DE10220234A1

DE10220234A1 - Processes and microorganisms for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols

Info

Publication number: DE10220234A1
Application number: DE10220234A
Authority: DE
Inventors: Tanja Gerharz; Bruno Zelic; Ralf Takors; Michael Bott
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2002-05-06
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2022-05-07
Also published as: WO2003093488A1; DE10220234B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen. DOLLAR A Die nach dem Stand der Technik bekannten chemischen Verfahren zur Herstellung von Pyruvat sind technisch aufwendig und kostenintensiv. Die bekannten biologischen Verfahren sowie Mikroorganismen weisen den Nachteil auf, daß die Substrate nicht zu 100% in Pyruvat umgesetzt werden und dadurch die Produktausbeute verschlechtert wird. Außerdem ist bei der mikrobiellen Pyruvat-Produktion aus Glucose eine aufwendige Steuerung der erforderlichen Vitamin-Konzentration notwendig. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den Mikroorganismen ist es möglich, mikrobiell Pyruvat mit einer nahezu 100%igen Umsetzung des Substrates herzustellen. Durch Verwendung von Mikroorganismen, die genetisch verändert wurden, d. h. Deletion, Insertion bzw. geringere Expression der ldhA-Gensequenz, die für die Lactat-Dehydrogenase kodiert, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden.The invention relates to a method and microorganisms for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols. DOLLAR A The chemical processes known from the prior art for producing pyruvate are technically complex and cost-intensive. The known biological processes and microorganisms have the disadvantage that the substrates are not 100% converted into pyruvate and the product yield is thereby deteriorated. In addition, the microbial pyruvate production from glucose requires complex control of the required vitamin concentration. With the method according to the invention and the microorganisms, it is possible to produce pyruvate microbially with an almost 100% conversion of the substrate. By using microorganisms that have been genetically modified, i. H. Deletion, insertion or less expression of the ldhA gene sequence which codes for the lactate dehydrogenase, an increased pyruvate production could be achieved.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen. The invention relates to a method and Microorganisms for the microbial production of Pyruvate from carbohydrates and alcohols.

Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d. h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikrobielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabilisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S)-Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, J. E.; Gavagan J. E.; Payne, M. S.; Anton D. L. (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223-232; US- Patent 5538875). Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H₂O₂ wird durch endogene Katalase zu H₂O und O₂ umgesetzt. Mit diesem Prozess konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S)-Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B. A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9: 253-258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R)-lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat-Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden. A classic method of producing pyruvate (the salt of pyruvic acid) is the pyrolysis (ie the burning) of grape acid. Heavy metals and temperatures of around 200 ° C are required (Römp Chemie Lexikon, 1995). The following microbial processes for pyruvate synthesis from lactate are also known: Production of pyruvate from lactate with permeabilized cells of the methylotrophic yeasts Hansenula polymorpha or Pichia pastoris, which express the gene for the (S) -hydroxy acid oxidase from spinach (DiCosimo, R .; Eisenberg, A .; Seip, JE; Gavagan JE; Payne, MS; Anton DL ( 1997 ): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2 , 223-232 ; US- Patent 5538875). The H ₂ O ₂ formed in the lactate oxidation is converted to H ₂ O and O ₂ by endogenous catalase. With this process, a 1 M solution of sodium or ammonium lactate could be converted to pyruvate to 98%. The possibility of cell-free oxidation of lactate to pyruvate with immobilized (S) -hydroxy acid oxidase and catalase is also known (Burdick, BA; Schaeffer, JR ( 1987 ): Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production Biotechnol Lett 9: 253-258). Another method is the conversion of lactate to pyruvate with resting, anaerobically grown cells from Proteus mirabilis or Proteus vulgaris (Simon, H .; Schinschel, C. ( 1993 ): Preparation of pyruvate from (R) -lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). With this system, a 0.65 M lactate solution could be converted to pyruvate to 94% in 1 h.

Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzierten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159). Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed- Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705-711) und Escherichia coli beschrieben (Yokota A.; Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638-643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an F1-ATPasedefective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2164-2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N.; Hayashi, C.; Takezawa Y.; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132-138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen. Außerdem muss eine aufwendige Optimierung der Vitamin-Konzentrationen erfolgen (Li, Y.; Chen, J.; Lun, S.-Y.; Rui, X.-S. (2001) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis glabrata: key role and optimization of vitamin levels. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 680-685). Von den Erfindern wurde bereits in der DE 101 29 711.4 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat mit Hilfe eines Escherichia coli Stammes YYC202 entwickelt, welches unter geeigneten Versuchsbedingungen eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erlaubt (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose). As an alternative to lactate, glucose is used as a substrate for pyruvate production by means of whole cell biotransformation by yeasts or bacteria, pyruvate being formed primarily by the reactions of glycolysis. For example, Torulopsis glabrata strains with multiple vitamin auxotrophy have been described which produced 1.17 mol pyruvate / mol glucose (Yonehara, T .; Miyata, R. ( 1994 ): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159). The maximum pyruvate concentration achieved with these strains in fed-batch fermentations was 67.8 g / L (0.77 M). A comparable method for pyruvate production from glucose was also used for lipoic acid auxotrophic strains of Enterobacter aerogenes (Yokota A. ( 1989 ): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705-711) and Escherichia coli (Yokota A .; Shimizu, H .; Terasawa Y .; Takaoka, N .; Tomita. F. ( 1994 b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol 41: 638-643). Enterobacter aerogenes strains produced a maximum of 0.8 mol pyruvate per mol glucose, while the Escherichia coli strains produced up to 1.2 mol pyruvate / mol glucose (Yokata A. Shimizu, H .; Terasawa Y .; Takaoka, N .; Tomita. F. ( 1994 a): Pyruvic acid production by an F1-ATPase defective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2164-2167; Yokota, A .; Henmi, M .; Takaoka, N .; Hayashi, C .; Takezawa Y .; Fukumori, Y .; Tomita, F. ( 1997 ): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132-138). The production of pyruvate by pyrolysis of grape acid has the disadvantage that 1. a high energy consumption (boiling point of grape acid: approx. 200 ° C.) arises for the process, and 2. heavy metals are required and 3. grape acid is only available to a limited extent. The disadvantage of the microbial production of pyruvate from lactate is that the substrate must first be produced, e.g. B. with the help of lactic acid bacteria from glucose. The disadvantage of the processes for microbial pyruvate formation from glucose is that the yields achieved are significantly below the maximum theoretically achievable yield. In addition, complex optimization of the vitamin concentrations must be carried out (Li, Y .; Chen, J .; Lun, S.-Y .; Rui, X.-S. ( 2001 ) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis glabrata: key role and optimization of vitamin levels. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 680-685). In DE 101 29 711.4, the inventors have already developed a process for the fermentative production of pyruvate using an Escherichia coli strain YYC202, which, under suitable test conditions, allows almost complete conversion of glucose to pyruvate (≥ 1.9 mol pyruvate / mol glucose ).

Dieses Verfahren basiert auf einem Escherichia coli Stamm YYC202, der eine Deletion der Gene aceEF für die Proteine E₁ und E₂ der Pyruvat-Dehydrogenase besitzt sowie Mutationen in den Genen poxB für die Pyruvat- Oxidase, pflB für die Pyruvat-Formiatlyase und pps für die PEP-Synthetase. Die Pyruvat-Dehydrogenase ist verantwortlich für die Oxidation von Pyruvat zu Acetyl-CoA unter aeroben Bedingungen. Die Pyruvat-Formiat-Lyase katalysiert die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat unter anaeroben Bedingungen und wird bereits bei geringen Sauerstoff-Konzentrationen vollständig inaktiviert. Die Pyruvat-Oxidase katalysiert die Oxidation von Pyruvat zu Acetat und überträgt die Elektronen dabei auf Ubichinon. Das Enzym wird verstärkt in der stationären Phase gebildet und seine Synthese ist abhängig von einem Sigma-Faktor S (RpoS). Die PEP-Synthetase katalysiert die Bildung von Phosphoenolpyruvat, AMP und PP_i aus Pyruvat und ATP. Der Stamm YYC202 ist bei aerobem Wachstum in Glucose-Minimalmedim Acetatauxotroph (Ace^-). Dieser Ace^--Phänotyp beruht darauf, dass vor allem durch das Fehlen der Pyruvat-Dehydrogenase keine Acetyl-Gruppen für Biosynthesen mehr bereitgestellt werden können. E. coli-Mutanten, denen nur die Pyruvat-Dehydrogenase fehlt, zeigen einen ähnlichen Phänotyp, können allerdings nach 6-8 Tagen Inkubation auf Glucose-Minimalmedium-Platten Mikrokolonien bilden. Verantwortlich für die geringe Acetat-Produktion, die die Bildung dieser Mikrokolonien ermöglicht, ist die Pyruvat-Oxidase. Inaktiviert man in einer Pyruvat- Dehydrogenase-Mutante zusätzlich das poxB-Gen, werden keine Mikrokolonien mehr gebildet. Der Stamm E. coli YYC202 bildete ebenfalls nach 6-8 Tagen keine Mikrokolonien auf Glucose-Minimalmedium-Platten ohne Acetat. This method is based on an Escherichia coli strain YYC202, which has a deletion of the genes aceEF for the proteins E ₁ and E ₂ of pyruvate dehydrogenase and mutations in the genes poxB for pyruvate oxidase, pfB for pyruvate formate lyase and pps for the PEP synthetase. Pyruvate dehydrogenase is responsible for the oxidation of pyruvate to acetyl-CoA under aerobic conditions. The pyruvate formate lyase catalyzes the conversion of pyruvate to acetyl-CoA and formate under anaerobic conditions and is completely inactivated even at low oxygen concentrations. Pyruvate oxidase catalyzes the oxidation of pyruvate to acetate and transfers the electrons to ubiquinone. The enzyme is increasingly formed in the stationary phase and its synthesis is dependent on a sigma factor S (RpoS). PEP synthetase catalyzes the formation of phosphoenolpyruvate, AMP and PP _i from pyruvate and ATP. The strain YYC202 is in acetic auxotroph (Ace ^- ) in aerobic growth in minimal glucose medium. This Ace ^- phenotype is based on the fact that, especially due to the lack of pyruvate dehydrogenase, acetyl groups can no longer be provided for biosynthesis. E. coli mutants, which only lack pyruvate dehydrogenase, show a similar phenotype, but can form microcolonies after 6-8 days of incubation on glucose minimal medium plates. Pyruvate oxidase is responsible for the low acetate production that enables the formation of these microcolonies. If the poxB gene is additionally inactivated in a pyruvate dehydrogenase mutant, no more microcolonies are formed. The E. coli YYC202 strain also did not form microcolonies on glucose minimal medium plates without acetate after 6-8 days.

Bei aerobem Wachstum in Minimalmedium mit Glucose und Acetat setzt E. coli YYC202 einen großen Teil der Glucose zu Pyruvat um (bis zu 1.7 Mol Pyruvat/Mol Glucose) und scheidet es ins Medium aus. Unter nicht wachsenden Bedingungen konnte mit E. coli YYC202 sogar ≥ 1.9 Mol Pyruvat/Mol Glucose gebildet werden. Sowohl unter wachsenden wie auch unter nicht wachsenden Bedingungen wird das in der Glykolyse gebildete NADH durch die Atmungskette mit Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor zu NAD⁺ reoxidiert. Unter anaeroben, gärenden Bedingungen ist dagegen eine Umsetzung von Glucose zu Pyruvat aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Reoxidation von NADH nicht möglich. When aerobically grown in minimal medium with glucose and acetate, E. coli YYC202 converts a large part of the glucose to pyruvate (up to 1.7 mol pyruvate / mol glucose) and excretes it into the medium. Under non-growing conditions, E. coli YYC202 could even produce ≥ 1.9 mol pyruvate / mol glucose. Both under growing and non-growing conditions, the NADH formed in glycolysis is reoxidized to NAD ⁺ by the respiratory chain with oxygen as the terminal electron acceptor. Under anaerobic, fermenting conditions, however, a conversion of glucose to pyruvate is not possible due to the lack of possibility for reoxidation of NADH.

Durch Transformation von E. coli YYC202 mit dem Plasmid pGS87 (erhalten von J. R. Guest, University of Sheffield, Great Britain), das die Gene aceEF und lpd (kodierend für die 3. Untereinheit der Pyruvat- Dehydrogenase) von E. coli trägt, konnte die Acetat- Auxotrophie aufgehoben werden und der Stamm produzierte kein Pyruvat mehr. Dies bestätigt, dass insbesondere die Deletion der Gene aceE und aceF für die Pyruvat- Bildung durch E. coli YYC202 verantwortlich ist. By transforming E. coli YYC202 with the plasmid pGS87 (obtained from J.R. Guest, University of Sheffield, Great Britain), which contains the genes aceEF and lpd (coding for the 3rd subunit of the pyruvate E. coli dehydrogenase), the acetate Auxotrophy can be canceled and the strain produced no more pyruvate. This confirms that in particular deletion of the genes aceE and aceF for the pyruvate Education by E. coli YYC202 is responsible.

Alle bisher beschriebenen Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose mit Ausnahme von DE 101 29 711.4 basieren auf Vitamin-auxotrophen, insbesondere Thiamin-auxotrophen Stämmen, z. B. von Torulopsis glabrata oder von E. coli. Dabei wird die Aktivität der Pyruvat-umsetzenden Enzyme, z. B. der Pyruvat-Decarboxylase oder der Pyruvat-Dehydrogenase, durch die Verfügbarkeit der Vitamine kontrolliert. Im Gegensatz dazu besitzt der Stamm E. coli YYC202 gemäß DE 101 29 711.4 keine Vitamin-Auxotrophien und benötigt ausschließlich Acetat als Supplement zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium. All previously described methods for microbial Pyruvate formation from glucose with the exception of DE 101 29 711.4 are based on vitamin auxotrophs, especially thiamine auxotrophic strains, e.g. B. from Torulopsis glabrata or from E. coli. The Activity of the pyruvate-converting enzymes, e.g. B. the Pyruvate decarboxylase or the pyruvate dehydrogenase controls the availability of vitamins. in the In contrast, the strain E. coli according to YYC202 DE 101 29 711.4 no vitamin auxotrophies and required only acetate as a supplement for growth in Glucose minimal medium.

Aus US 5,869,301 ist bekannt, daß die E. coli Mutante AFP-111 mit einem Defekt in den Genen, die für die Pyruvat-Formiat Lyase und die Lactat Dehydrogenase codieren, sowie einer weiteren, unbekannten Mutation, in verstärktem Maße unter anaeroben Bedingungen Malat, Fumarat und Succinat bildet, nicht aber Pyruvat. Es wird in US 5,869,301 allgemein darauf hingewiesen, daß Maßnahmen, die zum Ausschalten von Enzymsystemen des Pyruvatabbaus führen, theoretisch auch eine Anreicherung des Pyruvats verursachen. Ein Hinweis, welche Enzyme speziell ausgeschaltet werden müssen, um gezielt eine Steigerung der Pyruvatproduktion zu erzielen, wird jedoch nicht offenbart. Insbesondere wird aber nicht berücksichtigt, dass eine kontinuierliche Pyruvat-Bildung aus Glucose unter anaeroben, gärenden Bedingungen nicht möglich ist, da die Reoxidation des in der Glykolyse gebildeten NADH nur unter Umsetzung von Pyruvat zu anderen, reduzierteren Verbindungen, wie z. B. Lactat möglich ist. From US 5,869,301 it is known that the E. coli mutant AFP-111 with a defect in the genes responsible for the Pyruvate formate lyase and the lactate dehydrogenase code, as well as another, unknown mutation, in increased degree under anaerobic conditions malate, Fumarate and succinate forms, but not pyruvate. It will generally indicated in US 5,869,301 that Measures to switch off the enzyme systems of the Pyruvate breakdown, theoretically also an enrichment of pyruvate. An indication of which enzymes specifically need to be turned off to target one To achieve an increase in pyruvate production however not disclosed. In particular, however, will not takes into account that continuous pyruvate formation not from glucose under anaerobic, fermenting conditions is possible because the reoxidation of the in glycolysis formed NADH only with the conversion of pyruvate other, reduced compounds, such as e.g. B. Lactate is possible.

Wie in DE 101 29 711.4 beschrieben, konnte durch Ausschaltung Pyruvat abbauender Enzyme eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erreicht werden (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose). Bei aerober Kultivierung von E. coli YYC202 in Gegenwart hoher Glucose- Konzentrationen wurde neben Pyruvat jedoch auch Lactat gebildet. Dies reduziert die Ausbeute an Pyruvat und erschwert zusätzlich dessen Aufreinigung. As described in DE 101 29 711.4, could Elimination of pyruvate-degrading enzymes almost complete conversion of glucose to pyruvate achieved (≥ 1.9 moles pyruvate / mole glucose). At aerobic Cultivation of E. coli YYC202 in the presence of high glucose In addition to pyruvate, lactate was also used educated. This reduces the yield of pyruvate and additionally complicates its purification.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, welches die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweist. It is therefore an object of the invention to provide a method create which does not have the disadvantages mentioned above has more.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 12, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 12 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 13, gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 13 angegebenen Merkmalen. Starting from the preamble of claim 1 Task solved according to the invention, with in the characterizing Features specified in claim 1. The task continues to be solved, starting from the generic term of Claim 12, with the in the characterizing part of Claim 12 specified features. Furthermore, the Task, starting from the preamble of claim 13, solved with the in the characterizing part of the claim 13 specified characteristics.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungsgemäßen Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden überraschenderweise heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind oder eine verringerte Aktivität aufweisen, das zusätzliche Ausschalten der Enzymaktivität der NAD⁺-abhängigen D-Lactat-Dehydrogenase zu einer weiteren Steigerung der Pyruvatproduktion führt. Diese D-Lactat-Dehydrogenase wird im folgenden auch unter der Bezeichnung LDH zusammengefaßt. Der im folgenden verwendete Begriff "Ausschalten" beinhaltet die völlige Hemmung der Synthese von LDH bzw. die Inaktivierung des für die D-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme. With the method according to the invention and the microorganisms according to the invention, it is now possible to produce an increased concentration of pyruvate compared to conventional methods. The inventors surprisingly found that when using microorganisms in which the pyruvate dehydrogenase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase are inactivated or have a reduced activity, the additional deactivation of the enzyme activity of the NAD ⁺ -dependent D-lactate- Dehydrogenase leads to a further increase in pyruvate production. This D-lactate dehydrogenase is also summarized below under the name LDH. The term "deactivation" used in the following includes the complete inhibition of the synthesis of LDH or the inactivation of the gene coding for D-lactate dehydrogenase or the reduction or deactivation of the intracellular activity of the enzymes mentioned.

Die für die LDH kodierende Gensequenz ist aus der Literatur bereits bekannt (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187-195.). Dieses Gen wird im folgenden unter der Bezeichnung "ldhA-Gensequenz" zusammengefaßt. Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine LDH codierende Nukleotidsequenzen entfernt oder in ihrer Expression reduziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel die für die LDH kodierende ldhA-Gensequenz im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind dem Fachmann z. B. aus Link A. J., Philips D., Church G. M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-Type Escherichia coli: application to open reading frame charaterization. J. Bacteriol. 179: 6228-6237, oder auch aus Datsenko K. A., Wanner W. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645, bekannt. Auch können nur Teile der ldhA-Gensequenz deletiert werden, oder auch mutierte Fragmente der ldhA-Gensequenz ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der LDH-Aktivität erreicht. Durch Transduktion mit dem Phagen P1 konnte das intakte ldhA-Gen von E. coli YYC202 durch ein defektes ldhA-Gen aus dem Stamm E. coli NZN117 (erhalten von D. P. Clark, Dep. of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) ersetzt werden. Die entsprechenden Protokolle sind für E. coli gut etabliert (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). Durch Inaktivierung des ldhA-Gens wird ein völliger Verlust der LDH-Aktivität erreicht. The gene sequence coding for the LDH is already known from the literature (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP ( 1997 ) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195.). This gene is summarized below under the name "ldhA gene sequence". With the aid of directed recombinant DNA techniques, nucleotide sequences coding for an LDH can be removed or their expression reduced. These methods can be used, for example, to delete the LDHA gene sequence coding for the LDH in the chromosome. Suitable methods for this are the expert z. B. from Link AJ, Philips D., Church GM ( 1997 ) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-Type Escherichia coli: application to open reading frame charaterization. J. Bacteriol. 179: 6228-6237, or also from Datsenko KA, Wanner WL ( 2000 ) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645. Also, only parts of the ldhA gene sequence can be deleted or mutated fragments of the ldhA gene sequence can be exchanged. Deletion or exchange results in a loss or reduction in LDH activity. By transduction with phage P1, the intact ldhA gene from E. coli YYC202 could be replaced by a defective ldhA gene from strain E. coli NZN117 (obtained from DP Clark, Dep. Of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) become. The corresponding protocols are well established for E. coli (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. ( 1984 ) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). By inactivating the ldhA gene, a complete loss of LDH activity is achieved.

Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der Escherichia coli Stamm YYC202ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 unter der Bezeichnung DSM 14863, der eine Insertion in der ldhA-Gensequenz trägt. An example of such a mutant is Escherichia coli strain YYC202ldhA, deposited on March 12, 2002 under the designation DSM 14863, which an insertion in that carries the idha gene sequence.

Eine weitere Möglichkeit die Aktivität der LDH abzuschwächen oder auszuschalten sind Mutageneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden. Another possibility is the activity of the LDH weaken or switch off mutagenesis procedures. These include undirected chemical processes Reagents such as B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or also use UV radiation for mutagenesis. Procedures for mutation triggering and mutant search are generally known and can be found among others at Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) or in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology "of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Darüber hinaus kann auch die Expression der ldhA-Gensequenz reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionsregulationskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen Pyruvatproduktion zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Des weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität kodieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression der ldhA-Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. In addition, the expression of ldhA gene sequence can be reduced. So the promoter and Regulatory region located upstream of the Structural gene located to be mutated. Work in the same way Expression regulatory cassettes upstream of the Structural gene can be installed. With adjustable It is also possible for promoters to express in Course of fermentative pyruvate production to reduce. In addition, there is also a regulation of Translation possible by, for example, the Stability of the m-RNA is reduced. Furthermore, genes be used with the corresponding enzyme encode low activity. Alternatively, you can continue reduced expression of the ldhA gene sequence Change in media composition and culture management can be achieved.

Die LDH katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Lactat mit NADH als Coenzym und wird durch Pyruvat allosterisch aktiviert (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587-2596). Der apparente K_m-Wert für Pyruvat liegt je nach pH-Wert zwischen 4.4 mM (pH 6.7) und 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvatecontrolled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587-2596.). Diese Konzentrationen werden in E. coli- Wildtyp-Stämmen unter aeroben Bedingungen normalerweise nicht erreicht. Die Expression des ldhA-Gens wird unter anaeroben Bedingungen durch einen niedrigen pH-Wert induziert, unter aeroben Bedingungen gibt es eine pH-unabhängige Expression (Jiang, G. R., Nikolova, S. and Clark D. P. (2001) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 147: 2437-2446.). Pyruvat stimuliert die Expression des ldhA-Gens 2- bis 4-fach (Jiang et al. 2001). Die signifikante Bildung von Lactat bei Kultivierung von E. coli YYC202 mit hohen Glucose- Konzentrationen kann wie folgt erklärt werden: Durch die Blockade des Pyruvat-Abbaus kommt es zu einer Akkumulation von Pyruvat, die einerseits eine verstärkte Expression des ldhA-Gens bewirkt und andererseits die Aktivität des Enzyms stimuliert. Eine signifikante Lactat Bildung wird in Schüttelkolben-Ansätzen ab einer Glucose-Konzentration von 50 mM beobachtet, während sie bei Fermentationen bereits ab Glucose-Konzentrationen von ca. 5 mM beobachtet wird. Um die Lactat-Bildung zu unterbinden, wurde in der vorliegenden Erfindung beispielsweise ein Derivat des Stammes Escherichia coli YYC202 konstruiert, bei dem das ldhA-Gen durch Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz inaktiviert wurde. The LDH catalyzes the reduction of pyruvate to lactate with NADH as coenzyme and is activated allosterically by pyruvate (Tarmy, EM and Kaplan, NO ( 1968 ) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J Biol. Chem. 243: 2587-2596). The apparent K _m value for pyruvate is, depending on the pH value, between 4.4 mM (pH 6.7) and 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, EM and Kaplan, NO ( 1968 ) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587-2596.). These concentrations are normally not reached in wild-type E. coli strains under aerobic conditions. The expression of the ldhA gene is induced under anaerobic conditions by a low pH, under aerobic conditions there is a pH-independent expression (Jiang, GR, Nikolova, S. and Clark DP ( 2001 ) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 147 : 2437-2446.). Pyruvate stimulates the expression of the ldhA gene 2 to 4 times (Jiang et al. 2001). The significant formation of lactate when cultivating E. coli YYC202 with high glucose concentrations can be explained as follows: The blocking of pyruvate degradation leads to an accumulation of pyruvate, which on the one hand causes an increased expression of the ldhA gene and on the other hand stimulates the activity of the enzyme. Significant lactate formation is observed in shake flask batches from a glucose concentration of 50 mM, while in fermentations it is already observed from glucose concentrations of approximately 5 mM. To prevent lactate formation, for example, a derivative of the strain Escherichia coli YYC202 was constructed in the present invention in which the ldhA gene was inactivated by inserting a kanamycin resistance gene into the open reading frame of the ldhA gene sequence.

Escherichia coli YYC202 ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279-1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756-762; Georgiou, D. Ch.; Fang, H.; Gennis, R. B. (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107-2112). Für das Verfahren geeignet sind Bakterien und Hefen, insbesondere gram-negative Bakterien, bevorzugt aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia coli. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14863, erwiesen, der wie in oben beschriebener Weise verändert wurde. Escherichia coli YYC202 is described in the literature with regard to its genetic properties (Chang, YY .; Cronan, JE ( 1982 ): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279-1289; Chang, YY .; Cronan, JE ( 1983 ): Genetic and biochemical analyzes of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 ( 5 ): 756-762 ; Georgiou, D. Ch .; Fang, H .; Gennis, RB ( 1987 ): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrome d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107 -2112). Suitable for the process are bacteria and yeasts, in particular gram-negative bacteria, preferably from the Enterobacteriaceae family, such as, for example, B. Escherichia coli. The strain Escherichia coli YYC202ldhA, deposited on March 12, 2002 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under DSM number 14863, has proven to be particularly suitable and was modified as described above.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte die Bildung von Lactat als Stoffwechselendprodukt verhindert und durch Ausschalten der Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, und Phosphoenolpyruvat-Synthetase und zusätzlichem Ausschalten der LDH die Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen in Pyruvat signifikant verbessert werden. Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. With the method according to the invention, the formation prevented by lactate as a metabolic end product and by switching off the pyruvate dehydrogenase enzymes, Pyruvate oxidase, and phosphoenolpyruvate synthetase and additionally switching off the LDH the implementation high Significant glucose concentrations in pyruvate be improved. The microorganisms in the Processes according to the invention can be used, pyruvate for example from carbohydrates such as B. glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, Starch, cellulose, or from alcohols such as. B. Glycerin produce. These substances can be used individually or as Mixture can be used.

Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden. Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen werden aerob durchgeführt. Continuous or discontinuous in batch process (Set cultivation) or in fed-batch (feed process) or repeated fed-batch process (repetitive feed process) for Pyruvate production purposes. The culture medium to be used must be suitable meet the requirements of the microorganisms. The Fermentations are carried out aerobically.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Advantageous further developments are in the Subclaims specified.

Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoffwechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens. The figures show an overview of the Pyruvate pathway and experimental results of inventive method.

Es zeigt: It shows:

Fig. 1 Schema der Umsetzung von Glucose in Pyruvat in E. coli YYC202ldhA. Nach Aufnahme von Glucose durch das Phosphoenolpyruvat-abhängige Phosphotransferase-System (PTS) wird Glucose-6-phosphat in den Reaktionen der Glykolyse zu Pyruvat umgesetzt. Aufgrund der genetischen Defekte in den Genen aceEF, pflB, poxB, und ldhA kann Pyruvat nicht weiter umgesetzt werden und wird ins Medium ausgeschieden. Fig. 1 scheme of the implementation of glucose in pyruvate in E. coli YYC202ldhA. After glucose has been taken up by the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS), glucose-6-phosphate is converted into pyruvate in the reactions of glycolysis. Due to the genetic defects in the genes aceEF, PflB, poxB, and ldhA, pyruvate can no longer be converted and is excreted in the medium.

Fig. 2 Southern-Blot-Analyse (Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.) von E. coli YYC202ldhA. Fig. 2 Southern blot analysis (Southern, EM ( 1975 ) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.) By E. coli YYC202ldhA.

Die Spuren 1, 5 und 6 enthalten je 75 ng Digoxigeninmarkierten DNA-Standard. Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von E. coli YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale DNA von E. coli YYC202 ldhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von E. coli NZN117. Es wurden jeweils 15 µg chromosomale DNA, die mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, pro Spur aufgetrennt. Der Blot mit den Spuren 1-5 wurde mit einem Digoxigeninmarkierten 2153-bp DNA-Fragment mit dem E. coli ldhA- Gen hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6-10 mit einem Digoxigeninmarkierten 668-bp Fragment mit dem Kanamycin-Resistenzgen aus E. coli NZN117. Die DNA- Fragmente wurden auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt und nach Denaturierung auf eine Nylon-Membran geblottet. Die Markierung der Sonden mit Digoxigenin, Hybridisierung, Waschen und Detektion der Sonden mit CDP-Star erfolgten mit dem DIG-Chemlink-Labeling-and- Detektion-Kit (Roche Diagnostics) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Wie erwartet, wurde mit der ldhA-Sonde in E. coli YYC202 ein 11 kb EcoRI-HindIII- Fragment detektiert, in E. coli YYC202 ldhA und E. coli NZN117 dagegen Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb. Mit der kan-Sonde wurde erwartungsgemäss kein Signal in E. coli YYC202 detektiert, in YYC202 ldhA und NZN117 dagegen wiederum Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb. Lanes 1 , 5 and 6 each contain 75 ng digoxigenin-labeled DNA standard. Lanes 2 and 7 contain chromosomal DNA from E. coli YYC202, lanes 3 and 8 chromosomal DNA from E. coli YYC202 ldhA and lanes 4 and 9 chromosomal DNA from E. coli NZN117. 15 µg of chromosomal DNA, which had been digested with EcoRI and HindIII, were separated per lane. The blot with lanes 1-5 was hybridized with a digoxigenin-labeled 2153 bp DNA fragment with the E. coli ldhA gene, the blot with lanes 6-10 with a digoxigenin-labeled 668 bp fragment with the kanamycin resistance gene from E coli NZN117. The DNA fragments were separated on a 1% agarose gel and blotted onto a nylon membrane after denaturation. Labeling of the probes with digoxigenin, hybridization, washing and detection of the probes with CDP-Star were carried out using the DIG chemlink labeling and detection kit (Roche Diagnostics) in accordance with the manufacturer's instructions. As expected, an 11 kb EcoRI-HindIII fragment was detected with the ldhA probe in E. coli YYC202, whereas fragments of 6.2 kb and 6.8 kb were detected in E. coli YYC202 ldhA and E. coli NZN117. As expected, no signal was detected in E. coli YYC202 with the kan probe, whereas fragments of 6.2 kb and 6.8 kb were again detected in YYC202 ldhA and NZN117.

Fig. 3 Umsetzung von Glucose (▪) zu Pyruvat (▴) und ggf. Lactat (.) durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 (A) und E. coli YYC202ldhA (B). Fig. 3 conversion of glucose (▪) to pyruvate (▴) and possibly lactate (.) By cell suspensions of E. coli YYC202 (A) and E. coli YYC202ldhA (B).

Die Abszisse X gibt die Zeit in Stunden an und die Ordinate Y die Konzentration von Glucose, Pyruvat, bzw. Lactat in mM. The abscissa X indicates the time in hours and the Ordinate Y the concentration of glucose, pyruvate, or Lactate in mM.

Die Zellen wurden in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert, dann mit 0.9%-iger NaCl-Lösung gewaschen und anschließend zu einer OD₆₀₀ von 7.4 (YYC202) bzw. 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS-Puffer pH 7.0 mit 100 mM bzw. 88 mM Glucose resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Die Glucose-Konzentration wurde in einem gekoppelten enzymatischen Test mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bestimmt (Bergmeyer, H. U. (1984) Methods of enzymatic analysis, 3^rd edition. Vol. VI: Metabolites 1: Carbohydrates, Seiten 163-172. Verlag Chemie, Weinheim.). Pyruvat und Lactat wurden durch HPLC-Analyse mit einer Aminex HPX-87H-Säule (Bio- Rad) und UV-Detektion bei 215 nm bestimmt. The cells were precultivated in M9 minimal medium with glucose and acetate, then washed with 0.9% NaCl solution and then with an OD ₆₀₀ of 7.4 (YYC202) or 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS buffer pH 7.0 100 mM or 88 mM glucose resuspended. The cell suspensions were incubated in shake flasks at 37 ° C and 140 rpm. The glucose concentration was measured in a coupled enzymatic assay with hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase determined (Bergmeyer, HU (1984) Methods of Enzymatic Analysis, 3 ^rd edition Vol VI:.. Metabolites 1: Carbohydrates, pp 163-172 Verlag Chemie, Weinheim.). Pyruvate and lactate were determined by HPLC analysis with an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad) and UV detection at 215 nm.

Fig. 4 Fed-batch-Fermentation von E. coli YYC202 und E. coli YYC202ldhA. Fig. 4 Fed batch fermentation of E. coli YYC202 and E. coli YYC202ldhA.

Die Abszisse X gibt die Fermentationszeit in Stunden an und die Ordinate Y in A die optische Dichte OD₆₀₀ bzw. in B die Konzentration von Pyruvat bzw. Lactat in mM. Die Stämme wurden in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und konstant pH 7 (pH-Regulation) in einem synthetischen Medium kultiviert. Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines "On-line General Analyzer" konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO₂-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. In A ist das Wachstum von E. coli YYC202 (.) und E. coli YYC202 ldhA (▪) dargestellt. In B wird die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202 (.) und E. coli YYC202 ldhA (▪) sowie die Lactatbildung durch E. coli YYC202 (○) und E, coli YYC202 ldhA (□) dargestellt. The abscissa X indicates the fermentation time in hours and the ordinate Y in A the optical density OD ₆₀₀ or in B the concentration of pyruvate or lactate in mM. The strains were cultivated in a 7.5 l laboratory fermenter under aerobic conditions (pO2> 40% saturation) at 37 ° C and constant pH 7 (pH regulation) in a synthetic medium. The glucose concentration was kept constant at about 5 mM using an on-line general analyzer. The acetate was added in excess, the CO ₂ concentration in the exhaust gas being used for regulation. A shows the growth of E. coli YYC202 (.) And E. coli YYC202 ldhA (▪). In B the pyruvate formation is represented by E. coli YYC202 (.) And E. coli YYC202 ldhA (▪) and the lactate formation by E. coli YYC202 (○) and E, coli YYC202 ldhA (□).

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden. The invention is intended to serve as an example below to be discribed.

Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der LDH verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte bei Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen einem gegenüber z. B. aus DE 101 29 711.4 bekannten Verfahren, erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Mit ruhenden Zellen konnte die Ausbeute an Pyruvat bei Umsetzung von 100 mM Glucose um 20% gesteigert werden. Bei Fermenationen im fed-batch-Verfahren konnte die nach 37 h erreichte Pyruvat-Konzentration um 40% gesteigert werden. Als Mikroorganismen können sowohl Hefen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganismen aus der Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist z. B. aus DE 101 29 711.4 bekannt, dass folgende Gensequenzen verändert wurden: aceEF - kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase, poxB - kodierend für die Pyruvat-Oxidase; pps - kodierend für die Phosphoenolpyruvat-Synthetase; pflB - kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase. In überraschender Weise erzielte das zusätzliche Ausschalten der LDH in Form von z. B. einer Insertion eines Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz, wie für Escherichia coli YYC202ldhA beschrieben, eine weitere deutliche Steigerung der Pyruvatproduktion. Das Ausschalten der Gensequenzen kodierend für die Pyruvat- Dehydrogenase, die Pyruvat-Oxidase die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die LDH, wird für eine verbesserte Pyruvatproduktion als besonders vorteilhaft angesehen. By using microorganisms, their activity the LDH has been reduced or completely inactivated, could with high glucose concentrations one opposite z. B. known from DE 101 29 711.4 Processes, increased pyruvate production can be achieved. With The yield of pyruvate was able to contribute to resting cells Implementation of 100 mM glucose can be increased by 20%. In the case of fermentations in the fed-batch process, the after 37 h pyruvate concentration reached 40% be increased. As microorganisms, both Yeasts as well as bacteria can be used. Microorganisms from the Enterobacteriaceae family, especially from the genus Escherichia have proven to be special proven suitable. In particular, the Organism Escherichia coli YYC202 as very suitable proved. This bacterial strain points towards that Wild type strain (WT) some genetic changes. So is z. B. from DE 101 29 711.4 that the following Gene sequences were changed: aceEF - coding for the subunits E1 and E2 of pyruvate dehydrogenase, poxB - coding for pyruvate oxidase; pps - coding for phosphoenolpyruvate synthetase; pfB - coding for the pyruvate formate lyase. In The additional switching off of the LDH surprisingly achieved in the form of e.g. B. an insertion of a resistance gene in the open reading frames of the idhA gene sequence as for Escherichia coli YYC202ldhA described another significant increase in pyruvate production. The Switching off the gene sequences coding for the pyruvate Dehydrogenase, the pyruvate oxidase Phosphoenolpyruvate synthetase, as well as the LDH, is being improved for Pyruvate production is considered to be particularly advantageous.

Mit ruhenden Zellen konnte eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. Dabei konnte in DE 101 29 711.4 gezeigt werden, dass die Acetat-Verbrauchsrate identisch ist mit der CO₂ -Bildungsrate. Über diese Korrelation lässt sich anhand der online-messbaren CO₂-Konzentration im Abgas die Acetat- Verbrauchsrate bestimmen und regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute mit wachsenden Zellen nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. "ruhende" Zellen. Diese Zellen werden durch Kultivierung in einem Medium erhalten, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate, insbesondere Hexosen, sowie Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen. With resting cells it was possible to convert the substrate into pyruvate, which was considerably higher than the yields achieved with previously known processes. Due to the genotype, the organisms are unable to convert pyruvate to acetyl-CoA, acetate or phosphoenolpyruvate. This acetate auxotrophy allows growth and product formation to be regulated by dosing the essential co-substrate acetate. It could be shown in DE 101 29 711.4 that the acetate consumption rate is identical to the CO ₂ formation rate. This correlation can be used to determine and regulate the acetate consumption rate based on the online measurable CO ₂ concentration in the exhaust gas. In the presence of acetate and other nutrients such as. B. Nitrogen in the fermentation medium can take place due to metabolism cell division / growth. However, since part of the carbon source is used for the biosynthesis of new cell material during growth, a maximum pyruvate yield with growing cells is not to be expected. This is possible with cells which, due to the media conditions, do not perform biosynthesis for the purpose of forming new cell material, ie "resting" cells. These cells are obtained by culturing in a medium in which a high cell concentration can be formed. Then the cells are z. B. harvested by centrifugation and placed in a medium which contains no acetate and no other nutrients required for growth, such as. B. contains nitrogen. Under these conditions, an even higher pyruvate yield can be achieved. Carbohydrates, in particular hexoses, and alcohols are suitable as carbon sources. In order to ensure the economic viability of the process, substrates which are obtained as waste materials or are directly available are preferred, ie do not have to be pretreated or produced in a special way for further processing for the process according to the invention.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. ¹³C-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf die Produktion weiterer vom Pyruvat abgeleiteter Stoffwechselprodukte auswirken. So kann z. B. durch das Einbringen eines Gens für die L-Alanin-Dehydrogenase und in Gegenwart hoher Ammonium-Konzentrationen unter anaeroben Bedingungen eine Homoalanin-Gärung etabliert werden, bei der 1 Mol Glucose und 2 Mol Ammonium zu 2 Mol L-Alanin umgesetzt wird. The process according to the invention can furthermore be used, for example, to produce labeled pyruvate in high yields, for B. ¹³ C-labeled carbon sources can be used. The economy of this process is significantly improved by the high product yields. The method according to the invention can additionally have a positive effect on the production of further metabolic products derived from pyruvate. So z. B. by introducing a gene for L-alanine dehydrogenase and in the presence of high ammonium concentrations under anaerobic conditions, a homoalanine fermentation can be established in which 1 mole of glucose and 2 moles of ammonium is converted to 2 moles of L-alanine.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. The present invention will hereinafter be described with reference to Embodiments explained in more detail.

1. Construction of a derivative of E. coli YYC202 with defective ldhA gene

Zur Inaktivierung des ldhA-Gens wurde das offene Leseraster durch ein Kanamycin-Resistenzgen unterbrochen. Die entsprechende Mutation wurde durch P1-Transduktion (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) aus dem Donorstamm E, coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187-195.) in E. coli YYC202 transferiert. Die erfolgreiche Transduktion wurde durch Southern- Blot-Analyse bestätigt (Fig. 2). Die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität (LDH-Aktivität) im Ausgangsstamm YYC202 und im Derivat YYC202ldhA wurde nach 6-stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0.4% (w/v) Glucose bestimmt. Dazu wurden zellfreie Extrakte hergestellt, die Membranfraktion durch Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche Fraktion in einen Enzymtest eingesetzt, bei dem die pyruvatabhängige Oxidation von NADH zu NAD⁺ spektrophotometrisch anhand der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187-195). E. coli YYC202 besass eine hohe Lactat-Dehydrogenase-Aktivität von 3.1 µmol min^-1 mg Protein^-1, während E. coli YYC202ldhA eine Aktivität von < 0.01 µmol min^-1 mg Protein^-1 zeigte. To inactivate the ldhA gene, the open reading frame was interrupted by a kanamycin resistance gene. The corresponding mutation was determined by P1 transduction (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. ( 1984 ) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) From donor strain E, coli NZN117 (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP ( 1997 ) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195.) Transferred to E. coli YYC202 , Successful transduction was confirmed by Southern blot analysis ( Fig. 2). The lactate dehydrogenase activity (LDH activity) in the parent strain YYC202 and in the derivative YYC202ldhA was determined after 6 hours of cultivation in LB medium with 0.4% (w / v) glucose. Cell-free extracts were prepared, the membrane fraction was removed by ultracentrifugation and the soluble fraction was used in an enzyme test in which the pyruvate-dependent oxidation of NADH to NAD ^{+ was} measured spectrophotometrically on the basis of the decrease in absorbance at 340 nm (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP ( 1997 ) The ida gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195). E. coli YYC202 had a high lactate dehydrogenase activity of 3.1 µmol min ^-1 mg protein ^-1 , whereas E. coli YYC202ldhA showed an activity of <0.01 µmol min ^-1 mg protein ^-1 .

2. Glucose conversion by resting cells from E. coli YYC202 and E. coli YYC202ldhA

Die Stämme E. coli YYC202 und E. coli YYC202ldhA wurden in Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in einem Puffer (500 mM MOPS, pH 7.0) mit circa 100 mM Glucose resuspendiert, und in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Wie in Fig. 3A dargestellt, wurde die Glucose im Stamm YYC202 anfänglich mit annähernd gleicher Rate zu Pyruvat und Lactat umgesetzt. Nach dem Verbrauch der Glucose wurde das gebildete Lactat langsam zu Pyruvat reoxidiert. Im Stamm YYC202 ldhA wurde dagegen die Glucose mit konstanter Rate zu Pyruvat umgesetzt, aber kein Lactat gebildet (Fig. 3B). The strains E. coli YYC202 and E. coli YYC202ldhA were precultivated in minimal medium with glucose and acetate. The cells were then washed, resuspended in a buffer (500 mM MOPS, pH 7.0) with approximately 100 mM glucose, and incubated in shaking flasks at 37 ° C. and 140 rpm. As shown in Fig. 3A, the glucose in strain YYC202 was initially converted to pyruvate and lactate at approximately the same rate. After consumption of the glucose, the lactate formed was slowly reoxidized to pyruvate. In contrast, in the strain YYC202 ldhA, the glucose was converted to pyruvate at a constant rate, but no lactate was formed ( FIG. 3B).

3. Growth and product formation at fed-batch cultivation of E. coli YYC202 and E. coli YYC202 ldhA in Glucose minimal medium

Für die fed-batch-Fermentation wurden die Stämme in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und pH 7 (geregelt) in einem synthetischen Medium kultiviert (pro Liter 1.5 g NaH₂PO₄ × H₂O; 3.25 g KH₂PO₄; 2.5 g K₂HPO₄; 0.2 g NH₄Cl; 2 g (NH₄)SO₄; 0.5 g MgSO₄; 10 mg CaCl₂ × 2H₂O; 0.5 mg ZnSO₄ × 7H₂O l^-1; 0.25 mg CuCl₂ × 2H₂O; 2.5 mg MnSO₄ × H₂O; 1.75 mg CoCl₂ × 6H₂O; 1.25 mg H₃BO₃; 2.5 mg AlCl₃ × 6H₂O; 0.5 mg Na₂MoO₄ × 2H₂O; 10 mg FeSO₄). Die Glucose- Konzentration wurde mit Hilfe eines "On-line General Analyzer" konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat- Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO₂-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. Es war zuvor gezeigt worden, dass die Acetat-Verbrauchsrate gleich der CO₂-Bildungsrate ist (Deutsche Patent- Anmeldung 101 29 711.4). Bei den in Fig. 4A und 4B dargestellten Experimenten zeigten beide Stämme annähernd gleiches Wachstumsverhalten, unterschieden sich aber deutlich hinsichtlich Pyruvat- und Lactat-Bildung. Der Ausgangsstamm YYC202 hatte nach 37 h 487 mM Pyruvat und 341 mM Lactat gebildet, während der Stamm YYC202ldhA nach 37 h 673 mM Pyruvat, aber kein Lactat gebildet hatte. For fed-batch fermentation, the strains were cultivated in a 7.5 l laboratory fermenter under aerobic conditions (pO2> 40% saturation) at 37 ° C and pH 7 (controlled) in a synthetic medium (1.5 g NaH ₂ PO ₄ per liter × H ₂ O; 3.25 g KH ₂ PO ₄ ; 2.5 g K ₂ HPO ₄ ; 0.2 g NH ₄ Cl; 2 g (NH ₄ ) SO ₄ ; 0.5 g MgSO ₄ ; 10 mg CaCl ₂ × 2H ₂ O; 0.5 mg ZnSO ₄ × 7H ₂ O l ^-1 ; 0.25 mg CuCl ₂ × 2H ₂ O; 2.5 mg MnSO ₄ × H ₂ O; 1.75 mg CoCl ₂ × 6H ₂ O; 1.25 mg H ₃ BO ₃ ; 2.5 mg AlCl ₃ × 6H ₂ O; 0.5 mg Na ₂ MoO ₄ × 2H ₂ O; 10 mg FeSO ₄ ). The glucose concentration was kept constant at about 5 mM using an on-line general analyzer. The acetate was added in excess, the CO ₂ concentration in the exhaust gas being used for regulation. It had previously been shown that the acetate consumption rate is equal to the CO ₂ formation rate (German patent application 101 29 711.4). In the experiments shown in FIGS. 4A and 4B, both strains showed approximately the same growth behavior, but differed significantly in terms of pyruvate and lactate formation. The starting strain YYC202 had formed 487 mM pyruvate and 341 mM lactate after 37 hours, while the strain YYC202ldhA had formed 673 mM pyruvate but no lactate after 37 hours.

4. Control experiment with E. coli NZN117

Um auszuschließen, dass die ldhA-Mutation im Stamm E. coli YYC202-ldhA für die Pyruvat-Bildung verantwortlich ist, wurde der Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187-195.) in Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Zu keinem Zeitpunkt während des Wachstums und in der stationären Phase konnte Pyruvat im Kulturüberstand detektiert werden. Dies zeigt, dass eine ldhA-Mutation unter den genannten Bedingungen nicht zur Exkretion von Pyruvat führt. In E. coli YYC202ldhA ist dafür vielmehr die Deletion der aceEF- Gene für zwei Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase sowie die Inaktivierung des Gens poxB für die Pyruvat- Oxidase verantwortlich. To rule out that the ldhA mutation in strain E. coli YYC202-ldhA is responsible for pyruvate formation, the donor strain E. coli NZN117 (Bunch, PK, Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, DP ( 1997 ) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195.) In minimal medium with 10 mM glucose and 2 mM acetate at 37 ° C and 140 rpm. At no point during growth and in the stationary phase could pyruvate be detected in the culture supernatant. This shows that an ldhA mutation does not lead to the excretion of pyruvate under the conditions mentioned. In E. coli YYC202ldhA, the deletion of the aceEF genes for two subunits of pyruvate dehydrogenase and the inactivation of the poxB gene for pyruvate oxidase are responsible.

Claims

1. Process for the microbial production of pyruvate from carbohydrates and alcohols using microorganisms in which the pyruvate dehydrogenase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase are inactivated and / or have a reduced activity, characterized in that the D- Lactate dehydrogenase is turned off and these microorganisms are used.

2. The method according to claim 1, characterized in that expression of the ldhA gene sequence decreased and / or the ldhA gene sequence is changed so that no expression takes place or that the ldhA Gene sequence is deleted.

3. The method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that into the open reading frame of the ldhA gene sequence Resistance gene is incorporated.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that Microorganisms from the group of Enterobacteriaceae can be used.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that Microorganisms from the genus Escherichia be used.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that Escherichia coli YYC202ldhA, deposited under the designation DSM 14863, is used.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that as a substrate in fermentation carbohydrates, or alcohols are used.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that Acetate in fermentation with growing cells is used.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that no acetate in fermentations with resting cells is used.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that a CO ₂ measurement analysis is used in the fermentations.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that an aerobic fermentation is carried out.

12. Process for the production of metabolic products, derived from pyruvate, characterized in that performed a method according to claims 1 to 11 an anaerobic fermentation is carried out becomes.

13. Microorganism for the microbial production of Pyruvate from carbohydrates and alcohols in the pyruvate dehydrogenase, phosphoenolpyruvate Synthetase and the pyruvate oxidase inactivated are and / or have reduced activity, characterized in that he switched off D-lactate dehydrogenase having.

14. Microorganism according to claim 13, characterized in that expression of the ldhA gene sequence decreased and / or the ldhA gene sequence is changed such that no expression takes place or the ldhA Gene sequence is deleted.

15. Microorganism according to one of claims 13 to 14, characterized in that an insertion in the open reading frame of the ldhA Has gene sequence.

16. Microorganism according to one of claims 13 to 15, characterized in that he inserted an resistance gene in the open Has reading frame of the ldhA gene sequence.

17. Microorganism according to one of claims 13 to 16, characterized in that he comes from the Enterobacteriacea family.

18. Microorganism according to one of claims 13 to 17, characterized in that it comes from the genus Escherichia.

19. Microorganism according to one of claims 13 to 18, deposited with the DSMZ under the DSM no. 14,863th