DE10220234B4 - Processes and microorganisms for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols - Google Patents

Processes and microorganisms for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols Download PDF

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Abstract

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen unter Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird und diese Mikroorganismen eingesetzt werden.Process for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols using microorganisms in which the pyruvate dehydrogenase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase are inactivated and / or have a reduced activity, characterized in that the D-lactate Dehydrogenase is turned off and these microorganisms are used.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen.The invention relates to a method and microorganisms for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols.

Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d. h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikrobielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabilisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S)-Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, J. E.; Gavagan J. E.; Payne, M. S.; Anton D. L. (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223–232; US-Patent 5 538 875 A ). Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H2O2 wird durch endogene Katalase zu H2O und O2 umgesetzt. Mit diesem Prozess konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S)-Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B. A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems an nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9: 253–258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R)-lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191–203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat-Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden.A classic method of producing pyruvate (the pyruvic acid salt) is pyrolysis (ie, burning) of racemic acid. It requires heavy metals and temperatures of about 200 ° C (Römp Chemie Lexikon, 1995). Furthermore, the following microbial processes for pyruvate synthesis from lactate are known: production of pyruvate from lactate with permeabilized cells of the methylotrophic yeasts Hansenula polymorpha or Pichia pastoris expressing the gene for the (S) -hydroxy acid oxidase from spinach (DiCosimo, R .; Eisenberg, A., Seip, JE; Gavagan JE; Payne, MS; Anton DL (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223-232; U.S. Patent 5,538,875 A ). The formed in the lactate oxidation H 2 O 2 is converted by endogenous catalase to H 2 O and O 2 . With this process, a 1 M solution of sodium or ammonium lactate could be converted to more than 98% in pyruvate. In addition, the possibility for cell-free oxidation of lactate to pyruvate with immobilized (S) -hydroxy acid oxidase and catalase is known (Burdick, BA, Schaeffer, JR (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production, Biotechnol. Lett 9: 253-258). Another method is the conversion of lactate to pyruvate with quiescent, anaerobically grown cells of Proteus mirabilis or Proteus vulgaris (Simon, H., Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvates from (R) -lactates with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). With this system, a 0.65 M lactate solution in 1 h to 94% in pyruvate could be implemented.

Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzierten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155–159). Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed-Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705–711) und Escherichia coli beschrieben (Yokota A.; Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638–643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an F1-ATPase-defective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2164–2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N.; Hayashi, C.; Takezawa Y.; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132–138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen. Außerdem muss eine aufwendige Optimierung der Vitamin-Konzentrationen erfolgen (Li, Y.; Chen, J.; Lun, S.-Y.; Rui, X.-S. (2001) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis glabrata: key role and optimization of vitamin levels. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 680–685). Von den Erfindern wurde bereits in der DE 101 29 711 A1 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat mit Hilfe eines Escherichia coli Stammes YYC202 entwickelt, welches unter geeigneten Versuchsbedingungen eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erlaubt (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose).As an alternative to lactate, glucose is used as a substrate for pyruvate production by whole cell biotransformation by yeasts or bacteria, with pyruvate formed primarily by the reactions of glycolysis. For example, Torulopsis glabrata strains having a multiple vitamin auxotrophy producing 1.17 moles of pyruvate / mole of glucose have been described (Yonehara, T. Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvates from glucose by Torulopsis glabrata. Ferm. Bioeng. 78: 155-159). The maximum pyruvate concentration of fed-batch fermentation with these strains was 67.8 g / L (0.77 M). A comparable method of pyruvate production from glucose was also reported for lipoic acid auxotrophic strains of Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes Agric. Biol. Chem. 53: 705-711). and Escherichia coli (Yokota A, Shimizu, H, Terasawa Y, Takaoka, N .; Tomita F (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485, Appl. Microbiol., Biotechnol. 41: 638-643). When grown on glucose under lipoic acid deficiency conditions, the Enterobacter aerogenes produced a maximum of 0.8 moles of pyruvate per mole of glucose, the Escherichia coli strains up to 1.2 moles of pyruvate / mole of glucose (Yokata A. Shimizu, H .; Terasawa Y .; Takaoka, N., Tomita F. (1994a): Pyruvic acid production by F1-ATPase-defective mutant of Escherichia coli W1485lip2, Biosci Biotechnol.Biochem 58: 2164-2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N., Hayashi, C., Takezawa Y, Fukumori, Y .; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity J. Ferm Bioeng. 83: 132-138). The production of pyruvate by pyrolysis of grape acid has the disadvantage that 1. for the process, a high energy consumption (boiling point of the grape acid: about 200 ° C) is obtained and 2. heavy metals are needed and 3. grape acid is limited. The disadvantage of microbial production of pyruvate from lactate is that the substrate must first be produced, e.g. B. with the help of lactic acid bacteria from glucose. The disadvantage of the processes for microbial pyruvate formation from glucose is that the yields achieved are significantly below the maximum theoretically achievable yield. In addition, a complex optimization of the vitamin concentrations must be carried out (Li, Y., Chen, J .; Lun, S.-Y., Rui, X.-S. (2001) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis Glabrata: key role and optimization of vitamin levels, Appl. Microbiol., Biotechnol., 55: 680-685). By the inventors was already in the DE 101 29 711 A1 a method for the fermentative production of pyruvate with the aid of an Escherichia coli strain YYC202 developed, which allows under suitable experimental conditions, an almost complete conversion of glucose into pyruvate (≥ 1.9 moles of pyruvate / mole of glucose).

Dieses Verfahren basiert auf einem Escherichia coli Stamm YYC202, der eine Deletion der Gene aceEF für die Proteine E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase besitzt sowie Mutationen in den Genen poxB für die Pyruvat-Oxidase, pflB für die Pyruvat-Formiatlyase und pps für die PEP-Synthetase. Die Pyruvat-Dehydrogenase ist verantwortlich für die Oxidation von Pyruvat zu Acetyl-CoA unter aeroben Bedingungen. Die Pyruvat-Formiat-Lyase katalysiert die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat unter anaeroben Bedingungen und wird bereits bei geringen Sauerstoff-Konzentrationen vollständig inaktiviert. Die Pyruvat-Oxidase katalysiert die Oxidation von Pyruvat zu Acetat und überträgt die Elektronen dabei auf Ubichinon. Das Enzym wird verstärkt in der stationären Phase gebildet und seine Synthese ist abhängig von einem Sigma-Faktor S (RpoS). Die PEP-Syn-thetase katalysiert die Bildung von Phosphoenolpyruvat, AMP und PPi aus Pyruvat und ATP. Der Stamm YYC202 ist bei aerobem Wachstum in Glucose-Minimalmedim Acetat-auxotroph (Ace–). Dieser Ace–-Phänotyp beruht darauf, dass vor allem durch das Fehlen der Pyruvat-Dehydro-genase keine Acetyl-Gruppen für Biosynthesen mehr bereitgestellt werden können. E. coli-Mutanten, denen nur die Pyruvat-Dehydrogenase fehlt, zeigen einen ähnlichen Phänotyp, können allerdings nach 6–8 Tagen Inkubation auf Glucose-Minimalmedium-Platten Mikrokolonien bilden. Verantwortlich für die geringe Acetat-Produktion, die die Bildung dieser Mikrokolonien ermöglicht, ist die Pyruvat-Oxidase. Inaktiviert man in einer Pyruvat-Dehydrogenase-Mutante zusätzlich das poxB-Gen, werden keine Mikrokolonien mehr gebildet. Der Stamm E. coli YYC202 bildete ebenfalls nach 6–8 Tagen keine Mikrokolonien auf Glucose-Minimalmedium-Platten ohne Acetat.This method is based on an Escherichia coli strain YYC202, which has a deletion of the genes aceEF for the proteins E 1 and E 2 of pyruvate dehydrogenase and mutations in the genes poxB for pyruvate oxidase, pflB for pyruvate formate lyase and pps for the PEP synthetase. Pyruvate dehydrogenase is responsible for the oxidation of pyruvate to acetyl-CoA under aerobic conditions. The pyruvate-formate lyase catalyzes the reaction of pyruvate to acetyl-CoA and formate under anaerobic conditions and is completely inactivated even at low oxygen concentrations. The pyruvate oxidase catalyzes the oxidation of pyruvate to acetate and transfers the electrons to ubiquinone. The enzyme is increasingly formed in the stationary phase and its synthesis is dependent on a sigma factor S (RpoS). PEP synethetase catalyzes the Formation of phosphoenolpyruvate, AMP and PP i from pyruvate and ATP. Strain YYC202 is acetate auxotrophic (Ace - ) in aerobic growth in minimal glucose. This Ace - phenotype is based on the fact that mainly due to the absence of pyruvate dehydrogenase no acetyl groups for biosynthesis can be provided more. E. coli mutants lacking only pyruvate dehydrogenase show a similar phenotype, but can form microcolonies after 6-8 days of incubation on minimal glucose medium plates. Responsible for the low acetate production that enables the formation of these microcolonies is the pyruvate oxidase. If the poxB gene is additionally inactivated in a pyruvate dehydrogenase mutant, microcolonies are no longer formed. The strain E. coli YYC202 also did not form microcolonies on minimal glucose medium plates without acetate after 6-8 days.

Bei aerobem Wachstum in Minimalmedium mit Glucose und Acetat setzt E. coli YYC202 einen großen Teil der Glucose zu Pyruvat um (bis zu 1.7 Mol Pyruvat/Mol Glucose) und scheidet es ins Medium aus. Unter nicht wachsenden Bedingungen konnte mit E. coli YYC202 sogar ≥ 1.9 Mol Pyruvat/Mol Glucose gebildet werden. Sowohl unter wachsenden wie auch unter nicht wachsenden Bedingungen wird das in der Glykolyse gebildete NADH durch die Atmungskette mit Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor zu NAD+ reoxidiert. Unter anaeroben, gärenden Bedingungen ist dagegen eine Umsetzung von Glucose zu Pyruvat aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Reoxidation von NADH nicht möglich.In aerobic growth in minimal medium with glucose and acetate, E. coli YYC202 converts a large portion of the glucose to pyruvate (up to 1.7 moles of pyruvate / mole of glucose) and precipitates it into the medium. Under non-growing conditions, E. coli YYC202 produced even ≥ 1.9 moles of pyruvate / mole of glucose. Under both growing and non-growing conditions, the NADH formed in glycolysis is reoxidized through the respiratory chain with oxygen as the terminal electron acceptor to NAD + . On the other hand, under anaerobic, fermenting conditions, conversion of glucose to pyruvate is not possible due to the inability to reoxidize NADH.

Durch Transformation von E. coli YYC202 mit dem Plasmid pGS87 (erhalten von J. R. Guest, University of Sheffield, Great Britain), das die Gene aceEF und lpd (kodierend für die 3. Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase) von E. coli trägt, konnte die Acetat-Auxotrophie aufgehoben werden und der Stamm produzierte kein Pyruvat mehr. Dies bestätigt, dass insbesondere die Deletion der Gene aceE und aceF für die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202 verantwortlich ist.By transformation of E. coli YYC202 with the plasmid pGS87 (obtained from JR Guest, University of Sheffield, Great Britain) carrying the genes aceEF and lpd (coding for the 3rd subunit of pyruvate dehydrogenase) of E. coli the acetate auxotrophy are abolished and the strain no longer produces pyruvate. This confirms that, in particular, the deletion of genes aceE and aceF is responsible for pyruvate production by E. coli YYC202.

Alle bisher beschriebenen Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose mit Ausnahme von DE 101 29 711 A1 basieren auf Vitamin-auxotrophen, insbesondere Thiamin-auxotrophen Stämmen, z. B. von Torulopsis glabrata oder von E. coli. Dabei wird die Aktivität der Pyruvat-umsetzenden Enzyme, z. B. der Pyruvat-Decarboxylase oder der Pyruvat-Dehydrogenase, durch die Verfügbarkeit der Vitamine kontrolliert. Im Gegensatz dazu besitzt der Stamm E. coli YYC202 gemäß DE 101 29 711 A1 keine Vitamin-Auxotrophien und benötigt ausschließlich Acetat als Supplement zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium.All previously described methods for microbial pyruvate formation from glucose with the exception of DE 101 29 711 A1 are based on vitamin auxotrophic, in particular thiamine auxotrophic strains, eg. From Torulopsis glabrata or E. coli. The activity of pyruvate-converting enzymes, eg. As the pyruvate decarboxylase or pyruvate dehydrogenase, controlled by the availability of vitamins. In contrast, the strain E. coli has YYC202 according to DE 101 29 711 A1 no vitamin auxotrophs and only requires acetate as a supplement to growth in minimal glucose medium.

Aus US 5 869 301 A ist bekannt, daß die E. coli Mutante AFP-111 mit einem Defekt in den Genen, die für die Pyruvat-Formiat Lyase und die Lactat Dehydrogenase codieren, sowie einer weiteren, unbekannten Mutation, in verstärktem Maße unter anaeroben Bedingungen Malat, Fumarat und Succinat bildet, nicht aber Pyruvat. Es wird in US 5 869 301 A allgemein darauf hingewiesen, daß Maßnahmen, die zum Ausschalten von Enzymsystemen des Pyruvatabbaus führen, theoretisch auch eine Anreicherung des Pyruvats verursachen. Ein Hinweis, welche Enzyme speziell ausgeschaltet werden müssen, um gezielt eine Steigerung der Pyruvatproduktion zu erzielen, wird jedoch nicht offenbart. Insbesondere wird aber nicht berücksichtigt, dass eine kontinuierliche Pyruvat-Bildung aus Glucose unter anaeroben, gärenden Bedingungen nicht möglich ist, da die Reoxidation des in der Glykolyse gebildeten NADH nur unter Umsetzung von Pyruvat zu anderen, reduzierteren Verbindungen, wie z. B. Lactat möglich ist.Out US 5 869 301 A It is known that the E. coli mutant AFP-111 with a defect in the genes coding for pyruvate-formate lyase and lactate dehydrogenase, as well as another unknown mutation, to a greater extent under anaerobic conditions malate, fumarate and succinate but not pyruvate. It will be in US 5 869 301 A generally pointed out that measures that lead to the elimination of enzyme systems of pyruvate degradation, theoretically also cause an accumulation of pyruvate. An indication of which enzymes must be specifically switched off in order to specifically achieve an increase in pyruvate production, however, is not disclosed. In particular, however, is not considered that a continuous pyruvate formation from glucose under anaerobic fermenting conditions is not possible because the reoxidation of NADH formed in the glycolysis only under reaction of pyruvate to other, more reduced compounds such. B. lactate is possible.

Wie in DE 101 29 711 A1 beschrieben, konnte durch Ausschaltung Pyruvat abbauender Enzyme eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erreicht werden (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose). Bei aerober Kultivierung von E. coli YYC202 in Gegenwart hoher Glucose-Konzentrationen wurde neben Pyruvat jedoch auch Lactat gebildet. Dies reduziert die Ausbeute an Pyruvat und erschwert zusätzlich dessen Aufreinigung.As in DE 101 29 711 A1 An almost complete conversion of glucose into pyruvate could be achieved by eliminating pyruvate-degrading enzymes (≥ 1.9 moles of pyruvate / mole of glucose). In aerobic cultivation of E. coli YYC202 in the presence of high glucose concentrations, however, lactate was formed in addition to pyruvate. This reduces the yield of pyruvate and additionally complicates its purification.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, welches die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweist.It is therefore an object of the invention to provide a method which no longer has the abovementioned disadvantages.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 12, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 12 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 13, gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 13 angegebenen Merkmalen.Starting from the preamble of claim 1, the object is achieved according to the invention, with the features specified in the characterizing part of claim 1. The object is further achieved, starting from the preamble of claim 12, with the features indicated in the characterizing part of claim 12. Furthermore, the object is achieved on the basis of the preamble of claim 13, with the features specified in the characterizing part of claim 13.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungsgemäßen Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden überraschenderweise heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind oder eine verringerte Aktivität aufweisen, das zusätzliche Ausschalten der Enzymaktivität der NAD+-abhängigen D-Lactat-Dehydrogenase zu einer weiteren Steigerung der Pyruvatproduktion führt. Diese D-Lactat-Dehydrogenase wird im folgenden auch unter der Bezeichnung LDH zusammengefaßt. Der im folgenden verwendete Begriff „Ausschalten” beinhaltet die völlige Hemmung der Synthese von LDH bzw. die Inaktivierung des für die D-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.With the method according to the invention and the microorganisms according to the invention it is now possible to produce an increased concentration of pyruvate compared to conventional methods. The inventors surprisingly found that, when using microorganisms in which pyruvate dehydrogenase, phosphoenolpyruvate synthetase and pyruvate oxidase are inactivated or have reduced activity, the additional deactivation of the enzyme activity of the NAD + -dependent D-lactate Dehydrogenase leads to a further increase in pyruvate production. This D-lactate dehydrogenase is also referred to below as LDH summarized. The term "switching off" as used hereinafter includes the complete inhibition of the synthesis of LDH or the inactivation of the gene coding for the D-lactate dehydrogenase or the reduction or elimination of the intracellular activity of said enzymes.

Die für die LDH kodierende Gensequenz ist aus der Literatur bereits bekannt (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.). Dieses Gen wird im folgenden unter der Bezeichnung „ldhA-Gensequenz” zusammengefaßt. Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine LDH codierende Nukleotidsequenzen entfernt oder in ihrer Expression reduziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel die für die LDH kodierende ldhA-Gensequenz im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind dem Fachmann z. B. aus Link A. J., Philips D., Church G. M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-Type Escherichia coli: application to open reading frame charaterization. J. Bacteriol. 179: 6228–6237, oder auch aus Datsenko K. A., Wanner W. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640–6645, bekannt. Auch können nur Teile der ldhA-Gensequenz deletiert werden, oder auch mutierte Fragmente der ldhA-Gensequenz ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der LDH-Aktivität erreicht. Durch Transduktion mit dem Phagen P1 konnte das intakte ldhA-Gen von E. coli YYC202 durch ein defektes ldhA-Gen aus dem Stamm E. coli NZN117 (erhalten von D. P. Clark, Dep. of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) ersetzt werden. Die entsprechenden Protokolle sind für E. coli gut etabliert (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). Durch Inaktivierung des ldhA-Gens wird ein völliger Verlust der LDH-Aktivität erreicht. Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der Escherichia coli Stamm YYC202 ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 unter der Bezeichnung DSM 14863, der eine Insertion in der ldhA-Gensequenz trägt.The gene sequence coding for the LDH is already known from the literature (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP (1997) The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli.) Microbiology 143: 187-195.). This gene is summarized below under the name "ldhA gene sequence". With the aid of directed recombinant DNA techniques, nucleotide sequences coding for an LDH can be removed or reduced in their expression. By means of these methods, for example, the ldhA gene sequence coding for the LDH can be deleted in the chromosome. Suitable methods for this are the expert z. From Link A.J., Philips D., Church G.M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli. J. Bacteriol. 179: 6228-6237, or also from Datsenko K.A., Wanner W.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645, known. Also, only parts of the ldhA gene sequence can be deleted or mutated fragments of the ldhA gene sequence can be exchanged. Deletion or replacement results in loss or reduction of LDH activity. By transduction with phage P1, the intact ldhA gene of E. coli YYC202 could be replaced by a defective ldhA gene from strain E. coli NZN117 (obtained from DP Clark, Dep. Of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) become. The corresponding protocols are well established for E. coli (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). By inactivating the ldhA gene, complete loss of LDH activity is achieved. An example of such a mutant is the Escherichia coli strain YYC202 ldhA, deposited on 12.03.2002 under the name DSM 14863, which carries an insertion in the ldhA gene sequence.

Eine weitere Möglichkeit die Aktivität der LDH abzuschwächen oder auszuschalten sind Mutageneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.Another possibility to reduce or eliminate LDH activity is mutagenesis. These include undirected methods involving chemical reagents such as. As N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV irradiation for mutagenesis use. Mutation triggering and mutant screening methods are well known and can be found, inter alia, in Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) or in the Manual of Methods for General Bacteriology "of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).

Darüber hinaus kann auch die Expression der ldhA-Gen-sequenz reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionsregulationskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen Pyruvatproduktion zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Des weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität kodieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression der ldhA-Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.In addition, the expression of the ldhA gene sequence can also be reduced. Thus, the promoter and regulatory region located upstream of the structural gene can be mutated. Similarly, expression regulatory cassettes which are incorporated upstream of the structural gene function. By means of regulatable promoters it is additionally possible to reduce expression in the course of fermentative pyruvate production. In addition, however, a regulation of the translation is possible by, for example, the stability of the m-RNA is reduced. Furthermore, genes coding for the corresponding enzyme with low activity can be used. Alternatively, reduced expression of the ldhA gene sequence can be achieved by altering media composition and culture guidance.

Die LDH katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Lactat mit NADH als Coenzym und wird durch Pyruvat allosterisch aktiviert (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587–2596). Der apparente Km-Wert für Pyruvat liegt je nach pH-Wert zwischen 4.4 mM (pH 6.7) und 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587–2596.). Diese Konzentrationen werden in E. coli-Wildtyp-Stämmen unter aeroben Bedingungen normalerweise nicht erreicht. Die Expression des ldhA-Gens wird unter anaeroben Bedingungen durch einen niedrigen pH-Wert induziert, unter aeroben Bedingungen gibt es eine pH-unabhängige Expression (Jiang, G. R., Nikolova, S. and Clark D. P. (2001) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 147: 2437–2446.). Pyruvat stimuliert die Expression des ldhA-Gens 2- bis 4-fach (Jiang et al. 2001). Die signifikante Bildung von Lactat bei Kultivierung von E. coli YYC202 mit hohen Glucose-Konzentrationen kann wie folgt erklärt werden: Durch die Blockade des Pyruvat-Abbaus kommt es zu einer Akkumulation von Pyruvat, die einerseits eine verstärkte Expression des ldhA-Gens bewirkt und andererseits die Aktivität des Enzyms stimuliert. Eine signifikante Lactat Bildung wird in Schüttelkolben-Ansätzen ab einer Glucose-Konzentration von 50 mM beobachtet, während sie bei Fermentationen bereits ab Glucose-Konzentrationen von ca. 5 mM beobachtet wird. Um die Lactat-Bildung zu unterbinden, wurde in der vorliegenden Erfindung beispielsweise ein Derivat des Stammes Escherichia coli YYC202 konstruiert, bei dem das ldhA-Gen durch Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz inaktiviert wurde.The LDH catalyzes the reduction of pyruvate to lactate with NADH as coenzyme and is allosterically activated by pyruvate (Tarmy, EM and Kaplan, NO (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation Biol. Chem. 243: 2587-2596). The apparent K m value for pyruvate, depending on the pH, is between 4.4 mM (pH 6.7) and 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, EM and Kaplan, NO (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation J. Biol. Chem. 243: 2587-2596.). These concentrations are normally not reached in wild type E. coli strains under aerobic conditions. Expression of the ldhA gene is induced by low pH under anaerobic conditions, there is pH independent expression under aerobic conditions (Jiang, GR, Nikolova, S. and Clark DP (2001) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli, Microbiology 147: 2437-2446.). Pyruvate stimulates the expression of the ldhA gene 2-4 times (Jiang et al 2001). The significant production of lactate when cultivating E. coli YYC202 with high glucose concentrations can be explained as follows: The blockade of pyruvate degradation leads to an accumulation of pyruvate, which on the one hand causes an increased expression of the ldhA gene and on the other hand stimulates the activity of the enzyme. Significant lactate formation is observed in shake flask approaches from a glucose concentration of 50 mM, whereas in fermentations it is observed as from glucose concentrations of approximately 5 mM. In order to prevent lactate formation, in the present invention, for example, a derivative of the strain Escherichia coli YYC202 was constructed in which the ldhA gene is prepared by insertion of a kanamycin Resistance gene was inactivated in the open reading frame of the ldhA gene sequence.

Escherichia coli YYC202 ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279–1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756–762; Georgiou, D. Ch.; Fang, H.; Gennis, R. B. (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107–2112). Für das Verfahren geeignet sind Bakterien und Hefen, insbesondere gram-negative Bakterien, bevorzugt aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia coli. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202 ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14863, erwiesen, der wie in oben beschriebener Weise verändert wurde.Escherichia coli YYC202 is described in the literature for its genetic characteristics (Chang, YY, Cronan, JE (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase .J.Bacteriol. Cronan, JE (1983): Genetic and biochemical analyzes of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase J. Bacteriol 169 (5): 756-762 Georgiou, D.C., Fang, H .; Gennis, RB (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrome d terminal oxidase complex in Escherichia coli J. Bacteriol 169: 2107 -2112). Suitable for the process are bacteria and yeasts, especially Gram-negative bacteria, preferably from the family of Enterobacteriaceae such. B. Escherichia coli. Particularly suitable is the strain Escherichia coli YYC202 ldhA, deposited on 12.03.2002 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under the DSM number 14863, which was modified as described above.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte die Bildung von Lactat als Stoffwechselendprodukt verhindert und durch Ausschalten der Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, und Phosphoenolpyruvat-Synthetase und zusätzlichem Ausschalten der LDH die Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen in Pyruvat signifikant verbessert werden. Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.The process according to the invention prevented the formation of lactate as a metabolic end product and, by eliminating the enzymes pyruvate dehydrogenase, pyruvate oxidase and phosphoenolpyruvate synthetase and additionally switching off the LDH, the conversion of high glucose concentrations into pyruvate could be significantly improved. The microorganisms used in the process according to the invention, pyruvate, for example, from carbohydrates such. As glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose, or alcohols such. B. produce glycerol. These substances can be used individually or as a mixture.

Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden. Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen werden aerob durchgeführt.As cultivation methods, continuous or discontinuous batch (batch) or fed-batch (feed) or repeated fed-batch (repetitive feed) processes may be used for the production of pyruvate. The culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of microorganisms. The fermentations are carried out aerobically.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous developments are specified in the subclaims.

Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoff-wechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.The figures show an overview of the pyruvate-Stoffwechselwechseles and experimental results of the method according to the invention.

Es zeigt:It shows:

1: Schema der Umsetzung von Glucose in Pyruvat in E. coli YYC202 ldhA. Nach Aufnahme von Glucose durch das Phosphoenolpyruvat-abhängige Phosphotransferase-System (PTS) wird Glucose-6-phosphat in den Reaktionen der Glykolyse zu Pyruvat umgesetzt. Aufgrund der genetischen Defekte in den Genen aceEF, pflB, poxB, und ldhA kann Pyruvat nicht weiter umgesetzt werden und wird ins Medium ausgeschieden. 1 : Scheme of the conversion of glucose into pyruvate in E. coli YYC202 ldhA. After uptake of glucose by the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS), glucose-6-phosphate is converted into pyruvate in the glycolysis reactions. Due to the genetic defects in the genes aceEF, pflB, poxB, and ldhA, pyruvate can not be further reacted and is excreted into the medium.

2: Southern-Blot-Analyse (Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503–517.) von E. coli YYC202 ldhA. 2 Southern blot analysis (Southern, EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis J. Mol. Biol. 98: 503-517.) Of E. coli YYC202 ldhA.

Die Spuren 1, 5 und 6 enthalten je 75 ng Digoxigenin-markierten DNA-Standard. Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von E. coli YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale DNA von E. coli YYC202 ldhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von E. coli NZN117. Es wurden jeweils 15 μg chromosomale DNA, die mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, pro Spur aufgetrennt. Der Blot mit den Spuren 1–5 wurde mit einem Digoxigenin-markierten 2153-bp DNA-Fragment mit dem E. coli ldhA-Gen hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6–10 mit einem Digoxigenin-markierten 668-bp Fragment mit dem Kanamycin-Resistenzgen aus E. coli NZN117. Die DNA-Fragmente wurden auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt und nach Denaturierung auf eine Nylon-Membran geblottet. Die Markierung der Sonden mit Digoxigenin, Hybridisierung, Waschen und Detektion der Sonden mit CDP-Star erfolgten mit dem DIG-Chemlink-Labeling-and-Detektion-Kit (Roche Diagnostics) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Wie erwartet, wurde mit der ldhA-Sonde in E. coli YYC202 ein 11 kb EcoRI-HindIII-Fragment detektiert, in E. coli YYC202 ldhA und E. coli NZN117 dagegen Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb. Mit der kan-Sonde wurde erwartungsgemäss kein Signal in E. coli YYC202 detektiert, in YYC202 ldhA und NZN117 dagegen wiederum Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb.Lanes 1, 5 and 6 each contain 75 ng digoxigenin-labeled DNA standard. Lanes 2 and 7 contain chromosomal DNA of E. coli YYC202, lanes 3 and 8 chromosomal DNA of E. coli YYC202 ldhA and lanes 4 and 9 chromosomal DNA of E. coli NZN117. In each case, 15 μg of chromosomal DNA which had been digested with EcoRI and HindIII were separated per lane. The blot with lanes 1-5 was hybridized with a digoxigenin-labeled 2153 bp DNA fragment with the E. coli ldhA gene, the blot with lanes 6-10 with a digoxigenin-labeled 668 bp fragment with the kanamycin Resistance gene from E. coli NZN117. The DNA fragments were separated on a 1% agarose gel and blotted to a nylon membrane after denaturation. Labeling of the probes with digoxigenin, hybridization, washing and detection of the probes with CDP-Star were performed using the DIG Chemlink Labeling and Detection Kit (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions. As expected, an 11 kb EcoRI-HindIII fragment was detected with the ldhA probe in E. coli YYC202, whereas fragments of 6.2 kb and 6.8 kb were detected in E. coli YYC202 ldhA and E. coli NZN117. As expected, no signal was detected in E. coli YYC202 with the kan probe, but again fragments of 6.2 kb and 6.8 kb were detected in YYC202 ldhA and NZN117.

3: Umsetzung von Glucose

Figure 00100001
zu Pyruvat
Figure 00100002
und ggf. Lactat
Figure 00100003
durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 (A) und E. coli YYC202 ldhA (B). Die Abszisse X gibt die Zeit in Stunden an und die Ordinate Y die Konzentration von Glucose, Pyruvat, bzw. Lactat in mM. 3 : Conversion of glucose
Figure 00100001
to pyruvate
Figure 00100002
and optionally lactate
Figure 00100003
by cell suspensions of E. coli YYC202 (A) and E. coli YYC202 ldhA (B). The abscissa X indicates the time in hours and the ordinate Y the concentration of glucose, pyruvate, and lactate in mM.

Die Zellen wurden in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert, dann mit 0.9%-iger NaCl-Lösung gewaschen und anschließend zu einer OD600 von 7.4 (YYC202) bzw. 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS-Puffer pH 7.0 mit 100 mM bzw. 88 mM Glucose resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Die Glucose-Konzentration wurde in einem gekoppelten enzymatischen Test mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bestimmt (Bergmeyer, H. U. (1984) Methods of enzymatic analysis, 3rd edition. Vol. VI: Metabolites 1: Carbohydrates, Seiten 163–172. Verlag Chemie, Weinheim.). Pyruvat und Lactat wurden durch HPLC-Analyse mit einer Aminex HPX-87H-Säule (BioRad) und UV-Detektion bei 215 nm bestimmt.The cells were pre-cultured in M9 minimal medium with glucose and acetate, then washed with 0.9% NaCl solution and then to an OD 600 of 7.4 (YYC202) or 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS buffer pH 7.0 with 100 mM or 88 mM glucose resuspended. The cell suspensions were incubated in shake flasks at 37 ° C and 140 rpm. The glucose concentration was in a coupled enzymatic assay with Hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase determined (Bergmeyer, HU (1984) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed ., Vol. VI: Metabolites 1: Carbohydrates, pages 163-172, Verlag Chemie, Weinheim.). Pyruvate and lactate were determined by HPLC analysis on an Aminex HPX-87H column (BioRad) and UV detection at 215 nm.

4: Fed-batch-Fermentation von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA. Die Abszisse X gibt die Fermentationszeit in Stunden an und die Ordinate Y in A die optische Dichte OD600 bzw. in B die Konzentration von Pyruvat bzw. Lactat in mM. 4 : Fed-Batch Fermentation of E. coli YYC202 and E. coli YYC202 ldhA. The abscissa X indicates the fermentation time in hours and the ordinate Y in A the optical density OD 600 and in B the concentration of pyruvate or lactate in mM.

Die Stämme wurden in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und konstant pH 7 (pH-Regulation) in einem synthetischen Medium kultiviert. Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines „On-line General Analyzer” konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO2-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. In A ist das Wachstum von E. coli YYC202

Figure 00100004
und E. coli YYC202 ldhA
Figure 00100005
dargestellt. In B wird die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202
Figure 00110001
und E. coli YYC202 ldhA
Figure 00110002
sowie die Lactatbildung durch E. coli YYC202
Figure 00110003
und E coli YYC202 ldhA (☐) dargestellt.The strains were cultured in a 7.5 l laboratory fermenter under aerobic conditions (pO 2> 40% saturation) at 37 ° C. and constant pH 7 (pH regulation) in a synthetic medium. The glucose concentration was kept constant at about 5 mM using an "on-line general analyzer". The acetate feed was in excess, with the CO 2 concentration in the exhaust gas was used for the regulation. In A, the growth of E. coli is YYC202
Figure 00100004
and E. coli YYC202 ldhA
Figure 00100005
shown. In B, pyruvate formation by E. coli YYC202
Figure 00110001
and E. coli YYC202 ldhA
Figure 00110002
and lactate formation by E. coli YYC202
Figure 00110003
and E. coli YYC202 ldhA (□).

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.In the following, the invention will be described by way of example.

Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der LDH verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte bei Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen einem gegenüber z. B. aus DE 101 29 711 A1 bekannten Verfahren, erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Mit ruhenden Zellen konnte die Ausbeute an Pyruvat bei Umsetzung von 100 mM Glucose um 20% gesteigert werden. Bei Fermenationen im fed-batch-Verfahren konnte die nach 37 h erreichte Pyruvat-Konzentration um 40% gesteigert werden. Als Mikroorganismen können sowohl Hefen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganismen aus der Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist z. B. aus DE 101 29 711 A1 bekannt, dass folgende Gensequenzen verändert wurden: aceEF-kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase, poxB-kodierend für die Pyruvat-Oxidase; pps-kodierend für die Phosphoenolpyruvat-Synthetase; pflB-kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase. In überraschender Weise erzielte das zusätzliche Ausschalten der LDH in Form von z. B. einer Insertion eines Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz, wie für Escherichia coli YYC202 ldhA beschrieben, eine weitere deutliche Steigerung der Pyruvatproduktion. Das Ausschalten der Gensequenzen kodierend für die Pyruvat-Dehydrogenase, die Pyruvat-Oxidase die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die LDH, wird für eine verbesserte Pyruvatproduktion als besonders vorteilhaft angesehen.By using microorganisms whose activity of the LDH was reduced or completely inactivated, could in reacting high glucose concentrations with respect to z. B. off DE 101 29 711 A1 known methods, increased pyruvate production can be achieved. With resting cells, the yield of pyruvate could be increased by 20% when 100 mM glucose was converted. In fed-batch fermentation, the pyruvate concentration reached after 37 h could be increased by 40%. As microorganisms both yeasts and bacteria can be used. Microorganisms from the family Enterobacteriaceae, in particular from the genus Escherichia have proven to be particularly suitable. In particular, the organism Escherichia coli YYC202 has proved to be very suitable. This bacterial strain has some genetic changes compared to the wild-type strain (WT). So z. B. off DE 101 29 711 A1 it is known that the following gene sequences have been altered: aceEF coding for the subunits E1 and E2 of the pyruvate dehydrogenase, poxB coding for the pyruvate oxidase; pps encoding the phosphoenolpyruvate synthetase; pflB coding for pyruvate formate lyase. Surprisingly, the additional switching off the LDH achieved in the form of z. An insertion of a resistance gene into the open reading frame of the ldhA gene sequence as described for Escherichia coli YYC202 ldhA, a further marked increase in pyruvate production. Switching off the gene sequences encoding the pyruvate dehydrogenase, the pyruvate oxidase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the LDH is considered to be particularly advantageous for improved pyruvate production.

Mit ruhenden Zellen konnte eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. Dabei konnte in DE 101 29 711 A1 gezeigt werden, dass die Acetat-Verbrauchsrate identisch ist mit der CO2-Bildungs-rate. Über diese Korrelation lässt sich anhand der online-messbaren CO2-Konzentration im Abgas die Acetat-Verbrauchsrate bestimmen und regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute mit wachsenden Zellen nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. „ruhende” Zellen. Diese Zellen werden durch Kultivierung in einem Medium erhalten, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate, insbesondere Hexosen, sowie Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen.With resting cells, a conversion of the substrate into pyruvate could be achieved, which was significantly higher than the yields obtained with previously known methods. Due to the genotype, the organisms are unable to convert pyruvate to acetyl-CoA, acetate or phosphoenolpyruvate. This acetate auxotrophy allows growth and product formation to be regulated by dosing the essential co-substrate acetate. It was possible in DE 101 29 711 A1 shown that the acetate consumption rate is identical to the CO 2 formation rate. This correlation can be used to determine and regulate the acetate consumption rate based on the online measurable CO 2 concentration in the exhaust gas. In the presence of acetate and other nutrients such. B. Nitrogen in the fermentation medium can metabolism due to cell division / growth take place. However, since some of the carbon source is used for the biosynthesis of new cell material during growth, a maximum pyruvate yield with growing cells is not to be expected. This is possible with cells that, due to the media conditions, do not biosynthesize for the purpose of forming new cell material, ie, "dormant" cells. These cells are obtained by culturing in a medium in which a high cell concentration can be formed. Thereafter, the cells z. B. harvested by centrifugation and added to a medium containing no acetate and no other nutrients required for growth, such as. B. contains nitrogen. Under these conditions an even higher pyruvate yield can be achieved. Suitable carbon sources are carbohydrates, in particular hexoses, and alcohols. In order to ensure the economic viability of the process, preference is given to substrates which are obtained as waste materials or are directly available, ie do not have to be pretreated or produced in a special manner for further processing for the process according to the invention.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. 13C-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf die Produktion weiterer vom Pyruvat abgeleiteter Stoffwechselprodukte auswirken. So kann z. B. durch das Einbringen eines Gens für die L-Alanin-Dehydrogenase und in Gegenwart hoher Ammonium-Konzentrationen unter anaeroben Bedingungen eine Homoalanin-Gärung etabliert werden, bei der 1 Mol Glucose und 2 Mol Ammonium zu 2 Mol L-Alanin umgesetzt wird.By the method according to the invention, for example, labeled pyruvate can be prepared in high yields by z. B. 13 C-labeled carbon sources can be used. The economy of this process is significantly improved by the high product yields. The process according to the invention can additionally have a positive effect on the production of further pyruvate-derived metabolites. So z. B. by introducing a gene for L-alanine dehydrogenase and in the presence of high ammonium concentrations under anaerobic conditions Homoalanin fermentation can be established in which 1 mole of glucose and 2 moles of ammonium to 2 moles of L-alanine is implemented.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention will be explained in more detail below with reference to exemplary embodiments.

1. Konstruktion eines Derivats von E. coli YYC202 mit defektem ldhA-Gen1. Construction of a derivative of E. coli YYC202 with defective ldhA gene

Zur Inaktivierung des ldhA-Gens wurde das offene Leseraster durch ein Kanamycin-Resistenzgen unterbrochen. Die entsprechende Mutation wurde durch P1-Transduktion (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) aus dem Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.) in E. coli YYC202 transferiert. Die erfolgreiche Transduktion wurde durch Southern-Blot-Analyse bestätigt (2). Die Lactat-Dehydro-genase-Aktivität (LDH-Aktivität) im Ausgangsstamm YYC202 und im Derivat YYC202 ldhA wurde nach 6-stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0.4% (w/v) Glucose bestimmt. Dazu wurden zellfreie Extrakte hergestellt, die Membranfraktion durch Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche Fraktion in einen Enzymtest eingesetzt, bei dem die pyruvatabhängige Oxidation von NADH zu NAD+ spektrophotometrisch anhand der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195). E. coli YYC202 besass eine hohe Lactat-Dehydrogenase-Aktivität von 3.1 μmol min–1 mg Protein–1, während E. coli YYC202 ldhA eine Aktivität von < 0.01 μmol min–1 mg Protein–1 zeigte.To inactivate the ldhA gene, the open reading frame was disrupted by a kanamycin resistance gene. The corresponding mutation was detected by P1 transduction (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with Gene Fusion Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) From the donor strain E. coli NZN117 (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli, Microbiology 143: 187-195.) Into E. coli YYC202 , Successful transduction was confirmed by Southern blot analysis ( 2 ). The lactate dehydrogenase activity (LDH activity) in the starting strain YYC202 and in the derivative YYC202 ldhA was determined after culturing in LB medium with 0.4% (w / v) glucose for 6 hours. To this end, cell-free extracts were prepared, the membrane fraction was removed by ultracentrifugation and the soluble fraction was used in an enzyme assay in which the pyruvate-dependent oxidation of NADH to NAD + was measured spectrophotometrically by the decrease in absorbance at 340 nm (Bunch, PK, Mat-Jan. F., Lee, N. and Clark, DP (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli, Microbiology 143: 187-195). E. coli YYC202 had a high lactate dehydrogenase activity of 3.1 μmol min -1 mg protein -1 , while E. coli YYC202 ldhA had an activity of <0.01 μmol min -1 mg protein -1 .

2. Glucose-Umsetzung durch ruhende Zellen von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA2. Glucose conversion by resting cells of E. coli YYC202 and E. coli YYC202 ldhA

Die Stämme E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA wurden in Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in einem Puffer (500 mM MOPS, pH 7.0) mit circa 100 mM Glucose resuspendiert, und in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Wie in 3A dargestellt, wurde die Glucose im Stamm YYC202 anfänglich mit annähernd gleicher Rate zu Pyruvat und Lactat umgesetzt. Nach dem Verbrauch der Glucose wurde das gebildete Lactat langsam zu Pyruvat reoxidiert. Im Stamm YYC202 ldhA wurde dagegen die Glucose mit konstanter Rate zu Pyruvat umgesetzt, aber kein Lactat gebildet (3B).The strains E. coli YYC202 and E. coli YYC202 ldhA were pre-cultured in minimal medium with glucose and acetate. Subsequently, the cells were washed, resuspended in a buffer (500 mM MOPS, pH 7.0) with approximately 100 mM glucose, and incubated in shake flasks at 37 ° C and 140 rpm. As in 3A initially, the glucose in strain YYC202 was initially converted to pyruvate and lactate at approximately the same rate. After consumption of glucose, the lactate formed was slowly reoxidized to pyruvate. In strain YYC202 ldhA, on the other hand, glucose was converted to pyruvate at a constant rate, but no lactate was formed ( 3B ).

3. Wachstum und Produktbildung bei fed-batch-Kultivierung von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA in Glucose-Minimalmedium3. Growth and product formation in fed-batch culture of E. coli YYC202 and E. coli YYC202 ldhA in minimal glucose medium

Für die fed-batch-Fermentation wurden die Stämme in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und pH 7 (geregelt) in einem synthetischen Medium kultiviert (pro Liter 1.5 g NaH2PO4 × H2O; 3.25 g KH2PO4; 2.5 g K2HPO4; 0.2 g NH4Cl; 2 g (NH4)SO4; 0.5 g MgSO4; 10 mg CaCl2 × 2H2O; 0.5 mg ZnSO4 × 7H2O I–1; 0.25 mg CuCl2 × 2H2O; 2.5 mg MnSO4 × H2O; 1.75 mg CoCl2 × 6H2O; 1.25 mg H3BO3; 2.5 mg AlCl3 × 6H2O; 0.5 mg Na2MoO4 × 2H2O; 10 mg FeSO4). Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines „On-line General Analyzer” konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO2-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. Es war zuvor gezeigt worden, dass die Acetat-Verbrauchs-rate gleich der CO2-Bildungsrate ist ( Deutsche Patent-Anmeldung 101 29 711 ). Bei den in 4A und 4B dargestellten Experimenten zeigten beide Stämme annähernd gleiches Wachstumsverhalten, unterschieden sich aber deutlich hinsichtlich Pyruvat- und Lactat-Bildung. Der Ausgangsstamm YYC202 hatte nach 37 h 487 mM Pyruvat und 341 mM Lactat gebildet, während der Stamm YYC202 ldhA nach 37 h 673 mM Pyruvat, aber kein Lactat gebildet hatte.For fed-batch fermentation, the strains were cultivated in a 7.5 l laboratory fermenter under aerobic conditions (pO 2> 40% saturation) at 37 ° C. and pH 7 (regulated) in a synthetic medium (1.5 g NaH 2 PO 4 per liter × H 2 O; 3.25 g KH 2 PO 4 ; 2.5 g K 2 HPO 4 ; 0.2 g NH 4 Cl; 2 g (NH 4 ) SO 4 ; 0.5 g MgSO 4 ; 10 mg CaCl 2 × 2H 2 O; 0.5 mg ZnSO 4 × 7H 2 OI -1 , 0.25 mg CuCl 2 × 2H 2 O, 2.5 mg MnSO 4 × H 2 O, 1.75 mg CoCl 2 × 6H 2 O, 1.25 mg H 3 BO 3 , 2.5 mg AlCl 3 × 6H 2 O; 0.5 mg Na 2 MoO 4 × 2H 2 O, 10 mg FeSO 4 ). The glucose concentration was kept constant at about 5 mM using an "on-line general analyzer". The acetate feed was in excess, with the CO 2 concentration in the exhaust gas was used for the regulation. It has previously been shown that the acetate consumption rate is equal to the CO 2 production rate ( German Patent Application 101 29 711 ). At the in 4A and 4B As shown, both strains showed approximately the same growth behavior, but differed significantly in pyruvate and lactate formation. The starting strain YYC202 had formed 487 mM pyruvate and 341 mM lactate after 37 h, while the strain YYC202 ldhA after 37 h had formed 673 mM pyruvate, but no lactate.

4. Kontrollexperiment mit E. coli NZN1174. Control experiment with E. coli NZN117

Um auszuschließen, dass die ldhA-Mutation im Stamm E. coli YYC202-ldhA für die Pyruvat-Bildung verantwortlich ist, wurde der Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.) in Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Zu keinem Zeitpunkt während des Wachstums und in der stationären Phase konnte Pyruvat im Kulturüberstand detektiert werden. Dies zeigt, dass eine ldhA-Mutation unter den genannten Bedingungen nicht zur Exkretion von Pyruvat führt. In E. coli YYC202 ldhA ist dafür vielmehr die Deletion der aceEF-Gene für zwei Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase sowie die Inaktivierung des Gens poxB für die Pyruvat-Oxidase verantwortlich.To exclude that the ldhA mutation in strain E. coli YYC202-ldhA is responsible for pyruvate production, the donor strain E. coli NZN117 (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli, Microbiology 143: 187-195.) Was incubated in minimal medium with 10 mM glucose and 2 mM acetate at 37 ° C and 140 rpm. At no time during growth and in the stationary phase could pyruvate be detected in the culture supernatant. This shows that an ldhA mutation under the conditions mentioned does not lead to the excretion of pyruvate. In E. coli YYC202 ldhA, the deletion of the aceEF genes for two subunits of pyruvate dehydrogenase as well as the inactivation of the gene poxB is responsible for the pyruvate oxidase.

Claims (19)

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen unter Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird und diese Mikroorganismen eingesetzt werden.Process for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols using microorganisms in which the pyruvate dehydrogenase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase are inactivated and / or have a reduced activity, characterized in that the D-lactate Dehydrogenase is turned off and these microorganisms are used. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ldhA-Gensequenz verringert und/oder die ldhA-Gensequenz so verändert wird, dass keine Expression stattfindet oder die ldhA-Gensequenz deletiert wird.A method according to claim 1, characterized in that the expression of the ldhA gene sequence is reduced and / or the ldhA gene sequence is changed so that no expression takes place or the ldhA gene sequence is deleted. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass in das offene Leseraster der ldhA-Gensequenz ein Resistenzgen eingebaut wird.Method according to one of claims 1 to 2, characterized in that in the open reading frame of the ldhA gene sequence, a resistance gene is incorporated. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae eingesetzt werden.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that microorganisms from the group of Enterobacteriaceae are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia eingesetzt werden.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that microorganisms from the genus Escherichia are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli YYC202 ldhA, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 14863, eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that Escherichia coli YYC202 ldhA, deposited under the name DSM 14863, is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat bei der Fermentation Kohlenhydrate, oder Alkohole eingesetzt werden.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that are used as substrate in the fermentation carbohydrates, or alcohols. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Acetat bei der Fermentation mit wachsenden Zellen eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that acetate is used in the fermentation with growing cells. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Fermentationen mit ruhenden Zellen kein Acetat eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that in fermentations with resting cells, no acetate is used. Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei den Fermentationen eine CO2 Messanalytik eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that a CO 2 measurement analysis is used in the fermentations. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine aerobe Fermentationen durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that an aerobic fermentation is carried out. Verfahren zur Produktion von Stoffwechselprodukten, die sich vom Pyruvat ableiten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 11 durchgeführt wird und eine anaerobe Fermentation durchgeführt wird.Process for the production of metabolic products derived from pyruvate, characterized in that a process according to claims 1 to 11 is carried out and an anaerobic fermentation is carried out. Mikroorganismus zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen in dem die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass er eine ausgeschaltete D-Lactat-Dehydrogenase aufweist.Microorganism for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols in which the pyruvate dehydrogenase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase are inactivated and / or have a reduced activity, characterized in that it comprises a deactivated D-lactate dehydrogenase. Mikroorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ldhA-Gensequenz verringert und/oder die ldhA-Gensequenz so verändert ist, dass keine Expression stattfindet oder die ldhA-Gensequenz deletiert ist.Microorganism according to claim 13, characterized in that the expression of the ldhA gene sequence is reduced and / or the ldhA gene sequence is altered so that no expression takes place or the ldhA gene sequence is deleted. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Insertion im offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz aufweist.Microorganism according to one of claims 13 to 14, characterized in that it has an insertion in the open reading frame of the ldhA gene sequence. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er die Insertion eines Resistenzgens im offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz aufweist.Microorganism according to one of claims 13 to 15, characterized in that it has the insertion of a resistance gene in the open reading frame of the ldhA gene sequence. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Familie der Enterobacteriacea stammt.Microorganism according to one of claims 13 to 16, characterized in that it comes from the family of Enterobacteriacea. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gattung Escherichia stammt.Microorganism according to one of claims 13 to 17, characterized in that it is of the genus Escherichia. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 18, hinterlegt bei der DSMZ unter der DSM-Nr. 14863.A microorganism according to any one of claims 13 to 18, deposited at DSMZ under DSM No. 14,863th
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