JP2001504332A - Ｌ―アスパラギン酸の改良製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （１）（Ａ）マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する酵素含有物質、又は（Ｂ）マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及びアスパルターゼ活性を有する酵素含有物質と、マレイン酸とアンモニア、及び／又はマレイン酸一又は二アンモニウムを含む水性基質溶液とを接触させて、反応溶液中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムを形成すること、（２）この反応溶液を、マレイン酸又は無水マレイン酸の水性溶液に、制御された速度で添加して、母液中でＬ−アスパラギン酸を結晶化させること、及び（３）母液からＬ−アスパラギン酸を回収すること、及び（４）場合によっては、工程１の前記酵素含有物質とさらに反応させるために基質溶液として前記母液をリサイクルすること、及び（５）場合によっては、リサイクルの前、その間、又はその後に、アルカリ、例えばアンモニアを前記母液に添加することを含むＬ−アスパラギン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−アスパラギン酸の改良製造方法 本発明は、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法に関する。 発明の背景 アスパルターゼ活性を有する微生物を用いた、フマル酸とアンモニア（フマル 酸二アンモニウムを生じる）からのＬ−アスパラギン酸の様々な製造方法が公開 されている。例えば、Ｃｈｉｂａｔａ，Ｉ．；Ｔｏｓａ，Ｔ．；Ｓａｔｏ，Ｔ． の「総合バイオテクノロジー（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ）」第３巻、Ｅｄ．Ｍｕｒｒａｙ Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ、Ｐｅｒｍａ ｇｏｎ，１９８５年参照。これらの公開されている方法において、Ｌ−アスパラ ギン酸は通常、無機酸例えば硫酸の反応溶液への添加から生じたＬ−アスパラギ ン酸結晶の沈殿、及びこれらの結晶の分離によって回収される。しかしながらこ れらの公開された方法において、多量の廃棄塩例えば硫酸アンモニウムが、この 沈殿の副生成物として発生する。これらの塩の生成は、環境という観点からは望 ましくなく、かつアンモニアの望ましくない損失を生じる。 １９８５年１２月２４日に発行された米国特許第４，５６０，６５３号（‘６ ５３号）は、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法であって、アスパルターゼ又はアス パルターゼ産生微生物がフマル酸及びアンモニアに作用する方法を開示している 。Ｌ−アスパラギン酸は、マレイン酸の添加によって沈殿し、溶液から濾過され 、母液がリサイクルされる。この‘６５３号特許は、マレイン酸をフマル酸へ異 性化するための化学触媒の使用を開示している。 マレエートをフマレートへ異性化するためのもう１つの触媒として、マレエー トイソメラーゼ活性を有する酵素含有生物を用いることができる。例えばＯｔｓ ｕｋａ、Ｋ．“Ａｇｒ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．”第２５巻（９）、１９６１年、 ７２６頁、Ｓｃｈｅｒ，Ｗ．及びＪａｋｏｂｙ，Ｗ．Ｂ．“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．”第２４４巻（７）、１９６９年、１８７８頁参照。この触媒は、報告さ れているところでは、塩基性ｐＨにおいて、マレイン酸塩のフマル酸塩への高い 転換率を生じる。 １９６８年７月１２日に発行された米国特許第３，３９１，０５９号は、マレ イン酸から直接Ｌ−アスパラギン酸を製造するための、マレエートイソメラーゼ 活性とアスパルターゼ活性 とを有する酵素含有生物について開示している。 環境への悪影響が最小限であるか又はこれをまったく伴なわずに、Ｌ−アスパ ラギン酸を経済的かつ効率的に調製する技術は、産業界にとって常に関心がある ことである。 発明の目的 安価な出発基質を用いたＬ−アスパラキン酸の高い効率の製造方法を提供する ことが、この発明の目的である。 副生成物として最小限のアンモニウム塩の発生しか伴なわないＬ−アスパラギン 酸の高い効率の製造方法を提供することが、この発明のもう１つの目的である。 最小限の望ましくない副生成物しか発生させずに、向上した収率を有するＬ− アスパラギン酸の製造方法を提供することが、この発明のさらにもう１つの目的 である。 これらの目的及びその他の目的は、ここにより詳細に記載されるこの発明にお いて明らかになる。 発明の概要 この発明の最も広い態様において、及び好ましい実施態様において、Ｌ−アス パラギン酸アンモニウムは、酵素又は微生物によって、マレイン酸又は無水マレ イン酸から製造される。Ｌ −アスパラギン酸は、好ましくはマレイン酸を用いた沈殿によって回収される。 もう１つの利点は、反応溶液からＬ−アスパラギン酸を回収した後で、場合によ っては再使用のために母液をリサイクルすることができるということである。場 合によっては母液のｐＨは塩基性にされてもよい。 この発明は、次の工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法である。すなわち （１）（Ａ）マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する酵素 含有物質、又は（Ｂ）マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及びア スパルターゼ活性を有する酵素含有物質と、マレイン酸とアンモニア、及び／又 はマレイン酸一又は二アンモニウム又はこれらの混合物を含む水性基質溶液とを 接触させて、反応溶液中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムを形成する工程、（ ２）前記反応溶液を、マレイン酸の水性溶液又は無水マレイン酸の水性スラリー に、制御された速度で添加して、母液中でＬ−アスパラギン酸を結晶化させる工 程、及び（３）前記母液から前記Ｌ−アスパラギン酸を回収する工程、及び（４ ）場合によっては、前記工程（１）の前記酵素含有物質とさらに反応させるため に、基質溶液として前記母液をリサイクルする工程、及び（５）場合に よっては、リサイクルの前、その間、又はその後に、アンモニア又はその他のア ルカリを前記母液に添加する工程である。 この発明のもう１つの好ましい実施態様において、アンモニア／マレイン酸モ ル比が約１〜約２であるような、無水マレイン酸、マレイン酸、及びその塩と、 アンモニア又はマレイン酸アンモニウムとを含む、温度約１０℃〜約６０℃にお ける基質溶液を、マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性との両方を 有する微生物細胞、又はマレエートイソメラーゼ活性を有する微生物細胞及びア スパルターゼ活性を有する微生物細胞、あるいはまたその粉砕細胞又は酵素、あ るいはこれと同等のものと接触させる。 マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質例えば微生物細胞、及びア スパルターゼ活性を有する酵素含有物質は、所望であれば混合物として用いられ てもよい。理論に束縛されるわけではないが、マレエートイソメラーゼ含有物質 は、マレイン酸アンモニウムをフマル酸アンモニウムに転換し、ついでアスパル ターゼ含有物質は、フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸アンモニウムに 転換すると考えられる。これらの転換は、反応中に形成されるフマレート塩の濃 度を最小限にする ために、好ましくは同じ容器又はコンテナで行なわれる。以前に用いられた酵素 含有物質の活性が低下した場合、好ましくは新しい種と前部又は一部取替えても よい。 マレエートイソメラーゼ含有酵素／アスパルターゼ酵素の比は調節することが できる。好ましくはアスパルターゼ酵素の活性は、反応中に形成されるかなり高 いフマレート濃度を最小限にするのに十分なほど高いものである。アスパルテー トの最高収率は、フマレート濃度が抑制されている時に生じると考えられる。こ れは、マレエートイソメラーゼ活性を阻害すると考えられるからである。 Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムは反応中に形成され、その結果生じた溶液は 、無水マレイン酸スラリー又はマレイン酸溶液に、制御された速度で添加されて Ｌ−アスパラギン酸が結晶化される。このＬ−アスパラギン酸結晶は、溶液から 分離される。回収された結晶は水で洗浄され、マレイン酸及び／又はその塩の量 が減らされる。ここで用いられている「制御された速度」という用語は、漸進的 添加、すなわち反応副生成物の形成を最小限にし、その結果Ｌ−アスパラギン酸 の増加した収率が生じるように、反応溶液のマレイン酸又は無水マレイン酸への 制御された方法における添加を意味する。 結晶が除去された母液は好ましくはリサイクルされ、より多くのＬ−アスパラ ギン酸の製造のために基質溶液として再利用される。この任意工程が実施される 場合、これによって原料費が低減し、かなり多いアンモニアを含む廃水を発生さ せない。このアンモニアは、これまでは廃棄が必要であり、環境へ損害を与える 可能性があったものである。 この発明の方法において、無水マレイン酸は、好ましくはＬ−アスパラギン酸 を製造するための出発物質の１つとして用いられる。母液は、化学触媒を添加せ ずに基質溶液としてリサイクルされてもよい。可溶性母液の完全なリサイクルの 結果、非常に効率的な製造が行なわれ、廃棄物が最小限になるか又はゼロになり 、アンモニアの使用も最小限になる。従ってＬ−アスパラキン酸は、安価かつ効 率的に製造しうる。 発明の詳細な説明 理論に束縛されるわけではないが、この方法の部分として発生じると考えられ るいくつかの化学反応を、下記表に示す。いくつかの工程は必要により行う。大 幅に生じる工程もあり、小さい程度に生じる工程もある。 マレエートイソメラーゼ活性及びアスパルターゼ活性を有するあらゆる適切な 微生物を用いることができる。典型的ではあるか非限定的な酵素の例には、Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｌｃａｌｌｇｅｎｅｓｅ ｆ ａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｌｓ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅ ｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ｑｕａｌｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔａｒｕｍｅ ｎ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｎｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ及びこれらの混合物等が含まれる。 さらには所望であれば、マレエートイソメラーゼ活性を有する微生物と、アス パルターゼ活性を有する微生物との組合わせを用いることもできる。 ここで適切に用いることができるマレエートイソメラーゼ活性を有する微生物 の例証的ではあるが非限定的な例には、マレイン酸をフマル酸に転換する微生物 、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含むＰｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ属が含まれる。その他の適切な例証的酵素には、Ａｌｃａｌｌｇｅｎ ｅｓｅ ｆａｅｃａｌiｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、これらの混合物等が無制限に含ま れる。 ここで用いることができる適切な例証的で非限定的な微生物の例は、フマル酸 をＬ−アスパラギン酸に転換するアスパルターゼ活性を有するものである。これ らには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３、並びにＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物 が含まれる。 あらゆる酵素培養方法又は製造方法をこの発明において用いることができる。 通常の発酵技術及び通常の培地を用いることができる。酵素は、酵素ブロス、全 細胞、粉砕細胞、又はカプセル化酵素又は細胞、これらの混合物およびその他と して用いることができる。 反応は、好ましくはＬ−アスパラギン酸製造のための反応を妨害する酵素が不 活性化されるか、あるいは実質的に不活性化された後に行われる。例えば酵素含 有物質は、温度約４０℃〜６０℃、より好ましくは約５０℃〜５８℃まで加熱さ れてもよい。このような温度は、Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの 存在下において、フマラーゼ酵素を不活性化するため に用いることができる。 酵素反応は、同じ容器又はコンテナ又はタンクにおいて行うのが好ましいが、 これはマレエートイソメラーゼによって形成されたフマレートが、マレエートイ ソメラーゼ活性を阻害する傾向があるからである。好ましくは（但し必要なわけ ではないが）、工程（１ａ）又は（１ｂ）が、同時に又は幾分近い時間に、ある いは同じタンクで実施される。このように望ましい方法でこれらの工程を実施す ると、収率がかなり増加するからである。理論に束縛されるわけではないが、反 応中のフマレート濃度が最小限にされるように、アスパルターゼ酵素活性を高い ままに保つことは重要であると考えられる。 本発明における基質溶液は、好ましくは無水マレイン酸、マレイン酸、マレイ ン酸塩、これらの混合物等から成る群から選ばれる。本発明においてアンモニア は、取扱いを容易にするために気体アンモニア又は水性アンモニア溶液であって もよい。水性アンモニア溶液の濃度は決定的なものではない。しかしながらリサ イクル流における水を最小限にするために、より濃縮された溶液が一般的には望 ましい。 一般的には酵素基質溶液のｐＨは、約５〜約１０、好ましく は約７〜約９、最も好ましくは約８〜約９である。ｐＨは、アルカリ塩基を用い て調節することかできるが、アンモニアが好ましい。マレイン酸又はその塩とア ンモニアとが混合される場合、この混合はあらゆる都合のよい方法で実施するこ とができる。最小量の水をこの方法において添加する方がよいが、その理由は、 このプロセスの間中、一定又はほぼ一定の濃度に維持するために水を除去しなけ ればならないからである。 マレイン酸及びアンモニアを含む好ましい基質溶液は、好ましくは水とトロメ タミン（ＴＲＩＳ）又は燐酸塩緩衝液とを用いて調製される。マレイン酸の濃度 は好ましくは約０．１Ｍ〜約３．５Ｍである。但し所望であればこれより高い濃 度、あるいはこれより低い濃度も用いることができる。マレイン酸の濃度はより 好ましくは約１〜約２Ｍである。 マレエートイソメラーゼ酵素触媒活性を高めるために、２−メルカプトエタノ ール、チオグリセロール、あるいは実質的にこれと同等のもの等が含まれる（こ れらに限定されるわけではない）還元性ＳＨ基を含む化合物は、好ましくはマレ エートイソメラーゼ酵素触媒活性を高めるために、濃度約０．１〜約１００ｍＭ 、より好ましくは約１〜約２５ｍＭで添加される。 あらゆる通常の反応器、例えば連続攪拌タンク、カラム型反応器等を、本発明 のプロセスに用いることができる。カラム型反応器の場合、流量は、カラムに入 っている酵素含有物質の種類及び活性に従って変えてもよい。 酵素反応についての反応温度は通常、約１０〜約６０℃、好ましくは約２５〜 約４０℃である。但し所望であればこれより高い温度あるいはこれより低い温度 を用いることもできる。 好ましい実施態様において、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを形成するため のマレイン酸とアンモニアとの酵素反応の後、反応溶液を制御された速度で無水 マレイン酸の水性スラリー又はマレイン酸溶液に添加して、Ｌ−アスパラギン酸 を結晶化し、これを回収する。 Ｌ−アスパラギン酸を結晶化するために、マレイン酸又は無水マレイン酸を用 いて、母液を必要によりリサイクルをすることも可能である。Ｌ−アスパラギン 酸を結晶化するために無機酸が用いられる場合、無機酸のアンモニウム塩が形成 されるが、これは酵素基質として用いることはできない。無機酸が用いられる時 に得られる母液は、ついで通常は廃棄物として捨てられる。 この発明において、Ｌ−アスパラギン酸の結晶化という文脈で用いられている 「マレイン酸」という用語には、無水マレイン酸、マレイン酸、又はマレイン酸 の塩、これらの混合物等が無制限に含まれる。マレイン酸は、水性溶液又はスラ リーであってもよいが、好ましくは水中で無水マレイン酸を反応させることによ って形成されたものである。このプロセスにおいて、水バランスを得る必要があ るので、最小量の水が好ましくはこのプロセスにおいて添加される。その理由は 、このプロセスの間中、一定又はほぼ一定の濃度を維持するために、水を除去し なければならないからである。 Ｌ−アスパラギン酸を結晶化するために用いられるマレイン酸の総量は様々で あってよく、反応溶液における（塩として存在する）Ｌ−アスパラギン酸の総量 に依る。反応溶液中に存在するＬ−アスパラギン酸を酸性化するために用いられ るマレイン酸の量は、母液の効率的かつ多数回のリサイクルのために、好ましく はＬ−アスパラギン酸アンモニウム全体とほぼ等モルにある。但しこれらの濃度 は異なっていてもよい。好ましくはマレイン酸は、Ｌ−アスパラギン酸塩よりも 高い濃度にある。マレイン酸／Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムの望ましいモル 比は、好ましくは約０．５〜約１．５、最も好ましくは約０．９５〜約１．２で ある。但し所望であればこれより高い比及びこれより低い比を用いることもでき る。 しかしながら、前記のものよりも少ないマレイン酸が添加された場合、（結晶 として）回収されるＬ−アスパラギン酸の収率は低く、一方で、この量よりも多 く用いられた場合、Ｌ−アスパラギン酸以外の副生成物が生じることがある。さ らには過剰なマレイン酸は、基質の過剰な発生を引起こし、これらの各々がこの プロセスにおいて必要によりリサイクルをしなければならない。 無水マレイン酸がＬ−アスパラギン酸アンモニウム反応溶液に添加される場合 、通常約２％〜約５％の範囲でマレインアミド酸が形成される。これは望ましく ない副生成物であり、マレイン酸アンモニウムの効率的リサイクルを妨げる。形 成されたマレインアミド酸は、十分に水溶性であるので、これは母液中に止まり 、酵素反応によって有用な物質に転換されない。 Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムがマレイン酸又は無水マレイン酸に制御され た速度で添加される場合、有意に少ない量のマレインアミド酸が形成されるか、 あるいはまったく形成され ない。結晶化の間の無水マレイン酸の使用は、その使用の容易さ及び低コストに よって望ましい。従って制御された速度で反応溶液を水性マレイン酸溶液に添加 することによって、望ましくないマレインアミド酸の形成が妨げられる。 好ましくは反応溶液は、Ｌ−アスパラギン酸を結晶化するために、マレイン酸 溶液又は無水マレイン酸スラリーに徐々に添加される。より好ましくはこの発明 の利点を得るために、制御された添加方法が用いられる。結晶粒子サイズは、変 数、例えば結晶化温度、攪拌速度、音波処理、播種、及びマレイン酸への反応溶 液の添加速度、及びこの明細書を読んだ後で当業者に明らかになる同様な技術に よって制御することができる。 Ｌ−アスパラギン酸の結晶化は、約０℃〜約１００℃で約１０分間から約２４ 時間、好ましくは約５℃〜約６０℃で約３０分〜約２時間実施されてもよい。但 し所望であれば、これより高い温度又はこれより低い温度、及びこれより長い時 間又はこれより短い時間を用いることもできる。 Ｌ−アスパラギン酸の結晶は、あらゆる通常の分離方法、例えば遠心分離、濾 過、及び当業者に知られている同等の方法によって母液から分離される。所望で あれば、結晶は通常の洗浄 手順に従って洗浄されてもよい。Ｌ−アスパラギン酸の洗浄されない粗結晶は、 通常約５〜約１５重量％のマレイン酸又はその塩を含んでおり、これは所望であ れば水で洗浄することによって減らすことができる。 この洗浄水は、好ましくはＬ−アスパラギン酸を沈殿させるために用いられる マレイン酸を形成するためのメークアップウオーターとして用いられる。この洗 浄水はまた、Ｌ−アスパラギン酸結晶が分離された母液又はこれら２つの組合わ せと混合されてもよい。洗浄水は、母液と混合する前に濃縮されてもよい。 約０．０１〜約１５重量％（洗浄されていない）及び好ましくは約０．０１〜 約１重量％（洗浄されている）のマレイン酸及び／又はその塩を含むＬ−アスパ ラギン酸結晶が、好ましくは製造される。これは結晶化条件を変えることによっ て制御された平均結晶サイズを有する。約１５〜約５００ｍｍの平均粒子サイズ が得られる。これは望ましい「平板」結晶癖を有するが、但しこれは決定的なも のではない。 Ｌ−アスパラギン酸生成物は、例えば界面活性剤、金属イオン封鎖剤、洗浄剤 組成物、化粧品組成物、医薬、コーティング 等を形成するための出発物質又は中間体として工業的に有用である。さらには、 工業的に有用なポリマー、例えばポリ（アスパラギン酸）及びその誘導体、並び に食品添加剤の製造のための出発物質として用いられる。 所望であればＬ−アスパラギン酸が分離された母液は、Ｌ−アスパラギン酸の さらなる生成のための基質溶液として用いることができる。Ｌ−アスパラギン酸 粗結晶を洗浄した洗浄水は、母液と混合することができる。マレイン酸、無水マ レイン酸、及びマレイン酸塩は、母液におけるマレイン酸濃度を調節するために 母液に添加されてもよい。アンモニア／マレイン酸モル比を好ましくは約１〜約 ２モル当量に調節するために、アンモニアが添加されてもよい。所望であればリ サイクルされた母液の容積を以前の基質溶液の容積に調節するために、水を添加 又は除去してもよい。（１）マレイン酸及びアンモニアと微生物細胞又は粉砕細 胞との反応、（２）Ｌ−アスパラギン酸の結晶化、（３）Ｌ−アスパラギン酸の 分離及び洗浄、及び（４）母液の必要ならばリサイクルを集合的に含むサイクル を、この発明の方法によれば何度も繰り返すことができる。 場合によってはアルカリ、例えばアンモニア、水酸化アンモ ニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、あるいはあらゆる 適合性塩基、これらの混合物等を母液に添加してもよい。Ｌ−アスパラギン酸を 沈殿させるために用いられたマレイン酸の量に基づいて、約０．５〜約１．０モ ルで好ましくはアンモニアが母液に添加される。一般的にｐＨを約８〜約９のよ り好ましい範囲にするために、約０．６〜約０．７モル当量が用いられるであろ う。添加されたアンモニアの量が約０．５当量より低い場合、基質溶液のｐＨは 、酵素による効率的かつ完全な転換には低すぎることもある。 所望であれば酵素にとって望ましい基質を生じるため、かつ微生物細胞又は粉 砕細胞又は酵素の酵素活性をできるだけ長くするために、好ましくは母液にアン モニアを添加してもよい。好ましくは、溶液のｐＨを約６〜約９、より好ましく は約８〜約９に維持するために、アンモニアを母液に添加する。但しこれより高 いｐＨ値又はこれより低いｐＨ値を用いることもできる。 バッチ及び連続操作及びこれらの変形例が、この発明のプロセスとして無制限 に考えられる。この発明の組成物及びこのような組成物の成分の効果的な量が、 この発明の利点を得るため に好ましくは用いられる。 次の実施例は、この発明についての詳細を与えるためのものであり、この発明 を制限するためのものではない。 実施例 実施例１ 無水マレイン酸（４５．５４ｇ又は０．４６モル）を水（２９．６６ｇ）に溶 解して、溶液を形成した。ついでこの溶液を室温から６０℃まで加熱した。２４ ．２％（ｗ／ｗ）溶液のＬ−アスパラギン酸アンモニウム溶液２７９．６３ｇ全 部（０．４５モルのＬ−アスパラキン酸アンモニウム）を、攪拌しながら３０分 にわたって、制御された速度で計量供給した。９０分間６０℃で攪拌した後、溶 液を６℃まで氷水浴で冷却した。溶液の最終ｐＨは４．１であった。濾過を用い てＬ−アスパラギン酸結晶を回収し、水６７．３５ｇで洗浄した。洗浄後のＬ− アスパラギン酸結晶の最終収率は、９６％であった（５７．２４ｇ、０．４３モ ル）。 実施例２ 無水マレイン酸（４８．１４ｇ又は０．４９モル）を、水中（６９．６３ｇ） にスラリーにした。 溶液の温度は３２℃であった。２４．２％（ｗ／ｗ）溶液のＬ−アスパラギン 酸アンモニウム溶液３１１．２５ｇ全部（０．５０モルのＬ−アスパラギン酸ア ンモニウム）を、攪拌しながら３０分にわたって、制御された速度で添加した。 ９０分間３５℃で攪拌した後、溶液を９℃まで冷却した。溶液の最終ｐＨは４． ４であった。濾過を用いてＬ−アスパラギン酸結晶を回収し、水８２．３３ｇで 洗浄した。洗浄後のＬ−アスパラギン酸結晶の最終収率は、１００＋％であった （６９．０１ｇ、０．５２モル）。 実施例３ 比較例 無水マレイン酸（５３．７５ｇ又は０．５４８モル）を、６０℃で水（３６９ ．４０ｇ又は０．５９５モル）中の２４．２％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム 溶液に添加した。９０分間６０℃で攪拌した後、溶液を９℃まで冷却した。溶液 の最終ｐＨは３．９であった。濾過を用いてＬ−アスパラギン酸結晶を回収した が、結晶は洗浄しなかった。Ｌ−アスパラギン酸結晶の最終収率は、８８．２％ であった（６４．３３ｇ、０．４８モル）。母液のプロトンＮＭＲによってマレ イン酸の存在が確認された。実施例１及び２の結果と比較例３とを比べると、こ の 発明の方法を実施することによって、収率が増加することが分る。 実施例４ 濃度約１〜２Ｍ（３７２．９２ｇ）の水中マレイン酸のアンモニウム塩から主 として構成されるＬ−アスパラギン酸結晶化から生じる母液を、２９．７％水性 アンモニア３３．８１ｇ（０．２８モル）で処理した。アンモニアの添加前の母 液の出発ｐＨは４．２であった。この溶液の最終ｐＨは８．４であった。溶液は 、マレイン酸二アンモニウムとマレイン酸アンモニウム塩との混合物であった。 実施例５ この実施例は、マレエートイソメラーゼ反応を示している。実施例４からのマ レイン酸二アンモニウム約２５０μｌを、水、トロメタミン緩衝液（５０ｍＭに なる）及び２−メルカプトエタノール（４．９ｍＭになる）、及び５０ｍｌのマ レエートイソメラーゼ酵素ブロスで希釈した。最終マレエート基質濃度は１００ ｍＭであった。この溶液を約２５℃で２時間攪拌した。ついで管の内容物を、ソ ルヴァール(Ｓｏｒｖａｌｌ)ＲＴ ６０００Ｂ冷却遠心機を用いたアミコン・セ ントリコン（Ａｍｉ ｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０、１０，０００ＭＷカットフィルターを通 す遠心分離によって酵素から分離した。遠心機におけるすべての操作は約４℃で 実施された。ＨＰＬＣによって測定されたフマル酸二アンモニウムの収率は１０ ０％であった。 実施例６ 実施例４からのマレイン酸二アンモニウム溶液約２５０μｌを、水、トロメタ ミン緩衝液（５５ｍＭになる）及び２−メルカプトエタノール（５．５ｍＭにな る）、及び１００ｍｌのマレエートイソメラーゼ酵素ブロスで希釈した。最終マ レエート基質濃度は１１１ｍＭであった。アスパルターゼ酵素の入っているいく つかのカプセル化ビーズをもこの溶液に添加した。この溶液を２５℃で３０分間 攪拌した。ついで管の内容物を、ソルヴァール（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＴ ６００ ０Ｂ冷却遠心機を用いたアミコン・セントリコン（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ）−１０、１０，０００ＭＷカットフィルターを通す遠心分離によって、 酵素含有物質から分離した。遠心機におけるすべての操作は４℃で実施された。 ＨＰＬＣによって測定されたＬ−アスパラギン酸の収率は８３．７％であった。 実施例７ ＳｃｈｅｒとＪａｋｏｂｙ方法を用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ ｒｅｓｃｅｎｓを成長させた。ついでこの培養細胞を、５ｍＭの２−メルカプト エタノールを含む０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液中に懸濁させた。細胞をフレンチ プレスで溶解し、遠心分離した。この抑制液を緩衝溶液で洗浄し、５８℃で７時 間加熱した。ついで上澄み液を４℃まで冷却し、遠心分離し、ストレプトマイシ ンスルフェートで処理し、再び遠心分離した。ついで上澄み液を硫酸アンモニウ ム（５３％ｗ／ｗまで）で処理した。生じた沈殿物を、５ｍＭの２−メルカプト エタノールで０．０３Ｍトロメタミン緩衝液中に溶解した。ついでこのマレエー トイソメラーゼ酵素ブロスを、前記実施例５〜６に用いた。 本発明は、かなり詳細に記載されている特定の実施態様として記載されてはい るが、この記載は例証のためにすぎず、この発明は必ずしもこれに限定されない と理解すべきである。これは、これに代る実施態様及び操作技術が（この開示を 見れば）当業者には明らかになるからである。従って記載されている発明の精神 から逸脱せずになしうる修正も考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３） 【補正内容】 請求の範囲 １．（１）（Ａ）マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する 酵素含有物質、又は（Ｂ）マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及 びアスパルターゼ活性を有する酵素含有物質と、マレイン酸とアンモニア、及び ／又はマレイン酸一又は二アンモニウムを含む水性基質溶液とを接触させて、反 応溶液中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムを形成する工程、（２）前記反応溶 液を、マレイン酸又は無水マレイン酸の水性溶液に、制御された速度で添加して 、Ｌ−アスパラギン酸を母液中で結晶化させる工程、及び（３）前記母液から前 記Ｌ−アスパラギン酸を回収する工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法。 ２．前記母液が、工程１の前記酵素含有物質との反応のために、基質溶液として リサイクルされる、請求項１に記載の方法。 ３．前記母液のｐＨが、リサイクルの前、その間、又はその後に調節される、請 求項２に記載の方法。 ４．ｐＨが調節され、前記母液がリサイクルされる、請求項２に記載の方法。 ５．マレイン酸に対して約１．５〜約２．０モル当量を与えるのに十分な量のア ルカリが母液に添加され、この母液が基質溶液としてリサイクルされる、請求項 ４に記載の方法。 ６．前記アルカリが、アンモニア又はアンモニウム又はそれらの混合物である、 請求項５に記載の方法。 ７． 母液のｐＨが、ｐＨ約６〜約９の範囲に調節され、母液が基質溶液として リサイクルされる、請求項４に記載の方法。 ８． 前記ｐＨが、約８〜約９の範囲内にある、請求項７に記載の方法。 ９． マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及びアスパルターゼ活 性を有する酵素含有物質が、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを形成するために 同じタンクにおいてまたは同時に、マレイン酸とアンモニア、及び／又はマレイ ン酸一又は二アンモニウムを含む水性基質溶液と接触させられて、フマル酸塩又 はフマル酸の瞬間濃度が低下される、請求項１に記載の方法。 １０． マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する酵素含有 物質、マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質、及びアスパルターゼ 活性を有する酵素含有物質 は、微生物細胞、粉砕細胞、又は酵素であるか、あるいは微生物細胞、粉砕細胞 、又は酵素を含む固定化物質である、請求項１に記載の方法。 １１． 反応溶液を酸性化するために用いられる無水マレイン酸及び／又はマレ イン酸の量は、反応溶液中に存在するＬ−アスパラギン酸の量に対して約０．５ 〜約１．５モル当量である、請求項１に記載の方法。 １２． 無水マレイン酸及び／又はマレイン酸の量は、反応溶液中に存在するＬ −アスパラギン酸の量に対して約０．９５〜約１．２モル当量の範囲内にある、 請求項１１に記載の方法。 １３． Ｌ−アスパラギン酸結晶が水で洗浄され、この洗浄水は、マレイン酸溶 液又は無水マレイン酸のためのメークアップウオーターとして用いられるか、及 び／又はこの洗浄水は、Ｌ−アスパラギン酸が除去された母液と混合され、この 混合物は、基質溶液としてリサイクルされる、請求項１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （１）（Ａ）マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有す る酵素含有物質、又は（Ｂ）マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質 及びアスパルターゼ活性を有する酵素含有物質と、マレイン酸とアンモニア、及 び／又はマレイン酸一又は二アンモニウムを含む水性基質溶液とを接触させて、 Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを形成する工程、（２）前記反応溶液を、マレ イン酸又は無水マレイン酸の水性溶液に、制御された速度で添加して、Ｌ−アス パラギン酸を母液中で結晶化させる工程、及び（３）前記母液から前記Ｌ−アス パラギン酸を回収する工程を含むＬ−アスパラギン酸の製造方法。 ２． 前記母液が、工程１の前記酵素含有物質との反応のために、基質溶液とし てリサイクルされる、請求項１に記載の方法。 ３． 前記母液のｐＨが、リサイクルの前、その間、又はその後に調節される、 請求項２に記載の方法。 ４． ｐＨが調節され、前記母液がリサイクルされる、請求項２に記載の方法。 ５． マレイン酸に対して約１．５〜約２．０モル当量を与えるのに十分な量の アルカリが母液に添加され、この母液が基質溶液としてリサイクルされる、請求 項４に記載の方法。 ６． 前記アルカリが、アンモニア又はアンモニウム又はこれらの混合物である 、請求項５に記載の方法。 ７． 母液のｐＨが、ｐＨ約６〜約９の範囲に調節され、母液が基質溶液として リサイクルされる、請求項４に記載の方法。 ８． 前記ｐＨが、約８〜約９の範囲内にある、請求項７に記載の方法。 ９． マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及びアスパルターゼ活 性を有する酵素含有物質が、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを形成するために 同じタンクにおいてまたは同時に、マレイン酸とアンモニア、及び／又はマレイ ン酸一又は二アンモニウムを含む水性基質溶液と接触させられて、フマル酸塩又 はフマル酸の瞬間濃度が低下される、請求項１に記載の方法。 １０． マレエートイソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する酵素含有 物質、マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質、及びアスパルターゼ 活性を有する酵素含有物質 は、微生物細胞、粉砕細胞、又は酵素であるか、あるいは微生物細胞、粉砕細胞 、又は酵素を含む固定化物質である、請求項１に記載の方法。 １１． 反応溶液を酸性化するために用いられる無水マレイン酸及び／又はマレ イン酸の量は、反応溶液中に存在するＬ−アスパラギン酸の量に対して約０．５ 〜約１．５モル当量である、請求項１に記載の方法。 １２． 無水マレイン酸及び／又はマレイン酸の量は、反応溶液中に存在するＬ −アスパラギン酸の量に対して約０．９５〜約１．２モル当量の範囲内にある、 請求項１１に記載の方法。 １３． Ｌ−アスパラギン酸結晶が水で洗浄され、この洗浄水は、マレイン酸溶 液又は無水マレイン酸のためのメークアップウオーターとして用いられるか、及 び／又はこの洗浄水は、Ｌ−アスパラギン酸が除去された母液と混合され、この 混合物は、基質溶液としてリサイクルされる、請求項１に記載の方法。