<Desc/Clms Page number 1>
pour Synthèse enzymatique de la L-sérine.
La présente invention concerne un procédé pour synthétiser la L-sérine. La L-sérine est un aminoacide commercialement intéressant utilisé pour l'alimentation et l'hyperalimentation et aussi comme intermédiaire ou matière première dans certaines synthèses. Il existe
<Desc/Clms Page number 2>
donc un débouché pour la L-sérine pour la production de laquelle différents procédés ont été mis au point. Un certain nombre de ces procédés consistent à produire la L-sérine par fermentation. On peut se référer, par exemple à Morinaga, Y., et al., Agric. Biol. Chem.
45 (6) 1419-24 (1981) ; Morinaga, Y., et al., Agric.
Biol. Chem. 45 (6) 1425-1430 (1981). De plus, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 616.224 (Shiio et al., 1971) a pour objet un procédé pour produire différents aminoacides, notamment la sérine, par fermentation, suivant lequel on cultive certaines souches de bactéries sur des milieux contenant du méthanol comme source de carbone assimilable. On peut se référer aussi au brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 943.038 (Morinaga et al. 1976) décrivant un procédé pour produire la sérine et d'autres aminoacides par culture de souches spécifiques de différentes bactéries dans un milieu de culture aqueux en présence d'oxygène, d'hydrogène et de dioxyde de carbone.
Un inconvénient commun aux procédés de fermentation décrits est que la concentration en L-sérine atteinte dans le bouillon et recueillie est relativement faible, même après des durées de fermentation assez longues.
La sérine peut être produite aussi par synthèse chimique. On peut se référer, par exemple à Kanedo, Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). Souvent, ces procédés chimiques donnent la sérine sous la forme d'un mélange racémique des isomères optique D et L ou sous la forme de l'isomère D moins intéressant. Les mélanges DL doivent être dédoublés suivant des procédés mettant en jeu des bactéries qui catabolisent la D-sérine, la sérine racémase, une acylase pour les L-aminoacides, la cristallisation fractionnée des dérivés de la sérine ou
<Desc/Clms Page number 3>
des moyens analogues, ce qui augmente le coût du produit.
On sait que la L-sérine peut être produite à oartir de la qlycine. La oroduction biologinue de la Lsérine à partir de la glycine a déjà été effectuée au moyen de différents micro-orqanismes. Voir, par exemple, Tanaka, Y., et al., J. Ferment. Technol. 59 : 447 (1981). Comme dans les procédés par fermentation, un inconvénient de ce mode opératoire est que le rendement en L-sérine n'est normalement pas fort élevé.
Il serait donc intéressant de disposer d'un procédé pour synthétiser la L-sérine avec des rendements élevés.
La présente invention a donc pour but de procurer un procédé de synthèse de la L-sérine, suivant lequel la sérine est produite en concentrations élevées dans une solution d'où elle peut être recueillie efficacement.
L'invention a aussi pour but de procurer un procédé enzymatique de production de la L-sérine, suivant lequel la réaction peut être conduite en système discontinu ou immobilisé.
La Demanderesse a en effet découvert que la Lsérine peut être synthétisée efficacement à partir de glycine et de formaldéhyde en présence de quantités biocatalytiques de la sérine hydroxyméthyltransférase, qui est l'enzyme, et de tétrahydrofolate, qui est le cofacteur, dans les conditions de la production de la sérine. L'enzyme peut être présente dans des cellules entières ou dans un extrait brut ou bien sous la forme de l'enzyme purifiée et peut être présentée sous forme immobilisée ou non immobilisée.
On sait que la sérine hydroxyméthyltransférase (dite ci-après SHMT) catalyse la scission de la sérine en glycine au cours d'une réaction qui dépend de
<Desc/Clms Page number 4>
cofacteurs, à savoir le pyridoxal-5'-phosphate et le tétrahvdrofolate. La réaction donne de la glycine et du
EMI4.1
m On peut se r'férer à méthylènetétrahydrofolate.
On peut se référer àSchirck, L., Advances in Enzymology 53 : 83 (1982). La Demanderesse a découvert à présent que la SHMT peut être utilisée avec succès comme biocatalvseur pour
EMI4.2
produire la L-sérine à partir de glycine et de formaldéhvde. La réaction se fait en présence folate (THF) comme cofacteur. La source du THF peut être la source du SHMT, le THF existant dans les microorganismes contenant du SHMT, ou bien le THF peut être ajouté au moyen d'une source exogène. Un avantage de ce mode opératoire est qu'il donne uniquement la L-sérine optiquement active. Un autre avantage est qu'après l'exécution de la réaction, le mélange du réacteur contient uniquement de la glycine et de la L-sérine plutôt qu'un mélange complexe auquel on pourrait s'attendre dans un bouillon de fermentation ou à la suite d'une synthèse chimique.
Il est surprenant que la L-sérine puisse être synthétisée à partir de glycine et de formaldéhyde, du fait qu'on sait que le formaldéhyde réagit chimiquement avec les protéines et inactive les enzymes. On peut se référer à ce propos à French, D., et al., Advances in Protein Chemistry 2 : 277-335 (1945). En fait, la SHMT est rapidement inactivée par le formaldéhyde. La Demanderesse a néanmoins découvert que l'enzyme peut être protégée par addition d'un excès de tétrahydro- folate au mélange de réaction. Le THF réagit avec le formaldéhyde et protège ainsi l'enzyme.
La modification chimique de la SHMT assure également la stabilité et la protection contre l'inactivation par le formaldéhyde. Par exemple, il a été observé que la réaction des imidoesters avec les radicaux amino (voir Means, G., et al., Chemical
<Desc/Clms Page number 5>
Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) à la surface de l'enzyme permet à l'enzyme d'agir en présence de formaldéhyde en concentrations plus élevées que celles tolérées par l'enzyme non modifiée.
La voie enzymatique envisagée pour la synthèse
EMI5.1
de la L-sérine à partir de la glycine est la suivante :
EMI5.2
formaldéhyde + THF===1méthylène-THF SH, méthylène THF + glycine L-sérine + THF
EMI5.3
Il est préféré que la réaction soit exécutée en milieu anaérobie, par exemple en atmosphère d'azote, pour empêcher l'oxydation du THF.
Les substrats, la SHMT et le THF peuvent être mis à réagir ensemble de différentes façons. Bien que l'ordre dans lequel les réactifs et les catalyseurs sont introduits ne soit pas critique, il est préférable que la glycine et le formaldéhyde soient ajoutés lentement à la SHMT en présence du THF. La réaction est conduite dans les conditions de la production de la Lsérine. Lorsque le gène SHMT de E. coli (glyA) est utilisé comme source de SHMT, ces conditions comprennent généralement une température de réaction d'environ 40e à environ 60 C et un pH d'environ 4 à environ 11. Des conditions de réaction préférées comprennent une température d'environ 20 C à environ 45 C et un pH d'énviron 6 à 8,5.
Lorsque la température est infé-
EMI5.4
rieure à environ 4 C, la durée de réaction augmente beaucoup et lorsque la température excède environ 60 C, l'enzyme peut être dénaturée. De même, à un pH inférieur à environ 4 ou supérieur à environ 11, l'enzyme peut être inactivée. La SHMT est une enzyme centrale pour le métabolisme des micro-organismes et des orga-
<Desc/Clms Page number 6>
nismes supérieurs et il existe, par conséquent, de nombreuses sources possibles pour cette enzyme. Les gammes de conditions dans lesquelles la réaction produisant la L-sérine peut être effectuée dépendent de l'origine de l'enzyme utilisée. Par exemple, les enzymes provenant des micro-organismes thermophiles pourraient être utilisés à une température plus élevée que celle admissible lorsque l'enzyme est apportée par E. coli.
La sérine hydroxyméthyltransférase peut être présentée sous forme de cellules entières ou d'extrait brut ou bien sous forme d'enzyme purifiée. L'enzyme peut être utilisée sous forme immobilisée ou non immobilisée. L'enzyme est utilisée en quantités suffisantes pour catalyser la réaction.
L'enzyme peut être obtenue à partir de microorganismes qui ont été modifiés suivant les techniques habituelles de l'ingénierie génétique pour la produire avec des rendements élevés. On peut se référer à Stauffer, G., et al., Gene 15 : 63-72 (1981). Le gène SHMT (glyA) peut être isolé et cloné dans un plasmide, qui peut être utilisé ensuite pour transformer des cellules hôtes appropriées conduisant à une expression élevée de la SHMT. Des micro-organismes mutants, dont le métabolisme de la méthionine a été modifié, produisent également de la SHMT en surabondance. Voir Stauffer, G. V. et Brenchley, J. E., Genetics 88,221 (1978), de même que Stauffer, G. V. et Brenchley, J. E., J. Bacteriol. 129,740 (1977).
Suivant les techniques de clonage des gènes, l'activité enzymatique a pu être augmentée jusqu'à vingt fois et peut représenter plus de 10% de la protéine soluble que contient la cellule. Une souche de E. coli (Gx1703) transformée à l'aide d'un tel plasmide, spécifiquement un dérivé de pBR322 dans lequel le gène glyA a été cloné, pGx122, a été
<Desc/Clms Page number 7>
déposée au Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, sous le n NRRL B-15215.
Une souche de Klebsiella aerogenes (Gx1704) transformée à l'aide d'un plasmide semblable, mais plus petit, avec une modification induisant un nombre de copies élevé, pGX139, a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sous le n ATCC 39214, et une souche de Salmonella typhimurium (Gx1682) transformée par pGx139 a été déposée sous le n ATCC 39215.
En outre, lorsque le gène est prélevé sur une source telle que E. coli, il peut être modifié par mutagénèse statistique ou mutagénèse avec orientation sur le site pour produire une enzyme ayant une meilleure stabilité. En variante, le gène peut être synthétisé par voie entièrement chimique avec des modifications multiples améliorant la stabilité de l'enzyme pendant la conduite du procédé décrit.
Des cellules entières peuvent être utilisées pour apporter une source de THF. Si la chose est désirée, un supplément de THF peut être ajouté pour atteindre les concentrations de saturation, qui dépendent du pH et aussi de la température. Par exemple, à un pH d'environ 7,5 et à une température de réaction
EMI7.1
d'environ 37 C, en solution aqueuse, du THF peut être ajouté pour atteindre une concentration beaucoup supérieure à 50 mM. Le pH doit être ajusté pendant la dissolution du THF. Si la SHMT est ajoutée sous forme d'extrait brut ou sous forme d'enzyme purifiée, une source indépendante de THF est nécessaire. La quantité de THF qui peut être ajoutée varie avec la température, la nature du solvant et le pH appliqués pour la conduite de la réaction.
La Demanderesse a découvert que le THF conserve son activité à l'égard de la SHMT lorsqu'il est immobilisé. L'immobilisation du THF par fixation sur un
<Desc/Clms Page number 8>
support qui peut être retenu à l'intérieur d'un bioréacteur utilisé pour la conduite de la réaction est avantageuse, parce qu'elle favorise l'utilisation répétée du cofacteur, après achèvement de la synthèse de la L-sérine. Par exemple, le THF peut être immobilisé avec des polymères solubles, comme le dextranne, le polyéthylèneglycol ou la polyéthylèneimine. L'immobilisation se fait au moyen d'une fixation covalente dans les deux premiers cas et d'une interaction ionique dans le troisième. La fixation covalente se fait généralement à l'intervention des radicaux carboxyle du THF avec un radical amino du support.
En variante, des techniques de fixation analogues permettent aussi de fixer le THF sur un support insoluble.
En variante, si la sérine est synthétisée par un procédé à marche discontinue, il est possile de recycler le THF. Par exemple, après que la L-sérine a été synthétisée, la solution de réaction peut être amenée à passer sur du charbon activé ou une colonne échangeuse d'ions qui collecte et sépare le THF hors de la solution de L-sérine produite. Le THF peut être ensuite dégagé et neutralisé. En variante, le THF peut être modifié par fixation covalente sur une petite molécule, par exemple une glucosamine, facilitant l'isolement du cofacteur. Après que la L-sérine a été synthétisée, la solution de réaction est passée sur une colonne de borate. Le borate fixe uniquement la THFglucosamine et le THF modifié peut ensuite être dégaqé et recyclé.
La glycine et le formaldéhyde sont, de préférence, ajoutés au mélange de tétrahydrofolate et de SHMT. La quantité de glycine qui peut être ajoutée varie avec les conditions de pH, de température et de solvant pour la réaction, mais peut généralement atteindre la saturation.
<Desc/Clms Page number 9>
Comme déjà indiqué, le formaldéhyde peut être hautement toxique pour la SHMT. Par conséquent, le formaldéhyde est généralement ajouté lentement aux autres constituants et son addition est régulée. Le formaldéhyde est ajouté en une quantité suffisante pour maintenir l'activité enzymatique, généralement de manière à maintenir une concentration supérieure de moins d'environ 10 mM à la concentration en THF, bien que le formaldéhyde puisse être ajouté pour entretenir une concentration s'élevant jusqu'à environ 50 mM audelà de la concentration en THF. Plus la concentration en THF du système est élevée, plus la concentration en formaldéhyde peut être maintenue élevée, parce que le THF réagit favorablement avec le formaldéhyde et protège ainsi l'enzyme. Le mécanisme de réaction du THF et du formaldéhyde a été décrit par Kallen, R. G., et al., J.
Biol. Chem. 241 (24) 5851-5863 (1966). Le formaldéhyde peut être ajouté d'autant plus vite nour le maintien de la concentration désirée que l'activité de l'enzyme est plus élevée dans le réacteur.
La Demanderesse a découvert aussi qu'il peut être avantageux d'ajouter un second cofacteur de la SHMT, en l'occurrence du pyridoxal-5'-phosphate, aux réactifs. Le pyridoxal-5'-phosphate est énergiquement lié à l'enzyme. Lorsque de la L-sérine est synthétisée pendant une longue durée dans un réacteur, le pyridoxalphosphate peut se perdre ou être inactivé, auquel cas un supplément de pyridoxalphosphate peut être ajouté. La perte du cofacteur pendant la synthèse se traduit-par la disparition de la couleur jaune de la solution de réaction et par la perte d'activité de la sérine hydroxyméthyltransférase. La concentration en pyridoxalphosphate ajouté au milieu de réaction peut s'échelonner de 0 à environ 20 mM, suivant les besoins, et de préférence d'environ 0,1 à environ 1 mM.
<Desc/Clms Page number 10>
L'addition du pyridoxalphosphate en excès peut assurer une fonction supplémentaire. La Demanderesse a en effet découvert que dans certains micro-organismes qui ont été transformés par des plasmides contenant le gène glyA et qui expriment des concentrations élevées en SHMT, l'addition du pyridoxal-5'-phosphate est nécessaire pour saturer le SHMT en présence et améliorer l'activité enzymatique observée. Un tel microorganisme est Klebsiella aerogenes contenant le plasmide pGx139 identifié ci-dessus.
La synthèse peut être conduite en présence de tout solvant non nuisible. Des exemples de tels solvants sont l'éthanol, le méthanol, l'isopropanol et le dioxanne.
Les exemples ci-après illustrent davantage l'invention.
EXEMPLE 1. -
On cultive des souches de bactéries avec et sans le plasmide pGx139 dans du milieu LB (10 g par litre de Bacto tryptone, 5 g par litre d'extrait de levure et 5 g par litre de NaCL) ou dans du milieu minimal (10,5 g par litre de K2HP04, 4,5 g par litre de KH2P04, 1, 0 g par litre de (NH4)2SO4 et 0,5 g par litre de citrate de sodium dihydraté) additionné de 0, 4% de glucose ou de lactose. On ajoute des aminoacides jusqu'à 20/ug par ml et des vitamines jusqu'à 1/ug par ml, suivant les indications. On exprime l'activité spécifique de la sérine hydroxyméthyltransférase en nanomoles de 3-phénylsérine convertie en benzaldéhyde et glycine par minute et par mg de protéine extractible après exposition des cellules aux ultrasons.
On exécute les expériences dans du tampon au phosphate 50 mM à pH 7,3 en présence de 0,1 mM de
EMI10.1
¯A-ph'nylsérine à 20'C. pyridoxalphosphate et à 35 mM enp-phénylsérine e On surveille l'apparition du benzaldéhyde à 279 nm à
<Desc/Clms Page number 11>
l'aide d'un spectrophotomètre enregistreur.
SHMT
Activité spécifique (nanomoles/minute/mg)
EMI11.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Plasmide <SEP> Milieu <SEP> LB <SEP> Milieu <SEP> Supplément
<tb> minimal
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698-39 <SEP> N. <SEP> D. <SEP> *
<tb> GX1671 <SEP> pGx139 <SEP> 221 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1703 <SEP> pGxl39 <SEP> 141 <SEP> 533 <SEP> glucose,
<tb> phénylalanine
<tb> thiamine
<tb> GX1703 <SEP> pGx122 <SEP> 218 <SEP> 682 <SEP> glucose,
<tb> phénylalanine
<tb> thiamine
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682-28 <SEP> 10 <SEP> glucose
<tb> tryptophane
<tb> 17 <SEP> lactose,
<tb> tryptophane
<tb> GX1682 <SEP> pGxl39 <SEP> 152 <SEP> 133 <SEP> glucose
<tb> tryptophane
<tb> 306 <SEP> lactose
<tb> tryptophane
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704-36 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1704 <SEP> PGx139 <SEP> 590 <SEP> 114 <SEP> glucose
<tb> 223 <SEP> 108 <SEP> lactose
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Génotype
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698 <SEP> trpEA, <SEP> tna <SEP> 2, <SEP> serB, <SEP> lacIq <SEP> ts <SEP> 402
<tb> GX1671 <SEP> thi, <SEP> ara, <SEP> strR, <SEP> glyA, <SEP> LI-serB <SEP> trp <SEP> laciql, <SEP>
<tb> lacZ <SEP> : <SEP> :
<SEP> tn5
<tb> GX1703 <SEP> glyA, <SEP> pheA, <SEP> thi, <SEP> lac, <SEP> ara, <SEP> strR
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682 <SEP> trpBEDC43 <SEP> F'lacIq <SEP> ts420 <SEP> pro
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704 <SEP> lsd <SEP> (mutant <SEP> L-sérine <SEP> désaminase)
<tb>
EMI12.2
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 10,5 <SEP> g/litre
<tb> KH2P04 <SEP> 4,5 <SEP> g/litre
<tb> (NH4) <SEP> 2SO4 <SEP> 1 <SEP> g/litre
<tb> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> dihydraté <SEP> 0,5 <SEP> g/litre
<tb> Phénylalanine <SEP> 20/ug/ml
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> Vitamine <SEP> B1 <SEP> 1 <SEP> /ug/ml
<tb> Ampicilline <SEP> 100 <SEP> /ug/ml
<tb> MgSO4 <SEP> 2 <SEP> nM
<tb> FeSO4 <SEP> 5 <SEP> mg/ml
<tb>
EMI13.2
On du milieu de culture et on les utilise comme source de l'enzyme.
On mélange de la glycine (12 mM en concentration finale) avec du tétrahydrofolate (5 mM en
EMI13.3
Salmonella typhimurium LT2 concentration finale), Klebsiella aerogenes du formaldéhyde * non déterminé atmosphère
EMI13.4
tampon au phosphate du mélange de réaction étant de 100 réaction en dessus à 370e sous agitation. Après 8 heures, on obtient de la sérine 5 mM (rendement de 45 sur base de la glycine). détermine les concentrations en glycine et sérine par chromatographie liquide à haute performance.
EXEMPLE 3.On introduit une colonie de la souche GX1704 de (contenant pGx139), qui a été déposée sous le n dans 100 ml d'un milieu de culture II décrit ci-après et on l'agite à 300e jusqu'au lendemain.
EMI13.5
<tb>
<tb> du <SEP> pyMilieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> II
<tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g/litre
<tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g/litre <SEP>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> g/litre <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> gjlitre
<tb>
On recueille les cellules par centrifugation du milieu de culture et on les utilise comme source de l'enzyme.
<Desc/Clms Page number 14>
On suit le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 pour la production de la sérine, mais au moyen de Klebsiella aerogenes au lieu de E. coli. Après 8 heures, on obtient de la sérine 7 mM (rendement de 64% sur base de la glycine). Toute l'activité enzymatique persiste.
EXEMPLE 4.-
On suit le mode opératoire de l'exemple 1, mais en utilisant de la sérine hydroxyméthyltransférase partiellement purifiée de E. coli (souche GX1703). On provoque la rupture des cellules par exposition aux ultrasons à 4 C. On mélange le liquide qui surnage après centrifugation avec du sulfate d'ammonium (50% de la saturation) à 4 C et à pH 7,5. Après avoir séparé les solides par centrifugation, on extrait l'enzyme de la solution en augmentant la teneur en sulfate d'ammonium jusqu'à 100% de la saturation. On recueille l'enzyme par centrifugation et dialyse. Après 4 heures de réaction, on obtient de la sérine 10 mM. Le rendement est de 90% sur base de la glycine. Toute l'activité enzymatique se conserve.
EXEMPLE 5.-
On applique le mode opératoire de l'exemple 3, la différence étant que la glycine a une concentration initiale de 340 mM et qu'on introduit le formaldéhyde (concentration initiale 2 M) à raison de 1 ml par heure. Après 12 heures, on obtient de la sérine 119 mM.
EXEMPLE 6.-
On suit le mode opératoire de l'exemple 3, la différence étant qu'on introduit la glycine (concentration initiale 2 M) et le formaldéhyde (concentration initiale 2 M) au même débit de 1 ml par heure. Après 5 heures, on obtient de la sérine 57 mM.
EXEMPLE 7.-
On applique le mode opératoire de l'exemple 3
<Desc/Clms Page number 15>
en modifiant le THF. On dissout du dextranne (5 g, Pharmacia T40) dans de l'eau jusqu'à une concentration finale de 5%. On oxyde le dextranne en solution au moyen de NaI04 0,1 M pendant 1 heure à la température ambiante. On précipite le dextranne oxydé par addition d'éthanol jusqu'à 60% v/v. On répète l'opération deux fois. On dissout le dextranne oxydé dans 100 ml de 1,6hexanediamine (HMD) 0,2 M à pH 9,0. On ajoute du borohydrure de sodium (0,2 g) après 30 et 60 minutes, respectivement. On dialyse le mélange de 1, 6-hexanediamine et de dextranne contre de l'eau jusqu'au lendemain et on le lyophilise. On mélange du THF (5 mM) avec
EMI15.1
10 millimoles de l-éthyl-3- carbodiimide et 0, 5 de HMD-dextranne à pH 7, 0 en atmosphère d'azote.
On recueille par centrifugation le précipité résultant qu'on lave deux fois avec une solution de NaCl 0,5 M. On mélange le THF solide avec le mélange de réaction, comme décrit dans l'exemple 3.
Après 3 heures de réaction, on obtient de la sérine 7 mM.
<Desc / Clms Page number 1>
for Enzymatic synthesis of L-serine.
The present invention relates to a method for synthesizing L-serine. L-serine is a commercially interesting amino acid used for food and hyperalimentation and also as an intermediate or raw material in certain syntheses. It exists
<Desc / Clms Page number 2>
therefore an outlet for L-serine for the production of which various processes have been developed. A number of these methods involve producing L-serine by fermentation. We can refer, for example to Morinaga, Y., et al., Agric. Biol. Chem.
45 (6) 1419-24 (1981); Morinaga, Y., et al., Agric.
Biol. Chem. 45 (6) 1425-1430 (1981). In addition, United States Patent No. 3,616,224 (Shiio et al., 1971) relates to a process for producing various amino acids, including serine, by fermentation, in which certain strains of bacteria are grown on media containing methanol as an assimilable carbon source. Reference may also be made to United States patent No. 3,943,038 (Morinaga et al. 1976) describing a process for producing serine and other amino acids by culturing specific strains of different bacteria in a culture medium aqueous in the presence of oxygen, hydrogen and carbon dioxide.
A common drawback to the fermentation processes described is that the concentration of L-serine reached in the broth and collected is relatively low, even after fairly long fermentation times.
Serine can also be produced by chemical synthesis. Reference may be made, for example, to Kanedo, Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). Often, these chemical processes give the serine as a racemic mixture of the optical isomers D and L or in the form of the less interesting D isomer. DL mixtures must be split using methods involving bacteria which catabolize D-serine, serine racemase, an acylase for L-amino acids, fractional crystallization of serine derivatives or
<Desc / Clms Page number 3>
similar means, which increases the cost of the product.
It is known that L-serine can be produced from qlycine. The biological production of Lserine from glycine has already been carried out by means of various microorganisms. See, for example, Tanaka, Y., et al., J. Ferment. Technol. 59: 447 (1981). As in fermentation processes, a disadvantage of this procedure is that the yield of L-serine is normally not very high.
It would therefore be advantageous to have a method for synthesizing L-serine with high yields.
The object of the present invention is therefore to provide a process for the synthesis of L-serine, according to which the serine is produced in high concentrations in a solution from which it can be efficiently collected.
Another object of the invention is to provide an enzymatic process for the production of L-serine, according to which the reaction can be carried out in a batch or immobilized system.
The Applicant has in fact discovered that Lserine can be effectively synthesized from glycine and formaldehyde in the presence of biocatalytic amounts of the serine hydroxymethyltransferase, which is the enzyme, and of tetrahydrofolate, which is the cofactor. production of serine. The enzyme can be present in whole cells or in a crude extract or in the form of the purified enzyme and can be presented in immobilized or non-immobilized form.
It is known that the serine hydroxymethyltransferase (hereinafter called SHMT) catalyzes the cleavage of serine into glycine during a reaction which depends on
<Desc / Clms Page number 4>
cofactors, namely pyridoxal-5'-phosphate and tetrahydrofolate. The reaction gives glycine and
EMI4.1
m We can refer to methylenetetrahydrofolate.
We can refer to Schirck, L., Advances in Enzymology 53: 83 (1982). The Applicant has now discovered that SHMT can be successfully used as a biocatalyst for
EMI4.2
produce L-serine from glycine and formaldehyde. The reaction is carried out in the presence of folate (THF) as a cofactor. The source of THF may be the source of SHMT, the THF existing in microorganisms containing SHMT, or else THF may be added by means of an exogenous source. An advantage of this procedure is that it gives only optically active L-serine. Another advantage is that after the reaction has been carried out, the reactor mixture contains only glycine and L-serine rather than a complex mixture which one would expect in a fermentation broth or following chemical synthesis.
It is surprising that L-serine can be synthesized from glycine and formaldehyde, since we know that formaldehyde reacts chemically with proteins and inactivates enzymes. We can refer to this in French, D., et al., Advances in Protein Chemistry 2: 277-335 (1945). In fact, SHMT is rapidly inactivated by formaldehyde. The Applicant has nevertheless discovered that the enzyme can be protected by adding an excess of tetrahydrofolate to the reaction mixture. THF reacts with formaldehyde and thus protects the enzyme.
The chemical modification of the SHMT also provides stability and protection against inactivation by formaldehyde. For example, it has been observed that the reaction of imidoesters with amino radicals (see Means, G., et al., Chemical
<Desc / Clms Page number 5>
Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) on the surface of the enzyme allows the enzyme to act in the presence of formaldehyde in concentrations higher than those tolerated by the unmodified enzyme.
The enzymatic route envisaged for the synthesis
EMI5.1
L-serine from glycine is as follows:
EMI5.2
formaldehyde + THF === 1methylene-THF SH, methylene THF + glycine L-serine + THF
EMI5.3
It is preferred that the reaction be carried out in an anaerobic medium, for example in a nitrogen atmosphere, to prevent the oxidation of THF.
Substrates, SHMT and THF can be reacted together in different ways. Although the order in which the reactants and catalysts are introduced is not critical, it is preferable that glycine and formaldehyde be added slowly to the SHMT in the presence of THF. The reaction is carried out under the conditions of production of Lserine. When the E. coli SHMT gene (glyA) is used as the source of SHMT, these conditions generally include a reaction temperature of about 40 ° C to about 60 C and a pH of about 4 to about 11. Preferred reaction conditions include a temperature of about 20 C to about 45 C and a pH of about 6 to 8.5.
When the temperature is below
EMI5.4
lower than about 4 C, the reaction time increases a lot and when the temperature exceeds about 60 C, the enzyme can be denatured. Likewise, at a pH below about 4 or above about 11, the enzyme can be inactivated. SHMT is a central enzyme for the metabolism of microorganisms and organ-
<Desc / Clms Page number 6>
higher nisms and there are, therefore, many possible sources for this enzyme. The ranges of conditions under which the L-serine producing reaction can be carried out depend on the origin of the enzyme used. For example, enzymes from thermophilic microorganisms could be used at a higher temperature than that allowable when the enzyme is supplied by E. coli.
Serine hydroxymethyltransferase can be presented as whole cells or as a crude extract or as a purified enzyme. The enzyme can be used in immobilized or non-immobilized form. The enzyme is used in sufficient amounts to catalyze the reaction.
The enzyme can be obtained from microorganisms which have been modified according to the usual techniques of genetic engineering to produce it with high yields. Reference may be made to Stauffer, G., et al., Gene 15: 63-72 (1981). The SHMT gene (glyA) can be isolated and cloned into a plasmid, which can then be used to transform suitable host cells leading to high expression of SHMT. Mutant microorganisms, whose metabolism of methionine has been modified, also produce an overabundant SHMT. See Stauffer, G. V. and Brenchley, J. E., Genetics 88.221 (1978), as well as Stauffer, G. V. and Brenchley, J. E., J. Bacteriol. 129,740 (1977).
According to gene cloning techniques, the enzymatic activity could be increased up to twenty times and can represent more than 10% of the soluble protein that the cell contains. An E. coli strain (Gx1703) transformed using such a plasmid, specifically a derivative of pBR322 into which the glyA gene was cloned, pGx122, was
<Desc / Clms Page number 7>
deposited at the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, under NRRL B-15215.
A strain of Klebsiella aerogenes (Gx1704) transformed with a similar, but smaller, plasmid with a high copy-number modification, pGX139, has been deposited in the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under the n ATCC 39214, and a strain of Salmonella typhimurium (Gx1682) transformed by pGx139 was deposited under the n ATCC 39215.
In addition, when the gene is taken from a source such as E. coli, it can be modified by statistical mutagenesis or site-oriented mutagenesis to produce an enzyme with better stability. Alternatively, the gene can be synthesized entirely chemically with multiple modifications improving the stability of the enzyme while carrying out the process described.
Whole cells can be used to provide a source of THF. If desired, a supplement of THF can be added to reach saturation concentrations, which depend on the pH and also on the temperature. For example, at a pH of around 7.5 and a reaction temperature
EMI7.1
about 37 C, in aqueous solution, THF can be added to reach a concentration much higher than 50 mM. The pH must be adjusted during the dissolution of THF. If SHMT is added as a crude extract or as a purified enzyme, an independent source of THF is required. The amount of THF which can be added varies with the temperature, the nature of the solvent and the pH applied for carrying out the reaction.
The Applicant has discovered that THF retains its activity with respect to SHMT when it is immobilized. Immobilization of THF by fixation on a
<Desc / Clms Page number 8>
support which can be retained inside a bioreactor used for conducting the reaction is advantageous, because it promotes the repeated use of the cofactor, after completion of the synthesis of L-serine. For example, THF can be immobilized with soluble polymers, such as dextran, polyethylene glycol or polyethyleneimine. The immobilization is done by means of a covalent fixation in the first two cases and an ionic interaction in the third. The covalent fixing is generally done by the intervention of the THF carboxyl radicals with an amino radical of the support.
As a variant, analogous fixing techniques also make it possible to fix the THF on an insoluble support.
Alternatively, if the serine is synthesized by a batch process, it is possible to recycle the THF. For example, after L-serine has been synthesized, the reaction solution can be passed over activated carbon or an ion exchange column which collects and separates THF out of the L-serine solution produced. THF can then be released and neutralized. As a variant, THF can be modified by covalent attachment to a small molecule, for example a glucosamine, facilitating the isolation of the cofactor. After the L-serine has been synthesized, the reaction solution is passed through a borate column. The borate fixes only THFglucosamine and the modified THF can then be degassed and recycled.
Glycine and formaldehyde are preferably added to the mixture of tetrahydrofolate and SHMT. The amount of glycine that can be added varies with the pH, temperature and solvent conditions for the reaction, but can generally reach saturation.
<Desc / Clms Page number 9>
As already stated, formaldehyde can be highly toxic to SHMT. Consequently, formaldehyde is generally added slowly to the other constituents and its addition is regulated. Formaldehyde is added in an amount sufficient to maintain the enzymatic activity, generally so as to maintain a concentration of less than about 10 mM higher than the concentration of THF, although formaldehyde can be added to maintain a rising concentration up to about 50 mM above the THF concentration. The higher the THF concentration in the system, the higher the formaldehyde concentration can be kept, because THF reacts favorably with formaldehyde and thus protects the enzyme. The reaction mechanism of THF and formaldehyde has been described by Kallen, R. G., et al., J.
Biol. Chem. 241 (24) 5851-5863 (1966). Formaldehyde can be added all the more quickly to maintain the desired concentration as the activity of the enzyme is higher in the reactor.
The Applicant has also discovered that it may be advantageous to add a second SHMT cofactor, in this case pyridoxal-5'-phosphate, to the reagents. Pyridoxal-5'-phosphate is strongly linked to the enzyme. When L-serine is synthesized for a long time in a reactor, the pyridoxalphosphate may be lost or be inactivated, in which case an additional pyridoxalphosphate may be added. The loss of the cofactor during the synthesis results in the disappearance of the yellow color of the reaction solution and in the loss of activity of the serine hydroxymethyltransferase. The concentration of pyridoxalphosphate added to the reaction medium can range from 0 to about 20 mM, as required, and preferably from about 0.1 to about 1 mM.
<Desc / Clms Page number 10>
The addition of excess pyridoxalphosphate can provide an additional function. The Applicant has indeed discovered that in certain microorganisms which have been transformed by plasmids containing the glyA gene and which express high concentrations of SHMT, the addition of pyridoxal-5'-phosphate is necessary to saturate the SHMT in the presence and improve the enzyme activity observed. One such microorganism is Klebsiella aerogenes containing the plasmid pGx139 identified above.
The synthesis can be carried out in the presence of any non-harmful solvent. Examples of such solvents are ethanol, methanol, isopropanol and dioxane.
The following examples further illustrate the invention.
EXAMPLE 1. -
Strains of bacteria are cultivated with and without the plasmid pGx139 in LB medium (10 g per liter of Bacto tryptone, 5 g per liter of yeast extract and 5 g per liter of NaCL) or in minimal medium (10, 5 g per liter of K2HP04, 4.5 g per liter of KH2P04, 1.0 g per liter of (NH4) 2SO4 and 0.5 g per liter of sodium citrate dihydrate) added with 0.4% glucose or lactose. Amino acids up to 20 µg per ml and vitamins up to 1 µg per ml are added as indicated. The specific activity of the serine hydroxymethyltransferase is expressed in nanomoles of 3-phenylserine converted into benzaldehyde and glycine per minute and per mg of extractable protein after exposure of the cells to ultrasound.
The experiments are carried out in 50 mM phosphate buffer at pH 7.3 in the presence of 0.1 mM
EMI10.1
¯A-ph'nylserine at 20'C. pyridoxalphosphate and 35 mM enp-phenylserine e The appearance of benzaldehyde is monitored at 279 nm at
<Desc / Clms Page number 11>
using a recording spectrophotometer.
SHMT
Specific activity (nanomoles / minute / mg)
EMI11.1
<tb>
<tb> Strain <SEP> Plasmid <SEP> Medium <SEP> LB <SEP> Medium <SEP> Supplement
<tb> minimal
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698-39 <SEP> N. <SEP> D. <SEP> *
<tb> GX1671 <SEP> pGx139 <SEP> 221 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1703 <SEP> pGxl39 <SEP> 141 <SEP> 533 <SEP> glucose,
<tb> phenylalanine
<tb> thiamine
<tb> GX1703 <SEP> pGx122 <SEP> 218 <SEP> 682 <SEP> glucose,
<tb> phenylalanine
<tb> thiamine
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682-28 <SEP> 10 <SEP> glucose
<tb> tryptophan
<tb> 17 <SEP> lactose,
<tb> tryptophan
<tb> GX1682 <SEP> pGxl39 <SEP> 152 <SEP> 133 <SEP> glucose
<tb> tryptophan
<tb> 306 <SEP> lactose
<tb> tryptophan
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704-36 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
GX1704 <SEP> PGx139 <SEP> 590 <SEP> 114 <SEP> glucose
<tb> 223 <SEP> 108 <SEP> lactose
<tb>
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Strain <SEP> Genotype
<tb> E. <SEP> coli
<tb> GX1698 <SEP> trpEA, <SEP> tna <SEP> 2, <SEP> serB, <SEP> lacIq <SEP> ts <SEP> 402
<tb> GX1671 <SEP> thi, <SEP> ara, <SEP> strR, <SEP> glyA, <SEP> LI-serB <SEP> trp <SEP> laciql, <SEP>
<tb> lacZ <SEP>: <SEP>:
<SEP> tn5
<tb> GX1703 <SEP> glyA, <SEP> pheA, <SEP> thi, <SEP> lac, <SEP> ara, <SEP> strR
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> LT2
<tb> GX1682 <SEP> trpBEDC43 <SEP> F'lacIq <SEP> ts420 <SEP> pro
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes
<tb> GX1704 <SEP> lsd <SEP> (mutant <SEP> L-serine <SEP> deaminase)
<tb>
EMI12.2
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 10.5 <SEP> g / liter
<tb> KH2P04 <SEP> 4.5 <SEP> g / liter
<tb> (NH4) <SEP> 2SO4 <SEP> 1 <SEP> g / liter
<tb> Citrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> dihydrate <SEP> 0.5 <SEP> g / liter
<tb> Phenylalanine <SEP> 20 / ug / ml
<tb>
<Desc / Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> Vitamin <SEP> B1 <SEP> 1 <SEP> / ug / ml
<tb> Ampicillin <SEP> 100 <SEP> / ug / ml
<tb> MgSO4 <SEP> 2 <SEP> nM
<tb> FeSO4 <SEP> 5 <SEP> mg / ml
<tb>
EMI13.2
We use culture medium and use it as the source of the enzyme.
Glycine (12 mM in final concentration) is mixed with tetrahydrofolate (5 mM in
EMI13.3
Salmonella typhimurium LT2 final concentration), Klebsiella aerogenes of formaldehyde * not determined atmosphere
EMI13.4
phosphate buffer of the reaction mixture being 100 reaction above at 370th with stirring. After 8 hours, 5 mM serine is obtained (yield of 45 based on glycine). determines glycine and serine concentrations by high performance liquid chromatography.
EXAMPLE 3 A colony of the strain GX1704 from (containing pGx139) is introduced, which was deposited under n in 100 ml of culture medium II described below and the mixture is stirred at 300 ° overnight.
EMI13.5
<tb>
<tb> of <SEP> pyMilieu <SEP> of <SEP> culture <SEP> II
<tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g / liter
<tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g / liter <SEP>
<tb> Extract <SEP> from <SEP> yeast <SEP> 5 <SEP> g / liter <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> gjlitre
<tb>
The cells are collected by centrifugation from the culture medium and used as the source of the enzyme.
<Desc / Clms Page number 14>
The procedure described in Example 1 is followed for the production of serine, but by means of Klebsiella aerogenes instead of E. coli. After 8 hours, 7 mM serine is obtained (64% yield based on glycine). All the enzymatic activity persists.
EXAMPLE 4.-
The procedure of Example 1 is followed, but using partially purified serine hydroxymethyltransferase from E. coli (strain GX1703). The cells are ruptured by exposure to ultrasound at 4 ° C. The liquid which floats after centrifugation is mixed with ammonium sulphate (50% of saturation) at 4 ° C. and at pH 7.5. After separating the solids by centrifugation, the enzyme is extracted from the solution by increasing the ammonium sulfate content to 100% of the saturation. The enzyme is collected by centrifugation and dialysis. After 4 hours of reaction, 10 mM serine is obtained. The yield is 90% based on glycine. All the enzymatic activity is preserved.
EXAMPLE 5.-
The procedure of Example 3 is applied, the difference being that the glycine has an initial concentration of 340 mM and that formaldehyde is introduced (initial concentration 2 M) at a rate of 1 ml per hour. After 12 hours, 119 mM serine is obtained.
EXAMPLE 6.-
The procedure of Example 3 is followed, the difference being that glycine (initial concentration 2 M) and formaldehyde (initial concentration 2 M) are introduced at the same flow rate of 1 ml per hour. After 5 hours, 57 mM serine is obtained.
EXAMPLE 7.-
The procedure of Example 3 is applied
<Desc / Clms Page number 15>
by modifying the THF. Dextran (5 g, Pharmacia T40) is dissolved in water to a final concentration of 5%. The dextran in solution is oxidized using 0.1 M NaI04 for 1 hour at room temperature. The oxidized dextran is precipitated by addition of ethanol to 60% v / v. The operation is repeated twice. The oxidized dextran is dissolved in 100 ml of 0.2 M 1.6hexanediamine (HMD) at pH 9.0. Sodium borohydride (0.2 g) is added after 30 and 60 minutes, respectively. The mixture of 1,6-hexanediamine and dextran is dialyzed against water overnight and lyophilized. THF (5 mM) is mixed with
EMI15.1
10 millimoles of 1-ethyl-3-carbodiimide and 0.5 of HMD-dextran at pH 7.0 in a nitrogen atmosphere.
The resulting precipitate is collected by centrifugation, which is washed twice with a 0.5 M NaCl solution. The solid THF is mixed with the reaction mixture, as described in Example 3.
After 3 hours of reaction, 7 mM serine is obtained.