CN1235641A - 制备l－天冬氨酸的改进方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种制备L－天冬氨酸的方法,包括步骤(1)将(A)具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的含酶材料或(B)具有马来酸异构酶活性的含酶材料和具有天冬氨酸酶活性的含酶材料与含马来酸和氨和/或马来酸一或二铵的底物水溶液接触以在反应溶液中形成L－天冬氨酸铵,(2)以控制速率将所述反应溶液加入到马来酸或马来酸酐水溶液中以在母液中结晶L－天冬氨酸和(3)从所述母液中回收所述L－天冬氨酸,和(4)任选将所述母液循环作为用于与上面步骤(1)的所述含酶材料进一步反应的底物溶液和(5)任选在再循环之前,期间或之后将氨或其它碱加入到所述母液中。
Description
本发明涉及一种制备L-天冬氨酸的方法。
发明背景
已公开了多种使用具有天冬氨酸酶活性的微生物从富马酸和氨(以产生富马酸二铵)制备L-天冬氨酸的方法。例如参见Chibata,I.；Tosa,T.,Sato,T.综合生物技术卷3,Murray Moo-Young编，Permagon,1985。在这些公开的方法中，通常通过沉淀由向反应溶液中加入无机酸，如硫酸而产生的L-天冬氨酸晶体并分离晶体来回收L-天冬氨酸。然而，在这些公开的方法中，作为沉淀的副产物，产生大量的废盐，如硫酸铵。从环境的角度来看，这些盐的产生是不希望的。并导致不希望的氨的损失。
1985年12月24日公开的美国专利4,560,653(‘653)公开了一种制备L-天冬氨酸的方法，其中天冬氨酸酶或产生天冬氨酸酶的微生物对富马酸和氨发生作用。通过加入马来酸沉淀L-天冬氨酸，将其从溶液中过滤并循环使用母液。该’653专利公开了化学催化剂在将马来酸转化为富马酸的异构化中的应用。
作为用于将马来酸异构化为富马酸的另一种催化剂，可使用具有马来酸异构酶活性的含酶微生物。例如参见Otsuka,K.农业生物化学25(9),1961,726。--Scher,W.和Jakoby,W.B.生物和化学杂志，244(7),1969,1878。该催化剂被报道在碱性pH下产生将马来酸盐转化为富马酸盐的高的转化。
1968年7月12日公开的美国专利3,391,059公开了直接从马来酸制备L-天冬氨酸的具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的含酶微生物。
经济有效并对环境具有最小或无不利影响的L-天冬氨酸的制备方法仍是工业上所感兴趣的。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种高效的使用廉价起始底物制备L-天冬氨酸的方法。
本发明的另一个目的是提供一种具有最少铵盐副产物产生的高效的L-天冬氨酸的制备方法。
本发明另一个目的是提供一种具有提高产率而产生最少的不希望副产物的L-天冬氨酸的制备方法。
在下文更详细地描述的本发明中将实现这些和其它的目的。
发明概述
在本发明的最广的方面以及一个优选的具体实施方案中，通过酶或微生物从马来酸或马来酸酐制备L-天冬氨酸铵。优选通过使用马来酸的沉淀来回收L-天冬氨酸。额外的好处是在从反应溶液回收L-天冬氨酸后母液任选可循环再使用。母液的pH任选被配成碱性。
本发明包括一种制备L-天冬氨酸的方法，包括步骤(1)将(A)具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的含酶材料或(B)具有马来酸异构酶活性的含酶材料和具有天冬氨酸酶活性的含酶材料与含马来酸和氨和/或马来酸一或二铵或其混合物的底物水溶液接触以在反应溶液中形成L-天冬氨酸铵，(2)以控制速率将所述反应溶液加入到马来酸水溶液或马来酸酐的含水淤浆中以在母液中结晶L-天冬氨酸和(3)从所述母液中回收所述L-天冬氨酸，和(4)任选将所述母液循环作为用于进一步与上面步骤(1)的所述含酶材料反应的底物溶液和(5)任选在再循环之前，期间或之后将氨或其它碱加入到所述母液中。
在本发明的另一个优选具体实施方案中，在约10℃-约60℃的温度下，将含有马来酸酐、马来酸和其盐以及氨或马来酸铵的底物溶液与具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的微生物，或具有马来酸异构酶活性的微生物细胞和具有天冬氨酸酶活性的微生物细胞或另外的破碎细胞或其酶或其等同物接触，其中氨与马来酸的摩尔比为约1-约2。
如果需要，如具有马来酸异构酶活性的微生物细胞的含酶材料和具有天冬氨酸酶活性的含酶材料可以混合物的形式使用。若不囿于理论，可以认为含马来酸异构酶的材料将马来酸铵转化为富马酸铵，接着含天冬氨酸酶的材料将富马酸铵转化为L-天冬氨酸铵。这些转化优选在相同容器或器皿中发生以使反应期间形成的富马酸盐的浓度最小。当已经使用的的含酶材料的活性降低时，它可优选全部或部分被新鲜材料所代替。
可调节含有马来酸异构酶的酶与天冬氨酸酶的比例。优选天冬氨酸酶活性足够高以将在反应期间形成的任何显著的富马酸浓度减至最小。当富马酸浓度降低时，认为产生最高产率的天冬氨酸，因为它被认为抑制马来酸异构酶的活性。
在反应期间形成L-天冬氨酸铵，以控制的速率将产生的溶液加入到马来酸酐淤浆或马来酸溶液中以结晶L-天冬氨酸。从溶液中分离L-天冬氨酸晶体。用水洗涤回收的晶体以降低马来酸和/或其盐的量。如本文所采用的，术语“控制的速率”指逐渐加入，即以控制的方式将反应溶液加入到马来酸或马来酸酐中以使反应副产物的形成最小化并导致提高的L-天冬氨酸产率。
优选循环使用从中除去了晶体的母液并再用作进一步产生更多L-天冬氨酸的底物溶液。如果进行该任选的步骤，它降低原材料费用并避免产生至今需要可能对环境有害的处理的含有大量铵的废水。
在本发明的方法中，优选将马来酸酐用作一种起始材料以产生L-天冬氨酸。在不加入化学催化剂下可将母液再循环作为底物溶液。可溶性母液的充分循环导致极有效的具有最少或无废弃以及使用最少氨的制备。因此，可廉价且有效地制备L-天冬氨酸。
发明详述
若不囿于理论，下表显示被认为在本发明某些部分发生的一些化学反应的说明。一些步骤是任选的。一些步骤在较大或较少的程度上发生。
可使用具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的任何适宜的微生物。典型的非限制性作为例证的酶包括荧光假单胞菌、粪产碱杆菌、卵状假单胞菌、产气气杆菌、大肠杆菌、短杆菌(Brevibacterium guale)、居瘤胃短杆菌、液化无色杆菌、短芽孢杆菌、其混合物等。
此外，如果需要，可使用具有马来酸异构酶活性的微生物与具有天冬氨酸酶活性的微生物的混合物。
这里可被适当采用的具有马来酸异构酶活性的微生物的作为例证但为非限制性的实例包括将马来酸转化为富马酸的那些，如假单胞菌属，包括荧光假单胞菌。其它作为例证的适宜的酶包括但不局限于粪产碱杆菌、大肠杆菌、短芽孢杆菌、其混合物等。
这里有用的适宜的作为例证的非限制性的微生物的实例为具有将富马酸转化为L-天冬氨酸的天冬氨酸酶活性的那些。这些包括埃希氏菌属，如大肠杆菌ATCC 11303以及属于短杆菌属的微生物。
可采用用于本发明的任何酶培养或生产方法。可使用常规的发酵方法和常规培养基。该酶可以酶液体培养基、完整细胞、破碎细胞或，被包被的酶或细胞，其混合物等的形式使用。
优选在干扰制备L-天冬氨酸的反应的酶失活或基本失活后进行反应。例如，可将含酶材料加热到约40℃-约60℃的温度，较优选约50℃-58℃。可在存在L-天冬氨酸和铵离子时采用该温度以使富马酸酶失活。
优选在相同容器或器皿或罐中进行酶促反应，因为由马来酸异构酶形成的富马酸具有抑制马来酸异构酶活性的趋势。虽然不必需，但优选同时或在相当近的时间中或在相同的罐进行步骤(1a)或(1b)，因为以这种所需要的方式进行这些步骤显著提高产率。若不囿于理论，可以认为保持高的天冬氨酸酶酶活性是非常重要的，这样在反应期间的富马酸浓度被减至最小。
本发明的底物溶液优选选自马来酸酐、马来酸、马来酸盐、其混合物等。在本发明中，为了便于处理，氨可为气态氨或氨的水溶液。氨水溶液的浓度不是关键；然而，通常希望较浓的溶液以使循环流中的水最少。
酶底物溶液的pH通常为约5-约10，优选为约7-约9，最优选为约8-约9。可使用碱调节pH，但优选氨。当马来酸或其盐以及氨被混合时，可以任何常规方式进行混合。在该方法中应加入最少量的水，因为必需除去它以在该方法中保持恒定或几乎恒定的浓度。
优选的含有马来酸和氨的底物溶液优选用水和tromethamine(TRIS)或磷酸缓冲液配制。马来酸的浓度优选在为约0.1M-约3.5M的范围内，虽然如果需要可采用更高或更低的浓度。马来酸的浓度较优选为约1-约2M。
为了增加马来酸异构酶的酶催化活性，优选以约0.1-约100mM，较优选约1-约25mM的浓度加入含有还原SH基团的化合物，包括但不局限于2-巯基乙醇、硫甘油或其基本等同物等以增加马来酸异构酶的酶催化活性。
在本发明的方法中可采用任何常规的反应器，如连续搅拌罐、柱型反应器等。在柱型反应器的情况下，根据柱中所含的含酶产物的种类和活性可改变流速。
酶促反应温度通常为约10-约60℃，优选约25-约40℃，虽然如果需要可采用更高或更低的温度。
在一个优选的具体实施方案中，在马来酸与氨酶促反应形成L-天冬氨酸铵后，以控制速率将反应溶液加入到马来酸酐的含水淤浆或马来酸溶液中以结晶L-天冬氨酸并回收它。
通过使用马来酸或马来酸酐以结晶L-天冬氨酸使得任选的母液循环成为可能。如果无机酸被用来结晶L-天冬氨酸，形成不能被用作酶底物的无机酸的铵盐。那么使用无机酸获得的母液通常以废液的形式废弃。
在本发明中，在结晶L-天冬氨酸内容中所用的术语“马来酸”包括但不局限于马来酸酐、马来酸或马来酸盐、其混合物等。马来酸可为水溶液或含水淤浆，但优选通过在水中与马来酸酐反应所形成的那些。由于需要实现该方法中的水的平衡，优选在该方法中加入最少量的水，因为必需除去它以在整个过程中保持恒定或几乎恒定的浓度。
被用来结晶L-天冬氨酸的马来酸的总量可发生变化，并取决于反应溶液中的L-天冬氨酸(以盐形式存在)的总量。虽然浓度可能不同，但用来酸化存在于反应溶液中的L-天冬氨酸的马来酸的量优选为大约与用于有效和多次循环母液的全部L-天冬氨酸铵等摩尔。优选马来酸比L-天冬氨酸盐浓度高。所需的马来酸与L-天冬氨酸铵的摩尔比优选为约0.5-约1.5，最优选为约0.95-约1.2，虽然如果需要可采用更高或更低的比例。
然而，如果加入比上面所述的更少的马来酸，则回收的L-天冬氨酸(为晶体)的产率较低，而如果使用多于它的量的，可能产生不是L-天冬氨酸的副产品。此外，在该方法每个任选的循环中，过量的马来酸导致底物的过度产生。
当马来酸酐被加入到L-天冬氨酸铵反应溶液中，通常以约2％-约5％的范围形成马来酰胺酸。这是防碍马来酸铵有效循环的不希望的副产物。形成的马来酰胺酸为足够水溶性的以致它保留在母液中，并且不能通过酶促反应被转化为有用的产物。
如果L-天冬氨酸铵被以控制的速率加入到马来酸或马来酸酐中，形成非常少量并且可能未形成马来酰胺酸。由于其使用的简易和降低的成本，在结晶期间使用马来酸酐是所希望的。因此以控制的速率将反应溶液加入到马来酸水溶液中避免了形成不希望的马来酰胺酸。
优选逐渐将反应溶液加入到马来酸溶液或马来酸酐淤浆中以结晶L-天冬氨酸。较优选采用控制的加入方法以实现本发明的优点。通过可变量，如结晶温度、搅拌速度、超声处理、加入晶种、向马来酸中加入反应溶液的速率以及在阅读了本说明书后对本领域普通技术人员为显而易见的技术可控制晶体颗粒的大小。
可在约0℃-约100℃下，将L-天冬氨酸的结晶进行约10分钟-约24小时，优选在约5℃-约60℃下进行约30分钟-约2小时，虽然如果需要可采用更高或更低的温度或更长或更短的时间。
通过任何常规分离方法，如离心、过滤等本领域技术人员熟知的方法，从母液中分离L-天冬氨酸晶体。如果需要，可根据常规洗涤方法洗涤晶体。未洗涤的L-天冬氨酸的粗晶体通常含有约5％-约15％(重量计)的马来酸或其盐，如果需要这可通过用水洗涤来减少。
该洗涤水优选被用作形成用来沉淀L-天冬氨酸的马来酸的补充水。该洗涤水还可与L-天冬氨酸晶体从中被分离的母液或其混合物混合。可在与母液混合之前浓缩洗涤水。
优选制备含有约0.01-约15％(重量计)(未洗涤)，优选约0.01-约1％(重量计)(已洗涤)的马来酸和/或其盐的L-天冬氨酸晶体，其中它具有通过改变结晶条件而控制的平均晶体大小。虽然这不是关键，但获得约15-约500mm的平均颗粒大小，且具有所需的“平板”晶体习性。
L-天冬氨酸产物为工业有用的，例如作为形成表面活性剂、金属离子螯合剂、去污剂组合物、化妆品组合物、药物、涂料等的起始材料或中间体。此外，它被用作制备工业有用的聚合物，如聚(天冬氨酸)和其衍生物以及食品添加剂的起始物。
如果需要，L-天冬氨酸被从中分离的母液可被用作进一步制备L-天冬氨酸的底物溶液。可将来自洗涤粗L-天冬氨酸晶体的洗涤水与母液混合。可将马来酸、马来酸酐和马来酸盐加入到母液中以调节母液中的马来酸浓度。可加入氨以将氨与马来酸的摩尔比调至优选为约1-约2摩尔当量的范围。如果需要，还可加入或除去水以将循环母液的体积调至前面底物溶液的体积。循环总起来说包括(1)将马来酸和氨与微生物细胞或破碎细胞反应，(2)结晶L-天冬氨酸，(3)分离和洗涤L-天冬氨酸，和(4)根据本发明的方法可将任选的母液的循环重复数遍。
可将任选的碱，如氨、氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或任何相容碱，其混合物等加入到母液中。优选将基于用来沉淀L-天冬氨酸的马来酸量的约0.5-约1.0摩尔当量的氨加入到母液中。通常采用约0.6-约0.7摩尔当量以将pH调至较优选的约8-约9的范围。当加入的氨的量少于约0.5当量时，对于酶的有效和完全转化来讲，底物溶液的pH可能太低。
如果需要，可优选将氨加入到母液中以产生所需的酶底物并尽可能延长微生物细胞或破碎细胞或酶的酶活性。优选地，将氨加入到母液中以将溶液的pH保持在约6-约9，较优选为约8-约9，虽然可采用更高或更低的pH值。
不连续和连续操作和其的变化被设想作为本发明的非限制性方法。优选以实现本发明优点来采用有效量的本发明的组合物及该组合物的各成分。
下面的实施例旨在提供本发明的详细内容而决不打算限制本发明。
实施例
实施例1
将马来酸酐(45.54g或0.46摩尔)溶解在水(29.66g)以形成溶液。接着将该溶液从室温加热到60℃。在30分钟期间搅拌下，以控制的速率加入总共279.63g 24.2％(W/W)的L-天冬氨酸铵溶液(0.45摩尔L-天冬氨酸铵)。60℃下，搅拌90分钟后，冰浴中将溶液冷却至6℃。溶液的最终pH为4.1。使用过滤回收L-天冬氨酸晶体并用67.35g水洗涤。洗涤后，L-天冬氨酸晶体的最终产率为96％(57.24g,0.43摩尔)。
实施例2
将马来酸酐(48.14g或0.49摩尔)淤浆在水中(69.63g)。
溶液的温度为32℃。在30分钟期间搅拌下，以控制的速率加入总共311.25g 24.2％(W/W)的L-天冬氨酸铵溶液(0.50摩尔L-天冬氨酸铵)。35℃下，搅拌90分钟后，将溶液冷却至9℃。溶液的最终pH为4.4。使用过滤回收L-天冬氨酸晶体并用82.33g水洗涤。洗涤后，L-天冬氨酸晶体的最终产率为100+％(69.01g,0.52摩尔)。
实施例3：比较实施例
60℃下，将马来酸酐(53.75g或0.548摩尔)加入到369.40g(或0.595摩尔)的24.2％L-天冬氨酸铵的水溶液中。60℃下，搅拌90分钟后，将溶液冷却至9℃。溶液的最终pH为3.9。使用过滤回收L-天冬氨酸晶体，不洗涤晶体。L-天冬氨酸晶体的最终产率为88.2％(64.33g,0.48摩尔)。母液的质子核磁共振证实了马来酰胺酸的存在。将实施例1和2的结果与比较实施例3的结果比较表明使用本发明的方法导致增加的产率。
实施例4
来自L-天冬氨酸结晶的母液主要包括马来酸铵盐水溶液，大约1-2M浓度(372.92g)被用33.81g 29.7％的铵的水溶液(0.28摩尔)处理。氨加入之前的母液的起始pH为4.2。溶液的最终pH为8.4。溶液为马来酸二铵和马来酸铵盐的混合物。
实施例5
本实施例表明马来酸异构酶反应。将来自实施例4的约250微升马来酸二铵溶液用水、Tromethamine缓冲液(以达到50mM)和2-巯基乙醇(以达到4.9mM)和50ml马来酸异构酶液体培养基稀释。最终马来酸底物的浓度为100mM。约25℃下，将溶液搅拌2小时。接着使用SorvallRT 6000B冷冻离心机离心通过Amicon Centricon-10,10,000MW截止滤器将试管的内含物与酶分离。在约4℃下，在离心机中进行所有操作。如HPLC所测定的，富马酸二铵的产率为100％。
实施例6
将来自实施例4的约250微升的马来酸二铵溶液用水、Tromethamine缓冲液(以达到55mM)和2-巯基乙醇(以达到5.5mM)和100ml马来酸异构酶溶液稀释。最终马来酸底物的浓度为111mM。还将一些含有天冬氨酸酶的密封珠加入到溶液中。25℃下，将溶液搅拌30分钟。接着使用Sorvall RT 6000B冷冻离心机离心通过AmiconCentricon-10,10,000MW截止滤器将试管的内含物与酶分离。在4℃下，在离心机中进行所有操作。如HPLC所测定的，L-天冬氨酸的产率为83.7％。
实施例7
使用Scher和Jakoby的方法让荧光假单胞菌生长。接着将培养的细胞悬浮在0.1M含有5mM 2-巯基乙醇的0.1M磷酸钾缓冲液中。用弗氏压碎器裂解细胞并离心。将抑制剂液体用缓冲溶液洗涤并在58℃下加热7小时。然后，将上清冷却至4℃，离心，用硫酸链霉素处理，并再离心。接着将上清用硫酸铵处理(高达53％W/W)。将产生的沉淀溶解在含有5mM 2-巯基乙醇的0.03M tromethamine缓冲液中。接着将该马来酸异构酶液体培养液用于上面实施例5-6中。
虽然本发明已用相当详细描述的具体实施方案进行了描述，但应理解这些描述仅为说明，本发明不必仅限于此，因为其它具体实施方案和操作技术对于本领域技术人员来讲是显而易见的。因此，本发明包括在不背离所描述的本发明的实质下可作出的修改。
Claims (13)
1．一种制备L-天冬氨酸的方法，包括步骤(1)将(A)具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的含酶材料或(B)具有马来酸异构酶活性的含酶材料和具有天冬氨酸酶活性的含酶材料与含马来酸和氨和/或马来酸一或二铵的底物水溶液接触以形成L-天冬氨酸铵，(2)以控制速率将所述反应溶液加入到马来酸或马来酸酐水溶液中以在母液中结晶L-天冬氨酸和(3)从所述母液中回收所述L-天冬氨酸。
2．权利要求1的方法，其中所述母液被循环作为与步骤1所述含酶材料反应的底物溶液。
3．权利要求2的方法，其中在循环之前、期间或之后调节所述母液的pH。
4．权利要求2的方法，其中调节pH并循环所述母液。
5．权利要求4的方法，其中将足以提供相对于马来酸为约1.5-约2.0摩尔当量的量的碱加入到母液中，并循环母液作为底物溶液。
6．权利要求5的方法，其中所述碱为氨或铵或其混合物。
7．权利要求4的方法，其中母液的pH被调节至约6-约9的pH范围内并将母液循环作为底物溶液。
8．权利要求7的方法，其中所述pH为约8-约9的范围。
9．根据权利要求1的方法，其中具有马来酸异构酶活性的含酶材料以及具有天冬氨酸酶活性的含酶材料被与含有马来酸和氨和/或马来酸一铵或马来酸二铵的底物溶液接触以在相同罐或同时形成L-天冬氨酸铵以降低富马酸盐或富马酸的瞬时浓度。
10．根据权利要求1的方法，其中具有马来酸异构酶活性和天冬氨酸酶活性的含酶材料，具有马来酸异构酶活性的含酶材料和具有天冬氨酸酶活性的含酶材料为微生物细胞、破碎细胞或酶，或为含有微生物细胞的固定化材料、破碎细胞或酶。
11．权利要求1的方法，其中用于酸化反应溶液的马来酸酐和/或马来酸的量为相对于存在于反应溶液中的L-天冬氨酸量的约0.5-约1.5摩尔当量。
12．根据权利要求11的方法，其中马来酸酐和/或马来酸的量为相对于存在于反应溶液中的L-天冬氨酸量的约0.95-约1.2摩尔当量的范围。
13．根据权利要求1的方法，其中L-天冬氨酸晶体被用水洗涤，洗涤水被用作马来酸溶液或马来酸酐的补充水和/或将洗涤水与从中除去了天冬氨酸的母液混合并且混合物被循环作为底物溶液。
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