CH657373A5

CH657373A5 - ENZYMATIC SYNTHESIS OF L-SERINE.

Info

Publication number: CH657373A5
Application number: CH6225/83A
Authority: CH
Inventors: David Martin Anderson; Humg-Yu Hsiao; Ronald Lamont Somerville; Klaus Manfred Herrmann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-11-19
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1986-08-29
Also published as: FR2536415B1; PL244608A1; SE8306351D0; LU85096A1; IT8368213A0; FR2536415A1; DK529583A; DE3341763A1; CA1217158A; GB2130216B; FI834231A0; GB2130216A; ES527388A0; FI834231A; SE8306351L; IL70271A0; ZA838642B; ES8602128A1; NL8303978A; JPS59109187A

Description

so Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der Aminosäure L-Serin. Die Aminosäure L-Serin ist ein wertvolles Handelsprodukt, welches in der Hyperernährung und in Nährmitteln verwendet wird und auch als Zwischenprodukt oder Ausgansprodukt in gewissen 55 synthetischen Verfahren dient. Es besteht somit ein Bedarf an L-Serin, und verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um es herzustellen. Eine Anzahl dieser Verfahren umfasst die Erzeugung von L-Serin durch Fermentation. Siehe zum Beispiel Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45(6) 1419-24 60 (1981); Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45(6) 1425-1430 (1981). Ferner beschreibt die US-Patentschrift 3 616 224, erteilt an Shiio et al., (1971), ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Aminosäuren, einschliesslich Serin, durch Fermentation, bei welchem Stämme gewisser 65 Bakterien auf Medien gezüchtet werden, welche Methanol als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten. Siehe auch die US-Patentschrift 3 943 038, erteilt an Morinage et al. (1976), welches ein Verfahren zur Herstellung von Serin und The present invention relates to a method for producing the amino acid L-serine. The amino acid L-serine is a valuable commercial product which is used in hyper nutrition and in nutrients and also serves as an intermediate or starting product in certain 55 synthetic processes. There is therefore a need for L-serine and various methods have been developed to produce it. A number of these methods involve the production of L-serine by fermentation. See, for example, Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45 (6) 1419-24 60 (1981); Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45 (6) 1425-1430 (1981). Furthermore, U.S. Patent 3,616,224, issued to Shiio et al., (1971), describes a process for the production of various amino acids, including serine, by fermentation in which strains of certain 65 bacteria are grown on media which use methanol as a source of contain assimilable carbon. See also U.S. Patent 3,943,038 issued to Morinage et al. (1976), which describes a process for the production of serine and

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anderen Aminosäuren durch Züchten spezifischer Stämme verschiedener Bakterien in einem wässerigen Kulturmedium in Gegenwart von Sauerstoff, Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid offenbart. other amino acids by growing specific strains of various bacteria in an aqueous culture medium in the presence of oxygen, hydrogen and carbon dioxide.

In gemeinsamer Nachteil der bekannten Fermentationsmethoden besteht darin, dass die Konzentration an L-Serin, welches in der Brühe erzeugt wird und daraus gewonnen wird, verhältnismässig nieder ist, selbst nach verhältnismässig langen Fermentationen. A common disadvantage of the known fermentation methods is that the concentration of L-serine which is produced in the broth and is obtained therefrom is relatively low, even after relatively long fermentations.

Serin kann auch durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Kanedo (ed.), Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). Oft erzeugen diese chemischen Verfahren Serin in Form eines racemischen Gemisches der optischen D-und L-Isomeren oder in Form des weniger bevorzugten D-Isomers. DL-Gemische müssen aufgelöst werden mit Methoden, welche D-Serin verdauende Bakterien benötigen, Serin-Racemase, durch L-Aminosäureacylase, fraktionierte Kristallisation von Serin-Derivaten oder ähnlichen Methoden, wodurch die Kosten des Produktes erhöht werden. Serine can also be produced by chemical synthesis methods. See, for example, Kanedo (ed.), Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). These chemical processes often produce serine in the form of a racemic mixture of the optical D and L isomers or in the form of the less preferred D isomer. DL mixtures must be dissolved using methods that require D-serine digesting bacteria, serine racemase, by L-amino acid acylase, fractional crystallization of serine derivatives or similar methods, which increases the cost of the product.

Es ist bekannt, dass L-Serin aus Glycin hergestellt werden kann. Die biologische Erzeugung von L-Serin aus Glycin wurde mit verschiedenen Mikroorganismen durchgeführt. Siehe zum Beispiel Y. Tanaka et al., J. Ferment. Technol. 59:447 (1981). Wie bei den oben erwähnten Fermentationsverfahren besteht auch bei dieser Methode der Nachteil, dass die Ausbeute an L-Serin typischerweise nicht sehr hoch ist. It is known that L-serine can be made from glycine. The biological production of L-serine from glycine was carried out with various microorganisms. See, for example, Y. Tanaka et al., J. Ferment. Technol. 59: 447 (1981). As with the fermentation processes mentioned above, this method also has the disadvantage that the yield of L-serine is typically not very high.

Es besteht daher ein Bedarf für eine Methode zur Herstellung von L-Serin in hohen Ausbeuten. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Serin, in welchem Serin in hohen Konzentrationen in einer Lösung gebildet wird, aus welcher es wirksam gewonnen werden kann und welches chargenweise oder in einem immobilisierten System durchgeführt werden kann. There is therefore a need for a method for producing L-serine in high yields. An object of the present invention is therefore to develop a process for the production of L-serine, in which serine is formed in high concentrations in a solution, from which it can be obtained effectively and which can be carried out batchwise or in an immobilized system.

Es wurde gefunden, dass L-Serin aus Glycin und Formaldehyd in Gegenwart von biokatalytischen Mengen des Enzyms Serin-Hydroxymethyltransferase und des Cofaktors Tetrahydrofolat unter Serin erzeugenden Bedingungen wirksam hergestellt werden kann. Das Enzym kann in ganzen Zellen oder als roher Extrakt oder als gereinigtes Enzym vorhanden sein und kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen. It has been found that L-serine can be effectively prepared from glycine and formaldehyde in the presence of biocatalytic amounts of the enzyme serine hydroxymethyl transferase and the cofactor tetrahydrofolate under conditions which produce serine. The enzyme can be present in whole cells or as a crude extract or as a purified enzyme and can be in immobilized or non-immobilized form.

Es ist bekannt, dass das Enzym Serin-Hydroxymethyltransferase (im folgenden mit SHMT bezeichnet) die Spaltung von Serin zu Glycin in einer Reaktion, welche von den Cofak-toren Pyridoxal-5'-phosphat und Tetrahydrofolat abhängt, katalysiert. Die Reaktion ergibt Glycin und Methylentetra-hydrofolat. Siehe L. Schirck, Advances in Enzymology 53:83 (1982). Es wurde jetzt gefunden, dass das SHMT-Enzym wirksam als Biokatalysator verwendet werden kann, um L-Serin aus Glycin und Formaldehyd herzustellen. Die Reaktion erfolgt in Gegenwart des Cofaktors Tetrahydrofolat (im folgenden THF genannt). Die Quelle für das THF kann die Quelle für das SHMT sein, weil THF in Mikroorganismenzellen, welche SHMT enthalten, gefunden wird, oder das THF kann aus einer äusseren Quelle zugesetzt werden. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nur das optische L-Serin-Isomer ergibt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Ausstoss aus dem Reaktor nach vollendeter Reaktion nur Glycin und L-Serin enthält und kein komplexes Gemisch, wie dies in einer Fermentationsbrühe oder als Resultat einer chemischen Synthese zu erwarten wäre. The enzyme serine hydroxymethyl transferase (hereinafter referred to as SHMT) is known to catalyze the cleavage of serine to glycine in a reaction which depends on the cofactors pyridoxal-5'-phosphate and tetrahydrofolate. The reaction gives glycine and methylene tetra hydrofolate. See L. Schirck, Advances in Enzymology 53:83 (1982). It has now been found that the SHMT enzyme can be used effectively as a biocatalyst to produce L-serine from glycine and formaldehyde. The reaction takes place in the presence of the cofactor tetrahydrofolate (hereinafter referred to as THF). The source of the THF can be the source of the SHMT because THF is found in microorganism cells containing SHMT, or the THF can be added from an external source. An advantage of this method is that it only gives the optical L-serine isomer. Another advantage is that after the reaction is complete, the discharge from the reactor contains only glycine and L-serine and not a complex mixture, as would be expected in a fermentation broth or as a result of chemical synthesis.

Es ist überraschend, dass L-Serin aus Glycin und Formaldehyd synthetisiert werden kann, weil Formaldehyd dafür bekannt ist, chemisch mit Proteinen zu reagieren und die Inaktivierung von Enzymen zu verursachen. D. French et al., It is surprising that L-serine can be synthesized from glycine and formaldehyde because formaldehyde is known to react chemically with proteins and cause enzymes to be inactivated. D. French et al.,

Advances in Protein Chemistry, 2:277-335 (1945). In der Tat wird SHMT rasch durch Formaldehyd inaktiviert. Es wurde jedoch gefunden, dass das Enzym geschützt werden kann durch Zusatz eines Überschusses an Tetrahydrofolat zum s Reaktionsgemisch. Das THF reagiert mit dem Formaldehyd, wodurch das Enzym geschützt wird. Advances in Protein Chemistry, 2: 277-335 (1945). In fact, SHMT is quickly inactivated by formaldehyde. However, it has been found that the enzyme can be protected by adding an excess of tetrahydrofolate to the reaction mixture. The THF reacts with the formaldehyde, which protects the enzyme.

Eine chemische Modifikation von SHMT verleiht ebenfalls Stabilität und Schutz vor der Inaktivierung durch Formaldehyd. Beispielsweise wurde gefunden, dass die Reaktion io von Imidoestern mit Aminogruppen (siehe G. Means et al., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) an der Enzymoberfläche dem Enzym erlaubt, in Gegenwart von höheren Konzentrationen von Formaldehyd zu wirken als das nicht-modifizierte Enzym. A chemical modification of SHMT also provides stability and protection against inactivation by formaldehyde. For example, it has been found that the reaction of imido esters with amino groups (see G. Means et al., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) on the enzyme surface allows the enzyme to add in the presence of higher concentrations of formaldehyde act as the unmodified enzyme.

is Der enzymatische Weg, welcher wahrscheinlich für die Synthese von L-Serin aus Glycin zutrifft, ist im folgenden dargestellt: is The enzymatic route which is likely to apply to the synthesis of L-serine from glycine is shown below:

Formaldehyd + THF ^ ^ Methylen-THF Formaldehyde + THF ^ ^ methylene THF

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SHMT SHMT

Methylen - THF + Glycin < y L-Serin + THF Methylene - THF + glycine <y L-serine + THF

Vorzugsweise wird die Reaktion unter anaeroben Bedin-25 gungen, zum Beispiel in einer Stickstoffatmosphäre, durchgeführt, um die Oxidation des THF zu verhindern. The reaction is preferably carried out under anaerobic conditions, for example in a nitrogen atmosphere, in order to prevent the oxidation of the THF.

Die Substrate, das SHMT und der Cofaktor, THF, können in verschiedener Weise miteinander umgesetzt werden. Obwohl die Reihenfolge, in welcher die Reaktionsteil-30 nehmer und Katalysatoren zugesetzt werden, nicht kritisch ist, wird bevorzugt, dass das Glycin und das Formaldehyd langsam zum SHMT in Gegenwart von THF zugesetzt werden. Die Reaktion wird unter L-Serin erzeugenden Bedingungen durchgeführt. Wenn das E. coli-SHMT-Gen 35 (glyA) als Quelle für SHMT verwendet wird, umfassen diese Bedingungen im allgemeinen eine Reaktionstemperatur von etwa 4 bis etwa 60°C und ein pH im Bereich von etwa 4 bis etwa 11. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen umfassen die Ausführung der Reaktion bei einer Temperatur von etwa 40 20 bis etwa 45°C und einem pH von etwa 8,5. Wenn die Temperatur unter etwa 4°C liegt, wird die Reaktionszeit merklich verlängert, und wenn die Temperatur über etwa 60°C steigt, kann das Enzym denaturiert werden. Ebenso kann das Enzym bei einem pH unterhalb etwa 4 oder oberhalb etwa 11 45 inaktiviert werden. SHMT ist ein zentrales Enzym im Metabolismus von Mikroorganismen und höheren Organismen; es bestehen daher viele potentielle Quellen für dieses Enzym. Die Bereiche der Bedingungen, unter welchen die Reaktion zur Erzeugung von L-Serin durchgeführt wird, hängen von so der verwendeten Enzymquelle ab. Beispielsweise können Enzyme, welche aus den thermophilen Mikroorganismen erhalten werden, bei einer höheren Temperatur eingesetzt werden, als dies möglich ist, wenn E. coli die Enzymquelle bildet. The substrates, the SHMT and the cofactor, THF, can be reacted with one another in various ways. Although the order in which reactants and catalysts are added is not critical, it is preferred that the glycine and formaldehyde be added slowly to the SHMT in the presence of THF. The reaction is carried out under L-serine generating conditions. When the E. coli SHMT gene 35 (glyA) is used as a source of SHMT, these conditions generally include a reaction temperature of about 4 to about 60 ° C and a pH in the range of about 4 to about 11. The preferred reaction conditions include carrying out the reaction at a temperature of about 40 to about 45 ° C and a pH of about 8.5. If the temperature is below about 4 ° C, the reaction time is markedly increased, and if the temperature rises above about 60 ° C, the enzyme can be denatured. The enzyme can also be inactivated at a pH below about 4 or above about 11,45. SHMT is a central enzyme in the metabolism of microorganisms and higher organisms; there are therefore many potential sources for this enzyme. The ranges of the conditions under which the reaction for producing L-serine is carried out depend on the enzyme source used. For example, enzymes obtained from the thermophilic microorganisms can be used at a higher temperature than is possible when E. coli forms the enzyme source.

55 Die Serin-Hydroxymethyltransferase kann in der Form ganzer Zellen, eines rohen Extraktes oder als gereinigtes Enzym vorliegen. Das Enzym kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form verwendet werden. Das Enzym wird in Mengen eingesetzt, welche genügen, um die Reaktion 60 zu katalysieren. 55 The serine hydroxymethyltransferase can be in the form of whole cells, a crude extract or as a purified enzyme. The enzyme can be used in immobilized or non-immobilized form. The enzyme is used in amounts sufficient to catalyze reaction 60.

Das Enzym kann aus Mikroorganismen erhalten werden, welche unter Verwendung konventioneller genetischer Verfahren modifiziert wurden, um es in hohen Ausbeuten zu ergeben. Siehe G. Stauffer et al., Gene, 15:63-72 (1981). Das es SHMT -Gen (glyA) kann isoliert und in ein Plasmid geklont werden, welches sodann verwendet wird, um geeignete Wirtszellen umzuwandeln, wobei ein hoher Grad an SHMT-Expression erzielt wird. Mutante Mikroorganismen, welche The enzyme can be obtained from microorganisms which have been modified using conventional genetic methods to give it in high yields. See G. Stauffer et al., Gene, 15: 63-72 (1981). The SHMT gene (glyA) can be isolated and cloned into a plasmid, which is then used to convert suitable host cells, achieving a high level of SHMT expression. Mutant microorganisms which

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bezüglich ihres Methioninmetabolismus modifiziert wurden, überproduzieren SHMT ebenfalls. Siehe G. V. Stauffer und J. E. Brenchley, Genetics 88,221 (1978) sowie G. V. Stauffer und J. E. Brenchley, J. Bacteriol., 129,740 (1977). Unter Verwendung von Gen-Klonierungstechniken wurde die Enzym-Aktivität bis zum Zwanzigfachen erhöht, und sie kann mehr als 10% des löslichen Proteins der Zelle darstellen. Ein E. coli-Stamm (GX1703), mit einem solchen Plasmid umgewandelt, genauer gesagt einem Derivat von pBR322, in welches das glyA-Gen geklont wurde, nämlich pGx 122, wurde am 22. Okt. 1982 als NRRL No. B-l 5215 im Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt. Ein Klebsiella-aerogenes-Stamm (GX1704), welcher mit einem ähnlichen, aber kleineren Plasmid mit einer Änderung, welche eine hohe Kopiezahl bewirkt, nämlich pGX 139, umgewandelt wurde, wurde am 22. Oktober 1982 als ATCC No. 39214 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt und ein Salmonella-typhimurium -Stamm (GX1682), welcher mit pGx 139 umgewandetl wurde, wurde am 22. Oktober 1982 in derselben Stelle als ATCC NO. 39215 hinterlegt. modified for their methionine metabolism, SHMT also overproduce. See G.V. Stauffer and J.E. Brenchley, Genetics 88, 221 (1978) and G.V. Stauffer and J.E. Brenchley, J. Bacteriol., 129.740 (1977). Using gene cloning techniques, enzyme activity has been increased up to 20-fold and can represent more than 10% of the cell's soluble protein. An E. coli strain (GX1703) converted with such a plasmid, more specifically a derivative of pBR322, into which the glyA gene was cloned, namely pGx 122, was published on October 22, 1982 as NRRL No. B-l 5215 in the Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois 61604, USA. A Klebsiella aerogenes strain (GX1704), which was converted with a similar but smaller plasmid with a change that causes a high copy number, namely pGX 139, was published on October 22, 1982 as ATCC No. 39214 with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, and a Salmonella typhimurium strain (GX1682), which was converted with pGx 139, was registered on October 22, 1982 in the same place as ATCC NO . 39215 deposited.

Wenn das Gen von einer Quelle, wie E. coli entnommen wird, kann es ferner durch willkürliche Mutagenese oder durch stellengerichtete Mutagenese modifiziert werden, um ein Enzym mit verbesserter Stabilität zu ergeben. Das Gen kann aber auch vollständig chemisch synthetisiert werden mit mehrfachen Änderungen, um die Stabilität des Enzyms während des vorliegenden Verfahrens zu verbessern. Further, when the gene is taken from a source such as E. coli, it can be modified by arbitrary mutagenesis or by site-directed mutagenesis to give an enzyme with improved stability. However, the gene can also be completely chemically synthesized with multiple changes to improve the stability of the enzyme during the present process.

Die Verwendung ganzer Zellen kann eine Quelle für THF ergeben. Falls gewünscht, kann zusätzliches THF zugesetzt werden, um Sättigungsspiegel zu erreichen, welche vom pH und der Temperatur abhängen. Beispielsweise kann bei einem pH von etwa 7,5 und einer Reaktionstemperatur von etwa 37°C in einer wässerigen Lösung THF zugesetzt werden, um eine Konzentration von wesentlich über 50 mM pro Liter zu erreichen. Das pH muss angepasst werden, während sich das THF auflöst. Wenn das SHMT entweder als roher Extrakt oder als gereinigtes Enzym zugesetzt wird, wird eine unabhängige Quelle für THF benötigt. Die Menge an THF, welche zugesetzt werden kann, variiert mit der Temperatur, den Lösungsmittelbedingungen und dem pH, bei welchen die Reaktion durchgeführt wird. Using whole cells can provide a source of THF. If desired, additional THF can be added to achieve saturation levels that depend on pH and temperature. For example, at a pH of about 7.5 and a reaction temperature of about 37 ° C, THF can be added in an aqueous solution in order to achieve a concentration of well over 50 mM per liter. The pH needs to be adjusted as the THF dissolves. If the SHMT is added either as a crude extract or as a purified enzyme, an independent source of THF is needed. The amount of THF that can be added varies with the temperature, solvent conditions and pH at which the reaction is carried out.

Es wurde festgestellt, dass THF seine Aktivität gegenüber SHMT beibehält, wenn es immobilisiert ist. Die Immobilisierung des THF durch Bindung desselben an einen Träger, welcher innerhalb eines zur Durchführung der Reaktion verwendeten Bioreaktors zurückgehalten werden kann, ist vorteilhaft, weil es den wiederholten Gebrauch des Cofaktors nach Beendigung der Synthese des L-Serins erleichtert. Beispielsweise kann THF mit löslichen Polymeren immobilisiert werden, wie Dextran, Polyäthylenglykol oder Polyäthylen-imin. Die Immobilisierung erfolgt über covalente Bindung in den ersten zwei Fällen und durch ionische Interaktion im dritten Fall. Covalente Bindung erfolgt im allgemeinen über die Carboxygruppen des THF mit einer Aminogruppe des Trägers. Unter Verwendung ähnlicher Bindungsmethoden kann aber das THF auch an einen unlöslichen Träger gebunden werden. THF was found to retain its activity against SHMT when immobilized. Immobilization of the THF by binding it to a support which can be retained within a bioreactor used to carry out the reaction is advantageous because it facilitates repeated use of the cofactor after the L-serine synthesis is complete. For example, THF can be immobilized with soluble polymers, such as dextran, polyethylene glycol or polyethylene imine. Immobilization takes place via covalent binding in the first two cases and through ionic interaction in the third case. Covalent bonding generally takes place via the carboxy groups of the THF with an amino group of the support. However, using similar binding methods, the THF can also be bound to an insoluble carrier.

Wenn Serin in einem chargenweisen Verfahren synthetisiert wird, ist es andererseits auch möglich, das THF zu recy-clisieren. Beispielsweise kann die Reaktionslösung, nachdem das L-Serin synthetisiert worden ist, durch eine Aktivkohleoder Ionenaustauschersäule geführt werden, welche das THF von der L-Serin-Produktlösung zurückhält und trennt. Das THF kann sodann freigesetzt und neutralisiert werden. Das THF kann aber auch durch covalente Bindung an ein kleines Molekül, wie ein Glucosamin, modifiziert werden, um die On the other hand, if serine is synthesized in a batch process, it is also possible to recycle the THF. For example, after the L-serine has been synthesized, the reaction solution can be passed through an activated carbon or ion exchange column which retains and separates the THF from the L-serine product solution. The THF can then be released and neutralized. However, the THF can also be modified by covalent binding to a small molecule, such as a glucosamine, in order to

Rückgewinnung des Cofaktors zu erleichtern. Nachdem das L-Serin synthetisiert worden ist, kann die Reaktionslösung über eine Boratsäule geführt werden. Das Borat bindet nur das THF-Glucosamin, und das modifizierte THF kann freigesetzt und wieder zurückgeführt werden. Facilitate recovery of the cofactor. After the L-serine has been synthesized, the reaction solution can be passed over a borate column. The borate only binds the THF-glucosamine, and the modified THF can be released and recycled.

Glycin und Formaldehyd werden vorzugsweise zu dem Tetrahydrofolat-SHMT-Gemisch zugesetzt. Die Menge an Glycin, welche zugesetzt werden kann, variiert mit dem pH, der Temperatur und den Lösungsmittelbedingungen der Reaktion, doch kann es im allgemeinen zugesetzt werden, bis das Sättigungsniveau erreicht ist. Glycine and formaldehyde are preferably added to the tetrahydrofolate-SHMT mixture. The amount of glycine that can be added varies with the pH, temperature, and solvent conditions of the reaction, but it can generally be added until the saturation level is reached.

Wie oben erwähnt, kann Formaldehyd für SHMT hochtoxisch sein. Das Formaldehyd wird daher im allgemeinen langsam zu den übrigen Komponenten zugesetzt, und sein Zusatz wird reguliert. Das Formaldehyd wird in genügender Menge zugesetzt, um die enzymatische Aktivität beizubehalten, im allgemeinen um eine Konzentration von weniger als etwa 10 mM pro Liter höher als die verwendete THF -Konzentration aufrechtzuerhalten, doch kann der Formaldehyd in einer Menge zugesetzt werden, um eine Konzentration bis zu etwa 50 mM pro Liter über der verwendeten THF -Konzentration aufrechtzuerhalten. Je höher die Konzentration an THF im System ist, um so höher kann die Formaldehydkonzentration gehalten werden, weil das THF günstig mit dem Formaldehyd reagiert, wodurch das Enzym geschützt wird. Der Mechanismus der Reaktion von THF und Formaldehyd ist durch R. G. Kallen et al., J. Biol. Chem. 241 (24), 5851-588863 (1966) beschrieben. Je grösser die Enzymaktivität im Reaktor ist, um so schneller wird das Formaldehyd zugesetzt, um die gewünschte Konzentration beizubehalten. As mentioned above, formaldehyde can be highly toxic to SHMT. The formaldehyde is therefore generally added slowly to the other components and its addition is regulated. The formaldehyde is added in an amount sufficient to maintain the enzymatic activity, generally to maintain a concentration less than about 10mM per liter higher than the THF concentration used, but the formaldehyde can be added in an amount to a concentration up to up to about 50 mM per liter above the THF concentration used. The higher the concentration of THF in the system, the higher the formaldehyde concentration can be kept, because the THF reacts favorably with the formaldehyde, which protects the enzyme. The mechanism of the reaction of THF and formaldehyde is described by R.G. Kallen et al., J. Biol. Chem. 241 (24), 5851-588863 (1966). The greater the enzyme activity in the reactor, the faster the formaldehyde is added in order to maintain the desired concentration.

Es wurde ferner festgestellt, das es vorteilhaft sein kann, einen zweiten SHMT-Cofaktor, nämlich Pyridoxal-5'-phos-phat, zu den Reaktionsteilnehmern zuzusetzen. Pyridoxal-5'-phosphat wird fest an das Enzym gebunden. Wenn L-Serin in einem Reaktor über eine ausgedehnte Zeit synthetisiert wird, kann das Pyridoxalphosphat verlorengehen oder inaktiviert werden, in welchem Fall zusätzliches Pyridoxalphosphat zugesetzt werden kann. Der Verlust des Cofaktors während der Synthese wird angezeigt durch den Verlust an Aktivität durch die Serin-Hydroxymethyltransferase. Die Konzentration an dem der Reaktion zugesetzten Pyridoxalphosphat kann zwischen 0 bis etwa 20 mM pro Liter variieren, je nach Bedarf, und beträgt vorzugsweise etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM pro Liter. It has also been found that it may be advantageous to add a second SHMT cofactor, namely pyridoxal-5'-phosphate, to the reactants. Pyridoxal-5'-phosphate is firmly bound to the enzyme. If L-serine is synthesized in a reactor for an extended period of time, the pyridoxal phosphate can be lost or inactivated, in which case additional pyridoxal phosphate can be added. The loss of the cofactor during synthesis is indicated by the loss of activity by the serine hydroxymethyl transferase. The concentration of the pyridoxal phosphate added to the reaction can vary from 0 to about 20 mM per liter as needed, and is preferably from about 0.1 mM to about 1 mM per liter.

Der Zusatz von überschüssigem Pyridoxalphosphat kann einer zusätzlichen Funktion dienen. Es wurde festgestellt, dass in einigen Mikroorganismen, welche durch Plasmide, welche das glyA-Gen enthalten und welche hohe SHMT -Niveaux ausdrücken, der Zusatz von Pyridoxal-5'-phosphat notwendig ist, um das vorhandene SHMT zu sättigen und die beobachtete Enzymaktivität zu erhöhen. Ein solcher Mikroorganismus ist Klebsiella aerogenes, welches das oben identifizierte Plasmid pGx 139 enthält. The addition of excess pyridoxal phosphate can serve an additional function. It has been found that in some microorganisms which express plasmids which contain the glyA gene and which express high levels of SHMT, the addition of pyridoxal-5'-phosphate is necessary in order to saturate the SHMT present and the observed enzyme activity increase. One such microorganism is Klebsiella aerogenes, which contains the plasmid pGx 139 identified above.

Die Synthesereaktion kann in Gegenwart von jedem nichtschädlichen Lösungsmittel durchgeführt werden. Beispiele solcher Lösungsmittel umfassen Äthanol, Methanol, Isopro-panol und Dioxan. Die folgenden Beispiele sind zur weiteren Illustrierung der vorliegenden Erfindung bestimmt. The synthesis reaction can be carried out in the presence of any non-harmful solvent. Examples of such solvents include ethanol, methanol, isopropanol, and dioxane. The following examples are intended to further illustrate the present invention.

Beispiel 1 example 1

Bakterienstämme mit und ohne Plasmid pGx 139 wurden in LB-Medium (10 g/Liter Bactotrypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl) oder Minimalmedium (10,5 g/Liter K2HPO4,4,5 g/Liter KH2PO4,1,0 g/Liter (NH4)2S04 und 0,5 g/Liter Natriumcitrat.2H20), unter Zusatz von 0,4% Glucose oder Lactose gezüchtet. Aminosäuren wurden in einer Menge von 20 ng/ml und Vitamine in einer Menge von 1 ng/ml zugesetzt, wo dies zweckmässig war. Die spezifische Bacterial strains with and without plasmid pGx 139 were in LB medium (10 g / liter bactotrypton, 5 g / liter yeast extract, 5 g / liter NaCl) or minimal medium (10.5 g / liter K2HPO4.4.5 g / liter KH2PO4, 1.0 g / liter (NH4) 2S04 and 0.5 g / liter sodium citrate. 2H20), grown with the addition of 0.4% glucose or lactose. Amino acids were added in an amount of 20 ng / ml and vitamins in an amount of 1 ng / ml where appropriate. The specific

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Aktivität der Serin-Hydroxymethyltransferase wird als nMol KH2PO4 Activity of serine hydroxymethyltransferase is called nMol KH2PO4

ß-Phenylserin, das in Benzaldehyd und Glycin umgewandelt (NH4)2S04 ß-phenylserine, which is converted into benzaldehyde and glycine (NH4) 2S04

wurde, pro Minute pro Milligramm extrahierbarem Protein Natriumeitrat ■ was, per minute per milligram of extractable protein sodium citrate

nach Beschallung der Zellen ausgedrückt. Phenylalanin after sonicating the cells. Phenylalanine

Die Versuche erfolgten in 50 mM pro Liter Phosphatpuffer 5 Vitamin Bi bei pH 7,3 mit 0,1 mM pro Liter Pyridoxalphosphat und bei Ampicillin The experiments were carried out in 50 mM per liter phosphate buffer 5 vitamin Bi at pH 7.3 with 0.1 mM per liter pyridoxal phosphate and with ampicillin

35 mM pro Liter ß-Phenylserin bei 20°C. Das Auftreten von MgSCk 35 mM per liter of ß-phenylserine at 20 ° C. The appearance of MgSCk

Benzaldehyd wurde bei 279 nM in einem aufzeichnenden FeSoi Spektrophotometer überwacht. Benzaldehyde was monitored at 279 nM in a FeSoi recording spectrophotometer.

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2H2O 2H2O

4,5 g/Liter 1,0 g/Liter 0,5 g/Liter 20 ng/ml 4.5 g / liter 1.0 g / liter 0.5 g / liter 20 ng / ml

1 (ig/ml 100 [ig/ml 1 (ig / ml 100 [ig / ml

2 mM/Liter 5 mg/ml 2 mM / liter 5 mg / ml

SHMT SHMT

Spezifische Aktivität (nMol/Minuten/mg) Specific activity (nmoles / minutes / mg)

Stamm tribe

Plasmid Plasmid

LB- LB-

Medium medium

Minimai-Medium Minimai medium

Zusatz additive

E. coli E. coli

GX1698 GX1698

- -

39 39

N.D.* N.D. *

GX 1671 GX 1671

pGx 139 pGx 139

221 221

N.D. N.D.

GX1703 GX1703

pGx 139 pGx 139

141 141

533 533

Glukose Glucose

Phenylalanin Phenylalanine

Thiamin Thiamine

GX1703 GX1703

pGx 122 pGx 122

218 218

682 682

Glucose glucose

Phenylalanin Phenylalanine

Thiamin Thiamine

Salmonella typhimurium LT2 Salmonella typhimurium LT2

GX1682 GX1682

28 28

10 17 10 17

Glucose Tryptophan Lactose Tryptophan Glucose tryptophan lactose tryptophan

GX1682 GX1682

pGx 139 pGx 139

152 152

133 306 133 306

Glucose Tryptophan Lactose Tryptophan Glucose tryptophan lactose tryptophan

Klebsiella aerogenes Klebsiella aerogenes

GX1704 GX1704

- -

36 36

N.V. N.V.

GX1704 GX1704

pGx 139 pGx 139

590 590

114 114

Glucose glucose

223 223

108 108

Lactose Lactose

Stamm tribe

Genotyp genotype

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren des Zellkulturmediums gesammelt und als Enzymquelle verwendet. Glycin (12 mM, Endkonzentration) wurde mit Tetrahydrofolat (5 mM, Endkonzentration), Pyridoxalphosphat (1 mM) und Formaldehyd ( 10 mM Endkonzentration) unter einer Stick-is stoffdecke vermischt. Das pH wurde mit 0,1M Kaliumphosphatpuffer auf 7,6 gehalten, und das Endvolumen dieses Reaktionsgemisches betrug 100 ml.Die Reaktion wurde in Gang gesetzt durch Vermischen der oben genannten Reaktionslösung und der Zellen bei 37°C unter Schütteln. Nach 20 8 Stunden waren 5 mM Serin erzeugt (die Ausbeute betrug 45%, berechnet auf das Glycin). Die gesamte Enzymaktivität war noch vorhanden. Die Konzentration an Glycin und Serin wurde unter Verwendung der Hochleistungsflüssig-Chromatographie bestimmt. The cells were collected by centrifuging the cell culture medium and used as an enzyme source. Glycine (12 mM, final concentration) was mixed with tetrahydrofolate (5 mM, final concentration), pyridoxal phosphate (1 mM) and formaldehyde (10 mM final concentration) under a nitrogen blanket. The pH was kept at 7.6 with 0.1M potassium phosphate buffer and the final volume of this reaction mixture was 100 ml. The reaction was started by mixing the above reaction solution and the cells at 37 ° C with shaking. After 20 8 hours, 5 mM serine had been generated (the yield was 45%, calculated on the glycine). All enzyme activity was still present. The concentration of glycine and serine was determined using high performance liquid chromatography.

25 25th

Beispiel 3 Example 3

Eine Kolonie von Klebsiella aerogenes, Stamm GX1704 (enthaltend pGxl39), welcher als ATCC No. 39214 hinterlegt ist, wurde in 100 ml des unten beschriebenen Kulturme-30 diums I eingeimpft und bei 30°C über Nacht geschüttelt. A colony of Klebsiella aerogenes, strain GX1704 (containing pGxl39), which as ATCC No. 39214 is deposited, was inoculated into 100 ml of the culture medium described below and shaken at 30 ° C. overnight.

Kulturmedium II Trypton NaCl 35 Hefeextrakt Glucose lOg/Liter 10g/Liter 5 g/Liter 10g/Liter Culture medium II Trypton NaCl 35 yeast extract glucose 10 g / liter 10 g / liter 5 g / liter 10 g / liter

E. coli E. coli

GX 1698 trpEA, tna2, serB, laclq ts 402 GX 1671 thi, ara, strR, GlyA, [serB trpR], laclql, LacZ : tn5 GX 1698 trpEA, tna2, serB, laclq ts 402 GX 1671 thi, ara, strR, GlyA, [serB trpR], laclql, LacZ: tn5

GX1703 glyA, pheA, thi, lac, ara, strR GX1703 glyA, pheA, thi, lac, ara, strR

Salmonella typhimurium LT2 GX1682 trpBEDC43 F' laclq ts420 pro Salmonella typhimurium LT2 GX1682 trpBEDC43 F 'laclq ts420 pro

Klebsiella aerogenes Klebsiella aerogenes

GX1704 lsd (L-Serin-Deaminase-Mutant) GX1704 lsd (L-serine deaminase mutant)

* nicht bestimmt * not determined

E.-coli-Stamm GX 1671, welcher Plasmid pGx 139 enthält, ist ein repräsentativer zusätzlicher Stamm, welcher verwendet wurde als Quelle für SHMT in dem erfindungsgemässen Verfahren. E. coli strain GX 1671, which contains plasmid pGx 139, is a representative additional strain which was used as a source for SHMT in the method according to the invention.

Beispiel 2 Example 2

Eine Kolonie von Escherichia coli, Stamm GX1703 (enthaltend pGx 122), welcher als NRRLNo. B-15215 hinterlegt ist, wurde in 100 ml Kulturmedium I, welches unten beschrieben ist, eingeimpft und bei 37°C über Nacht geschüttelt. A colony of Escherichia coli, strain GX1703 (containing pGx 122), which as NRRLNo. B-15215 is deposited, was inoculated into 100 ml of culture medium I, which is described below, and shaken at 37 ° C. overnight.

Kulturmedium I K2HPO4 Culture medium I K2HPO4

10,5 g/Liter 10.5 g / liter

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren des Zellkulturme-40 diums gesammelt und als Enzymquelle verwendet. The cells were collected by centrifuging the cell culture medium and used as an enzyme source.

Das Verfahren nach Beispiel 2 für die Serin-Erzeugung wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Klebsiella aeo-genes anstelle von E. coli verwendet wurde. Nach 8 Stunden waren 7 mM Serin erzeugt (die Ausbeute betrug 64% 45 berechnet auf Glycin). Die ganze Enzymaktivität war noch vorhanden. The procedure of Example 2 for serine production was repeated, except that Klebsiella aeo-genes was used instead of E. coli. After 8 hours, 7 mM serine had been generated (the yield was 64% 45 calculated on glycine). All enzyme activity was still present.

Beispiel 4 Example 4

Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt, mit Aus-50 nähme, dass partiell gereinigte Serin-Hydroxymethyltransferase aus E. coli (Stamm GX1703) verwendet wurde. Die Zellen wurden durch Beschallung bei 4°C gebrochen. Die nach dem Zentrifugieren gesammelte überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat (50%ige Sättigung) bei 4°C 55 und pH 7,5 vermischt. Nach Entfernung der Feststoffe durch Zentrifugieren wurde das Enzym aus der Lösung auszutreten gezwungen durch Erhöhung des Ammoniumsulfatgehaltes auf 100%ige Sättigung. Das Enzym wurde durch Zentrifugieren gesammelt und dialysiert. 10 mM Serin wurden nach «o 4 Stunden Reaktionszeit erzeugt. Die Ausbeute betrug 90%, bezogen auf Glycin. Die ganze enzymatische Aktivität war noch vorhanden. The procedure according to Example 2 was repeated, except that partially purified serine hydroxymethyltransferase from E. coli (strain GX1703) was used. The cells were broken by sonication at 4 ° C. The supernatant liquid collected after centrifugation was mixed with ammonium sulfate (50% saturation) at 4 ° C 55 and pH 7.5. After removing the solids by centrifugation, the enzyme was forced to exit the solution by increasing the ammonium sulfate content to 100% saturation. The enzyme was collected by centrifugation and dialyzed. 10 mM serine was generated after a reaction time of 4 hours. The yield was 90% based on glycine. All the enzymatic activity was still there.

Beispiel 5 Example 5

65 Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die anfängliche Glycinkonzentration 340 mM betrug und Formaldehyd (ursprüngliche Konzentration 2M) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Stunde ein- 65 The procedure of Example 3 was repeated, except that the initial glycine concentration was 340 mM and formaldehyde (original concentration 2M) was added at a rate of 1 ml per hour.

657373 657373

geführt wurde. Nach 12 Stunden waren 119 mM Serin erzeugt worden. was led. After 12 hours, 119 mM serine had been generated.

Beispiel 6 Example 6

Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Glycin (ursprüngliche Konzentration von 2M) und Formaldehyd (ursprüngliche Konzentation von 2M) in derselben Geschwindigkeit von 1 ml pro Stunde eingeführt wurden. Nach 5 Stunden waren 57 mM Serin erzeugt worden. The procedure of Example 3 was repeated except that glycine (original concentration of 2M) and formaldehyde (original concentration of 2M) were introduced at the same rate of 1 ml per hour. After 5 hours, 57 mM serine had been generated.

Beispiel 7 Example 7

Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass THF modifiziert wurde. Dextran (5 g, Pharmacia T40) wurde in Wasser auf eine Endkonzentration von 5% aufgelöst. Die Dextranlösung wurde mit 0,1 M NaIÛ4 während 1 Stunde bei Zimmertemperatur oxidiert. Das oxidierte Dextran wurde durch Zusatz von Äthanol auf 60% (Volumen/Volumen) ausgefällt. Diese Stufe wurde zweimal wiederholt. Das oxidierte Dextran wurde sodann in 100 ml s 0,2 M 1,6-Hecandiamin (HMD) bei pH 9,0 aufgelöst. Natriumborhydrid (0,2 g) wurde nach 30 Minuten und nach 60 Minuten zugesetzt. Das HMD-Dextran wurde über Nacht gegen Wasser dialysiert und sodann lyophilisiert. THF (5 mM) wurde mit 10 mM l-Äthyl-3-63-dimethylamino-lo propyl)-carbodiimid und 0,5% HMD-Dextran bei pH 7,0 unter Stickstoffatmosphäre vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und zweimal mit 0,5 M NaCl-Lösung gewaschen. Das fest THF wurde mit dem Reaktionsgemisch vermischt, wie in Beispiel 3 ls beschrieben. Nach dreistündiger Reaktion waren 7 mM Serin erzeugt worden. The procedure of Example 3 was repeated, except that THF was modified. Dextran (5 g, Pharmacia T40) was dissolved in water to a final concentration of 5%. The dextran solution was oxidized with 0.1 M NaIÛ4 for 1 hour at room temperature. The oxidized dextran was precipitated to 60% (volume / volume) by adding ethanol. This step was repeated twice. The oxidized dextran was then dissolved in 100 ml of 0.2 M 1,6-hecanediamine (HMD) at pH 9.0. Sodium borohydride (0.2 g) was added after 30 minutes and after 60 minutes. The HMD dextran was dialyzed against water overnight and then lyophilized. THF (5 mM) was mixed with 10 mM 1-ethyl-3-63-dimethylamino-lo propyl) carbodiimide and 0.5% HMD-dextran at pH 7.0 under a nitrogen atmosphere. The precipitate formed was collected by centrifugation and washed twice with 0.5 M NaCl solution. The solid THF was mixed with the reaction mixture as described in Example 3 ls. After three hours of reaction, 7 mM serine had been generated.

B B

Claims

657 373

PATENT CLAIMS

1. A process for the preparation of L-serine, characterized in that glycine and formaldehyde are reacted in the presence of biocatalytic amounts of serine hydroxymethyltransferase and tetrahydrofolate under conditions which produce LrSerin.

2. The method according to claim 1, characterized in that the temperature is kept at 4 ° to 60 ° C and the pH in the range of 4 to 11.

3. The method according to claim 2, characterized in that the temperature is in the range from 20 ° to 45 ° C and the pH is in the range from 6 to 8.5.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the serine hydroxymethyl transferase is contained in whole cells.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the serine hydroxymethyl transferase is used in the form of a crude extract.

6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the serine hydroxymethyl trans-ferase is used in the form of a purified enzyme.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the serine hydroxymethyl transferase is immobilized.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the reaction is carried out in batches.

9. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the reaction is carried out continuously.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the source of tetrahydrofolate consists of whole microbial cells which contain serine hydroxy methyl transferase.

Process according to claim 10, characterized in that additional tetrahydrofolate is added to the reaction system in order to increase the tetrahydrofolate concentration to a maximum of the saturation level.

12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the concentration of tetrahydrofolate is in the range of 0.15 to 50 mM per liter.

13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the tetrahydrofolate is immobilized.

14. The method according to claim 13, characterized in that the tetrahydrofolate is immobilized with a soluble polymer.

15. The method according to claim 13, characterized in that the tetrahydrofolate is immobilized by binding to a solid base.

16. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the tetrahydrofolate is modified in such a way that it can be recycled.

17. The method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that glycine is added until the reaction solution is saturated with glycine.

18. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized in that formaldehyde is added up to a maximum concentration of 30 mM to 50 mM per liter higher than the tetrahydrofolate concentration.

19. The method according to claim 18, characterized in that the concentration of formaldehyde is brought to a constant value of about 10 mM per liter above that of the concentration of tetrahydrofolate.

20. The method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that pyridoxal phosphate is added to the reactants in a concentration of up to 20 mM per liter.

21. The method according to claim 20, characterized in that the pyridoxal phosphate concentration is in the range of 0.1 to 1.0 mM per liter.

22. The method according to any one of claims 1 to 21,

s characterized in that the source of serine hydroxymethyltransferase is Escherichia coli strain GX1703, which contains plasmid pGx 122, deposited in the Northern Regional Research Laboratory as NRRLNo. B-15215.

23. The method according to any one of claims 1 to 21,

io characterized in that the source of serine hydroxy

methyltransferase Salmonella typhimurium strain GX1682, which contains plasmid pGxl39, deposited in the American Type Culture Collection as ATCC No. 39215.

24. The method according to any one of claims 1 to 21,

i5 characterized in that the source of serine hydroxy

methyltransferase Klebsiella aerogenic strain GX1704, which contains plasmid pGxl39, is deposited in the American Type Cultur Collection as ATCC No. 39214.

25. The method according to any one of claims 1 to 24,

20 characterized in that a serine hydroxymethyl

transferase is used, whose activity in cells has been increased by genetic manipulation.

26. The method according to any one of claims 1 to 24, characterized in that a serine hydroxymethyl

25 transferase is used, the activity of which was increased in cells by cloning the serine hydroxymethyltransferase gene into a plasmid and converting a host cell with this plasmid to overproduce the serine hydroxymethyltransferase.

27. The method according to claim 1, characterized in that the serine hydroxymethyltransferase was obtained from any biological source.

28. The method according to any one of claims 25 or 26, characterized in that the serine hydroxymethyl

35 transferase gene was changed by arbitrary mutagenesis or site-directed mutagenesis to increase the stability of the enzyme.

29. The method according to any one of claims 1 to 21, characterized in that the serine hydroxymethyl

40 transferase enzyme is chemically modified to increase enzyme stability.

30. The method according to claim 29, characterized in that the enzyme is modified by reaction with imido esters.

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