）
、ピリドキサーノリンＨＣ０，０２８１１／リットル）
、大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｉからのトランスアミナーゼ（２
，５００単位／リットル）、豚腎臓からのＤ−アミノ酸
オキシｐ”−セ（１，ｏ ｏ ｏ単位／リットル）、シ
ュード−Ｅ−ナスプチダＰｓｔｕｄ、ｏｍｏｎａｓ ｐ
ａｔｉｄ、ａ （ＡＴＣＣ； ９５０）からのオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼ（２０，０００単位／リットル
）、及びアスペルギルスニガーＡｓｐｔｒ、ｑｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ カらｔｖ力ｐ７−ゼ（ｉｏｏ、ｏｏ。
ニンの調製 り、Ｌ−フェニルアラニン（１，６５，Ｐ／リットル）
、ピリドキサーノリンＨＣ０，０２８１１／リットル）
、大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｉからのトランスアミナーゼ（２
，５００単位／リットル）、豚腎臓からのＤ−アミノ酸
オキシｐ”−セ（１，ｏ ｏ ｏ単位／リットル）、シ
ュード−Ｅ−ナスプチダＰｓｔｕｄ、ｏｍｏｎａｓ ｐ
ａｔｉｄ、ａ （ＡＴＣＣ； ９５０）からのオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼ（２０，０００単位／リットル
）、及びアスペルギルスニガーＡｓｐｔｒ、ｑｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ カらｔｖ力ｐ７−ゼ（ｉｏｏ、ｏｏ。
単位／リットル以上）を浅底筒状容器中にてＰ Ｈ７，
０で回転混合により８０分間混合した。定期的に一部を
採取し、変換率の指標として生成するピルビン酸を検定
した。
０で回転混合により８０分間混合した。定期的に一部を
採取し、変換率の指標として生成するピルビン酸を検定
した。
Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンのＬ−フェニルアラニンへの
変換率は０−ＳＯ分の間にわたり直線的であった。この
割合に基すき、その触媒系の生産性は１時間あた。９
Ｄ、 Ｌ−混合物中の１．８６ミリモルのＤ−フェニル
アラニンがＬ−フェニルアラニンに変換されるものであ
った。゛ 実施例１５Ｄ、Ｌ−ラセミ混合物がらＬ−フェニルアラ
ニン調製の別法 り、Ｌ−フェニルアラニン（１，４２ｆ７／リットル）
、Ｌ−アスパラギン酸（１，３３，！９／リットル）、
ピリドキサールリン酸（０，０５６Ｆ／ＩＪツ）ル）、
ｆＧ１２−６Ｈ２０（２，０３ｆｉ／リツトル）、豚腎
臓からのＤ−アミノ酸オギシグーゼ（１２５単位／ｍｌ
） 、牛肝臓がらｏ力ｐ ＞−セ（１ｏ ｏ、ｏ ｏ
Ｏ単位／ＩＭ以上）、大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１
２からのトランスアミナーゼ（ｓ、ｏｏｏ単位／リット
ル）、シュードモナス プチダｐｓｔ＋ｂｄｏｒｎｏｎ
ａｓ ｐｕ、ｆ、１ｃＬａ （ＡＴｃ；Ｏ９５０）から
のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（１９，０００単位
／リットルンを浅底円筒型容器中にて回転振盪によりＰ
Ｈ７，５でインキュイードした。一部を時間を置いて採
取し、反応の完結の指標としてピルビン酸を検定した。
変換率は０−ＳＯ分の間にわたり直線的であった。この
割合に基すき、その触媒系の生産性は１時間あた。９
Ｄ、 Ｌ−混合物中の１．８６ミリモルのＤ−フェニル
アラニンがＬ−フェニルアラニンに変換されるものであ
った。゛ 実施例１５Ｄ、Ｌ−ラセミ混合物がらＬ−フェニルアラ
ニン調製の別法 り、Ｌ−フェニルアラニン（１，４２ｆ７／リットル）
、Ｌ−アスパラギン酸（１，３３，！９／リットル）、
ピリドキサールリン酸（０，０５６Ｆ／ＩＪツ）ル）、
ｆＧ１２−６Ｈ２０（２，０３ｆｉ／リツトル）、豚腎
臓からのＤ−アミノ酸オギシグーゼ（１２５単位／ｍｌ
） 、牛肝臓がらｏ力ｐ ＞−セ（１ｏ ｏ、ｏ ｏ
Ｏ単位／ＩＭ以上）、大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１
２からのトランスアミナーゼ（ｓ、ｏｏｏ単位／リット
ル）、シュードモナス プチダｐｓｔ＋ｂｄｏｒｎｏｎ
ａｓ ｐｕ、ｆ、１ｃＬａ （ＡＴｃ；Ｏ９５０）から
のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（１９，０００単位
／リットルンを浅底円筒型容器中にて回転振盪によりＰ
Ｈ７，５でインキュイードした。一部を時間を置いて採
取し、反応の完結の指標としてピルビン酸を検定した。
１０５分後、８１％の変換に相当する３、５１ミ！７モ
ル／リットルのピルビン酸が生成されていた。これらの
条件下におけるこの触媒系の生産性は時間あた夛り、Ｌ
−混合物中のＤ−フェニルアラニンカラ生成シたＬ−７
ェニルアンニンば３４６■であった。
ル／リットルのピルビン酸が生成されていた。これらの
条件下におけるこの触媒系の生産性は時間あた夛り、Ｌ
−混合物中のＤ−フェニルアラニンカラ生成シたＬ−７
ェニルアンニンば３４６■であった。
実施例１５Ｄ、Ｌ−ラセミ混合物からのＬ−ロイシンの
調製 り、Ｌ−ロイシン（１ａ、２ｆＩ／リツトル）、Ｌ−ア
スパラギン酸（０，６８，９／リツトル）、ピリドキサ
ールリン酸（０，０７０ｇ／リットル）、ＭｔｌＣｌ
２・６Ｈ２０（２，０，ｌ／リットル）、豚腎臓からの
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（１５，０００単位／リット
ル）、アスはルギルスニガ−ｋｓｐｅｒｇｉｌｌｕ、ｓ
ｎｉｇｔｒからのカタラーゼ（１５０，０００単位／
リットル）、大腸菌Ｅ。
調製 り、Ｌ−ロイシン（１ａ、２ｆＩ／リツトル）、Ｌ−ア
スパラギン酸（０，６８，９／リツトル）、ピリドキサ
ールリン酸（０，０７０ｇ／リットル）、ＭｔｌＣｌ
２・６Ｈ２０（２，０，ｌ／リットル）、豚腎臓からの
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（１５，０００単位／リット
ル）、アスはルギルスニガ−ｋｓｐｅｒｇｉｌｌｕ、ｓ
ｎｉｇｔｒからのカタラーゼ（１５０，０００単位／
リットル）、大腸菌Ｅ。
ｃｏ１番に−１２からのトランスアミナーゼ（８，００
０単位／リットル）、シュードモナス プチダｐｇｔｒ
ｔｄｏｍ、ｏｎａｓ ｐａｔｉｃｔａ ＡＴＣＣ９５０
からのオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（２０，０００
単位／リットル）をその溶液の酸素量を増加させるため
、コブ付きの筒状容器中にて回転振盪しなから２５Ｕ及
びｐＨ７，５でインキュベートする。その反応は一部を
採取しピルビン酸を検定することによシ完結まで追跡す
る。Ｌ−ロイシンはイオン交換クロマトグラフィーによ
シ反応混合物から精製し、純粋の生成物を（ｉＩる。ピ
ルビン酸もまた同様にそのナトリウム塩として回収する
。
０単位／リットル）、シュードモナス プチダｐｇｔｒ
ｔｄｏｍ、ｏｎａｓ ｐａｔｉｃｔａ ＡＴＣＣ９５０
からのオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ（２０，０００
単位／リットル）をその溶液の酸素量を増加させるため
、コブ付きの筒状容器中にて回転振盪しなから２５Ｕ及
びｐＨ７，５でインキュベートする。その反応は一部を
採取しピルビン酸を検定することによシ完結まで追跡す
る。Ｌ−ロイシンはイオン交換クロマトグラフィーによ
シ反応混合物から精製し、純粋の生成物を（ｉＩる。ピ
ルビン酸もまた同様にそのナトリウム塩として回収する
。
実施例１７Ｄ、Ｌ−ラセミ混合物からのＬ−バリンの調
製 り、Ｌ−バリン（２３，４１７リツトル）、Ｌ−アスパ
ラギｙｅ （１３，３ｇ／リットル）、ピリドキサール
リン酸（０，０６０，９／リツトル）、Ｍ、！７Ｃ１２
・６Ｈ２０（２，ｏ３Ｎ／リットル）、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ（１５，０００単位／リットル）、カタラー
ゼ（１５０，０００単位／リットル）、大腸菌Ｅ、ｃｏ
ｌｉトランスアミナーゼＢ、 Ｅ、 ｃ、 ２．６．１
．６．モニエール（Ｍｏｎｎ１ｔｒ）ら、ビオケミ−Ｂ
ｉ ｏｃｈｔｍｉ ｅ（ｘ９７６）５ｓ、６６３−６７
５参照（１０，０００単位／ＩＪットル）、シュードモ
ナス プチダｐｓｉｕｄ、ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｃＬ
αＡＴＣＣ９５０からのオキザロ酢Ｈデカルボキシラー
ゼを２５ ｃ及ヒｐＨ７，ｓにて通気振盪しつつインキ
ュベートする。その生成物Ｌ−バｌ） ７及びピルビン
酸はイオン交換法によシ分離・精製【７純粋なＬ−バリ
ン及び純粋々ピルビン酸ナトリウムを得る。
製 り、Ｌ−バリン（２３，４１７リツトル）、Ｌ−アスパ
ラギｙｅ （１３，３ｇ／リットル）、ピリドキサール
リン酸（０，０６０，９／リツトル）、Ｍ、！７Ｃ１２
・６Ｈ２０（２，ｏ３Ｎ／リットル）、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ（１５，０００単位／リットル）、カタラー
ゼ（１５０，０００単位／リットル）、大腸菌Ｅ、ｃｏ
ｌｉトランスアミナーゼＢ、 Ｅ、 ｃ、 ２．６．１
．６．モニエール（Ｍｏｎｎ１ｔｒ）ら、ビオケミ−Ｂ
ｉ ｏｃｈｔｍｉ ｅ（ｘ９７６）５ｓ、６６３−６７
５参照（１０，０００単位／ＩＪットル）、シュードモ
ナス プチダｐｓｉｕｄ、ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｃＬ
αＡＴＣＣ９５０からのオキザロ酢Ｈデカルボキシラー
ゼを２５ ｃ及ヒｐＨ７，ｓにて通気振盪しつつインキ
ュベートする。その生成物Ｌ−バｌ） ７及びピルビン
酸はイオン交換法によシ分離・精製【７純粋なＬ−バリ
ン及び純粋々ピルビン酸ナトリウムを得る。
本発明をその望ましい具体例を含めて詳述してきた。し
かしながら、当分野の専門家には本文中に公表した事柄
の考察によ）、本発明の意図及び範囲内で修正及び改良
がなしうることは了解されるであろう。
かしながら、当分野の専門家には本文中に公表した事柄
の考察によ）、本発明の意図及び範囲内で修正及び改良
がなしうることは了解されるであろう。
第１頁の続ぎ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）トランスアミナーゼ酵素の存在下にてフルファー
ケト酸をＬ−アスパラギン酸と反応さぜｌ該アルファー
ケト酸に対応するアルファアミノ酸及び（ｌｉ） オキ
ザロ酢酸を製造し；そして該オキザロ酢酸を脱炭酸する
ことな特徴とするアル７デブミノ酸またはその誘導体の
製造方法。 （２）該トランスアミナーゼが精製または部分精製酵素
調製物、あるいは完全細胞内に含まれるものとする特許
請求の範囲第１項記載の方法。 （３）オキザロ酢酸の脱炭酸工程をオキザロ酢酸デカル
ボキシラーゼ酵素を用いて達成するものとする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 （４）該オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ酵素がｆｆ製
または部分精製酵素調製物、あるいは完全細胞内に含ま
れるものとする特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）該トランスアミナーゼ及び該オキザロ酢酸デカル
ボキシラーゼをそれぞれ不溶性支持体上に固定化するも
のとする特許請求の範囲第３項記載の方法。 （６）該固定化支持体が孔隙制御されたセラミック粒子
または孔隙制御されたガラス粒子であるものとする特許
請求の範囲第５項記載の方法。 （７）該））ンスアミナーゼ及び該オキザロ酢酸デカル
ボキシ２−ゼの両者を同一支持体上に固定化するものと
する特許請求の範囲第５項記載の方法。 （８）該トランスアミナーゼ及びオキザロ酢酸デカルボ
キシラーゼをジエチルアミンエチルセルロースに吸着せ
しめるものとする特許請求の範囲第５項記載の方法。 （９）該トランスアミナーゼを芳香族アミノ酸トランス
アミナーゼとする特許請求の範囲８１項記載の方法。 Ｑｌ 該アルファーケト酸をフェニルピルビン酸、ｐ−
ヒドロキシフェニルピルビン［，３−（３−インドリル
）ピルビン酸、３−（４−イミダゾイル）ピルビン酸か
ら成る群よシ選択するものとする特許請求の範囲第１項
記載の方法。 （ＩＩ） フェニルピルビン酸を芳香族アミノ酸トラン
スアミナーゼ及びオキザロ酢酸デカルボキシ２−ゼの存
在下Ｌ−アスパラギン酸と反応させ、それによりＬ−フ
ェニルアツニンを製造することを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載の方法。 α２ 該トランスアミナーゼが分枝側鎖を有するアミノ
酸類のアミノ基転移に対して選択的である酵素とする特
許請求の範囲第１項記載の方法。 （１３） 該アルファーケト酸′ｔ−２−オキソ−３−
メチルメタン酸、２−オキソ−４−メチルペンタン酸、
２−オキシー３−メチルペンタン酸及び３−ヒドロキシ
ピルビン酸から成る群から選択するものとする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 （２）該トランスアミナーゼがヒドロキシピルビン酸の
Ｌ−セリンへのアミノ基転移を触媒し得る酵素であるも
のとする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ＜１５１ 該トランスアミナーゼ會ニジエリチア コ３
１ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ、バチルス サ
プチルスＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、アクロモ
バクタ−エラリブイセＡｃｈｒｏｒｍｂｓｃｔｅｒｅｕ
ｒｙｄｉｃｅ、またはクレブシェラ エアログネスＫｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓから成る群から選
択した微生物から単離した酵素とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。 θｌ１９＃オキザロ酢酸デカルボキシ２−ゼをミクロコ
ツカス ルテウスＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕ
ｓ＋シユードモナス プチダＰｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａ：
、； ｐｕｔｉｄｓまたはアゾトバクタ−ビネランデイ
Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｕｅｌａｏｄｉｉから
成る群よシ選択した微生物から単離した酵素とする特許
請求の範囲第３項記載の方法。 面 該オキザロ酢酸デカルボキシラーゼをＭｎ 、ｃａ
、ｃｏ 、Ｍｇ 、Ｎ（（、Ｚｎ 、Ｆｅ 。 及びＣａ＋＋から成る群から選択する金属イオンの存在
下にて反応させるものとする特許請求の範囲第３項記載
の方法。 と反応させＬ−４−フェニル−２−アミノブタン酸及び
オキザロ酢酸を製造し、該オキザロ酢酸を脱炭酸するこ
とを特徴とするアルファ１．４−フェニル−２−アミノ
ブタン酸またはその誘導体の製造方法。 ←９ Ｄ、Ｌ−アミノ酸混合物を適当するアミノ基供与
体の存在下Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及ヒト２ンスアミ
ナーゼとの混合状態にて反応させる事を６徴とする相当
するり、Ｌ−アミノ酸ジセミ混合物から直接Ｌ−アミノ
酸を製造する方法。 可 該アミノ基供与体がＬ−グルタミン酸であるものと
する特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ＣＩ）該アミノ基供与体がＬ−アスパラギン酸であるも
のとする特許請求の範囲第１９項記載の方法。 （２々 該混合物がさらにオキザロ酢酸デカルボキシラ
ーゼを含むものとする特許請求の範囲第２１項記載の方
法。 σａ 該混合物がさらにカタラーゼ金倉むものとる特許
請求の範囲第２３項記載の方法。 （ホ）該金属酸化物を酸化マンガンとする特許請求の範
囲第２４項記載の方法。 ｃ！ｅ 該酸化マンガンｅＭｎｚｏａ とする特許請求
の範囲第６項記載の方法。 ＠ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びトランスアミナーゼ
はそれぞれ精製または部分精製酵素調製物、あるいは完
全細胞内に含まれるものとする特許請求の範囲第１９項
記載の方法。 （ハ）その酵素類を不溶性支持体上に固定化するものと
する特許請求の範囲第２７項記載の方法。 翰 該固定化支持体は孔隙制御されたセラミック粒子ま
たは孔隙制御されたガラス粒子であるものとする特許請
求の範囲第四項記載の方法。 （至）該酵素類が同一支持体上に固定化されているもの
とする特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ０１） 該酵素類をジエチルアミノエチルセルロース上
に吸着せしめるものとする特許請求の範囲第あ項記載の
方法。 Ｇつ 該トランスアミナーゼを芳香族アミノ酸トランス
アミナーゼとする特許請求の範囲第１９項記載の方法。 （至）該トランスアミナーゼをニジエリチアコリＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、バチルス サチルス Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、アクロモバクタ−エ
ラリブイセＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｙｄｉ
ｃｅ、またはクレズシエフ ェアロゲネスＫｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓから成る群から選択した
微生物から単離した酵素とする特許請求の範囲第１９項
記載の方法。 ｔａ４Ｉｖオキザロ酢酸デカルボキシ２−ゼｔミクロコ
ツカス ルテウス Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅ
ｕｓ、シュードモナス プチダＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａまたはアゾトバクタ−ビネランデイＡｚ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ から成る群
よシ選択した微生物から単離した酵素とする特許請求の
範囲第２２項記載の方法。 （至）該オキザロ酢酸デカルボキシラーゼをＭｎ 。 Ｃｄ＋＋ 、 Ｃｏ＋＋ 、 Ｍｇ＋＋ 、 Ｎ４＋＋
、ｚｎ＋＋ 、 Ｆ１８＋十及びＣａ＋＋から成る群
から選択する金属イオンの存在下にて反応するものとす
る特許請求の範囲第ｎ項記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/528,730 US4518692A (en) | 1983-09-01 | 1983-09-01 | Production of L-amino acids by transamination |
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| JPS6338193B2 JPS6338193B2 (ja) | 1988-07-28 |
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