JP2015012838A - 光学活性アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの高光学純度で製造する方法を提供する。
【解決手段】入手容易な2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルから高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルに変換可能な酵素源、または2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドから高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換可能な酵素源を取得する。各酵素源を用いた反応後、更にホフマン転位反応等により光学活性イソバリンの製造が可能となる。
【選択図】なし
【解決手段】入手容易な2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルから高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルに変換可能な酵素源、または2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドから高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換可能な酵素源を取得する。各酵素源を用いた反応後、更にホフマン転位反応等により光学活性イソバリンの製造が可能となる。
【選択図】なし
Description
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造原料の製造法に関する。
光学活性イソバリンの製造原料として有用な光学活性2-エチル-2-メチル-マロン酸モノエステルの製造法として、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルにブタ肝臓由来エステラーゼを作用させて(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチルを取得する方法(非特許文献1)があるが、光学純度が15%eeと十分でない。
また、同じく光学活性イソバリンの製造原料として有用な光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドの製造法として、2-エチル-2-メチルマロン酸ジニトリルにロドコッカス属微生物(ロドコッカス ロドクロウスNBRC15564)を作用させて(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを取得する方法(非特許文献2)があるが、光学純度が12%eeと非常に低い。
以上のように、現在知られている光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドの製造方法は、光学純度が低いため、工業的生産に有利な方法とは言い難い。
Tetrahedron 41,1347-1352(1985)
Tetrahedron : Asymmetry 15,2817-2820(2004)
上記に鑑み、本発明の目的は、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルを原料に光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルを高光学純度にて製造することにあり、これを光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応することで、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造に繋げる点にある。
また、本発明の目的は、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドを原料に光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを高光学純度にて製造することにあり、これをホフマン転位反応することで、医薬品中間体として有用な光学活性イソバリンの製造に繋げる点にある。
本発明者らは、前記課題に基づき鋭意検討を行った結果、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルを不斉加水分解して高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルが得られる酵素源を見出し、本発明を完成させるに至った。
また、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドを不斉加水分解して高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドが得られる酵素源を見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、本発明は、高光学純度のイソバリンの合成も可能にする。
即ち、本発明は
[1]下記式(1);
[1]下記式(1);
(式中、XはCO2R、又はCONH2を表す。Rは置換基を有しても良いC1〜C5のアルキル基を表す)で表される2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドに酵素源を作用させて下記式(2);
(式中、*は不斉炭素原子を表す)で表されるモノカルボン酸を製造し、必要に応じて下記式(3);
(式中、*は不斉炭素原子を表す)で表される2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応することを特徴とする下記式(4);
(式中、*は不斉炭素原子を表す)で表される光学活性イソバリンの製造法に関する。
[2]Rが置換基を有していてもよい炭素数1〜3のアルキル基である[1]に記載の製造法。
[3]Rがメチル基、又はエチル基である[2]に記載の製造法。
[4]Rがエチル基である[3]に記載の製造法。
[5]酵素源が、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である[1]〜[4]のいずれかに記載の製造法。
[6]酵素源が、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である[1]〜[5]のいずれかに記載の製造法。
[7]酵素源として、コマモナス(Comamonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。
[8]酵素源として、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する[7]に記載の製造法。
[9]酵素源として、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、又はカプリアビダス(Cupriavidus)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。
[10]酵素源として、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する[9]に記載の製造法。
[2]Rが置換基を有していてもよい炭素数1〜3のアルキル基である[1]に記載の製造法。
[3]Rがメチル基、又はエチル基である[2]に記載の製造法。
[4]Rがエチル基である[3]に記載の製造法。
[5]酵素源が、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である[1]〜[4]のいずれかに記載の製造法。
[6]酵素源が、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である[1]〜[5]のいずれかに記載の製造法。
[7]酵素源として、コマモナス(Comamonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。
[8]酵素源として、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する[7]に記載の製造法。
[9]酵素源として、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、又はカプリアビダス(Cupriavidus)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する[5]に記載の製造法。
[10]酵素源として、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する[9]に記載の製造法。
本発明により、プロキラルな2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドを原料として、高光学純度で光学活性イソバリンを製造できる。
以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。
本発明の原料である2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルは、下記式(5);
(式中、Rは置換基を有しても良いC1〜C5のアルキル基を表す)で表され、
2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、下記式(3);
2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、下記式(3);
(式中、*は不斉炭素原子を表す)で表される。
最終生成物である光学活性イソバリンは下記式(4);
(式中、*は不斉炭素原子を表す)で表される。
本発明で用いる「酵素源」は、光学活性な2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルを高光学純度で製造する能力を有する酵素であり、市販酵素、酵素源となる微生物の菌体およびその処理物が含まれる。
「高光学純度」とは、絶対配置がSである2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは20%ee以上、より好ましくは80%ee以上、更に好ましくは90%ee以上、最も好ましくは95%ee以上である。
また、本発明で用いる「酵素源」は、光学活性な2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを高光学純度で製造する能力を有する酵素であり、市販酵素、酵素源となる微生物の菌体およびその処理物が含まれる。
「高光学純度」とは、絶対配置がSである2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは20%ee以上、より好ましくは80%ee以上、更に好ましくは85%ee以上、更により好ましくは90%ee以上、最も好ましくは95%ee以上である。
また、絶対配置がRである2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源を用いる場合は、好ましくは20%ee以上、より好ましくは30%ee以上である。
「微生物の菌体」とは、菌体そのものの他、菌体を含む培養液あるいは菌体懸濁液を含めて意味する。なお、菌体には、野生株の他、変異を生じさせて有利な性質を得た変異株も含み、さらには、該微生物由来の光学活性な2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する活性を有する酵素をコードするDNAが導入された形質転換株も含む。
「菌体の処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、又はそれら菌体の破砕物等を意味し、さらには、光学活性な2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素自体、或いは部分精製酵素であってもよい。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法(例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等)で行うことができる。
本明細書で後述する各微生物は、特許微生物寄託機関やその他研究機関から入手可能であり、更には、自然界から分離することもできる。(例えば、NBRC番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。)
また、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドや酵素生産を誘導するための誘導剤を用いて集積培養することにより、自然界から分離することもできる。
また、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドや酵素生産を誘導するための誘導剤を用いて集積培養することにより、自然界から分離することもできる。
本発明は、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルを不斉加水分解して高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルが得られる酵素源を用いる。
得られた2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルは、化学的に2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換し、更にホフマン転位反応により、光学活性イソバリンを製造できる。
2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルに不斉加水分解活性を有する酵素源としては例えば、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属由来の酵素源が挙げられる。
前記酵素源のうち、絶対配置がSである2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属微生物由来の酵素源が挙げられる。
好ましくはミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、又はミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)等の微生物由来の酵素源である。
より好ましくはミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans) NBRC14471、又はミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum) NBRC15302由来の酵素源である。
また、得られた(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステルは、(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドに変換後、ホフマン転移反応により、(S)-イソバリンを合成できる。
また、本発明は、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドを不斉加水分解して高光学純度の2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドが得られる酵素源を用いる。
得られた2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、更にホフマン転位反応により、光学活性イソバリンを製造できる。
2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドに不斉加水分解活性を有する酵素源としては例えば、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。
前記酵素源のうち、絶対配置がSである2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。
好ましくは、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidusmetallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidusnecator)等の微生物由来の酵素源である。
より好ましくはアクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)NBRC15125、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)NBRC3558、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)NBRC15513、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidusmetallidurans)NBRC101272、カプリアビダス ネケター(Cupriavidusnecator)NBRC102504由来の酵素源である。
また、得られた(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、ホフマン転移反応により、(R)-イソバリンを合成できる。
前記酵素源のうち、絶対配置がRである2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを製造する能力を有する酵素源としては、例えば、コマモナス(Comamonas)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。
好ましくは、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)等の微生物由来の酵素源である。
より好ましくはコマモナス エスピー(Comamonas sp.)KNK3-7(NITE BP-963)、又はシュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)KNK24-9(NITE BP-962)由来の酵素源である。
また、得られた(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、ホフマン転移反応により、(S)-イソバリンを合成できる。
なお、前記コマモナス エスピー(Comamonas sp.)KNK3-7(NITE BP-963)、又はシュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)KNK24-9(NITE BP-962)は、本発明者らによって土壌から分離された菌株であり、それぞれ前記の受託番号で、平成22年7月7日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に寄託されている。
また、本発明の酵素源となりうる微生物としては、野生株又は変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合又は遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。
例えば、遺伝子操作された微生物であれば、上記で例示した微生物から、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドを不斉水解しうる酵素を単離及び/又は精製して酵素のアミノ酸配列の一部又は全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするDNA配列を得る工程、このDNAを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法等により得ることができる。これらの各工程は、当業者に周知の遺伝子操組換え技術により、実施することができる。
上記のような組換え微生物としては、前記不斉水解酵素をコードするDNAを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。また、宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が好ましい。
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸1水素カリウム、燐酸2水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地を使用することができる。
また、微生物の酵素生産を誘導するために誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤としては、エステル、ニトリル、ラクタム化合物、アミド等が挙げられる。例えば、エステルとしては、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステルなどが挙げられ、ニトリルとしては、アセトニトリル、イソバレロニトリル、プロピオニトリル、ピバロニトリル、n−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、n−カプロニトリル、3−ペンテンニトリルなどが挙げられ、ラクタム化合物としては、γ−ブチロラクタム、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタムなどが挙げられ、アミドとしては、クロトンアミド、ベンズアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、n−ブチルアミド、イソブチルアミド、n−バレルアミド、n−カプロンアミド、メタクリルアミド、フェニルアセトアミド、シクロヘキサンカルボキサミド、2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドなどが挙げられる。
これら誘導剤の培地への添加量は0.05%〜2.0%、好ましくは0.1%〜1.0%である。培養は好気的に行い、通常、培養時間は1〜5日間程度、培地のpHが3〜9、培養温度は10〜50℃で行うことができる。
本発明において、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル或いは2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミド(1)の立体選択的な加水分解反応は、適当な溶媒中に原料である2-エチル-2-メチルマロン酸ジエステル或いは2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミド(1)、及び前記微生物の菌体又はその処理物等を添加し、pH調整下攪拌することにより行うことができる。
反応条件は用いる酵素、微生物又はその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約0.1〜99重量%、好ましくは1〜60重量%であり、反応温度は10〜60℃、好ましくは20〜50℃であり、反応のpHは4〜11、好ましくは6〜9であり、反応時間は1〜120時間、好ましくは1〜72時間で行うことができる。基質は一括、又は連続的に添加して行うことができる。反応はバッチ方式又は連続方式で行うことができる。
反応で生じた光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドは、常法により、それぞれを単離、精製できる。例えば、加水分解反応で生じた光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノエステル或いは光学活性2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、又は、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液を、硫酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
(実施例1)
2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステルの立体選択的加水分解
表1に示した各微生物を、試験管内で滅菌した8mlの培地(ペプトン1.0%、イーストエキス0.2%、硫酸マグネシウム7水和物0.1%、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル0.1%、pH7.0)に植菌して、30℃で46時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、2mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステルの立体選択的加水分解
表1に示した各微生物を、試験管内で滅菌した8mlの培地(ペプトン1.0%、イーストエキス0.2%、硫酸マグネシウム7水和物0.1%、2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル0.1%、pH7.0)に植菌して、30℃で46時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、2mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
この菌体懸濁液1mlと、(参考例1)に記載した方法で合成した基質2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル5mgを混合し、30℃にて24時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率(%)及び2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチルエステルの光学純度(%ee)を求めた。
その結果を表1に示す。
・変換率(%)=生成物量/(基質量+生成物量)×100
・光学純度(%ee)=(A−B)/(A+B)×100 (A及びBは対応する鏡像異性体量を表し、A>Bである)
・光学純度(%ee)=(A−B)/(A+B)×100 (A及びBは対応する鏡像異性体量を表し、A>Bである)
<高速液体クロマトグラフィー分析条件>
[変換率の分析]
・カラム:COSMOSIL 5C18−AR−II(4.6mmφ×250mm、ナカライテスク社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=4/6
・流速:0.5ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:205nm
[光学純度の分析]
・カラム:CHIRALCEL OJ−RH(4.6mmφ×150mm、ダイセル社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=8/2
・流速:0.5ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:210nm
[変換率の分析]
・カラム:COSMOSIL 5C18−AR−II(4.6mmφ×250mm、ナカライテスク社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=4/6
・流速:0.5ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:205nm
[光学純度の分析]
・カラム:CHIRALCEL OJ−RH(4.6mmφ×150mm、ダイセル社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=8/2
・流速:0.5ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:210nm
(実施例2)
(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチルを原料とした(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドの合成、(S)-イソバリンの合成
実施例1記載の微生物ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans) NBRC14471を用いて調製した(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチル2g(11.5mmol)を用いて、20重量%アンモニア/メタノール溶液19.6g(230mmol)とともにオートクレーブ容器に密封し、100℃にて30時間撹拌した。反応液に水10gを加え、減圧濃縮してメタノールを留去した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドが1.6g(10.8mmol、収率70%)含まれていた。この水溶液に30重量%水酸化ナトリウム水溶液4.6g(34.5mmol)を加え、3℃に冷却し、13%次亜塩素酸水溶液6.6g(11.5mmol)を30分かけて滴下した。3℃で1時間撹拌した後、25℃に昇温し5時間撹拌した。反応液のpHが2.5になるまで濃塩酸を加え、酢酸エチルでこれを洗浄した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である(S)-イソバリンを塩酸塩換算で1.7g(10.9mmol、収率95%)含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度(%ee)を求めた結果、99(%ee)であった。
(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチルを原料とした(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドの合成、(S)-イソバリンの合成
実施例1記載の微生物ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans) NBRC14471を用いて調製した(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノエチル2g(11.5mmol)を用いて、20重量%アンモニア/メタノール溶液19.6g(230mmol)とともにオートクレーブ容器に密封し、100℃にて30時間撹拌した。反応液に水10gを加え、減圧濃縮してメタノールを留去した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である(R)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドが1.6g(10.8mmol、収率70%)含まれていた。この水溶液に30重量%水酸化ナトリウム水溶液4.6g(34.5mmol)を加え、3℃に冷却し、13%次亜塩素酸水溶液6.6g(11.5mmol)を30分かけて滴下した。3℃で1時間撹拌した後、25℃に昇温し5時間撹拌した。反応液のpHが2.5になるまで濃塩酸を加え、酢酸エチルでこれを洗浄した。この水溶液を分析したところ、表題化合物である(S)-イソバリンを塩酸塩換算で1.7g(10.9mmol、収率95%)含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度(%ee)を求めた結果、99(%ee)であった。
<高速液体クロマトグラフィー分析条件>
[イソバリンの光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
・溶離液:2mM硫酸銅水溶液/メタノール=97/3
・流速:0.5ml/分、カラム温度:40℃、測定波長:254nm
[イソバリンの光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
・溶離液:2mM硫酸銅水溶液/メタノール=97/3
・流速:0.5ml/分、カラム温度:40℃、測定波長:254nm
(実施例3)
2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドの立体選択的加水分解
表2及び表3に示した各微生物を、試験管内で滅菌した8mlの培地(グリセロール1.0%、ペプトン0.5%、モルトエキス0.3%、イーストエキス0.3%、シクロヘキサンカルボキサミド0.1%、pH7.0)に植菌して、30℃で46時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、2mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドの立体選択的加水分解
表2及び表3に示した各微生物を、試験管内で滅菌した8mlの培地(グリセロール1.0%、ペプトン0.5%、モルトエキス0.3%、イーストエキス0.3%、シクロヘキサンカルボキサミド0.1%、pH7.0)に植菌して、30℃で46時間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、2mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
この菌体懸濁液1mlと、(参考例2)に記載した方法で合成した基質2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミド2mgを混合し、30℃にて24時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率(%)及び2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドの光学純度(%ee)を求めた。
その結果を表2及び表3に示す。
・変換率(%)=生成物量/(基質量+生成物量)×100
・光学純度(%ee)=(A−B)/(A+B)×100 (A及びBは対応する鏡像異性体量を表し、A>Bである)
・光学純度(%ee)=(A−B)/(A+B)×100 (A及びBは対応する鏡像異性体量を表し、A>Bである)
<高速液体クロマトグラフィー分析条件>
[変換率、光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×250mm、住化分析センター社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=8/2
・流速:0.7ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:210nm
[変換率、光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×250mm、住化分析センター社製)
・溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=8/2
・流速:0.7ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:210nm
(実施例4)
(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを原料とした(R)-イソバリンの合成
実施例3記載の微生物ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)NBRC3558を用いて調製した(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミド2g(13.8mmol)を含む水溶液10gに、30重量%水酸化ナトリウム水溶液5.5g(41.3mmol)を加え、3℃に冷却し、13%次亜塩素酸水溶液9.5g(16.6mmol)を30分かけて滴下した。3℃で1時間撹拌した後、25℃に昇温し6時間撹拌した。反応液のpHが4.0になるまで濃塩酸を加え、得られた水溶液を分析したところ、表題化合物である(R)-イソバリンを塩酸塩換算で2.0g(13.2mmol、収率96%)含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度(%ee)を求めた結果、98(%ee)であった。
(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミドを原料とした(R)-イソバリンの合成
実施例3記載の微生物ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)NBRC3558を用いて調製した(S)-2-エチル-2-メチルマロン酸モノアミド2g(13.8mmol)を含む水溶液10gに、30重量%水酸化ナトリウム水溶液5.5g(41.3mmol)を加え、3℃に冷却し、13%次亜塩素酸水溶液9.5g(16.6mmol)を30分かけて滴下した。3℃で1時間撹拌した後、25℃に昇温し6時間撹拌した。反応液のpHが4.0になるまで濃塩酸を加え、得られた水溶液を分析したところ、表題化合物である(R)-イソバリンを塩酸塩換算で2.0g(13.2mmol、収率96%)含んでいた。高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度(%ee)を求めた結果、98(%ee)であった。
<高速液体クロマトグラフィー分析条件>
[イソバリンの光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
・溶離液:2mM硫酸銅水溶液/メタノール=97/3
・流速:0.5ml/分、カラム温度:40℃、測定波長:254nm
[イソバリンの光学純度の分析]
・カラム:SUMICHIRAL OA−7000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
・溶離液:2mM硫酸銅水溶液/メタノール=97/3
・流速:0.5ml/分、カラム温度:40℃、測定波長:254nm
(参考例1)2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステルの合成
tert−ブトキシカリウム7.1g(63.1mmol)をTHF(29ml)に懸濁し、0℃に冷却して、市販の2-エチルマロン酸ジエチルエステル10g(57.4mmol)を1時間かけて滴下し、さらに1時間撹拌した。臭化エチル8.1g(74.6mmol)を滴下後25℃に昇温し20時間撹拌した。反応液に水(20ml)加え、水層を分離した。有機層を減圧濃縮することで表題化合物である2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル10.8g(53.5mmol、収率93%)を得た。
tert−ブトキシカリウム7.1g(63.1mmol)をTHF(29ml)に懸濁し、0℃に冷却して、市販の2-エチルマロン酸ジエチルエステル10g(57.4mmol)を1時間かけて滴下し、さらに1時間撹拌した。臭化エチル8.1g(74.6mmol)を滴下後25℃に昇温し20時間撹拌した。反応液に水(20ml)加え、水層を分離した。有機層を減圧濃縮することで表題化合物である2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル10.8g(53.5mmol、収率93%)を得た。
(参考例2)2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミドの合成
参考例1の方法で調製した2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル10.8g(53.5mmol)と、20重量%アンモニア/メタノール溶液22.8g(267mmol)、ホルムアミド7.2g(160mmol)、28重量%ナトリウムメトキシド/メタノール溶液7.7g(40.1mmol)からなる溶液を30℃、20時間撹拌した。反応液にトルエン(19ml)を滴下し、20℃で1時間撹拌後、5℃に冷却してさらに1時間撹拌した。析出した結晶をろ別し、トルエンで洗浄後乾燥させることで、表題の化合物である2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミド6.0g(47.9mmol、収率90%)を得た。
参考例1の方法で調製した2-エチル-2-メチルマロン酸ジエチルエステル10.8g(53.5mmol)と、20重量%アンモニア/メタノール溶液22.8g(267mmol)、ホルムアミド7.2g(160mmol)、28重量%ナトリウムメトキシド/メタノール溶液7.7g(40.1mmol)からなる溶液を30℃、20時間撹拌した。反応液にトルエン(19ml)を滴下し、20℃で1時間撹拌後、5℃に冷却してさらに1時間撹拌した。析出した結晶をろ別し、トルエンで洗浄後乾燥させることで、表題の化合物である2-エチル-2-メチルマロン酸ジアミド6.0g(47.9mmol、収率90%)を得た。
Claims (10)
- Rが置換基を有していてもよい炭素数1〜3のアルキル基である請求項1に記載の製造法。
- Rがメチル基、又はエチル基である請求項2に記載の製造法。
- Rがエチル基である請求項3に記載の製造法。
- 酵素源が、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コマモナス(Comamonas)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である請求項1〜4のいずれかに記載の製造法。
- 酵素源が、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物である請求項1〜5のいずれかに記載の製造法。
- 酵素源として、コマモナス(Comamonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、又はシュードモナス(Pseudomonas)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する請求項5に記載の製造法。
- 酵素源として、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、ミクロバクテリウム ラエバニフォルマンス(Microbacterium laevaniformans)、ミクロバクテリウム テスタセアム(Microbacterium testaceum)、又はシュードモナス スピーシーズ(Pseudomonas sp.)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がSであるイソバリンを製造する請求項7に記載の製造法。
- 酵素源として、アクロモバクター(Achromobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、又はカプリアビダス(Cupriavidus)属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する請求項5に記載の製造法。
- 酵素源として、アクロモバクター デニトリフィカンス(Achromobacter denitrificans)、ブレビバクテリウム ヨーデナム(Brevibacterium iodinum)、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)、カプリアビダス メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、又はカプリアビダス ネケター(Cupriavidus necator)からなる群から選択される少なくとも1種の微生物の菌体及び/又はその処理物を用いて絶対配置がRであるイソバリンを製造する請求項9に記載の製造法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN112195202A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-08 | 甘肃皓天医药科技有限责任公司 | 一种s-吲哚啉-2-羧酸的生物催化制备方法 |
-
2013
- 2013-07-05 JP JP2013141914A patent/JP2015012838A/ja active Pending
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CN112195202A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-08 | 甘肃皓天医药科技有限责任公司 | 一种s-吲哚啉-2-羧酸的生物催化制备方法 |
CN112195202B (zh) * | 2020-09-14 | 2022-07-05 | 甘肃皓天医药科技有限责任公司 | 一种s-吲哚啉-2-羧酸的生物催化制备方法 |
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