WO2012104233A1 - Method for producing 2, 3-butanediol by fermentation - Google Patents

Method for producing 2, 3-butanediol by fermentation Download PDF

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Abstract

The invention relates to a production strain for producing 2, 3-butanediol. Said production strain can be obtained from an original strain and has, under production conditions of 2, 3-butanediol, a glucose dehydrogenase enzyme activity which is not present in the original strain or only present under physiological conditions which are different from the production conditions of 2, 3-butanediol. The invention also relates to a method for producing 2, 3-butanediol (2, 3-BDL) by fermentation by means of said type of production strain.

Description

Verfahren z fermentativen Herstellung von 2 , 3-Butandiol Process z fermentative production of 2, 3-butanediol
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2, 3-Butandiol (2,3-BDL) mittels eines verbesserten Mikroorganismenstammes , der gegenüber dem nicht verbesserten Ausgangsstamm die Enzyraaktivität einer Glucose Dehydrogenase (GDH) , bzw. eine erhöhte Enzymaktivität einer Glucose Dehydrogenase aufweist. Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe. The invention relates to a process for the fermentative production of 2,3-butanediol (2,3-BDL) by means of an improved microorganism strain which has the enzyraactivity of a glucose dehydrogenase (GDH) or an increased enzyme activity of a glucose dehydrogenase compared to the non-improved starting strain , Due to rising crude oil prices, the production costs of the resulting petrochemical raw materials for the chemical industry are also increasing. This results in a growing interest in alternative production processes for chemical raw materials, especially based on renewable raw materials.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2- Baustein) , Glycerin, 1, 3-Propandiol, 1, 2-Propandiol (C3- Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol 1,4- Butandiol oder auch 2 , 3-Butandiol {C4-Bausteine} . Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Dabei ist ent- scheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen das gewünschte Produkt in hoher Konzentration und unter geringer Nebenproduktbildung aus dem biogenen Rohstoff herstellen. Die Optimierung der als Produktionsstämme bezeichneten Mikroorganismen in Bezug auf Produktivität und Wirtschaftlichkeit wird beispielsweise erreicht durch Metabolie Engineering. Examples of basic chemical substances (so-called chemical synthesis building blocks) from renewable raw materials are ethanol (C2 building block), glycerol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol (C3 building blocks) or succinic acid, 1-butanol, 2-butanol 1 , 4-butanediol or 2, 3-butanediol {C4 building blocks}. These chemical building blocks are the biogenic starting compounds from which further basic chemicals can be produced chemically. The prerequisite for this is the cost-effective fermentative production of the respective synthesis building blocks from renewable raw materials. Decisive cost factors include the availability of suitable cheaper renewable raw materials as well as efficient microbial fermentation processes, which efficiently convert these raw materials into the desired chemical raw material. It is crucial that the microorganisms used produce the desired product in high concentration and with low by-product formation from the biogenic raw material. The optimization of the productivity and cost-effectiveness of the microorganisms known as production strains is achieved, for example, through metabolic engineering.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Baustein ist 2,3- Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusaramengefasst in Celinska und A C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol. The state of the art for the fermentative 2,3- Butanediol production is composed in Celinska and
Grajek (Biotechnol . Advances 27 (2009), 715-725) . 2 , 3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier OAtomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3- Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK) . Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure (DE 102010001399) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2 , 3-Butandiol sind auch C8™Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben. Grajek (Biotechnol. Advances 27 (2009), 715-725). 2, 3-butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four O atoms (C4 building blocks) such as acetoin, diacetyl, 1,3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK). In addition, products with two carbon atoms (C2 units) such as acetic acid (DE 102010001399) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are accessible. By dimerization of 2,3-butanediol, C8 ™ compounds are also conceivable, e.g. as a fuel in the aviation sector.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosyntheti¬ sche Weg zu 2 , 3-Butandiol ist bekannt (siehe Review von Celins¬ ka und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) und führt vom zentralen StoffWechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2 , 3-Butandiol : The trodden by various microorganisms biosyntheti ¬ cal way to 2, 3-butanediol is known (see review by Celins ¬ ka and Grajek, Biotechnol Advances (2009). 27: 715-725) and leads from the central metabolite pyruvate over the three following enzymatic Steps to 2, 3-butanediol:
Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02. Reaction of acetolactate synthase: Formation of acetolactate from two molecules of pyruvate with elimination of CO 2.
Figure imgf000004_0001
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0001
Reaction of Acetolactate Decarboxylase: Decarboxylation of Acetolactate to Acetoin.
Figure imgf000004_0002
Reaktion der Acetoinreduktase {2, 3-Butandioldehydrogenase) : NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2 , 3-Butandiol . Reaction of acetoin reductase {2, 3-butanediol dehydrogenase): NADH-dependent reduction of acetoin to 2, 3-butanediol.
(III)
Figure imgf000004_0003
Verschiedene natürliche Produzenten von 2, 3-~Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus, Lactobacillus, Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z.B. Bäckerhefe). Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwändige und teuere technische Sicherheitsmassnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2 , 3~Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725). Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten. (III)
Figure imgf000004_0003
Various natural producers of 2,3-butanediol are known, e.g. B. from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc. But also yeasts are known as producers (eg bakers yeast). Most bacterial producers are microorganisms of biological safety level S2, so they can not be used on a large scale without costly and expensive technical safety measures (for this and other microbial 2, 3 ~ butanediol producers, see review by Celinska and Grajek, Biotechnol Advances (2009) 27: 715 -725). This would also apply to hitherto undescribed genetically optimized production strains based on these strains.
Für eine kosteneffiziente großtechnische 2,3-BDL Produktion sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe Sl bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen 2,3-BDL Ausbeuten beschrieben. Bekannte 2, 3™BDL-Produkt ions- stärame aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Arten Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Bacillus polymyxa o- der Bacillus licheniformis . In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925-932) werden infolge einer taxonomischen Umbenennung die Arten Klebsiella terrigena und Klebsiella planticola synonym auch als Raoultella terrigena und Raoultella planticola bezeichnet. Es handelt sich dabei um Mikroorgansimenstämme der gleichen Art. Für diese in der Sicherheitsstufe Sl eingestuften Stämme wurden bisher 2 , 3-Butandiolausbeuten von nicht mehr als 57 g/1 (637 mM, Produktionsdauer 60 h) berichtet (Nakashimada et al., J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661-664). Diese Ausbeuten sind für eine wirtschaftliche Produktion bei weitem zu gering. Als minimale Fermentationsausbeute für eine wirtschaftliche Produktion werden >80 g/1 2 , 3-Butandiol (Fermentationsdauer maximal 72 h) , bevorzugt >100 g/1 2 , 3™Butandiol angesehen . Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicher¬ heitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff. {Tabelle 1}, Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), For a cost-efficient large-scale 2,3-BDL production, production strains of the biological safety level S1 are preferred. For these, however, no sufficiently high 2,3-BDL yields have been described so far. Known 2,3 ™ BDL product ionizing starches from the biological safety level S1 are strains of the species Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola, strains of the genus Bacillus (or Paenibacillus) such as Bacillus polymyxa or Bacillus licheniformis. In the technical literature (Drancourt et al., Int J Syst. Evol Microbiol. (2001), 51: 925-932) the species Klebsiella terrigena and Klebsiella planticola are also synonymously referred to as Raoultella terrigena and Raoultella planticola as a result of a taxonomic renaming , These are microorganism strains of the same species. For these strains classified in the safety step Sl, 2, 3-butanediol yields of not more than 57 g / l (637 mM, production time 60 h) have hitherto been reported (Nakashimada et al., J. Bioscience and Bioengineering (2000) 90: 661-664). These yields are far too low for economical production. As a minimum fermentation yield for economical production> 80 g / 1 2, 3-butanediol (fermentation time of 72 h maximum), preferably> 100 g / 1 2, 3 ™ butanediol considered. A common definition of the term "biological Safe ¬ ness level" and the division into different security levels can be found for example in "Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff. {Table 1}, Centers for Disease Control and Prevention (US) (Editor), Public Health Service (US) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber: U.S. Dept . of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010) ; ISBN- 10: 0160850428. Publisher: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN 10: 0160850428.
Groleau et al., Biotechnol. Lett. 7 (1985): 53-58 untersuchten die 2, 3-Butandiolproduktion aus Glucose in Bacillus polymyxa. 2, 3-Butandiol wurde nur so lange produziert, wie das Substrat Glucose verfügbar war (Abbildungen in Groleau et al.). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Sporulation in Bacillus polymyxa (gleichbedeutend mit der GDH-Expression) erst einsetzte, nachdem das Glucose Substrat verbraucht war (gleichbedeutend mit dem Ausklingen der 2, 3-Butandiolproduktion) . Zusammen mit der in Fujita et al . , J. Bacteriol. 132 (1977) : 282-293, offen¬ barten Charakterisierung der GDH-Aktivität in sporulierenden Bacillus Stämmen ergibt sich für den Fachmann, dass in Stämmen der Gattung Bacillus die 2 , 3-Butandiolproduktion unabhängig von GDH-Aktivität erfolgt und daher auch keine Verbesserung der 2 , 3-Butandiolproduktion in Gegenwart von GDH-Aktivität zu erwarten war. Groleau et al., Biotechnol. Lett. 7 (1985): 53-58 examined 2,3-butanediol production from glucose in Bacillus polymyxa. 2,3-Butanediol was only produced for as long as the substrate glucose was available (Figures in Groleau et al.). Moreover, it was observed that sporulation into Bacillus polymyxa (synonymous with GDH expression) only started after the glucose substrate was consumed (equivalent to the fade of 2,3-butanediol production). Together with the in Fujita et al. , J. Bacteriol. 132 (1977): 282-293, disclosed herein ¬ characterization of the GDH activity in sporulating Bacillus strains obtained for the skilled person that in strains of the genus Bacillus, the 2, 3-Butandiolproduktion is independent of GDH activity, and therefore no improvement 2, 3-butanediol production in the presence of GDH activity was to be expected.
Aufgabe der Erfindung war es, Produkt ionsstämme zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol bereitzustellen, die deutlich höhere 2,3- Butandiolausbeuten ermöglichen als der Ausgangsstarnm. The object of the invention was to provide production of production of 2, 3-butanediol, which allow significantly higher 2,3-Butandiolausbeuten than the Ausgangssstarnm.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm unter Bedingungen der 2,3- Butandiolproduktion eine eine Glucose Dehydrogenase Enzymaktivität aufweist, die im Ausgangsstamm nicht oder nur unter physiologischen Bedingungen die verschieden von den Bedingungen der 2, 3-Butandiolproduktion sind, vorhanden ist. Bevorzugt handelt es sich bei der Glucose Dehydrogenase Enzymaktivität um die Enzymaktivität einer NAD-, bzw. NADP- abhängigen Glucose Dehydrogenase (GDH) aus der Enzymklasse EC 1.1.1.47. The object has been achieved by a production strain which can be produced from a parent strain, characterized in that the production strain has a glucose dehydrogenase enzyme activity under conditions of 2,3-butanediol production which does not differ in the starting strain or only under physiological conditions different from the conditions of the 2, 3-butanediol production is present. The glucose dehydrogenase enzyme activity is preferably the enzyme activity of an NAD- or NADP-dependent glucose dehydrogenase (GDH) from the enzyme class EC 1.1.1.47.
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten, aber zur 2,3- Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm oder eiΪΊΘΪΊ ]06ir© tS weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Bei einem bereits weiter optimierten Wildtypstamm (z.B. durch einen gentechnischen Eingriff erfolgt) , ist jedoch nicht die Glucose Dehydrogenase Aktivität von der Optimierung betroffen. In the present invention, a distinction is made between a parent strain and a production strain. The parent strain may be a wild type strain that has not been further optimized but is capable of 2,3-butanediol production or a wild-type strain that has been further optimized. However, in an already optimized wild-type strain (e.g., by genetic engineering), the glucose dehydrogenase activity is not affected by the optimization.
Unter einem Produktionsstamm ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein bezüglich der 2 , 3~Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der eine Enzymaktivität einer NAD-, bzw. NADP-abhängigen Glucose Dehydrogenase (GDH) vorzugsweise aus der Enzymklasse EC 1.1.1.47 aufweist, die im Ausgangsstamm entweder nicht oder nur unter speziellen physiologischen Bedingungen die verschieden von den Bedingungen der 2,3- Butandiolproduktion sind, vorhanden ist. Eine derartige Bedingung ist beispielsweise die die Sporulation. For the purposes of the present invention, a production strain is to be understood as meaning an initial strain which has been optimized with respect to the production of 2,3-butanediol and which has an enzyme activity of an NAD- or NADP-dependent glucose dehydrogenase (GDH), preferably from the enzyme class EC 1.1.1.47 either non-existent in the parent strain or only under specific physiological conditions other than the conditions of 2,3-butanediol production. One such condition is, for example, sporulation.
Der Produktionsstamm wird vorzugsweise aus dem Ausgangsstamm hergestellt. Wenn ein bereits optimierter Ausgangsstamm durch eine Erhöhung der Glucose Dehydrogenase Aktivität nochmals verbessert werden soll, so ist es natürlich ebenso möglich zu- nächst in einem unverbesserten Stamm die GDH Aktivität zu erhöhen und anschließend weitere Verbesserungen einzubringen. The production strain is preferably produced from the parent strain. If an already optimized starting strain is to be further improved by increasing the glucose dehydrogenase activity, then it is of course also possible first to increase the GDH activity in an unmodified strain and then to introduce further improvements.
Die Erhöhung der Glucose Dehydrogenase Aktivität im Produktionsstamm kann hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes, z.B. eine Mutation, welche dieThe increase in glucose dehydrogenase activity in the production strain may be due to any mutation in the genome of the parent strain, e.g. a mutation that the
Expression eines inaktiven GDH-Gens aktiviert oder eine Mutation, die zur konstitutiven Expression eines ansonsten nur unter spezifischen physiologischen Bedingungen wie z.B. der Sporula- tion exprimierten GDH-Gens führt oder durch Expression eines homologen oder aber auch heterologen GDH-Gens im Ausgangsstamm. Expression of an inactive GDH gene activated or a mutation that is for the constitutive expression of otherwise only under specific physiological conditions such as the sporula tion expressed GDH gene leads or by expression of a homologous or heterologous GDH gene in the parent strain.
Bevorzugt ist die Expression eines homologen oder eines hetero- logen GDH-Gens im Ausgangsstamm. Preference is given to the expression of a homologous or heterologous GDH gene in the parent strain.
Bevorzugt ist unter einer erhöhten Aktivität des GDH Gens eine um den Faktor 1000 bis 10, besonders bevorzugt um den Faktor 100 bis 10 und insbesondere bevorzugt um den Faktor 10 erhöhte GDH-Aktivität gegenüber dem Ausgangsstamm zu verstehen. An increased activity of the GDH gene is preferably to be understood as meaning a GDH activity increased by a factor of 1000 to 10, more preferably by a factor of 100 to 10 and particularly preferably by a factor of 10 compared with the starting strain.
Bei dem Ausgangsstamm kann es sich um einen beliebigen 2,3- Butandiol produzierenden Stamm handeln. Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella, Raoultella, Bacil- lus, Paenibacillus oder Lactobacillus . The parent strain can be any 2,3-butanediol producing strain. It is preferably a strain of the genus Klebsiella, Raoultella, Bacillus, Paenibacillus or Lactobacillus.
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola nochmals bevorzugt ist. Particularly preferred is a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa or Bacillus licheniformis with a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola is again preferred.
Insbesondere bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe Sl und von diesen, darüber hinaus bevorzugt, Stämme der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticol . In der Enzymklasse der Glucose Dehydrogenasen (GDHs) unter¬ scheidet man verschiedene Formen. GDHs, welche unter die Enzymklassifizierung EC 1.1.99.17 eingestuft werden, enthalten Pyr- rolochinolin als Enzym-gebundenen Cofaktor (Oubrie et al., EMBO J. 18 (1999) : 5187-5194) für die enzymatische Oxidation von Glucose. GDHs der Enzymklasse EC 1.1.99.17 sind teilweise Membranproteine und übertragen die aus der Glucoseoxidation gewonnenen Elektronen auf Ubichinon. GDHs, welche unter die Enzymklassifizierung EC 1.1.1.47 eingestuft werden, oxidieren Glucose zu δ-Gluconolacton und reduzieren NAD, bzw. NADP zu NADH, bzw. NADPH. Sie wurden beispielsweise beschrieben für Stämme der Gattung Bacillus, wo sie in Sporen, bzw. sporulierenden Zellen exprimiert werden (Fujita et al., J. Bacteriol. 132 (1977): 282-293). Die Enzymstabilität isolierter GDB-Enzyme wurde als sehr gering beschrieben und Mutanten mit erhöhter Stabilität isoliert. Ein Beispiel für eine GDH aus B. subtilis mit erhöhter chemischer Stabilität ist of- fenbart in DE102004059376. Particularly preferred is a parent strain and a production strain classified in the security level Sl and of these, more preferably, strains of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticol. In a class of enzymes glucose dehydrogenases (GDHs) under ¬ is deposited various forms. GDHs which are classified under the enzyme classification EC 1.1.99.17 contain pyrroloquinoline as enzyme-bound cofactor (Oubrie et al., EMBO J. 18 (1999): 5187-5194) for the enzymatic oxidation of glucose. GDHs of the enzyme class EC 1.1.99.17 are partially membrane proteins and transfer the electrons obtained from the glucose oxidation to ubiquinone. GDHs, which are classified under the enzyme classification EC 1.1.1.47, oxidize glucose to δ-gluconolactone and reduce NAD or NADP to NADH or NADPH. They have been described, for example, for strains of the genus Bacillus, where they are expressed in spores or sporulating cells (Fujita et al., J. Bacteriol 132 (1977): 282-293). The enzyme stability of isolated GDB enzymes has been described as very low and mutants with increased stability have been isolated. An example of a B. subtilis GDH with increased chemical stability is disclosed in DE102004059376.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist eine (Übe ) Expression der GDH dazu geeignet, die 2,3- Butandiolausbeute (bestimmt als Volumenausbeute 2, 3-Butandiol in g/1) in Schüttelkolben um mehr als 25 %, bevorzugt mehr als 50 % und insbesondere um mehr als 100 % (siehe 4. Beispiel) und in der Fermentation um mehr als 35 %, bevorzugt mehr als 45 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 60 % zu steigern. Bei der GDH handelt es sich vorzugsweise um ein Enzym der En¬ zymklasse EC 1.1.1.47. Es kann sich um jedes genkodierte Enzym handeln, das Glucose oxidiert und dabei NAD, bzw. NADP zu NÄDH, bzw. NADPH reduziert. In einer bevorzugten Ausführung stammt das Gen der GDH aus einem Bakterium der Gattung Bacillus. Besonders bevorzugt stammt das Gen der GDH aus einem Bakterium der Art Bacillus subtilis. As shown in the examples of the present application, (practice) expression of the GDH is suitable for increasing the 2,3-butanediol yield (determined as volume yield 2, 3-butanediol in g / l) in shake flasks by more than 25%, preferably more than 50% and in particular by more than 100% (see Example 4) and in the fermentation by more than 35%, preferably more than 45% and particularly preferably by more than 60% increase. When GDH is preferably an enzyme of En ¬ zymklasse EC 1.1.1.47. It may be any gene-encoded enzyme that oxidizes glucose, thereby reducing NAD or NADP to NADH or NADPH. In a preferred embodiment, the gene of GDH is derived from a bacterium of the genus Bacillus. Particularly preferably, the gene of the GDH is derived from a bacterium of the species Bacillus subtilis.
Insbesondere bevorzugt ist das Gen einer GDH Mutante der Art Bacillus subtilis mit verbesserter chemischer Stabilität wie z. B. in DE102004059376 offenbart. Particularly preferred is the gene of a GDH mutant of the species Bacillus subtilis with improved chemical stability such. B. in DE102004059376 discloses.
Der erfindungsgemäße Stamm enthält die Enzymaktivität einer GDH, bevorzugt einer durch rekombinante Expression einer NAD-, bzw. NADP-abhängigen GDH (EC 1.1.1.47) erhaltenen GDH, die es in unerwarteter Weise ermöglicht, die Ausbeute an 2 , 3-Butandiol signifikant zu steigern. GDH oxidiert Glucose zu Gluconsäure und reduziert NAD, bzw. NADP zu NADH, bzw. NADPH. Das GDH Enzym kann daher prinzipiell den energetischen Haushalt der Zelle verändern, indem sie zu einer verstärkten Regenerierung von NÄDH und NADPH Cofaktoren beiträgt. Das Ausmaß dieser Reaktion ist jedoch von der intrazellulären Verfügbarkeit an freier Glu™ cose abhängig. Es ist bekannt, dass Bakterien Glucose fast ausschließlich über das sog. PTS-System als Glucose-6-Phosopht importieren, wo es direkt für die Glykolyse zur Verfügung steht. Glucose-6-Phösphat ist jedoch kein Substrat der GDH und es war zu erwarten, dass der intrazelluläre Spiegel an freier Glucose sehr gering ist. Ein positiver Einfluss einer im Produktionsstamm rekombinant hergestellten GDH auf die 2,3-BDL Produktion war somit für den Fachmann nicht zu erwarten. The strain according to the invention contains the enzyme activity of a GDH, preferably a GDH obtained by recombinant expression of an NAD- or NADP-dependent GDH (EC 1.1.1.47), which makes it possible in an unexpected manner to significantly increase the yield of 2,3-butanediol increase. GDH oxidizes glucose to gluconic acid and reduces NAD or NADP to NADH or NADPH. The GDH enzyme Therefore, it can in principle change the energy budget of the cell by contributing to an increased regeneration of NÄDH and NADPH cofactors. However, the extent of this response is dependent on the intracellular availability of free Glu ™ cose. It is known that bacteria import glucose almost exclusively via the so-called PTS system as glucose-6-phosphorus, where it is directly available for glycolysis. However, glucose-6-phosphate is not a substrate of GDH and it was expected that the intracellular level of free glucose would be very low. Thus, a positive influence of a GDH recombinantly produced in the production strain on the 2,3-BDL production was not to be expected for the skilled person.
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht neben der Steigerung der 2 , 3-Butandiol Produktion auch die Steigerung der Ausbeute anderer fermentativ hergestellter Produkte, darunter Acetolactat, Acetoin, Diacetyl, Ethanol, Essigsäure, aber auch Pyruvat, Lactat (Milchsäure), 1 , 2-Propandiol, 1 , 3~Propandiol sowie 1,4- Butandiol, 1-Butanol und 2-Butanol. In addition to increasing the production of 2,3-butanediol, the strain according to the invention also makes it possible to increase the yield of other products produced by fermentation, including acetolactate, acetoin, diacetyl, ethanol, acetic acid, but also pyruvate, lactate (lactic acid), 1,2-propanediol, 1, 3 ~ propanediol and 1,4-butanediol, 1-butanol and 2-butanol.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm ist in einer bevorzugten Ausführungsform auch dadurch charakterisiert, dass er aus einem Ausgangsstamm, wie in der Anmeldung definiert, hergestellt wurde und eine GDH in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion (Volumenproduktion ausgedrückt in g/1 2,3-BDL) gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Aus¬ gangsstamm um mindestens 30 %, bevorzugt 45 %, besonders bevor¬ zugt 60 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2,3-BDL Ausbeute des Ausgangsstammes mindestens 80 g/1 beträgt. A production strain according to the invention is also characterized in a preferred embodiment by being prepared from a parent strain as defined in the application and producing a GDH in recombinant form with the result that its 2,3-BDL production (volume production expressed in g / 1 2,3-BDL) with respect to the non-genetically optimized from ¬ gear stem by at least 30%, preferably 45%, particularly before ¬ Trains t 60% and is particularly preferably increased by 100%, wherein the 2,3-BDL yield the parent strain at least 80 g / 1.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstruktes in einen der genannten Ausgangsstämme. The production strain of the invention is preferably prepared by introducing a gene construct into one of said parent strains.
Das Genkonstrukt in seiner einfachsten Form ist definiert als bestehend aus dem GDH-Strukturgen, dem, operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkon- strukt auch einen Terminator umfassen, der dem GDH-Strukturgen nachgeschaltet ist. Dabei ist die Funktion des Promotors definiert als ein genetisches Element, das die Transkription des GDH-Gens im Wirtsorganismus bewirkt. Die Funktion des Termina- tors ist definiert als ein genetisches Element, das die Transkription des GDH-Gens im Wirtsorganismus stoppt. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der sog. dem Fach¬ mann geläufige Tac-Promotor . The gene construct in its simplest form is defined as consisting of the GDH structural gene which, operatively linked, is preceded by a promoter. If necessary, the gene structur also includes a terminator downstream of the GDH structural gene. The function of the promoter is defined as a genetic element that effects the transcription of the GDH gene in the host organism. The function of the terminator is defined as a genetic element that stops the transcription of the GDH gene in the host organism. Preferred is a strong promoter, which leads to a strong transcription. Among the strong promoters preferably of the skilled man ¬ known. Familiar Tac promoter.
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können. The gene construct can be present in a manner known per se in the form of an autonomously replicating plasmid, it being possible for the copy number of the plasmid to vary. A variety of plasmids are known to those skilled in the art, which can replicate autonomously depending on their genetic structure in a given production strain.
Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstam- mes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist. However, the gene construct can also be integrated in the genome of the production strain, with each gene locus along the genome being suitable as an integration site.
Das Genkonstrukt, entweder in Plasmidform oder mit dem Ziel der genomischen Integration, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotech- nol. (2010) 85: 1301 - 1313), darunter beispielsweise die The gene construct, either in plasmid form or with the aim of genomic integration, is introduced into the production strain in a manner known per se by genetic transformation. Various methods of genetic transformation are known to the person skilled in the art (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechol. (2010) 85: 1301-1313), including, for example, the
Elektroporation. Zur Selektion transformierter Produktionsstämme enthält dasElectroporation. For the selection of transformed production strains contains the
Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen sog. Selekti- onsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus sog. Antibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarkern. Gene construct, also in a known manner, a so-called selection markers for the selection of transformants with the desired gene construct. Known selection markers are selected from so-called antibiotic resistance markers or from the auxotrophy complementing selection markers.
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarke , besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicil- lin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Zeocin verleihen . Preference is given to an antibiotic resistance marker, particularly preferably those which are resistant to antibiotics selected from ampicillin lin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol or zeocin.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform das Genkonstrukt , entweder in Plasmidform oder in das Genom integriert und produziert ein GDH- Enzym, vorzugsweise eine GDH aus der Enzymklasse EC 1.1.1.47, in rekombinanter Form. Das rekombinante GDH-Enzym ist in der Lage, Glucose zu oxidieren und NAD, bzw. NADP zu NADH, bzw. Thus, in one preferred embodiment, a production strain according to the invention contains the gene construct, either in plasmid form or integrated into the genome, and produces a GDH enzyme, preferably a GDH from the enzyme class EC 1.1.1.47, in recombinant form. The recombinant GDH enzyme is able to oxidize glucose and NAD, or NADP to NADH, respectively
NADPH zu reduzieren. Nun wurde überraschend gefunden, dass infolge der rekombinanten Expression des GDH-Enzyms im Produktionsstamm die 2, 3-Butandiol Ausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm, der das GDH-Enzym nicht exprimiert, in signifikanter Weise gesteigert werden kann. To reduce NADPH. It has now surprisingly been found that as a result of the recombinant expression of the GDH enzyme in the production strain, the 2,3-butanediol yield can be significantly increased compared to the starting strain which does not express the GDH enzyme.
Beim Ausgangsstamm kann es sich um einen nicht weiter optimierten Wildtypstamm handeln. Der Ausgangsstamm kann jedoch bereits vorher optimiert worden sein, bzw. als erfindungsgemäßer GDH™ produzierender Produktionsstamm weiter optimiert werden. Die von der Erfindung umfasste Optimierung des Produktionsstammes kann einerseits durch Mutagenese und Selektion von Mutanten mit verbesserten Produktionseigenschaften erfolgen. Die Optimierung kann jedoch auch gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind die bereits genannten 2, 3-Butandiol Biosynthesegene Aceto- lactatsynthase, Acetolactatdecarboxylase und Acetoinreduktase . Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressions- einheit {als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Klebsiella terrige- na alle drei Biosynthesegene des 2, 3-Butandiols (sog. BUD- Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392 - 1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Aceto- lactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863 - 3875) . Weiterhin kann der Produktionsstamm dadurch optimiert werden, dass ein oder mehrere Gene inaktiviert werden, deren Genproduk¬ te sich negativ auf die 2, 3™Butandiol Produktion auswirken. The parent strain may be a non-optimized wild type strain. However, the parent strain may have been previously optimized or further optimized as the GDH ™ producing production strain of the present invention. The optimization of the production strain encompassed by the invention can on the one hand be carried out by mutagenesis and selection of mutants with improved production properties. However, the optimization can also be carried out by genetic engineering by additional expression of one or more genes which are suitable for improving the production properties. Examples of such genes are the already mentioned 2,3-butanediol biosynthesis genes acetolactate synthase, acetolactate decarboxylase and acetoin reductase. These genes can be expressed in a manner known per se as separate gene constructs or else combinedly as an expression unit {so-called operon) in the production strain. It is known, for example, that in Klebsiella terrigena, all three biosynthesis genes of 2,3-butanediol (so-called BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392-1404), or in strains of the genus Bacillus, the genes of acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase are organized in an operon (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863-3875). Furthermore, the production strain can be optimized such that one or more genes are inactivated whose Genproduk ¬ te negatively on the 2, 3 ™ butanediol production effect.
Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenpro- duktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactat- dehydrogenase {Milchsäurebildung) , die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) oder aber auch die Phosphotransacetylaser bzw. die Acetatkinase (Acetatbildung) . Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von 2 , 3-Butandiol mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Produktionsstammes . Examples include genes whose gene products are responsible for by-product formation. These include z. B. the lactate dehydrogenase {lactic acid formation), the acetaldehyde dehydrogenase (ethanol formation) or else the phosphotransacetylase r or the acetate kinase (acetate formation). Furthermore, the invention comprises a process for the production of 2, 3-butanediol with the aid of a production strain according to the invention.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eines er- findungsgemäßen, GDH-produzierenden Produktionsstammes in einem Anzuchtmedium kultiviert werden. Dabei wird einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits das Produkt 2,3-BDL ge¬ bildet. Die Bildung von Biomasse und 2,3-BDL kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt er- folgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation ( Produktionsmaß- stab) . Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen größer 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen größer 300 1 insbesondere bevorzugt ist. Anzuchtmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die 2,3-BDL Produktbildung optimiert werden. C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zurThe method is characterized in that cells of a GDH-producing production strain according to the invention are cultivated in a growth medium. In this case, the biomass of the producing strain and on the other hand, the product 2,3-BDL is one hand ge ¬ forms. The formation of biomass and 2,3-BDL can be correlated in time or decoupled in time. The cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art. This can be done in shake flasks (laboratory scale) or by fermentation (production scale). Preference is given to a production-scale process by fermentation, with a fermentation volume greater than 10 l being particularly preferred as the production scale and a fermentation volume greater than 300 l being particularly preferred. Cultivation media are familiar to those skilled in the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source), and additives such as vitamins, salts, and trace elements, which optimize cell growth and 2,3-BDL product formation. C sources are those that originate from the production base
2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z. B. Glu- cosef Mannose oder Fructose sowie C5-Zucker wie z.B. Xylose, Arabinose, Ribose oder Galactose. 2,3-BDL product formation can be availed. These include all forms of monosaccharides, including C6 sugars such as. For example cose f mannose or fructose and C5 sugars such as xylose, arabinose, ribose or galactose.
Das erfindungsgeraäße Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose. However, the production process according to the invention also encompasses all C sources in the form of disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiose.
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Malto- dextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch} freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C- Quellen dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschal- tet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Pro¬ duktionsverfahrens erfolgen. The production process of the invention further comprises all C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units such. For example, maltodextrin, starch, cellulose, hemicellulose, pectin or monomers or oligomers released therefrom by hydrolysis (enzymatically or chemically), in which the hydrolysis of the higher C sources may be preceded by the production process according to the invention or in situ during the reaction Pro ¬ production process according to the invention take place.
Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) , Milchsäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze} . Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmo- noxid denkbar. Die vom erfindungsgemäßen Produktionsverfahren betroffenen C~ Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanz- liehen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z. B.Other useful C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or derived acetate salts), ethanol, glycerol, citric acid (and its salts), lactic acid (and its salts), or pyruvate (and its salts) The C sources which are affected by the production process according to the invention comprise both the isolated pure substances and, for reasons of greater economic efficiency, not further purified mixtures of the individual C sources, such as hydrolyzates can be obtained by chemical or enzymatic digestion of the vegetable raw materials.
Hydrolysate der Stärke (Monosaccharid Glucose) , der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose) , des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose), des Pektins (Monosaccharid Ga~ lacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glu- cose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den Kohlehydraten gehörende Lignin) . Weiterhin können als C-Quellen auch Ab- fallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr) . Hydrolysates of starch (monosaccharide glucose), sugar beet (monosaccharides glucose, fructose and arabinose), sugar cane (disaccharide sucrose), pectin (monosaccharide galacturonic acid) or lignocellulose (monosaccharide glucose from cellulose, monosaccharides xylose, arabinose , Mannose, hemicellulose galactose, and non-carbohydrate lignin). Furthermore, C sources can also be used as fall products from the digestion of vegetable raw materials are used, such. As molasses (sugar beet) or bagasse (sugar cane).
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können. Preferred C sources for the production of the production strains are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose and vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Glucose, entweder in isolier- ter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats. A particularly preferred C source is glucose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehören Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO3, NaN03, Ammoniumnitrat, Ca(N03)2/ Mg(N03)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Ämino- säuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base. Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das An¬ zuchtmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt. Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zu¬ sätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen N sources are those that can be used by the production strain for biomass production. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or else its salts such. For example, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, suitable N-source are the known nitrate salts such. As KNO 3 , NaN0 3 , ammonium nitrate, Ca (N0 3 ) 2 / Mg (N0 3 ) 2 and other N-sources such as urea. The N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base. The cultivation can be carried out in the so-called batch mode, wherein the An ¬ breeding medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources. The growth can also be done in the so-called. Fed-batch mode, and after an initial period of growth in batch mode to ¬ additionally nutrient sources may be fed (feed) to compensate for their consumption. The feed can consist of the C source, the N source, one or more important for the production of vitamins, or trace elements or a combination of the aforementioned. The feed components can be used together as a mixture or else separately
Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die 2,3-BDL Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus. Feed lines are added. In addition, others can Media components and specifically the 2,3-BDL production-enhancing additives to be added to the feed. The feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Preference is given to the cultivation according to the fed-batch mode.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose, Melasse, oder pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können. Preferred C sources in the feed are glucose, sucrose, molasses, or vegetable hydrolysates, which can be obtained from starch, lignocellulose, sugar cane or sugar beet.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO3, NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen B<3. © * Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) . Preferred N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KNO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids Corn steep liquor (Corn Steep Liquor) as well as NZ-Amine and Yeast Nitrogen B <3. © * Particularly preferred N sources in the feed are ammonia, or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (liquid or in dried form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7. Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C. The cultivation takes place under pH and temperature conditions which favor the growth and the 2,3-BDL production of the production strain. The useful pH range is from pH 5 to pH 8. Preferred is a pH range of pH 5.5 to pH 7.5. Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7. The preferred temperature range for the growth of the production strain is 20 ° C to 40 ° C. Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauer- stoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzuf hr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleis- tet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft. The growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation). Preference is given to aerobic cultivation with oxygen, oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen. tet is. Particularly preferred is the aerobic cultivation by entry of compressed air.
Die Kultivierungsdauer zur 2,3-BDL Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h. The cultivation time for 2,3-BDL production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das 2,3-BDL Produkt, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene 2,3-BDL Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des 2,3-BDL Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zent- rifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion, Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das 2,3-BDL Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung des 2,3-BDL Produkts. Cultivation batches obtained by the method described above contain the 2,3-BDL product, preferably in the culture supernatant. The 2,3-BDL product contained in the cultivation mixtures can either be used further directly without further work-up or else be isolated from the cultivation batch. For the isolation of the 2,3-BDL product known process steps are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction, distillation or crystallization, or precipitation. These process steps can be combined in any desired form in order to isolate the 2,3-BDL product in the desired purity. The degree of purity to be achieved depends on the further use of the 2,3-BDL product.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des 2,3-BDL Pro- duktes sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden. Various analytical methods for the identification, quantification and determination of the purity of the 2,3-BDL product are available, including NMR, gas chromatography, HPLC, mass spectrometry or a combination of these analytical methods.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 4,1 kb großen GDH Expessionsvektor pGDBS-E96Atet (+ ) . The figures show the plasmids mentioned in the examples. Fig. 1 shows the 4.1 kb GDH expression vector pGDBS-E96Atet (+) prepared in Example 1.
Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 2,9 kb großen Expes- sionsvektor pKKj .  FIG. 2 shows the 2.9 kb expansion vector pKKj used in Example 1.
Fig. 3 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,3 kb großen Ex- pessionsvektor pKKj-tet.  FIG. 3 shows the 3.3 kb expression vector pKKj-tet prepared in Example 1.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert : 1. Beispiel: The invention is further illustrated by the following examples: 1st example:
Herstellung des GDH-Expressionsvektors pGDBS-E96Atet ( +) Verwendet wurde das mutierte GDH-Gen aus B. subtilis mit der Bezeichnung GDBS-E96A, wie in DE102004059376 offenbart. GDBS- E96A wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus dem in DE102004059376 offenbarten Plasmid pGDBS-E96Ayexl mit den Primern gdbslf und gdbs2r als DNS-Fragment von 0,8 kb Größe isoliert.  Preparation of the GDH expression vector pGDBS-E96Atet (+) The mutant GDB gene from B. subtilis named GDBS-E96A was used as disclosed in DE102004059376. GDBS-E96A was isolated in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) from the plasmid pGDBS-E96Ayexl disclosed in DE102004059376 with the primers gdbslf and gdbs2r as a DNA fragment of 0.8 kb size.
Primer gdbslf (SEQ ID NO: 1) und gdbs2r (SEQ ID NO: 2) hatten folgende DNS-Sequenzen: SEQ ID NO: 1: Primers gdbslf (SEQ ID NO: 1) and gdbs2r (SEQ ID NO: 2) had the following DNA sequences: SEQ ID NO: 1:
5'~~GCA GAA TTC ATG TAT CCG GAT TTA AAA GG-3 Λ 5 '~~ GCA GAA TTC ATG ACT CCG GAT TTA AAA GG-3 Λ
SEQ ID NO: 2: SEQ ID NO: 2:
5'-CAC CTG CAG TTA ACC GCG GCC TGC CTG GAA TG-3 Λ 5'-CAC CTG CAG TTA ACC GCG GCC TGC CTG GAA TG-3 Λ
Das PCR-Produkt wurde mit Eco RI (in Primer gdbsl enthalten) und Pst I (in Primer gdbs2r enthalten) nachverdaut und in den Expressionsvektor pKKj-tet kloniert . Dabei entstand der 4,1 kb große GDH-Expessionsvektor pGDBS -E 96Atet (+) (Abb. 1). The PCR product was digested with Eco RI (contained in primer gdbsl) and Pst I (contained in primer gdbs2r) and cloned into the expression vector pKKj-tet. This resulted in the 4.1 kb GDH expression vector pGDBS -E96Atet (+) (Figure 1).
Expressionsvektor pKKj-tet: Expression vector pKKj-tet:
pKKj-tet ist ein Derivat des Expressionsvektors pK j (Abb. 2 ) . Der Expressionsvektor pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223~3. Die DNS-Sequenz von p K223-3 ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugriffnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 - 1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz), wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj entstand. Aus pKKj wurde das Ampicillin Resistenzgen als 1 kb Fragment durch Verdau mit Bsp HI entfernt. In das verbliebene 1,9 kb Vektorf agment wurde das Tetracyclin Resistenzgen als 1,45 kb Fragment kloniert. Das Tetracyclin Resistenzgen war vorher aus dem Plasmid pKKj-tet is a derivative of the expression vector pK j (FIG. 2). The expression vector pKKj is a derivative of the expression vector pKK223 ~ 3. The DNA sequence of p K223-3 is disclosed in the "GenBank" gene database under accession number M77749.1 From the 4.6 kb plasmid approximately 1.7 kb were removed (bp 262-1947 of those disclosed in M77749.1 From the pKKj, the ampicillin resistance gene was removed as a 1 kb fragment by digestion with Ex HI and the tetracycline resistance gene was expressed as 1.45 kb in the remaining 1.9 kb vector agent Fragment cloned. The tetracycline resistance gene was previously removed from the plasmid
PÄCYC184 durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern tet3f und tet4r und anschließendem Verdau mit Nco I (Schnitt- stellen enthalten in den Primern tet3f und tet4r) isoliert worden. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zugänglich in der „Genbank" Gendatenbank unter der Zugangnummer X06403.1. Es entstand der 3,3 kb große Expressionsvektor pKKj-tet (Abb. PÄCYC184 was isolated by PCR (Taq DNA polymerase, Qiagen) with the primers tet3f and tet4r and subsequent digestion with Nco I (cleavage sites contained in the primers tet3f and tet4r). The DNA sequence of pACYC184 is accessible in the "Genbank" gene database under the accession number X06403.1, resulting in the 3.3 kb expression vector pKKj-tet (FIG.
3) . 3).
Primer tet3f {SEQ ID NO: 3) und tet4r (SEQ ID NO: 4) hatten folgende DNS-Sequenzen: Primers tet3f (SEQ ID NO: 3) and tet4r (SEQ ID NO: 4) had the following DNA sequences:
SEQ ID NO: 3: SEQ ID NO: 3:
5'-CCA TGG CAG TGC AAT TTA TCT CTT C 3 5'-CCA TGG CAG TGC AAT TTA TCT CTT C 3
SEQ ID NO: 4: SEQ ID NO: 4:
5'-CCA TGG GCC AAG GGT TGG TTT GCG CAT TC-3' 2. Beispiel:  5'-CCA TGG GCC AAG GGT TGG TTT GCG CAT TC-3 '2nd Example
Expressionsanalyse in E. coli  Expression analysis in E. coli
Plasmid-DNS des Expressionsvektors pGDBS-E96Atet (+) wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm JM105 transfor- miert. Als Kontrolle diente E. coli JM105, mit dem pKKj-tetPlasmid DNA of the expression vector pGDBS-E96Atet (+) was transformed according to methods known per se into E. coli strain JM105. The control was E. coli JM105, with the pKKj-tet
Leervektor transformiert. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Von den E. coli- Stämmen wurde in LBtet-Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 μg/ .l Tetracyclin) eine Vorkultur herge- stellt {Anzucht bei 37 °C und 120 rpm über Nacht) . Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBtet Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Haupt kulturen wurden bei 30 °C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte ODgoo vo 2,0 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor IPTG Empty vector transformed. One clone each was selected and cultured in a shake flask culture. Of the E. coli strains, a preculture was prepared in LBtet medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 μg / .l tetracycline) {cultivation at 37 ° C. and 120 rpm overnight). 2 ml each of preculture was used as the inoculum of a main culture of 100 ml LBtet medium (300 ml Erlenmeyer flask). The main cultures were shaken at 30 ° C and 180 rpm until a cell density ODgoo of 2.0 was reached. Then the inductor became IPTG
( Isopropyl-ß-thiogalactosid, 0,4 mM Endkonzentration) zugegeben und über Nacht bei 30 °C und 180 rpm geschüttelt. Zur Analyse der GDH-Produktion wurden 50 ml der E. coli Zellen zentrifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) , das Zellpellet in 2 ml KPi-Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog. ,,French®Press' Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der GDH-Aktivität verwendet. Während im Kont ollstamm keine GDH-Äktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische GDH-Aktivität in Zellextrakten 4,9 U/mg Protein. (Isopropyl-β-thiogalactoside, 0.4 mM final concentration) was added and shaken overnight at 30 ° C and 180 rpm. For analysis of GDH production, 50 ml of E. coli cells were centrifuged (10 min 15000 rpm, Sorvall SS34 rotor), the cell pellet in 2 ml KPi buffer (0.1 M potassium phosphate, pH 7.0, 0.1 M NaCl), disrupted in a manner known per se with a so-called. French® Press high pressure homogenizer (SLM-AMINCO) and a cell extract by centrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 rotor) isolated. Aliquots of the cell extracts were used for the spectrophotometric determination of GDH activity. While no GDH activity could be measured in the control strain, specific GDH activity in cell extracts was 4.9 U / mg protein.
Spektralphotometrische Bestimmung der GDH-Aktivität: Spectrophotometric determination of GDH activity:
Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung der GDH-Aktivität war zusammengesetzt aus Messpuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl) , 10 mg/ml Glucose, 2 mM NAD und GDH-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe der Glucose (aus einer 40- fach konzentrierten Stammlösung) und die Extinktionszunahme in- folge der Bildung von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADH: ε = 0,63 x 104 1 x Mol" 1 x cm""1} . Ein Unit GDH-Aktivität ist definiert als die Bildung von 1 pmol NADH/min unter Testbedingungen. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt. The measurement batch of 1 ml volume for the photometric determination of GDH activity was composed of measurement buffer (0.1 M potassium phosphate, pH 7.0, 0.1 M NaCl), 10 mg / ml glucose, 2 mM NAD and GDH-containing cell extract , Measurement temperature was 25 ° C. The reaction was started by adding the glucose (from a 40-fold concentrated stock solution) and the absorbance increase due to the formation of NADH measured at a wavelength of 340 nm (extinction coefficient of NADH: ε = 0.63 × 10 4 1 × mol "1 x cm""1}. One unit of GDH activity is defined as the formation of 1 pmol of NADH / min under test conditions. in order to determine the specific activity of the protein concentration of the cell extracts was in so-called per se known manner to the." BioRad protein assay "the company BioRad determined.
3. Beispiel: 3rd example:
Expression von GDH in Klebsiella terrigena Expression of GDH in Klebsiella terrigena
Ausgangsstamm war Klebsiella terrigena DSM 2687 (synonyme Initial strain was Klebsiella terrigena DSM 2687 (synonyms
Stammbezeichnung Raoultella terrigena DSM 2697). Der Stamm Klebsiella (Raoultella) terrigena DSM 2687 ist käuflich erhält- lieh bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Die Transformation mit dem Plasmid pGDBS- E96Atet{+) erfolgte in an sich bekannter Weise analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Als Kontrollstamm, wurde Klebsiella terrigena, mit dem pKKj-tet Vektor transformiert, verwendet. Strain name Raoultella terrigena DSM 2697). The strain Klebsiella (Raoultella) terrigena DSM 2687 is commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH. The transformation with the plasmid pGDBS-E96Atet {+) was carried out in a manner known per se analogously to the methods familiar to the skilled worker for the transformation of E. coli. As a control strain, Klebsiella terrigena, with which pKKj-tet vector was transformed, was used.
Trans ormanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf GDH-Aktivität getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2tet- Medium mit einer Transformante beimpft und 24 h bei 30 °C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert. Transmonauts were isolated and tested for GDH activity by shake flask culture. For this purpose, in each case 50 ml FM2tet medium were inoculated with a transformant and incubated for 24 h at 30 ° C and 140 rpm (Infors shaker).
FM2tet Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulfat 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; KH2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt. FM2tet medium contained glucose 60 g / l; 10g / 1; Yeast Extract (Oxoid) 2.5 g / 1; Ammonium sulfate 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 × 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1; KH 2 P0 4 1.5 g / 1; Trace element mix 10 ml / 1 and tetracycline 15 mg / 1. The pH of the FM2tet medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3BO3 2,5 g/1; C0CI2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 x 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; nS0 x 7 H20 0, 3 g/1 und Na2 o04 x 2 H20 0, 15 g/1. Die Zellen wurden, wie im 2. Beispiel für E. coli beschrieben, analysiert. Klebsiella Zellen wurden mit der „French®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf GDH-Aktivität untersucht. Die spezifische GDH-Aktivität in Rohextrakten (bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben) betrug zwischen 0,9 und 1,6 The trace element mix had the composition H 3 BO 3 2.5 g / l; C0Cl 2 x 6 H 2 0 0.7 g / 1; CuSO 4 × 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 × 4 H 2 O 1.6 g / 1; nS0 x 7 H 2 0 0, 3 g / 1 and Na 2 o0 4 x 2 H 2 0 0, 15 g / 1. The cells were analyzed as described in Example 2 for E. coli. Klebsiella cells were disrupted with French®Press and the cell extracts were analyzed for GDH activity The specific GDH activity in crude extracts (determined as described in Example 2) was between 0.9 and 1.6
U/mg Protein. Im Klebsiella terrigena Kontrollstamm konnte keine GDH-Aktivität gemessen werden. U / mg protein. In the Klebsiella terrigena control strain, no GDH activity could be measured.
4. Beispiel: 4th example:
2, 3-BDL-Produktion durch Schüttelkolbenanzucht rekombinanter K. terrigena Stämme  2, 3-BDL production by shake flask culture of recombinant K. terrigena strains
Die Kultivierung der mit dem Plasmid pGDBS-~E96Atet transformierten K. terrigena Stämme erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Als Kontrollstamm wurde Klebsiella terrigena, mit dem pKKj-tet Vektor transformiert {Kontrollstamm aus dem 3.Cultivation of the K. terrigena strains transformed with the plasmid pGDBS ~ E96Atet was carried out as described in example 3. As a control strain, Klebsiella terrigena was transformed with the pKKj-tet vector {control strain from the 3.
Beispiel), verwendet. Die Kultivierungsdauer betrug jedoch 96 h. Dabei wurde die Glucosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Glucoseanalysator 7100MBS der Fa. YSI) und Glucose bei Bedarf aus einer 40 % (w/v) Stocklösung nachgefüttert. In Abständen von 48 h wurden Proben auf ihren 2,3-BDL Gehalt untersucht. Das Ergebnis der 2,3-BDL Produktion ist in Tabelle 1 dargestellt . Example). However, the cultivation time was 96 hours. The glucose concentration was determined at intervals of 24 h (glucose analyzer 7100MBS from YSI) and glucose if necessary from a 40% (w / v) stock solution re-fed. At intervals of 48 h, samples were tested for their 2,3-BDL content. The result of 2,3-BDL production is shown in Table 1.
Tabelle 1: BDL-Produktion in Klebsiella terrigena Transformanten Table 1: BDL production in Klebsiella terrigena transformants
K. t. K. t. GDBS- K. t. GDBS- . t. GDBS- K. t. GDBS-K. t. K. t. GDBS-K. t. GDBS. t. GDBS-K. t. GDBS-
WT- E96A E96Ä E96A pKKj ~~ ff 1 ■ff2 #3 #4 tet WT-E96A E96A E96A pKKj ~~ ff 1 ■ ff2 # 3 # 4 tet
Zeit 2 ^ 3 DL 2 3 HDXJ 2,3 BDL 2,3 BDL 2^-3 O J Time 2 ^ 3 DL 2 3 HDXJ 2,3 BDL 2,3 BDL 2 ^ -3 O J
{h) (g/D (g/l) (g/D (g/D (g/D{h) (g / D (g / l) (g / D (g / D (g / D
48 27, 3 35, 8 36, 5 34, 9 34, 848 27, 3 35, 8 36, 5 34, 9 34, 8
96 24, 4 56, 1 57, 3 57, 0 57, 6 96 24, 4 56, 1 57, 3 57, 0 57, 6
Wie in Tabelle 1 dargestellt, resultierte die Expression des GDH-Gens in Klebsiella terrigena in einer unerwartet hohen Steigerung der 2,3-BDL Produktion in der Schüttelkolbenanzucht um ca. 100 %. Die Bestimmung des 2 , 3-Butandiolgehalts in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR. Dazu wurde ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3- (Trimethylsilyl) propionsäure-2 , 2, 3, 3-d Natriumsalz} Stan- dardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D20 gemischt. Die 1H-N R Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die N R-Signale der Analyten in folgenden Bereichen in- tegriert: As shown in Table 1, expression of the GDH gene in Klebsiella terrigena resulted in an unexpectedly high increase in 2,3-BDL production in shake flask culture by approximately 100%. The determination of the 2, 3-Butandiolgehalts in culture supernatants was carried out in a conventional manner by 1 H-NMR. For this purpose, an aliquot of the culture was centrifuged (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) and 0.1 ml of the culture supernatant with 0.6 ml of TSP (3- (trimethylsilyl) propionic acid 2, 2, 3, 3-d sodium salt) standard. standard solution, typically 5 g / l) in D 2 O. The 1H-NR analysis including peak integration was carried out according to the prior art using an Avance 500 NMR instrument from Bruker the N R signals of the analytes are integrated in the following areas:
TSP : 0,140 TSP: 0.140
2 , 3~Butandiol : 1,155  2,3-butanediol: 1,155
Ethanol: 1,205  Ethanol: 1.205
Essigsäure: 2,000 Acetoin: 2,238 - 2,200 ppm (3H) Acetic acid: 2,000 Acetoin: 2.238 - 2.200 ppm (3H)
5. Beispiel: 5th example:
2,3-BDL Produktion mit GDH-exprimierenden K. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation  2,3-BDL production with GDH-expressing K. terrigena strains by fed-batch fermentation
Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des p02 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm) , Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute) , p02 (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt} , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und auf- gezeichnet. Feed Medium (74 % Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Glucoseverbrauch über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol® J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt), verwendet. "Labfors II" fermenters from Infors were used, the working volume being 1.5 l (3 l fermenter volume) .The fermenters were equipped according to the prior art with electrodes for measuring the pO 2 and the pH, and with a foam probe which was used The values of the measuring probes were recorded by a computer program and graphically represented: The fermentation parameters stirrer speed (rpm), aeration (supply of compressed air in vvm, volume of compressed air per volume of fermentation medium per minute), p0 2 (oxygen partial pressure , pH and fermentation temperature were controlled and recorded via a computer program provided by the fermenter manufacturer.Feed medium (74% glucose, w / v) was metered in according to the glucose consumption via a peristaltic pump To control foaming, an alkoxyl was used rter fatty acid ester to a vegetable-based, commercially available under the name Struktol J673 ® at Schill & Seilacher (20-25% v / v diluted in water) was used.
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren der Klebsiella Wildtyp Stamm, transformiert mit dem Vektor pKKj-tet (Kontrollstamm aus dem 3. Beispiel) und der GDH-produzierende Stamm K. t. GDBS-E96A#3 (siehe 4 . Beispiel}. Batch-Strains used in the fermentation were the Klebsiella wild type strain transformed with the vector pKKj-tet (control strain from the 3rd example) and the GDH-producing strain K.t. GDBS-E96A # 3 (see 4th example).
Fermentationsmedium war FM2tet Medium (siehe 3. Beispiel). Fermentation medium was FM2tet medium (see 3rd example).
1,35 1 des Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüt- telkolbenanzucht in Batch-Fermentationsmedium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30 °C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,0. In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter: 1.35 L of the medium was inoculated with 150 ml of preculture. The preculture of the strains to be fermented was prepared by 24 h shake flask growing in batch fermentation medium. The fermentation conditions were: temperature 30 ° C, stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.0. The fermenter was sampled periodically to analyze the following parameters:
Die Zelldichte OD60o als Maß der gebildeten Biomasse wurde pho- tometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) . The cell density OD 60 o as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (BioRad photometer SmartSpec ™ 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet. To determine the dry biomass, 1 ml of fermentation batch was centrifuged per measurement point in a triple determination, the cell pellet was washed with water and dried at 80 ° C. to constant weight.
Der Glucosegehalt wurde bestimmt wie im 4. Beispiel beschrie¬ ben . wurde durch NMR bestimmt wie im 4. Beispiel beschrieben . The glucose level was determined as beschrie ¬ ben in the fourth example. was determined by NMR as described in Example 4.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa.After the glucose introduced in the batch medium had been consumed, the product was pumped by means of a pump (peristaltic pump 101 U / R of the Fa.
Watson Marlow} eine 74 % (w/v) Glucoselösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt. Tabelle 2 zeigt die zeitabhängige 2 , 3-BDL-Bildung im K. terri- gena Kontrollstamm und in dem GDH-produzierenden Stamm Klebsiella terrigena K. t. GDBS-E96A#3. Watson Marlow} added a 74% (w / v) glucose solution. The feeding rate was determined by the current glucose consumption rate. Table 2 shows the time-dependent 2, 3-BDL formation in the K. terrigena control strain and in the GDH-producing strain Klebsiella terrigena K. t. GDBS-E96A # 3.
Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (Bei- spiel 4), führt die Expression des GDH-Enzyms zu einer signifi¬ kanten Steigerung der 2 , 3-Butandiolproduktion um ca. 48 %, be¬ zogen auf die Maximalausbeute bei 72 h Fermentationsdauer. Tabelle 2 As has been observed in the shake flask experiments (examples game 4), the expression of the GDH enzyme leads to a signifi cant ¬ increase in 2, 3-Butandiolproduktion by about 48%, ¬ be subjected to the maximum yield at 72 hours fermentation time. Table 2
Produktion von 2,3-BDL in . terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation  Production of 2,3-BDL in. terrigena strains through fed-batch fermentation
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Figure imgf000025_0001
6. Beispiel: 6th example:
2,3-BDL Fermentation im 330 1 Maßstab  2,3-BDL fermentation in the 330 1 scale
Fermentiert wurde der Stamm Klebsiella terrigena pGDBS-E96A#3 (siehe 4. und 5. Beispiel). The strain Klebsiella terrigena pGDBS-E96A # 3 was fermented (see 4th and 5th examples).
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von Klebsiella terrigena pGDBS-E96A#3 in LBtet Medium (siehe 2. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, je- weils in einem 1 1 Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Uber-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20 °C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD6oo l von 0,5 - 2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium. Preparation of an inoculum for the pre-fermenter: An inoculum of Klebsiella terrigena pGDBS-E96A # 3 in LBtet medium (see Example 2) was prepared by mixing 2 × 100 ml LBtet medium, in each case in a 1 liter Erlenmeyer flask, each with 0, 25 ml of a glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet medium, treated with glycerol in a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C) were inoculated. The cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density OD 6oo l of 0.5 - 2.5). 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel). Die Fermen¬ tation erfolgte im sog. Batch Modus. 2 x 8 1 FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30 °C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3PO4 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstan- ten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauersto fpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff- partialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rprn} . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol® J673 (20-25 % v/v in Wasser} verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD60o ^l von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet . Pre-fermenter: The fermentation was carried out in two Biostat® C-DCU 3 fermenters from Sartorius BBI Systems GmbH. Fermentation medium was FM2tet (see 3rd example). The Fermen ¬ tation took place in the so-called. Batch mode. 2 x 8 1 FM2tet were inoculated with 100 ml of inoculum. Fermentation temperature was 30 ° C. pH of the fermentation was 6.0 and was kept constant with the correction agents 25% NH 4 OH, or 6 NH 3 PO 4 . Aeration was carried out with compressed air at a constant flow rate of 1 vvm. The oxygen partial pressure p02 was set at 50% saturation. The regulation of the partial pressure of oxygen was effected by the stirring speed (stirrer speed 450-1000 rprn) .Structol.RTM. J673 (20-25% v / v in water) was used to control the foam formation After 18 h fermentation period (cell density OD 60 %) from 30-40) the two pre-fermenters were used as inoculum for the main fermenter.
Haupt fermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet (siehe 3. Beispiel}. Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. 180 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3PO4 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (siehe 4. Beispiel, bezogen auf das An- fangsvolumen) . Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartial- druckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rprn) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol® J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermen- tation wurde der Glucoseverbrauch durch off-line Glucose-Main fermenter: The fermentation was carried out in a Biostat® D 500 fermenter (working volume 330 l, boiler volume 500 l) from Sartorius BBI Systems GmbH. Fermentation medium was FM2tet (see Example 3) The fermentation was carried out in the so-called fed-batch mode: 180 l of FM2tet were inoculated with 16 l of inoculum, fermentation temperature was 30 ° C. The pH of the fermentation was 6.0 and was corrected using the correction means 25 % NH 4 OH or 6 NH 3 PO 4. The aeration was carried out with compressed air at a constant flow rate of 1 vvm (see Example 4, based on the initial volume) The oxygen partial pressure pO 2 was set to 50% saturation . the regulation of the oxygen partial pressure was made about the rate of stirring (stirrer speed 200-500 RPRN) to control foaming ® Struktol J673 was used (20-25% v / v in water) in the course of the fermenter tation of glucose consumption was.. off-line glucose
Messung mit einem Glucose-Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 4. Beispiel). Sobald die Glukosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) r wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feedlösung gestar- tet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glukosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1. Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 5. Bei spiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 4 da gestellt. Die erzielte Ausbeute an 2 , 3-Butandiol wurde gegen¬ über dem Kontrollstamm aus Beispiel 5 um 60 % gesteigert. Measurement with a glucose analyzer from the company YSI determined (see 4th example). Once the glucose concentration of the fermentation batches about 20 g / 1 was (8-10 h after inoculation) r was the addition of a 60% w / w glucose feed solution tet gestar-. The flow rate of the feed was chosen so that during the production phase a glucose concentration of 10 - 20 g / 1 could be maintained. After completion of the fermentation, the volume in the fermenter was 330 1. The analysis of the fermentation parameters was carried out as described in the 5th game. The production process is shown in Table 4. The yield of 2,3 -butanediol obtained was increased by 60% compared to the control strain from Example 5.
Tabelle 4 Table 4
Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Maßstab  Production of 2,3-BDL by fed-batch fermentation in the 330 1 scale
Figure imgf000027_0001
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Claims

Patentansprüche : Claims:
1. Produktions stamm zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol her¬ stellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm unter Bedingungen der 2,3-1. Production line for the production of 2, 3-butanediol forth ¬ adjustable from a parent strain, characterized in that the production strain under conditions of 2.3-
Butandiolproduktion eine Glucose Dehydrogenase Enzymaktivität aufweist, die im Ausgangsstamm nicht oder nur unter physiologischen Bedingungen die verschieden von den Bedingungen der 2 , 3-Butandiolproduktion sind, vorhanden ist. Butanediol production has a glucose dehydrogenase enzyme activity, which is not in the parent strain or only under physiological conditions other than the conditions of the 2, 3-butanediol production is present.
2. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Glucose Dehydrogenase um ein Enzym der Enzymklasse EC 1.1.1.47 handelt. 2. Production strain according to claim 1, characterized in that it is an enzyme of the enzyme class EC 1.1.1.47 in the glucose dehydrogenase.
3. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucose Dehydrogenase Aktivität im Produktionsstamm durch Expression eines für das Glucose De- hydrogenaseenzym kodierenden Gens erreicht wird. 3. Production strain according to claim 1 or 2, characterized in that the glucose dehydrogenase activity in the production strain is achieved by expression of a coding for the glucose dehydrogenase enzyme gene.
4. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, 4. production strain according to one of claims 1 to 3,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Gattung Klebsiella, Raoultella, Bacillus, Paenibacillus oder Lactobacillus handelt, wobei ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa oder Bacillus licheniformis bevorzugt ist und ein Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terrigena oder Klebsiella (Raoultella) planticola besonders bevorzugt ist und es sich insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Sicherheitsstufe Sl handelt.  characterized in that it is a strain of the genus Klebsiella, Raoultella, Bacillus, Paenibacillus or Lactobacillus, a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena, Klebsiella (Raoultella) planticola, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa or Bacillus licheniformis is preferred, and a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena or Klebsiella (Raoultella) planticola is particularly preferred and it is particularly preferred to be a strain of safety level S1.
5. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 5. production strain according to one of claims 1 to 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gen der Glucose Dehydrogenase aus einem Bakterium der Gattung Bacillus, bevorzugt aus einem Bakterium der Art Bacillus subtilis stammt.  characterized in that the gene of glucose dehydrogenase is derived from a bacterium of the genus Bacillus, preferably from a bacterium of the species Bacillus subtilis.
6. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 6. production strain according to one of claims 1 to 5,
dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem nicht gentech- nisch optimierten Ausgangsstamm hergestellt wurde und eine Glucose Dehydrogenase in rekombinanter Form produziert mit der Folge, dass seine 2,3-BDL Produktion gegenüber dem nicht gentechnisch optimierten Ausgangsstamm um mindestens 30 %, bevorzugt 45 %, besonders bevorzugt 60 % und insbesondere bevorzugt um 100 % gesteigert wird, wobei die 2,3- Butandiol Ausbeute des Ausgangsstammes mindestens 80 g/1 beträgt . Verfahren zur Herstellung von 2 , 3-Butandiol , dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird. characterized in that it consists of a non-GM nisch optimized starting strain was produced and a glucose dehydrogenase produced in recombinant form with the result that its 2,3-BDL production compared to the non-genetically optimized starting strain by at least 30%, preferably 45%, more preferably 60% and most preferably by 100% is increased, wherein the 2,3-butanediol yield of the parent strain is at least 80 g / 1. A process for the preparation of 2, 3-butanediol, characterized in that a production strain according to claim 1 to 6 is cultivated in a cultivation medium.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoff ersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur 2,3~BDL Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt. A method according to claim 7, characterized in that a cultivation in a pH range of pH 5 to pH 8 and a temperature range of 20 ° C to 40 ° C and anaerobic or aerobic with an oxygen supply by entry of compressed air or pure oxygen takes place and there is a culture time for 2,3 ~ BDL production between 10 h and 200 h.
Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen größer als 300 1 erfolgt. A method according to claim 7, or 8, characterized in that a cultivation in a fermentation volume greater than 300 1 takes place.
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