KR100566024B1 - 아크릴산 수용액으로 세정한 미생물 촉매에 의한아크릴아미드의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

보존 안정성이 양호하고, 아크릴아미드 중합체 물성이 향상되도록 하는 아크릴아미드의 미생물 촉매에 의한 제조 방법을 제공한다. 아크릴니트릴로부터 아크릴아미드로 변환시키는 촉매 활성을 갖는 미생물 촉매를 아크릴산 수용액으로 세정한 후, 상기 변환 반응에 사용함으로써 상기 아크릴아미드의 제조는 달성된다.

니트릴히드라타제, 미생물 촉매, 아크릴아미드 중합체, 보존 안정성, 아크릴산 수용액

Description

아크릴산 수용액으로 세정한 미생물 촉매에 의한 아크릴아미드의 제조 방법 {Process for Producing Acrylamide Using Microbial Catalyst Having Been Washed with Aqueous Acrylic Acid Solution}

본 발명은 미생물 유래의 효소 니트릴히드라타제의 작용에 의해 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 아크릴아미드는 산업상 중요한 물질로서 광범한 분야에서 사용되고 있다. 예를 들면, 아크릴아미드의 중합체는 폐수 처리용 응집제, 지력(紙力) 증강제, 석유 회수제 등에 널리 사용되고 있다.

아크릴아미드는 종래, 환원 상태의 구리를 촉매로 하여 대응하는 아크릴로니트릴을 수화함으로써 공업적으로 제조되었지만, 최근 구리 촉매 대신에 미생물 촉매를 사용하는 방법이 개발되어 그의 일부는 실용화되어 있다. 미생물 촉매 등을 사용하는 생체 촉매법은 그의 반응 조건이 온화하고 부생성물도 거의 없으며, 매우 단순한 공정이 설계되므로 공업적 제법으로서 유력시되고 있고, 지금까지 아크릴로니트릴을 수화하여 아크릴아미드로 변환시키는 촉매능을 갖는 효소(효소명: 니트릴히드라타제)를 갖는 많은 미생물이 발견되어 있다.

이러한 미생물로서는, 예를 들면 바실러스(Bacillus)속, 박테리듐(Bacteridium)속, 마이크로코커스(Micrococcus)속, 브레비박테리움 (Brevibacterium)속 [이상, 일본 특허 공고 (소)62-21519호 공보 참조], 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 노카르디아(Nocardia)속 [이상, 일본 특허 공고 (소)56-17918호 공보 참조], 슈도모나스(Pseudomonas)속 [일본 특허 공고 (소)59-3795]호 공보 참조], 로도코커스(Rhodococcus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속 [이상, 일본 특허 공고(평)4-4873호 공보 참조], 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous)종 [일본 특허 공고(평)6-55148호 공보 참조], 로도코커스(Rhodococcus)속 균주 [일본 특허 공고(평)7-40948호 공보 참조] 등의 미생물을 들 수 있다.

또한, 상기 미생물을 미생물 촉매로서 사용한 아크릴아미드의 제조 방법으로서, 일본 특허 공개 (평)11-123098, 일본 특허 공개 (평)7-265091, 일본 특허 공고 (소)56-38118, 반응 방법으로서 일본 특허 공개 (평)11-89575 등을 들 수 있다.

또한, 효소 활성의 향상이나 반응 중의 효소 활성의 저하(실활)를 억제하기 위한 검토도 다양하게 이루어지고 있고, 예를 들면 반응을 빙점 내지 15 ℃의 저온에서 행하는 방법[일본 특허 공고 (소)56-38118호 공보 참조], 복수의 공급구로부터 저농도의 기질을 연속적으로 공급하는 방법[일본 특허 공고 (소)57-1234호 공보 참조], 미생물 또는 그의 처리물을 유기 용매로 처리하는 방법[일본 특허 공개 (평)5-308980호 공보 참조], 고급 불포화 지방산 존재하에 반응을 행하는 방법[일본 특허 공개 (평)7-265090호 공보 참조], 균체를 글루타르알데히드 등으로 가교 처리하는 방법[일본 특허 공개 (평)7-265091호, 일본 특허 공개 (평)8-154691호 공보 참조] 등이 있다.

한편, 미생물 촉매의 세정에 대해서는, 효소 활성 저하를 억제하기 위해서 생리 식염수, 인산이나 트리스염산의 수용액 등의 완충액을 사용하여 세정하는 것이 일반적으로 알려져 있다. 그러나, 세정액 성분이 미치는 아크릴아미드 중합체 물성이나 단량체의 보존 안정성에 대한 영향까지 고려한 미생물 촉매의 세정에 관한 것은 없다.

상술된 바와 같이, 미생물 촉매에 의한 아크릴아미드의 제조법은, 그 반응 조건이 온화하고 부생성물도 거의 없기 때문에, 정제할 필요가 없어 매우 단순한 공정이 설계될 가능성이 있기 때문에 공업적 제법으로서 유망시되고 있다.

그러나, 상기 제조법은 효소 반응시의 부생성물은 없지만, 사용되는 미생물 촉매의 세정시에 세정액 유래의 불순물의 혼입이 아크릴아미드 중합체의 물성이나 단량체의 보존 안정성에 영향을 미친다는 문제점이 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해서 결정화, 이온 교환 및 증류 등의 정제를 행하는 것도 가능하지만, 미생물 촉매를 사용한 제조법의 큰 특징인 반응시 부생성물이 거의 없다는 점을 살릴 수 없을 뿐만 아니라 에너지 및 환경 문제의 관점에서도 바람직하지 않다.

<발명의 개시>

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 미생물 유래의 효소 니트릴히드라타제를 갖는 미생물 촉매를 이용하여 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드를 제조하는 방법에 있어서, 아크릴산 수용액으로 세정한 미생물 촉매를 반응시에 사용함으로써, 아크릴아미드 중합체 물성이나 단량체의 보존 안정성이 향상된 아크릴아미드를 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 미생물 촉매를 이용하여 아크릴아미드를 제조하는 방법에 있어서, 미생물 촉매로서 아크릴산 수용액으로 세정한 미생물 촉매를 사용하는 것을 특징으로 하는 아크릴아미드의 제조 방법이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 미생물 촉매란, 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 촉매 활성(니트릴히드라타제 활성)을 갖는 미생물로부터 제조된 것이라면, 어떤 것을 사용해도 좋다. 미생물 종류로서는 바실러스(Bacillus)속, 박테리듐(Bacteridium}속, 마이크로코커스(Micrococcus)속, 브레비박테리움 (Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 노카르디아(Nocardia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 로도코커스 (Rhodococcus)속, 아크로모박터(Achromobacter)속 또는 슈도노카르디아 (Pseudonocardia)속에 속하는 미생물이 바람직하다. 상기 미생물은 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 미생물 유래의 니트릴히드라타제 유전자를 얻고, 그대로 또는 인위적으로 개량하여 임의의 숙주에 상기 유전자를 도입한 형질 전환체를 사용할 수도 있다.

상기 형질 전환체로서는, 아크로모박터(Achromobacter)속의 니트릴히드라타제로 형질 전환한 대장균 MT10770(FERM P-14756)(일본 특허 공개 (평)8-266277호 공보), 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속의 니트릴히드라타제로 형질 전환한 대장균 MT10822(FERM BP-5785)(일본 특허 공개 (평)9-275978호 공보) 또는 로도코커스ㆍ로도크로스(Rhodococcus rhodochrous)종의 니트릴히드라타제(일본 특허 공개 (평)4-211379호 공보)로 형질 전환한 미생물이 바람직하다.

상기 미생물의 배양 방법은 미생물의 종류에 따라 적절한 방법에 의해 실시할 수 있다.

본 발명에서 말하는 미생물로부터 제조된 미생물 촉매란, 미생물을 배양함으로써 얻어진 배양액, 집균 조작 등에 의해 얻어진 균체, 균체를 초음파 처리 등으로 파쇄한 균체 파쇄물, 균체 파쇄 후 제조된 조효소, 부분 정제 효소 또는 정제 효소를 말한다. 이들 미생물 촉매는 필요에 따라서 폴리아크릴아미드 겔, 알긴산염, 카라기난, 이온 교환 수지 등의 담체에 고정화시킬 수도 있다. 미생물 촉매의 사용 형태는 효소의 안정성, 생산 규모 등에 따라 적절하게 선택된다.

본 발명에서 말하는 세정은, 배양이 종료된 미생물 균체 및(또는) 반응에서 사용하는 미생물 촉매를 세정하는 것을 말한다. 따라서, 세정은, 배양이 종료된 미생물 균체 및 반응에서 사용하는 미생물 촉매를 모두 아크릴산으로 세정할 수도 있고, 반응에 사용하는 미생물 촉매만을 아크릴산으로 세정할 수도 있다. 예를 들면, 반응에 사용하는 미생물 촉매를 물, 완충액 등으로 1회 세정한 후, 반응에 사용하기 전에 아크릴산으로 세정할 수도 있다. 미생물 촉매는 반응 직전에 아크릴산으로 세정될 수도 있다.

또한, 세정 방법은 어떤 방법을 사용해도 좋다. 예를 들면, 세정ㆍ원심 분 리를 반복하는 방법, 중공사막에 의한 세정 방법 등을 예시할 수 있다. 또한, 고정화된 미생물 촉매를 세정하는 경우에는, 고정화 촉매를 세정액 중에서 교반, 침강, 상청액 제거를 반복함으로써 실시할 수 있다.

세정 방법 및 세정 횟수는 세정 효율, 효소의 안정성 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있다.

세정시에 사용되는 아크릴산의 농도는 아크릴산 수용액 중 0.01 중량％ 내지 10 중량％가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.05 중량％ 내지 1 중량％이고, 가장 바람직하게는 0.1 중량％이다.

아크릴산의 농도가 0.01 중량％ 이하이면, 세정 시간 및 세정 횟수가 증가하여 조작이 번잡해진다. 또한, 세정 횟수가 증가됨으로써 세정 중 균체의 파쇄, 고정화 균체의 붕괴 등을 일으킨다. 10 중량％ 이상이 되면 효소 활성의 저하를 야기하므로 바람직하지 않다. 또한 경제적으로도 바람직하지 않다.

아크릴산 수용액은 수산화나트륨, 암모니아 등을 사용하여 pH를 조정한다. 바람직하게는 pH를 5 내지 11, 보다 바람직하게는 6 내지 10, 가장 바람직하게는 7로 조정하여 사용한다.

상기와 같이 제조된 미생물 촉매는 아크릴산 수용액에 현탁 또는 분산시킨 상태 또는 고액(固液) 분리를 행한 상태로 미생물 촉매로서 사용할 수 있다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이 러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(1) 배양 및 세정 균체의 제조 방법

니트릴히드라타제 활성을 갖는 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) J-1(FERM BP-1478)(일본 특허 공고 (평)6-55148호 공보 기재)를 용량 30 L 종모 배양기(jar fermenter)(다까스기 세이사꾸쇼사 제조)에서 글루코오스 2 중량％, 요소 1 중량％, 펩톤 0.5 중량％, 효모 엑기스 0.3 중량％, 염화코발트 0.05 중량％를 포함하는 배지(pH 7.0)에 의해 온도 30 ℃에서 호기적으로 60 시간 배양하였다.

상기 배양된 배양액 20 L를 크로스플로우(crossflow)형 중공사막 모듈을 통해 순환 여과시키고, 여액의 양에 대응하는 양의 0.7 중량％ 인산 완충액(pH 7.0)을 연속적으로 배양액에 공급함으로써 세정하여 세정 균체를 얻었다.

상기 배양된 배양액 20 L를 크로스플로우형 중공사막 모듈을 통해 순환 여과시키고, 여액의 양에 대응하는 양의 0.7 중량％ 인산 완충액(pH 7.0)을 연속적으로 배양액에 공급함으로써 세정하여 세정 균체를 얻었다.

(2) 미생물 고정화 담체의 제조

(1)에서 얻어진 세정, 균체 현탁액(건조 균체 환산 20 중량％) 500 g에 아크릴아미드, 메틸렌비스아크릴아미드 및 2-디메틸아미노프로필메타크릴아미드를 각각 20, 2 및 2 중량％ 농도로 함유하는 단량체 혼합 용액 500 g을 첨가하여 잘 현탁하였다. 여기에 5 중량％의 과황산암모늄 2 g, 50 중량％의 N,N,N,N-테트라메틸에틸렌디아민 2 g을 첨가하여, 중합시키고 겔화하였다. 이를 약 1 mm각의 입방체로 절단하여 미생물 고정화 담체를 얻었다.

상기 방법에서 얻어진 미생물 고정화 담체를 ① 0.1 중량％의 아크릴산나트륨 수용액(pH 7.0)에 현탁, 교반, ② 정치 침강, ③ 상청액 폐기의 조작을 1 사이클로 하여, 20 사이클을 행하였다.

(3) 아미드 생성 반응

내용적 5 L의 세퍼러블(seperable) 플라스크에 0.2 g/L의 아크릴산나트륨 수용액을 3200 g 넣고, 상기 아크릴산 수용액에 (2)에서 제조한 고정화 균체를 3 g 첨가하였다. 상기 용액을 pH 7.0, 온도 20 ℃로 제어하면서 교반하였다.

여기에, 아크릴로니트릴 농도가 항상 2 중량％가 되도록 연속적으로 공급하고, 아크릴아미드의 농도가 50 중량％가 될 때까지 축적 반응을 행하였다.

반응 종료 후, 공경 0.45 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 촉매를 제거하였다.

(4) 중합체 물성 평가 방법

물 80 중량％에 실시예 1(3)에서 얻어진 아크릴아미드 20 중량％를 용해시키고, pH를 8.0로 조정한 후 드와(Dewar) 병으로 옮기고, 계 내를 질소로 치환하였다. 그 후, 과황산암모늄 0.0004 ％, 황산철 0.0004 ％, 4,4'-아조비스-(4-시아노발레르산) 0.01 ％를 첨가하여 중합시켰다. 얻어진 함수 겔상의 중합체를 미트 민서기(meat mincer)로 직경 수 mm의 입자로 파쇄하고, 80 ℃에서 10 시간 건조시키고, 윌리(Wiley) 분쇄기로 2 mm 이하의 입경으로 분쇄하여 중합체 분말을 얻었다.

얻어진 중합체 분말을 500 g의 물로 0.2 ％ 농도로 만들고, 실온에서 4 시간 교반하여 용해시킨 후, 브룩필드(Brookfield) 점도(B형 점도계, 로터 회전수 30 rpm, 로터 No.1)를 측정하였다. 그 후, 80 메쉬의 철망으로 여과하고, 수세한 후 금망 상에 남은 불용물의 질량을 측정하였다.

(5) 단량체 보존 안정성 평가 방법

100 ml의 폴리에틸렌제 병에 실시예 1(3)에서 얻어진 50 ％ 아크릴아미드 단량체 수용액 50 g 및 철 시험편을 넣고, 증발하지 않도록 뚜껑을 닫았다. 이를 50 ℃의 고온 상자에 보존하고, 중합물의 유무에 의해 안정성을 판정하였다.

실시예 1의 (4) 및 (5)의 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

<비교예 1>

실시예 1의 (2) 미생물 고정화 담체의 제조에 있어서, 0.1 중량％의 아크릴산나트륨 수용액(pH 7.0) 대신에 0.7 ％ 인산 완충액(pH 7.0)을 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 조작을 행하였다. 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

<중합체 특성>

	중합 시간[분]	점도[mPaㆍs]	불용해분[g]
실시예 1	17	44	0
비교예 1	74	150	290

<보존 안정성>

	보존 일수[일]
실시예 1	>10
비교예 1	<1

명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

이상, 상세하게 설명한 바와 같이, 미생물 촉매에 의한 아크릴아미드 제조시에 아크릴산으로 세정한 미생물 촉매를 사용함으로써 보존 안정성이 높고, 고품질인 아크릴아미드를 얻을 수 있다.

Claims (5)

1. 니트릴히드라타제를 갖는 1종 이상의 미생물로부터 미생물 촉매를 제조하는 단계;

   수성 아크릴산 용액으로 미생물 촉매를 세정하는 단계;

   세정된 미생물 촉매를 사용하여 수용액 중에서 아크릴아미드를 제조하는 반응에 아크릴로니트릴을 공급하는 단계; 및

   생성된 아크릴아미드를 회수하는 단계를 포함하는,

   니트릴히드라타제를 갖는 미생물 촉매를 이용한 아크릴로니트릴로부터의 아크릴아미드의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 니트릴히드라타제를 갖는 미생물이 바실러스(Bacillus)속, 박테리듐(Bacteridium)속, 마이크로코커스(Micrococcus)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 노카르디아(Nocardia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 아크로모박터(Achromobacter)속 및 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 및 외래 니트릴히드라타제 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 아크릴아미드의 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아크릴산 수용액의 아크릴산 농도가 0.01 중량％ 내지 10 중량％인 아크릴아미드의 제조 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아크릴산 수용액의 pH가 5 내지 11인 아크릴아미드의 제조 방법.
5. 제3항에 있어서, 아크릴산 수용액의 pH가 5 내지 11인 아크릴아미드의 제조 방법.