DE69709952T2

DE69709952T2 - Verbessertes verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure

Info

Publication number: DE69709952T2
Application number: DE69709952T
Authority: DE
Inventors: Stuart Waller
Original assignee: Solutia Inc
Current assignee: Solutia Inc
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2017-11-01
Also published as: IN184328B; JP2001504332A; KR20000052670A; WO1998020147A1; DE69709952D1; AU5093798A; EP0941358B1; CN1235641A; EP0941358A1; CA2269770A1; ATE211768T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure.

Hintergrund der Erfindung

Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak (zur Bildung von Diammoniumfumarat) unter Verwendung von Mikroorganismen mit Aspartase-Aktivität veröffentlicht worden. Siehe beispielsweise Chibata, L; Tosa, T; Sato, T. Comprehensive Biotechnology Vol.3. Seiten 633-640, Hrsg. Murray Moo-Young, Pergamon, 1985. In diesen veröffentlichten Verfahren wird die L- Asparaginsäure gewöhnlich durch Ausfällen von L-Asparaginsäure-Kristallen, die aus der Zugabe einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, zu der Reaktionslösung resultieren, und Trennen der Kristalle gewonnen. In diesen veröffentlichten Verfahren wird jedoch eine große Menge an Abfallsalz(en), wie Ammoniumsulfat, als ein Nebenprodukt der Ausfällung gebildet. Die Bildung dieser Salze ist aus der Umweltperspektive unerwünscht und verursacht einen unerwünschten Verlust an Ammoniak.
Das US-Patent 4,560, 653 ('653), herausgegeben am 24. Dezember 1985, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, worin Aspartase oder ein Aspartaseproduzierender Mikroorganismus auf Fumarsäure und Ammoniak einwirkt. L-Asparaginsäure wird durch Zugabe von Maleinsäure ausgefällt und von der Lösung abfiltriert, und die Mutterlaugen werden zurückgeführt. Dieses '653-Patent offenbart die Verwendung eines chemischen Katalysators für die Isomerisierung von Maleinsäure zu Fumarsäure.
Als ein alternativer Katalysator für die Isomerisierung von Maleat zu Fumarat können enzymhaltige Organismen mit Maleatisomerase-Aktivität verwendet werden. Siehe beispielsweise Otsuka, K. Agr. Biol. Chem., 25(9), 1961, 726. - Scher, W. und Jakoby, W. B. J. Biol. Chem. 244(7), 1969, 1878. Dieser Katalysator ergibt, wie berichtet wird, hohe Umsätze an Maleinsäuresalzen zu Fumarsäuresalzen bei basischem pH.
Das US-Patent 3,391,059, welches am 12. Juli 1968 herausgegeben wurde, offenbart einen enzymhaltigen Organismus mit Maleatisomerase-Aktivität und Aspartase-Aktivität zur direkten Bildung von L-Asparaginsäure aus Maleinsäure.
Der Stand der Technik der wirtschaftlichen und effizienten Herstellung von L-Asparaginsäure mit minimalen oder keinen nachteiligen Auswirkungen auf die Umwelt ist weiterhin von industriellem Interesse.
Die Europäische Patentanmeldung EP-A-0 683 231 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, worin Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid zu einer Reaktionslösung hinzugegeben wird, welche L-Aspartat enthält, und worin ein spezieller Kristallisationsschritt eingeschlossen ist.
Die Europäische Patentanmeldung EP-A-0 752 476 offenbart ein Verfahren zur Zugabe von Maleinsäureanhydrid oder Maleinsäure zu einer Umsetzung, enthaltend ein Monoammoniumaspartat-Salz.
Die Chem. Abstracts Vol. 125, Nr. 23 (2.2.96), Abstract-Nr. 301601p offenbaren, daß Asparaginsäure aus der Reaktionsmischung kristallisiert werden kann, wenn geringe Mengen Maleinsäure mit einer anorganischen Säure zugegeben werden.

Ziele der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure unter Verwendung von günstigen Ausgangssubstraten vorzusehen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure mit minimaler Bildung von Ammoniumsalzen als Nebenprodukt vorzusehen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure mit einer verbesserten Ausbeute und gleichzeitiger Bildung nur eines Minimums an unerwünschten Nebenprodukten vorzusehen.
Diese und andere Ziele werden in der vorliegenden Erfindung erfüllt, die nachstehend detaillierter beschrieben wird.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

In dem breitesten Aspekt dieser Erfindung und in einer bevorzugten Ausführungsform wird L-Ammoniumaspartat aus Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid durch Enzyme oder Mikroorganismen hergestellt. L-Asparaginsäure wird bevorzugt durch Ausfällen unter Verwendung von Maleinsäure gewonnen. Ein zusätzlicher Vorteil ist, daß die Mutterlauge wahlweise zur Wiederverwendung nach der Gewinnung der L-Asparaginsäure aus der Reaktionslösung zurückgeführt werden kann. Wahlweise kann der pH der Mutterlauge basisch gemacht werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, welches die Schritte umfaßt:
(1) Kontaktieren
(A) eines enzymhaltigen Materials mit Maleatisomerase-Aktivität und Aspartase- Aktivität, oder
(B) eines enzymhaltigen Materials mit Maleatisomerase-Aktivität und eines enzymhaltigen Materials mit Aspartase-Aktivität,
mit einer wässrigen Substratlösung, enthaltend Maleinsäure und Ammoniak, und/oder Mono- oder Diammoniummaleat oder Mischungen daraus unter Bildung von L-Ammoniumaspartat in einer Reaktionslösung,
(2) Zugabe dieser Reaktionslösung zu einer wässrigen Lösung von Maleinsäure oder einer wässrigen Aufschlämmung von Maleinsäureanhydrid in einer kontrollierten Rate, um L- Asparaginsäure in einer Mutterlauge zu kristallisieren, und
(3) Gewinnung der L-Asparaginsäure aus der Mutterlauge, und
(4) wahlweise Rückführung der Mutterlauge als eine Substratlösung für eine weitere Umsetzung mit dem enzymhaltigen Material aus Schritt (1) oben, und
(5) wahlweise Zugabe von Ammoniak oder anderem Alkali zu der Mutterlauge vor, während oder nach der Rückführung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Substratlösung bei einer Temperatur von ungefähr 10ºC bis ungefähr 60ºC, welche Maleinsäureanhydrid, Maleinsäure und Salze davon sowie Ammoniak oder Ammoniummaleat enthält, worin das Molverhältnis von Ammoniak zu Maleinsäure von ungefähr 1 bis ungefähr 2 reicht, mit mikrobiellen Zellen, die sowohl Maleatisomerase- Aktivität als auch Aspartase-Aktivität aufweisen, oder mit mikrobiellen Zellen, die Maleatisomerase-Aktivität aufweisen, und mit mikrobiellen Zellen, die Aspartase-Aktivität aufweisen, oder alternativ mit zerstörten (disruptiven) Zellen oder mit Enzymen daraus oder mit dem Äquivalent davon kontaktiert.
Ein enzymhaltiges Material, wie mikrobielle Zellen, mit Maleatisomerase-Aktivität und ein enzymhaltiges Material mit Aspartase-Aktivität kann als eine Mischung verwendet werden, wenn erwünscht. Ohne durch eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, daß das Maleatisomerase-enthaltende Material Ammoniummaleat zu Ammoniumfumarat umsetzt, und anschließend das Aspartase-enthaltende Material das Ammoniumfumarat zu L- Ammoniumaspartat umsetzt. Diese Umsetzungen laufen bevorzugt in dem gleichen Gefäß oder Behälter ab, so daß die Konzentration des während der Umsetzung gebildeten Fumaratsalzes minimiert wird. Wenn die Aktivität des vorher benutzten enzymhaltigen Materials abnimmt, kann es vollständig oder teilweise durch frische Spezies ersetzt werden.
Das Verhältnis von Maleatisomerase-enthaltendem Enzym zu Aspartase-Enzym kann eingestellt werden. Bevorzugt ist die Aktivität des Aspartase-Enzyms ausreichend hoch, um jede merkliche Fumarat-Konzentration, die während der Umsetzung gebildet wird, zu minimieren. Es wird angenommen, daß die höchsten Ausbeuten an Aspartat auftreten, wenn die Fumarat-Konzentration gedrückt wird, da geglaubt wird, daß sie die Maleatisomerase- Aktivität inhibiert.
L-Ammoniumaspartat wird während der Umsetzung gebildet, und die resultierende Lösung wird zu einer Aufschlämmung von Maleinsäureanhydrid oder einer Lösung von Maleinsäureanhydrid in einer kontrollierten Rate hinzu gegeben, um L-Asparaginsäure zu kristallisieren. Die L-Asparaginsäure-Kristalle werden von der Lösung abgetrennt. Die gewonnenen Kristalle werden mit Wasser gewaschen, um den Anteil an Maleinsäure und/oder Salzen davon zu vermindern. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "kontrollierte Rate" die schrittweise Zugabe, d. h. die Zugabe in einer kontrollierten Weise, der Reaktionslösung zu der Maleinsäure oder dem Maleinsäureanhydrid, um die Bildung von Reaktionsnebenprodukten zu minimieren und in einer erhöhten Ausbeute an L- Asparaginsäure zu resultieren.
Die Mutterlauge, aus der die Kristalle entnommen worden sind, wird bevorzugt zurückgeführt und als eine Substratlösung für die zusätzliche Herstellung von weiterer L-Asparaginsäure wieder verwendet. Wenn dieser wahlweise Schritt ausgeführt wird, werden die Kosten für die Ausgangsmaterialien vermindert und die Bildung von Abwasser verhindert, welches deutliche Mengen an Ammoniak enthält, das bisher die Beseitigung erforderte bei einem potentiellen Nachteil für die Umwelt.
In dem Verfahren dieser Erfindung wird Maleinsäureanhydrid bevorzugt als eines der Ausgangsmaterialien zur Herstellung von L-Asparaginsäure verwendet. Die Mutterlauge kann als die Substratlösung ohne Zugabe eines chemischen Katalysators zurückgeführt werden. Die vollständige Rückführung der löslichen Mutterlauge resultiert in einer äußerst effizienten Herstellung mit minimalem bzw. keinem Abwasser und minimaler Ammoniak-Verwendung. Somit kann L-Asparaginsäure billig und effizient hergestellt werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, sind Illustrationen einiger chemischer Reaktionen, von denen angenommen wird, daß sie in Teilen dieses Verfahrens ablaufen, in einer Tabelle unten aufgeführt. Einige Schritte sind wahlweise. Einige Schritte laufen zu einem größeren oder einem kleineren Grad ab. TABELLE
Jeder geeignete Mikroorganismus mit Maleatisomerase-Aktivität und Aspartase-Aktivität kann verwendet werden. Typische nicht-begrenzende illustrative Enzyme umschließen Pseudomonas fluorescens, Alcaligenese faecalis, Pseudomonas ovalis, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Brevibacterium guale, Brevibacterium vitarumen, Achromobacter liquenfaciens, Bacillus brevis, Mischungen davon und ähnliche.
Zusätzlich kann eine Kombination eines Mikroorganismus mit Maleatisomerase-Aktivität und eines Mikroorganismus mit Aspartase-Aktivität eingesetzt werden, wenn dieses erwünscht ist.
Verdeutlichende, aber nicht-limitierende Bespiele für Mikroorganismen, welche Maleatisomerase-Aktivität aufweisen, die hierin geeignet eingesetzt werden können, umschließen diejenigen, welche Maleinsäue in Fumarsäure umwandeln, wie die Gattung Pseudomonas einschließlich Pseudomonas fluorescens. Andere verdeutlichende geeignete Enzyme umschließen ohne Begrenzung Alcaligenese faecalis, Escherichia coli, Bacillus brevis, Mischungen davon und ähnliche.
Beispiele geeigneter verdeutlichender nicht-limitierender Mikroorganismen, die hierin nützlich sind, stellen diejenigen mit Aspartase-Aktivität dar, die Fumarsäure in L- Asparaginsäure umwandeln. Diese umschließen die Gattung Escherichia, wie Escherichia coli ATCC 11303, sowie Mikroorganismen, die zur Gattung Brevibacterium gehören.
Ein jedes Verfahren zur Enzymkultivierung oder -Herstellung zur Verwendung in dieser Erfindung kann eingesetzt werden. Es können konventionelle Fermentations-Techniken und konventionelle Medien verwendet werden. Die Enzyme können als eine Enzymnährlösung, als gesamte Zelle, als zerstörte (disruptive) Zelle oder als ein eingekapseltes Enzym oder Zelle, Mischungen davon oder ähnliches, eingesetzt werden.
Die Umsetzung wird bevorzugt nach der Inaktivierung oder annähernder Inaktivierung von Enzymen ausgeführt, welche mit der Reaktion zur L-Asparaginsäure-Herstellung wechselwirken. Beispielsweise kann das enzymhaltige Material auf ungefähr eine Temperatur von 40ºC bis 60ºC, und insbesondere von ungefähr 50ºC bis 58ºC, erwärmt werden. Solche Temperaturen können in Gegenwart von L-Asparaginsäure und Ammoniumionen zum Inaktivieren von Fumarase-Enzym eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, daß die enzymatischen Umsetzungen in dem selben Gefäß oder Behälter oder Tank durchgeführt werden, da das durch die Maleatisomerase gebildete Fumarat eine Tendenz zum Inhibieren der Maleatisomerase-Aktivität aufweist. Bevorzugt, obwohl nicht erforderlich, werden die Schritte (1a) oder (1b) zur selben Zeit oder zeitlich ziemlich dicht beieinander oder in dem selben Behälter durchgeführt, da die Ausführung dieser Schritte in einer solchen gewünschten Weise die Ausbeuten wesentlich erhöht. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß es wichtig ist, die Aspartat-Enzym-Aktivität hoch zu halten, so daß die Fumarat-Konzentration während der Umsetzung minimiert wird.
Die Substratlösung in der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäureanhydrid, Maleinsäure, Salze der Maleinsäure, Mischungen davon und ähnliches. In der vorliegenden Erfindung kann das Ammoniak gasförmiges Ammoniak oder eine wässrige Ammoniaklösung zwecks leichter Handhabung sein. Die Konzentration der wässrigen Ammoniaklösung ist nicht kritisch; eine höher konzentrierte Lösung ist typischerweise jedoch wünschenswert, um Wasser in dem Rückführfluss zu minimieren.
Typischerweise reicht der pH-Wert der Enzymsubstratlösung von ungefähr 5 bis ungefähr 10, bevorzugt von ungefähr 6 bis ungefähr 9, und ganz besonders bevorzugt von ungefähr 8 bis ungefähr 9. Der pH kann unter Verwendung von Alkalibasen eingestellt werden, allerdings ist Ammoniak bevorzugt. Wenn Maleinsäure oder Salze davon und Ammoniak gemischt werden, kann das Mischen in einer jeden konventionellen Weise erfolgen. Minimale Mengen an Wasser sollten in diesem Verfahren zugesetzt werden, da es wieder entfernt werden muß, um eine konstante oder annähernd konstante Konzentration während des Verfahrens aufrecht zu erhalten.
Eine bevorzugte Substratlösung, enthaltend Maleinsäure und Ammoniak, wird bevorzugt mit Wasser und einem Tromethamin- (TRIS) oder Phosphatpuffer hergestellt. Die Konzentration an Maleinsäure liegt bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 0,1 M bis ungefähr 3,5 M, obwohl größere oder kleinere Konzentrationen eingesetzt werden können, wenn dieses erwünscht ist. Die Konzentration an Maleinsäure reicht besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis ungefähr 2 M.
Um die Maleatisomerase-Enzymkatalysator-Aktivität zu erhöhen, wird eine Verbindung, welche eine reduzierende SH-Gruppe, einschließlich aber nicht limitierend auf 2- Mercaptoethanol, Thioglycerol, oder ein wesentliches Äquivalent davon oder ähnliches, bevorzugt in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 100 mM, und ganz besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis ungefähr 25 mM, zugesetzt, um die Maleatisomerase- Enzymkatalysator-Aktivität zu erhöhen.
Jeder konventionelle Reaktor, wie ein kontinuierlicher gerührter Behälter, eine Säulen-Typ- Reaktor oder ähnliches, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Im Falle eines Säulen-Typ-Reaktors kann der Durchsatz in Abhängigkeit von der Art und Aktivität des enzymhaltigen Produkts, welches in der Säule enthalten ist, geändert werden.
Die Reaktionstemperatur für die Enzymreaktion(en) reicht gewöhnlich von ungefähr 10 bis ungefähr 60ºC, und bevorzugt von ungefähr 25 bis ungefähr 40ºC, obwohl höhere oder niedrigere Temperaturen eingesetzt werden können, wenn dieses erwünscht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform, nach der enzymatischen Umsetzung von Maleinsäure und Ammoniak unter Bildung von L-Ammoniumaspartat, wird die Reaktionslösung in einer kontrollierten Rate zu einer wässrigen Aufschlämmung von Maleinsäureanhydrid oder einer Lösung von Maleinsäure hinzugegeben, um L-Asparaginsäure zu kristallisieren und selbige zu gewinnen.
Die wahlweise Rückführung der Mutterlauge ist möglich unter Verwendung von Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid zur Kristallisierung von L-Asparaginsäure. Wenn zur Kristallisierung von L-Asparaginsäure eine Mineralsäure verwendet wird, wird das Ammoniumsalz der Mineralsäure gebildet, welches nicht als ein Enzymsubstrat verwendet werden kann. Die bei Verwendung einer Mineralsäure erhaltene Mutterlauge wird gewöhnlich anschließend als Abfall verworfen.
In dieser Erfindung umschließt der Begriff "Maleinsäure", wie verwendet in dem Zusammenhang des Kristallisierens von L-Asparaginsäure, umschließt ohne Begrenzung Maleinsäureanhydrid, Maleinsäure oder Salze von Maleinsäure, Mischungen davon und ähnliches. Maleinsäure kann in einer wässrigen Lösung oder Aufschlämmung vorliegen, allerdings ist sie bevorzugt jene, welche durch Umsetzung von Maleinsäureanhydrid mit Wasser gebildet wird. Auf Grund des Erfordernisses des Erhalts eines Wassergleichgewichtes in dem Verfahren werden bevorzugt minimale Mengen an Wasser in diesem Verfahren zugesetzt, da es zur Aufrechterhaltung einer konstanten oder annähernd konstanten Konzentration während des Verfahrens entfernt werden muss.
Die zur Kristallisation von L-Asparaginsäure eingesetzte Gesamtmenge an Maleinsäure kann variieren und hängt von der Gesamtmenge an L-Asparaginsäure (vorliegend als Salz) in der Reaktionslösung ab. Die Menge an Maleinsäure, die zum Ansäuern des in der Reaktionslösung anwesenden L-Aspartats eingesetzt wird, ist bevorzugt annähernd äquimolar zum gesamten L-Ammoniumaspartat zur effizienten und mehrfachen Rückführung der Mutterlauge, obwohl die Konzentrationen differieren können. Bevorzugt liegt die Maleinsäure in einer höheren Konzentration vor als das L-Asparaginsäuresalz. Ein wünschenswertes Molverhältnis von Maleinsäure zu L-Ammoniumaspartat reicht bevorzugt von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 und am meisten bevorzugt von ungefähr 0,95 bis ungefähr 1, 2, obwohl größere und kleinere Verhältnisse eingesetzt werden können, wenn dieses erwünscht ist.
Wenn jedoch weniger Maleinsäure als oben angegeben zugesetzt wird, ist die Ausbeute an gewonnener L-Asparaginsäure (als Kristalle) geringer, während wenn mehr als diese Menge verwendet wird, können andere Nebenprodukte unterschiedlich von L-Asparaginsäure hergestellt werden. Zusätzlich bedingt ein Überschuß an Maleinsäure eine übermäßige Bildung von Substrat mit jeder wahlweisen Rückführung in dem Verfahren.
Wenn Maleinsäureanhydrid zu der L-Ammoniumaspartat-Reaktionslösung zugegeben ist, wird Maleaminsäure gebildet, gewöhnlich in dem Bereich von ungefähr 2% bis ungefähr 5%. Diese stellt ein unerwünschtes Nebenprodukt dar, welches die effiziente Rückführung von Ammoniummaleat behindert. Die gebildete Maleaminsäure ist ausreichend wasserlöslich, so daß sie in der Mutterlauge verbleibt und nicht in ein nützliches Produkt durch enzymatische Einwirkung umgewandelt wird.
Wenn L-Ammoniumaspartat zu Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid in einer kontrollierten Rate zugegeben wird, wird ein wesentlich geringerer Anteil und möglicherweise keine Maleaminsäure gebildet. Die Verwendung von Maleinsäureanhydrid während der Kristallisation ist auf Grund der einfachen Verwendung und der reduzierten Kosten wünschenswert. Somit vermeidet die Zugabe der Reaktionslösung zu der wässrigen Maleinsäurelösung in einer kontrollierten Rate die Bildung unerwünschter Maleaminsäure.
Bevorzugt wird die Reaktionslösung schrittweise zu der Maleinsäure-Lösung oder Aufschlämmung von Maleinsäureanhydrid gegeben, um als L-Asparaginsäure zu kristallisieren. Besonders bevorzugt wird ein kontrolliertes Zugabeverfahren eingesetzt, um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Die Kristallteilchengröße kann durch die Variablen, wie Kristallisationstemperatur, Bewegungs-/Rührgeschwindigkeit, Beschallung, Impfen sowie die Rate der Zugabe der Reaktionslösung zu der Maleinsäure, und ähnliche Techniken kontrolliert werden, welche für den Fachmann nach dem Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sein werden.
Die Kristallisierung von L-Asparaginsäure kann von ungefähr 0ºC bis ungefähr 100ºC innerhalb ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 24 Stunden, und bevorzugt von ungefähr 5ºC bis ungefähr 60ºC innerhalb ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden, durchgeführt werden, obwohl höhere oder niedrigere Temperaturen und längere oder kürzere Zeiten eingesetzt werden können, wenn dieses erwünscht ist.
Die L-Asparaginsäure-Kristalle werden von der Mutterlauge mittels eines jeden konventionellen Abtrennungsverfahrens, wie Zentrifugieren, Filtrieren und ähnliches, wie dem Fachmann bekannt ist, abgetrennt. Wenn erwünscht, können die Kristalle gemäß konventionellen Waschverfahren gewaschen werden. Die ungewaschenen Rohkristalle der L- Asparaginsäure enthalten gewöhnlich ungefähr 5 Gew.-% bis ungefähr 15 Gew. -% Maleinsäure oder Salze davon, und dies kann durch Waschen mit Wasser verringert werden, sofern es erwünscht ist.
Dieses Waschwasser wird bevorzugt als Nachfüllwasser (Makeup-Wasser) zur Bildung der Maleinsäure verwendet, eingesetzt zum Ausfällen der L-Asparaginsäure. Dieses Waschwasser kann ebenso mit den Mutterlaugen, von denen die L-Asparaginsäure-Kristalle abgetrennt worden sind, gemischt werden, oder eine Kombination von beidem. Das Waschwasser kann vor dem Mischen mit der Mutterlauge aufkonzentriert werden.
Es werden bevorzugt L-Asparaginsäure-Kristalle hergestellt, die ungefähr 0,01 bis ungefähr 15 Gew.-% (ungewaschen) und bevorzugt ungefähr 0,01 bis ungefähr 1 Gew.-% (gewaschen) Maleinsäure und/oder Salze davon enthalten, wobei sie eine mittlere Kristallgröße aufweisen, welche durch den Wechsel der Kristallisationsbedingungen kontrolliert wird. Es wird eine mittlere Teilchengröße von ungefähr 15 bis ungefähr 500 mm mit dem erwünschten "flache Platte"-Kristallverhalten, obwohl dieses nicht kritisch ist.
Das L-Asparaginsäureprodukt ist industriell nützlich, beispielsweise als ein Ausgangsmaterial oder Zwischenprodukt bei der Herstellung von Tensiden, Metallionenkomplexierern, Reinigungsmittelzusammensetzungen, kosmetischen Zusammensetzungen, Pharmazeutika, Beschichtungen und ähnlichem. Zusätzlich wird es als ein Ausgangsmaterial für die Herstellung von industriell nützlichen Polymeren, wie Poly(asparaginsäure) und deren Derivaten, sowie als Nahrungsmittelzusatz verwendet.
Wenn erwünscht, kann die Mutterlauge, von der L-Asparaginsäure abgetrennt worden ist, als die Substratlösung für eine weitere Herstellung von L-Asparaginsäure verwendet werden. Das Waschwasser vom Waschen der Roh-L-asparaginsäure-Kristalle kann mit der Mutterlauge gemischt werden. Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid und Maleinsäuresalze können zu der Mutterlauge hinzugegeben werden, um die Maleinsäurekonzentration in der Mutterlauge einzustellen. Ammoniak kann zum Einstellen des Molverhältnisses von Ammoniak zu Maleinsäure bevorzugt in einem Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 2 Moläquivalenten zugesetzt werden. Wasser kann ebenso zugegeben oder entfernt werden, um das Volumen der rückgeführten Mutterlauge auf das der vorherigen Substratlösung einzustellen, sofern das erwünscht ist. Die Zyklen, welche insgesamt (1) die Umsetzung von Maleinsäure und Ammoniak mit mikrobiellen Zellen oder zerstörten (disruptiven) Zellen, (2) die Kristallisierung von L-Asparaginsäure, (3) die Abtrennung und das Waschen von L- Asparaginsäure und (4) die wahlweise Rückführung der Mutterlauge umfassen, können immer wieder gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wiederholt werden.
Wahlweise können ein Alkali, wie Ammoniak, Ammoniumhydroxid, ein Alkalimetallhydroxid, Erdalkalimetallhydroxid, oder eine jede kompatible Base, Mischungen davon und ähnliches, zu der Mutterlauge hinzugegeben werden. Alkali wird bevorzugt zu der Mutterlauge von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,0 Moläquivalenten, bevorzugt von ungefähr 1,5 bis ungefähr 2,0 Moläquivalenten, auf der Basis der Menge an Maleinsäure, die zum Ausfällen der L-Asparaginsäure verwendet wird, zugesetzt. Typischerweise werden ungefähr 0,6 bis ungefähr 0,7 Moläquivalente eingesetzt, um den pH in den bevorzugten Bereich von ungefähr 8 bis ungefähr 9 zu bringen. Wenn der Anteil an zugesetztem Ammoniak geringer als ungefähr 0,5 Äquivalente ist, kann der pH der Substratlösung für eine effiziente und vollständige Umwandlung durch das (die) Enzym(e) zu gering sein.
Wenn erwünscht, kann Ammoniak bevorzugt zu der Mutterlauge zugegeben werden, um ein erwünschtes Substrat für das (die) Enzym(e) zu bilden und um die Enzymaktivitäten der mikrobiellen Zellen oder der zerstörten (disruptiven) Zellen oder der Enzyme so lang wie möglich zu verlängern. Bevorzugt wird Ammoniak zu der Mutterlauge zugegeben, um einen pH der Lösung von ungefähr 6 bis ungefähr 9, und ganz besonders bevorzugt von ungefähr 8 bis ungefähr 9, aufrecht zu erhalten, obwohl größere oder kleinere pH-Werte eingesetzt werden können.
Absatzweise oder kontinuierliche Verfahren und Variationen davon werden als erfindungsgemäße Verfahren ohne Begrenzung angesehen. Eine wirksame Menge an der (den) Zusammensetzung(en) der vorliegenden Erfindung und an den Komponenten von (einer) solchen Zusammensetzung(en) wird bevorzugt eingesetzt, um die Vorzüge dieser Erfindung zu erreichen.
Die folgenden BEISPIELE sind zur Bereitstellung von Einzelheiten dieser Erfindung vorgesehen und sollen nicht so verstanden werden, daß sie diese Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen.

BEISPIELE

Beispiel 1

Maleinsäureanhydrid (45,54 g oder 0,46 Mol) wurde in Wasser gelöst (29,66 g) unter Bildung einer Lösung. Diese Lösung wurde anschließend von Raumtemperatur auf 60ºC erwärmt. Insgesamt 279,63 g einer 24,2%-igen (w/w) Lösung einer L-Ammoniumaspartat-Lösung (0,45 Mol L-Ammoniumaspartat) wurden in einer kontrollierten Rate über einen 30-Minuten- Zeitraum unter Rühren zugemessen. Nach 90-minütigem Rühren bei 60ºC wurde die Lösung auf 6ºC in einem Eiswasserbad abgekühlt. Der endgültige pH der Lösung war 4,1. L- Asparaginsäure-Kristalle wurden unter Verwendung von Filtration gewonnen und mit 67,35 g Wasser gewaschen. Die endgültige Ausbeute an L-Asparaginsäure-Kristallen nach dem Waschen betrug 96% (57,24 g; 0,43 Mol).

Beispiel 2

Maleinsäureanhydrid (48,14 g oder 0,49 Mol) wurde in Wasser (69,63 g) aufgeschlämmt.
Die Temperatur der Lösung betrug 32ºC. Insgesamt 311,25 g einer 24,2%-igen (w/w) Lösung einer L-Ammoniumaspartat-Lösung (0,50 Mol L-Ammoniumaspartat) wurden in einer kontrollierten Rate über einen 30-Minuten-Zeitraum unter Rühren zugegeben. Nach 90- minütigem Rühren bei 35ºC wurde die Lösung auf 9ºC abgekühlt. Der endgültige pH der Lösung war 4,4. L-Asparaginsäure-Kristalle wurden unter Verwendung von Filtration gewonnen und mit 82,33 g Wasser gewaschen. Die endgültige Ausbeute an L- Asparaginsäure-Kristallen nach dem Waschen betrug 100+% (96,01 g; 0,52 Mol).

Beispiel 3 Vergleichsbeispiel

Maleinsäureanhydrid (53,75 g oder 0,548 Mol) wurde zu einer 24,2%-igen L- Ammoniumaspartat-Lösung in Wasser (369,40 g oder 0,595 Mol) bei 60ºC gegeben. Nach 90-minütigem Rühren bei 60ºC wurde die Lösung auf 9ºC abgekühlt. Der endgültige pH der Lösung betrug 3,9. L-Asparaginsäure-Kristalle wurden unter Verwendung von Filtration gewonnen, wobei die Kristalle nicht gewaschen wurden. Die endgültige Ausbeute an L- Asparaginsäure-Kristallen betrug 88,2% (64,33 g; 0,48 Mol). Das Protonen-NMR der Mutterlauge bestätigte die Anwesenheit von Maleaminsäure. Der Vergleich der Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 mit Vergleichsbeispiel 3 zeigt, daß die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in erhöhten Ausbeuten resultiert.

Beispiel 4

Die Mutterlauge von der L-Asparaginsäure-Kristallisation, welche hauptsächlich Ammoniumsalze von Maleinsäure in Wasser umfaßt, in einer Konzentration von annähernd 1-2 Mol (372,92 g), wurde mit 33,81 g 29,7%-igem wässrigem Ammoniak (0,28 Mol) behandelt. Der Ausgangs-pH der Mutterlauge vor der Ammoniak-Zugabe betrug 4,2. Der End-pH der Lösung betrug 8,4. Die Lösung war eine Mischung von Diammoniummaleat- und Ammoniummaleatsalzen.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Maleatisomerase-Reaktion. Ungefähr 250 ul der Diammoniummaleat-Lösung aus Beispiel 4 wurde mit Wasser, Tromethamin-Puffer (um 50 mM zu ergeben) und 2-Mercaptoethanol (um 4,9 mM zu ergeben) sowie mit 50 ml Maleatisomeraseenzym-Nährlösung verdünnt. Die endgültige Maleatsubstrat-Konzentration betrug 100 mM. Die Lösung wurde bei ungefähr 25ºC 2 Stunden lang gerührt. Die Rohrbestandteile wurden anschließend von dem Enzym mittels Zentrifugieren durch einen Amicon Centricon-10, einen 10.000 MW Sperrfilter, unter Verwendung einer Sorvall RT 6000B gekühlten Zentrifuge abgetrennt. Alle Arbeitsgänge in der Zentrifuge wurden bei ungefähr 4ºC durchgeführt. Die Ausbeute an Diammoniumfumarat, gemessen mittels HPLC, betrug 100%.

Beispiel 6

Ungefähr 250 ul der Diammoniummaleat-Lösung aus Beispiel 4 wurden mit Wasser, Tromethamin-Puffer (um 55 mM zu ergeben) und 2-Mercaptoethanol (um 5, 5 mM zu ergeben) sowie mit 100 ml Maleatisomeraseenzym-Nährlösung verdünnt. Die endgültige Maleatsubstrat-Konzentration betrug 111 mM. Mehrere eingekapselte Kügelchen, enthaltend Aspartaseenzym, wurden ebenfalls der Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde bei ungefähr 25ºC 30 Minuten lang gerührt. Die Rohrbestandteile wurden anschließend von den enzymhaltigen Materialien mittels Zentrifugieren durch einen Amicon Centricon-10, einen 10.000 MW Sperrfilter, unter Verwendung einer Sorvall RT 6000B gekühlten Zentrifuge abgetrennt. Alle Arbeitsgänge in der Zentrifuge wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Ausbeute an L-Asparaginsäure, gemessen mittels HPLC, betrug 83,7%.

Beispiel 7

Man ließ Pseudomonas fluorescens unter Verwendung der Methode von Scher und Jakoby wachsen. Die kultivierten Zellen wurden anschließend in einem Puffer aus 0,1 M Kaliumphosphat, enthaltend 5 mM 2-Mercaptoethanol, suspendiert. Die Zellen wurden mit einer Französischen Presse (French Press) lysiert und zentrifugiert. Die Pressflüssigkeit wurde mit der Pufferlösung gewaschen und 7 Stunden lang auf 58ºC erwärmt. Der Überstand wurde anschließend auf 4ºC abgekühlt, zentrifugiert, mit Streptomycinsulfat behandelt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend mit Ammoniumsulfat (bis zu 53% w/w) behandelt. Der resultierende Niederschlag wurde in 0,03 M Tromethaminpuffer mit 5 mM 2- Mercaptoethanol gelöst. Diese Maleatisomeraseenzym-Nährlösung wurde anschließend für die obigen Beispiele 5-6 verwendet.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf spezifische Ausführungsformen, welche in erheblichem Detail dargestellt sind, beschrieben worden ist, sollte es klar sein, daß diese Beschreibung nur zur Verdeutlichung dient und daß die Erfindung nicht zwangsläufig darauf beschränkt ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, umfassend die Schritte

(1) Kontaktieren

(A) eines enzymhaltigen Materials mit Maleatisomerase-Aktivität und Aspartase-Aktivität, oder

(B) eines enzymhaltigen Materials mit Maleatisomerase-Aktivität und eines enzymhaltigen Materials mit Aspartase-Aktivität, mit einer wäßrigen Substratlösung, enthaltend Maleinsäure und Ammoniak, und/oder Mono- oder Diammoniummaleat, unter Bildung von L-Ammoniumaspartat in einer Reaktionslösung;

(2) Zugabe dieser Reaktionslösung zu einer wäßrigen Lösung von Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid in einer kontrollierten Rate, um L-Asparaginsäure in einer Mutterlauge zu kristallisieren, und

(3) Gewinnung der L-Asparaginsäure aus der Mutterlauge.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mutterlauge als eine Substratlösung zur Umsetzung mit dem (den) enzymhaltigen Material(ien) aus Schritt (1) zurückgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der pH der Mutterlauge vor, während oder nach der Rückführung eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin der pH eingestellt wird und die Mutterlauge zurückgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin eine Menge an Alkali zu der Mutterlauge hinzugegeben wird, die zur Bereitstellung von ungefähr 1,5 bis ungefähr 2,5 Moläquivalenten bezogen auf Maleinsäure ausreicht, und die Mutterlauge als Substratlösung zurückgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Alkali Ammoniak oder Ammonium oder Mischungen davon darstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin der pH der Mutterlauge auf einen pH in dem Bereich von ungefähr 6 bis ungefähr 9 eingestellt wird und die Mutterlauge als Susbtratlösung zurückgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der pH in dem Bereich von ungefähr 8 bis ungefähr 9 liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das enzymhaltige Material mit Maleatisomerase-Aktivität und ein enzymhaltiges Material mit Aspartase- Aktivität mit einer Substratlösung in Kontakt gebracht werden, enthaltend Maleinsäure und Ammoniak, und/oder Mono- oder Diammoniummaleat, unter Bildung von L-Ammoniumaspartat in dem selben Behälter oder zur selben Zeit, so daß die gleichzeitige Konzentration an Fumarsäuresalzen oder Fumarsäure vermindert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das enzymhaltige Material mit Maleatisomerase-Aktivität und Aspartase-Aktivität, das enzymhaltige Material mit Maleatisomerase-Aktivität sowie das enzymhaltige Material mit Aspartase-Aktivität mikrobielle Zellen, zerstörte (disruptive) Zellen oder Enzyme oder immobilisiertes Material, enthaltend mikrobielle Zellen, zerstörte (disruptive) Zellen oder Enzyme, darstellen.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Anteil an Maleinsäureanhydrid und/oder Maleinsäure, verwendet zum Ansäuern der Reaktionslösung, von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 Moläquivalenten bezogen auf den Anteil von in der Reaktionslösung vorliegender L-Asparaginsäure reicht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Anteil an Maleinsäureanhydrid und/oder Maleinsäure in dem Bereich von ungefähr 0,95 bis ungefähr 1,2 Moläquivalenten bezogen auf den Anteil von in der Reaktionslösung anwesender L-Asparaginsäure reicht.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin L-Asparaginsäurekristalle mit Wasser gewaschen werden, anschließend das Waschwasser als Nachfüllwasser für die Maleinsäurelösung oder Maleinsäureanhydrid verwendet wird und/oder das Waschwasser mit der Mutterlauge gemischt wird, aus der L-Asparaginsäure entfernt wurde, und die Mischung als Substratlösung zurückgeführt wird.