NL1028762C2 - Stereoselectieve biologische omzetting van alifatische dinitrillen in cyaancarbonzuren. - Google Patents
Stereoselectieve biologische omzetting van alifatische dinitrillen in cyaancarbonzuren. Download PDFInfo
- Publication number
- NL1028762C2 NL1028762C2 NL1028762A NL1028762A NL1028762C2 NL 1028762 C2 NL1028762 C2 NL 1028762C2 NL 1028762 A NL1028762 A NL 1028762A NL 1028762 A NL1028762 A NL 1028762A NL 1028762 C2 NL1028762 C2 NL 1028762C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- nit
- cyano
- alkyl
- formula
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/002—Nitriles (-CN)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/20—Oxygen containing
- Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/20—Oxygen containing
- Y10T436/207497—Molecular oxygen
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
Description
1 \ 5
STEREOSELECTIEVE BIOLOGISCHE OMZETTING VAN ALIFATISCHE DI-NITRILLEN IN CYAANCARBONZUREN
10 Gebied van de uitvinding
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe biokatalytische werkwijzen voor de regio- en stereoselec-tieve omzetting van geselecteerde alifatische dinitrillen in de overeenkomstige cyaancarbonzuren. Meer in het bij-15 zonder verschaft de onderhavige uitvinding werkwijzen voor de omzetting van 2-isobutyl-succinonitril in (S)-3-cyaan- 5-methylhexaanzuur, dat een bruikbaar tussenproduct is bij de synthese van (S)-3-(aminomethyl)-5-methylhexaanzuur (pregabaline). Pregabaline kan gebruikt worden voor het 20 behandelen van bepaalde hersenziekten, bijvoorbeeld bij de behandeling en preventie van attaques, pijn en psychotische stoornissen. Omdat pregabaline werkzaam is als middel voor het verbeteren van hersenfuncties, is het ook bruikbaar bij de behandeling van geriatrische patiënten.
25
Achtergrond van de uitvinding
De enzymatische hydrolyse van organische nitrillen in de overeenkomstige carbonzuren en amiden verschaft een belangrijke alternatieve synthetische werkwijze voor een 30 breed spectrum aan nuttige verbindingen. De gebruikelijke chemische hydrolyse van nitrillen in de overeenkomstige carbonzuren en amiden wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van een sterk zure of basische katalysator bij een hoge reactietemperatuur, wat de hydrolyse onverenigbaar 35 maakt met verbindingen die gevoelige functionele groepen bevatten. Bovendien kan de slechte selectiviteit van chemische hydrolyse leiden tot ongewenste bijproducten naast 1028762- I .
2 grote hoeveelheden anorganische zouten. Daarentegen treedt enzymatische nitrilhydrolyse op onder milde omstandigheden (neutrale pH, 30°C) wat de mogelijkheid voor grote chemo-, regio- en stereoselectiviteit biedt. Als bijkomend voor-5 deel wordt de vorming van anorganische zouten als bijproduct vermeden.
De best bekende industriële toepassingen van nitril-omzettende enzymen zijn de productie van acrylamide (T. Nagasawa c.s., Tibtech., 1992, vol. 10, 402-408) en nico-10 tinamide (T. Nagasawa c.s., Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol. 54, 1766-1769) met gebruikmaking van een ni- trilhydratase uit Rhodococcus rhodochrous J1. Verscheidene recente overzichtsartikelen (L. Martinkové c.s., Current Organic Chemistry, 2003, vol. 7, 127 9-1295 en D. Cowan 15 c.s., Extremophiles, 1998, vol. 2, 207-216) beschrijven de biochemie en de mogelijke industriële toepassingen van ni-trilomzettende enzymen.
Enzymatische nitrilhydrolyse wordt gekatalyseerd door nitrilasen, die natrillen in de overeenkomstige carbonzu-20 ren omzetten en nitrilhydratasen, die nitrillen in de overeenkomstige amiden omzetten. Amidasen, die amiden tot de overeenkomstige carbonzuren hydrolyseren, kunnen in combinatie met nitrilhydratasen gebruikt worden om nitrillen in carbonzuren om te zetten.
25 Het gebruik van een nitrilase-enzym voor het bereiden van een carbonzuur uit het overeenkomstige nitril is beschreven in WO 02/072856. Het opnemen van het enzym in een polymeermatrix met verknoping verschaft een katalysator met verbeterde fysische en biochemische integriteit.
30 De regioselectieve bereiding van ω-nitrilcarbonzuren uit alifatische a, ω-dinitrillen met een biokatalysator werd beschreven in US-octrooi nr. 5.814.508. Er werd bijvoorbeeld een katalysator met nitrilaseactiviteit gebruikt om 2-methylglutaronitril in 4-cyaanpentaanzuur om te zet-35 ten.
K. Yamamoto, c.s., J. Ferment. Bioengineering, 1992, vol. 73, 125-129 beschrijven het gebruik van microbiële 1028762- 1 * 3 cellen met zowel nitrilhydratase- en amidaseactiviteit voor het omzetten van trans-1,4-dicyaancyclohexaan in trans-4-cyaancyclohexaancarbonzuur.
Regioselectieve biokatalytische omzettingen van dini-5 trillen in .met cyaan gesubstitueerde carbonzuren zijn beschreven voor een reeks alifatische a,o-dinitrilverbindin-gen, met gebruikmaking van microbiële cellen met een alifatische nitrilaseactiviteit, of een combinatie van ni-trilhydrataseactiviteit en amidaseactiviteit. (J.E. Gava-10 gan c.s., J. Org. Chem., 1998, vol. 63, 4792-4801).
Stereoselectieve enzymatische omzettingen van nitril-len zijn beschreven voor de bereiding van chirale carbonzuren en amiden die met één enantiomeer verrijkt zijn (M. Wieser c.s., Chapter in Stereoselective Biocatalysis, Mar-15 cel Dekker Ine.: New York, 2000, 461-486). Een stereo- selectief nitrilase-enzym uit Alcaligenes faecalis ATCC 8750 is gebruikt voor de bereiding van (R)-amandelzuur uit racemisch amandelnitril (K. Yamamoto c.s., Appl. Environ. Microbiol., 1991, vol. 57, 3028-3032). Een nitrilase uit 20 Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 hydrolyseert preferent (+)-2-methylhexaannitril in een racemisch mengsel van 2-methylhexaannitril waarbij (-)-2-methylhexaannitril onomgezet achter blijft (M. Gradley c.s., Biotechnology Lett., 1994, vol. 16, 41-46). Amerikaans octrooi nr. 25 5.593.871 beschrijft een werkwijze voor het bereiden van 2-alkaanzuuramiden die verrijkt zijn met één enantiomeer, uit nitrillen met gebruikmaking van micro-organismen die stereoselectieve nitrilhydratasen bevatten. Enantiomeer zuivere α-aminozuren en amiden werden bereid uit racemi-30 sche α-aryl- en α-alkylgesubstitueerde glycinenitrillen met gebruikmaking van Rhodococcus sp. AJ270 dat een stere-oselectief nitrilhydratase en een stereoselectief amidase bevat (M.C. Wang c.s., J. Org. Chem., 2002, vol. 67, 6542). Bovenstaande literatuurplaatsen worden door verwij-35 zing in hun geheel in deze beschrijving opgenomen.
Er is gebleken.dat de therapeutische waarde van racemisch pregabaline, in het bijzonder de werking ervan als 1028762’ 4 anticonvulsievum hoofdzakelijk kan worden toegeschreven aan de (5)-enantiomeer. Met het oog op het verschaffen van een rendabele pregabalinegeneesmiddeltherapie is een aantal synthetische routes naar de met de (S)-enantiomeer 5 verrijkte verbinding onderzocht. Zo verschaft bijvoorbeeld de asymmetrische hydrogenering van het geschikte met cyaan gesubstitueerde olefine gevolgd door reductie van de cy-aangroep tot het overeenkomstige amine pregabaline dat substantieel verrijkt is met de (S)-enantiomeer (US-oc- 10 trooiaanvrage publicatienummer 2003/0212290).
De synthese van pregabaline, de derivaten en analoga daarvan door zuiver chemische methoden is beschreven in US-octrooien 6.642.398, 6.635.673 en 6.046.353.
15 Samenvatting van de uitvinding
Bij de werkwijze van de onderhavige uitvinding worden regio- en stereoselectieve biokatalytische omzettingen van alifatische dinitrillen in carbonzuren verkregen met gebruikmaking van enzymkatalysatoren met nitrilaseactivi- 20 teit.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor het bereiden van een (S) -enantiomeer van een verbinding met formule I: 25 Λ
JCOOH
R2 7/ chi x:n
30 I
R1 1 1028762" waarin C3 een (S)-configuratie heeft; R1 waterstof, (Ci-C6)alkyl of fenyl is; en
1 I
5 R2 (Ci-C8) alkyl, (C2-C8) alkenyl, (C3-C8) cycloalkyl, -0(Ci-C6)alkyl, -CH2-CH2-0- (Ci-C6) alkyl, (Ci-C6) alkyl-OH, -fenyl-(Ci-Cê) alkyl-OH, -fenyl-O-(Ci-Ce) alkyl, fenyl of gesubstitueerd fenyl is; 5 met dien verstande, dat als R2 methyl is, R1 water stof, (Ci~C6)alkyl of fenyl is; die de volgende stappen omvat: (la) het in contact brengen van een verbinding met formule II: 1°
lCN
R2 l/ 3I Π
CH3 ^CN
15 I
R1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1028762- 2 met een enzymkatalysator met nitrilaseactiviteit in een 3 reactiemedium; en 4 (lb) het isoleren van de (S)-isomeer van de verbin 5 ding met formule I uit het reactiemedium en eventueel het 6 terugwinnen van onveranderde (R)-isomeer van verbinding 7 II.
8
Verbindingen met formule I zijn bruikbaar bij het 9 synthetiseren van verbindingen met farmaceutische activi 10 teit zoals pregabaline.
11
Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding 12 zijn R1 en R2 onafhankelijk waterstof of Ci-Cs-alkyl.
13
Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is 14 de verbinding met formule II een racemisch mengsel dat 3R- 15 en 3S-isomeren bevat.
16
Een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uit vinding is de werkwijze waarbij racemisch 2-isobutylsucci-nonitril (de verbinding met formule II waarin R1 H is en 6 R2 methyl is) wordt omgezet in (S)-3-cyaan-5-methylhexaan-zuur (de verbinding met formule I waarin R1 H is en R2 methyl is) die de volgende stappen omvat: (2a) het in een reactiemedium in contact brengen van 5 racemisch 2-isobutyl-succinonitril met een enzymkatalysa-tor met nitrilaseactiviteit in; en (2b) het isoleren van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit het waterige mengsel; en eventueel het terugwinnen van onomgezet (R)-2-isobutylsuccinonitril.
10 Bij voorkeur is het reactiemedium een waterig medium.
Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt de teruggewonnen en onveranderde (R)-iso-meer van verbinding II vervolgens geracemiseerd door verhitting met een zwakke base in de aanwezigheid van een or-15 ganisch oplosmiddel. Een voorkeursbase is 1,8-diazabicy-clo[5.4.0]undec-7-een en een voorkeursoplosmiddel is tolueen. Eventueel kan het verkregen racemaat van II worden teruggevoerd naar elk van de hierboven vermelde processen bij stap (la) of (2a).
20 Bij één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding bevindt de enzymkatalysator zich in de vorm van gehele mi-crobiële cellen, extracten van microbiële cellen, gedeeltelijk gezuiverde enzymen, gezuiverde enzymen of enzymka-talysatoren die op een drager geïmmobiliseerd zijn.
25 Bij een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is de enzymkatalysator een gedeeltelijk gezuiverd enzym. Voorbeelden van gedeeltelijk gezuiverde enzymen bevatten, maar zijn niet beperkt tot NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalytics Ine., Pasadena, CA), en nitrilase 30 uit Arabidopsis thaliana (Jülich Fine Chemicals, Jülich, Duitsland).
Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is de nitrilase-enzymkatalysator geïmmobiliseerd op een drager. Voorbeelden van geïmmobiliseerde ni-35 trilase-enzymkatalysatoren omvatten, maar zijn niet beperkt tot NIT-102 C2 (BioCatalytics Ine., Pasadena, CA), NIT-102 geïmmobiliseerd op Eupergit (Röhm GmbH & Co. KG, l'028762 = 7
Darmstadt, Duitsland), en nitrilase uit Arabidopsis thali-ana, geïmmobiliseerd op Eupergit. Bij een voorkeursuitvoeringsvorm is de geïmmobiliseerde nitrilase-enzymkatalysa-tor NIT-102 C2.
5 Bij een andere uitvoeringsvorm is het reactiemedium samengesteld uit gedestilleerd water of gebufferd water. Bij voorkeur is het gebufferde water gebufferd op een pH in het traject van ongeveer 5,0 tot ongeveer 10,0 en liefst op een pH in het traject van ongeveer 6,0 tot onge- 10 veer 8,0.
De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor de bereiding van (S)-3-(aminomethyl)-5-me-thylhexaanzuur (pregabaline) die de volgende stappen omvat: 15 (a) het in een reactiemedium in contact brengen van racemisch 2-isobutylsuccinonitril met een enzymkatalysator met nitrilaseactiviteit; (b) het isoleren van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit het reactiemedium; 20 (c) het omzetten van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur in een zuurzout; en (d) het hydrogeneren van het zuurzout om (S)-3-(aminomethyl) -5-methylhexaanzuur (pregabaline) te vormen.
Bij voorkeur heeft het zuurzout de formule 25 \θ© 30 xco2m waarin M Na, K, Li, NH4, NH2R6R7, 35 NH3R1 of NH(R6)2R7 is, waarin R6 en R7 elk onafhankelijk (Ci-Ce)alkyl zijn.
1028762“ 8
Gemakshalve worden bepaalde uitdrukkingen die in de beschrijving, voorbeelden en bijgaande conclusies gebruikt worden, hier verzameld. Tenzij anders gedefinieerd, hebben de in de beschrijving gebruikte technische en wetenschap-5 pelijke uitdrukkingen dezelfde betekenis als die welke er gewoonlijk door een deskundige op het gebied waartoe de uitvinding behoort, aan wordt gegeven.
De uitdrukking "alkyl" is een rechte of vertakte groep met 1 tot 8 koolstofatomen waaronder, maar niet uit-10 sluitend methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl en tert-butyl.
De uitdrukking "cycloalkyl" zoals deze in deze beschrijving wordt gebruikt, omvat resten die zijn afgeleid van cyclische koolwaterstoffen die 3 tot 7 ringkoolstof-15 atomen bevatten, waaronder cyclische koolwaterstofresten die met rechte of vertakte alkylresten gesubstitueerd zijn.
De uitdrukking "alkoxy" zoals deze in deze beschrijving wordt gebruikt, betekent "alkyl-O-", waarin "alkyl" 20 de hiervoor gegeven betekenis heeft.
De uitdrukking "alkenyl" omvat koolwaterstofketens met een rechte of vertakte configuratie die één of meer dubbele koolstof-koolstofbindingen bevatten die op elk stabiel punt langs de keten aanwezig kunnen zijn, zoals 25 ethenyl en propenyl. Alkenylgroepen bevatten in het algemeen 2 tot ongeveer 12 koolstofatomen, meer in het bijzonder 2 tot ongeveer 8 koolstofatomen.
De uitdrukking "racemaat" zoals deze in deze beschrijving wordt gebruikt, betekent een equimolair mengsel 30 van een paar enantiomeren. Een racemaat wordt gewoonlijk gevormd als de synthese leidt tot de vorming van een ste-reocentrum. Zoals in deze beschrijving gebruikt, betekent de uitdrukking "racemisch mengsel" een racemaat.
Zoals in deze beschrijving gebruikt, verwijst de uit-35 drukking "enantiomeren" naar verbindingen die op het moleculaire niveau niet superponeerbaar zijn met de spiegel- 1028762- 9 beelden van elkaar. Enantiomeren kunnen in de (R)- of (S)-configuratie voorkomen.
Zoals in deze beschrijving gebruikt, verwijst de term "stereoselectieve synthese" naar een chemische reactie die . 5 leidt naar .de vorming van een enkele enantiomeer of een enantiomeerverrijkt mengsel van isomeren uit twee of meer mogelijke stereo-isomeren.
Zoals in deze beschrijving wordt gebruikt, verwijst de uitdrukking "regioselectief" naar een reactie die 10 plaats heeft op een enkel atoom of een groep atomen uit twee of meer mogelijke atomen of groepen atomen. De regio-selectieve hydrolyse van dinitril leidt tot de omzetting van een enkele nitrilgroep in een carboxylgroep.
"°C" betekent graden Celsius.
15 De uitdrukking "enzymkatalysator" zoals deze in deze beschrijving wordt gebruikt, betekent een katalysator die wordt gekenmerkt door hetzij nitrilaseactiviteit, of een combinatie van een nitrilhydrataseactiviteit en een amida-seactiviteit. De katalysator kan zich bevinden in de vorm 20 van een gehele microbiële cel, gepermeabiliseerde microbi-ele cellen, één of meer celbestanddelen van een extract van microbiële cellen, gedeeltelijk gezuiverde enzymen of gezuiverde enzymen.
Zoals in.deze beschrijving gebruikt, verwijst de uit-25 drukking "enantiomere overmaat" naar de molaire fractie van het overheersende enantiomeer in een mengsel van enantiomeren uitgedrukt als percentage.
De uitdrukking "waterig reactiemengsel" betekent een mengsel van het substraat en de enzymkatalysator in een 30 overwegend waterig medium.
De uitdrukking "nitrilaseactiviteit" betekent een en-zymactiviteit die een nitrilgroep in een carboxylgroep omzet .
De uitdrukking "nitrilasehydrataseactiviteit" zoals 35 die in deze beschrijving wordt gebruikt, betekent een' en-zymactiviteit die een nitrilgroep in een amidegroep omzet.
1028762- 10
De uitdrukking "amidaseactiviteit" betekent enzymac-tiviteit die een amidegroep in een carboxylgroep omzet.
ATCC is American Type Culture Collection die is gevestigd op 10801 University Boulevard, Manassas, Va., 5 20110-2209, U.S.A. BioCatalytics Ine. is gevestigd op 129 N. Hill Avenue, Suite 103, Pasadena, CA, 91106, U.S.A. Jü-lich Fine Chemicals GmbH is gevestigd op Rudolf-Schulten-Strafte 5, D-52428 Jülich, Duitsland.
10 Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding
De onderhavige uitvinding verschaft een enzymatische werkwijze voor het bereiden van alifatische cyaancarbon-zuren met formule I uit dinitrillen met formule II. Elke geschikte werkwijze die gewoonlijk in de techniek wordt 15 gebruikt, kan worden gebruikt voor het bereiden van de di-nitril(II)-uitgangsmaterialen.
Schema 1 verwijst naar een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding waarbij een chemisch-enzyma-tische methode wordt gebruikt bij de omzetting van 2-iso-20 butylsuccinonitril (V) in (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur (VI) . Verbinding VI kan worden gebruikt als tussenproduct bij de synthese van pregabaline (VII) zoals wordt toegelicht in schema 2. Stap 3 van schema 1 stélt de racemisa-tie voor van het bijproduct (-R)-isomeer (Va) en daaropvol-25 gende terugvoer naar stap 2.
Bij stap 1 van schema 1 wordt racemisch 2-isobutyl-succinonitril (V) gevormd door de condensatie van isova-leeraldehyde (III) met ethylcyaanacetaat (IV) gevolgd door het toevoegen van KCN. Het racemaat is het gevolg van het 30 stereocentrum dat op het C3-koolstofatoom van V wordt gevormd .
Stap 2 van schema 1 geeft de regio- en stereoselec-tieve hydrolyse van het dinitril V-racemaat die (S)-3-cy-aan-5-methylhexaanzuur (VI) en onveranderde (R)-isomeer 35 van V geeft, weer.
De nitrilasegekatalyseerde hydrolyse van 2-isobutyl-succinonitril (V) tot (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur VI is >1028762- 11 zowel regioselectief als stereoselectief. Regioselectivi-teit is gebaseerd op omzetting van de cyaangroep in een carboxylgroep op alleen het Cl-koolstofatoom. De reactie is stereoselectief, omdat de (S)-enantiomeer van V hoofd-5 zakelijk is betrokken bij de omzetting waarbij , de .
(R)-enantiomeer in wezen onveranderd achterblijft.
Zoals wordt toegelicht in schema 2, wordt in een volgende stap een zuurzout Vla van S-cyaanzuur VI gehydroge-neerd ter verkrijging van (S)-3-(aminomethyl)-5-methyl-10 hexaanzuur (pregabaline). De reactie wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van een hydrogeneringskatalysator, bij voorkeur Raney-nikkel. Aanvaardbare zuurzouten omvatten verbindingen met formule Vla waarin M Na, K, Li, NH4f NH2R6R7, NH3R6 of NH(R6)2R7 is, waarbij R6 en R7 onafhanke-15 lijk (Ci-C6)alkyl zijn.
1028762“ 12
Schema 1
CO Et Piperidine/hejcaan \/\^CN
5 YSho + <- ! LJSË- T T V
I CN Stap 1 *\CN
γ 111 IV (R, S)-2-isobutyl-succinonitrll (racemaat) nitrilase/ 0 · i λ Y :stap 3 base iU / stap 2 ...
YYCN + YYCN
^COOH CN
VI 1 Va ^5 (S)-3-cyaan-5-methyltiexaanzuar (R)-2-isobutyl-succinordtril schana 2 v CN NH2
. RaNi, H2 T
I : -:-*· I H '«—C02H
„„ ^"CO-M
20 Vla VII
(S)-3-cyaan-5-nethylhexaanzuur-zout pregabaline 25
Bij de regio- en stereoselectieve omzetting van racemaat V in (S)-cyaanzuur VI, zoals weergegeven in schema 1, 30 reageert het nitrilase-enzym voornamelijk met de (S)-enan-tiomeer. Bijgevolg wordt het reactiemengsel steeds meer verrijkt met de (J?)-enantiomeer Va als de omzetting voortgaat.
Een ander doel van de onderhavige uitvinding is het 35 vermijden van economische verspilling door het terugvoeren of hergebruiken van het onveranderde (R)-dinitril Va. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werkwijze 1028762" 13 voor het racemiseren van het (R)-dinitril (stap 3, schema 1) en de daaropvolgende terugvoer door stap 2 van schema 1.
Verschillende enzymen van de onderhavige uitvinding 5 met. niirilaseactiviteit of een combinatie van nitrilhydra-taseactiviteit en amidaseactiviteit kunnen worden gevonden door screeningsprotocols zoals verrijkingsisolatietechnie-ken die aanvankelijk micro-organismen te selecteren op basis van hun vermogen om in media met het verrijkte nitril 10 te kunnen groeien. Verrijkingsisolatietechnieken omvatten kenmerkend het gebruik van koolstofbeperkte of stikstofbe-perkte media die zijn. aangevuld met een verrij kingsnitril,. dat het nitrilsubstraat voor de gewenste biologische omzetting of een structureel verwante nitrilverbinding kan 15 zijn. Micro-organismen die nitrilaseactiviteit hebben, kunnen aanvankelijk geselecteerd worden op basis van hun vermogen om te kunnen groeien in media die het verrij -kingsnitril bevatten. Gavagan c.s., (Appl. Microbiol. Bio- I technol. (1999) vol. 52, 654-659) gebruikten verrijkings- i 20 technieken om een Gram-negatieve bacterie, Acidovorax fa- cillis 72W (ATCC 557 46) , te isoleren uit grond met gebruikmaking van 2-ethylsuccinonitril als de enige stik-stofbron. Van Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)werd aangetoond dat het bruikbaar is voor de selectieve omzetting 25 van 2-methylglutaronitril in 4-cyaanpentaazuur. Verrij-kingstechnieken werden ook gebruikt voor het isoleren van de thermofiele bacterie Bacillus pallidus Dac521, die de omzetting van 3-cyaanpyridine in nicotinezuur katalyseert (Almatawah en. Cowan, Enzym Microb. Technol. (1999) vol. 30 25, 718-724). Micro-organismen die geïsoleerd zijn door verrijkingstechnieken kunnen op nitrilhydrolyseactiviteit onderzocht worden door suspensies van microbiële cellen in contact te brengen met een nitrilverbinding en te onderzoeken op de aanwezigheid van het corresponderende carbon-35 zuur met gebruikmaking van analytische methoden zoals vloeistofchromatografie met groot scheidend vermogen, gas-vloeistofchromatografie of vloeistofchromatografie-massa- L__ 1028762- 14 spectrometrie (LCMS). Technieken voor het onderzoeken van de nitrilhydrolyseactiviteit van Acidovorax facillis 72W (ATCC 55746) worden vermeld in US-octrooi nr. 5.814.508.
Zodra een micro-organisme met nitrilaseactiviteit of 5 nitrilhydrataseactiviteit en amidaseactiviteit is geïsoleerd, kan enzymmanipulatie worden gebruikt om verschillende aspecten van het enzym te verbeteren. Deze verbeteringen kunnen nuttig zijn voor de onderhavige uitvinding en omvatten het vergroten van selectiviteit, katalytische 10 efficiëntie van het enzym, stabiliteit bij hoge temperaturen en een groter pH-traject en maken het mogelijk dat het enzym werkt in een reactiemengsel dat een mengsel van waterige buffer en organisch oplosmiddel bevat. j
Technieken die gebruikt kunnen worden bij de onderha-15 vige uitvinding om een enzymkatalysator te produceren met nitrilaseactiviteit of nitrilhydrataseactiviteit en amidaseactiviteit naast een verbeterde opbrengst, doorzet en productkwaliteit geschikt voor een bepaald biologisch om-zettingsproces, omvatten, maar zijn niet beperkt tot en-20 zymmanipulatietechnieken zoals rationele ontwerpmethoden die plaatsgerichte mutagenese omvatten en gerichte ontwik-kelingstechnieken die gebruikmaken van statistische mutagenese of DNA-shufflingtechnieken.
Geschikte enzymkatalysatoren voor de omzetting van 25 verbindingen met formule II in verbindingen met formule I bevinden zich in de vorm van gehele microbiële cellen, ge-permeabiliseerde microbiële cellen, extracten van microbi-ele cellen, gedeeltelijk gezuiverde enzymen, of gezuiverde enzymen en dergelijke katalysatoren kunnen op een drager 30 geïmmobiliseerd zijn.
Deze werkwijze kan in een enkele fase worden . uitgevoerd door 2-isobutylsuccinonitril in contact te brengen met een enzymkatalysator in gedestilleerd water of in een waterige oplossing van een buffer die de aanvankelijke pH 35 van de reactie tussen 5,0 en 10,0, bij voorkeur tussen. 6,0 en 8,0 zal houden. Geschikte buffermiddelen omvatten kali-umfosfaat en calciumacetaat. Als de reactie verloopt, kan 11028762=1 15 de pH van het reactiemengsel veranderen als gevolg van vorming van een ammoniumzout van het carbonzuur uit de overeenkomstige nitrilfunctie van het dinitril. De reactie kan worden uitgevoerd zonder pH-regeling, of een geschikt 5 zuur of geschikte base kan worden toegevoegd tijdens het verloop van de reactie om de gewenste pH te handhaven. Zoals hierboven is aangegeven, is het echter ook mogelijk om enzymkatalysatoren te produceren met technieken zoals en-zymmanipulatie en gerichte ontwikkeling die in een breder 10 pH-traject werkzaam zullen zijn.
Deze werkwijze kan worden uitgevoerd in reactiemeng-sels die bestaan uit twee fasen: een waterfase die aanvankelijk enzym en opgelost 2-isobutylsuccinonitril bevat en een organische fase die hoofdzakelijk uit racemisch 2-iso-15 butylsuccinonitril bestaat. Tweefasenreactiemengsels worden bereid door het toevoegen van 2-isobutylsuccinonitril aan een waterige oplossing van enzym en buffermiddelen, zodanig dat de hoeveelheid 2-isobutylsuccinonitril de op-losbaarheidsgrens in water overschrijdt. De oplosbaar-20 heidsgrens in water van 2-isobutylsuccinonitril in 50 mM kaliumfosfaat (30°C, pH 7,5) is ongeveer 0,06 M. Tijdens het verloop van de reactie wordt (S) -3-cyaan-5-methyl- i i hexaanzuur-ammoniumzout gevormd en neemt de concentratie ervan in de waterfase toe, terwijl het volume van de orga-25 nische fase afneemt en de organische fase met (R) -2-isobutylsuccinonitril verrijkt wordt. Als andere mogelijkheid kan deze werkwijze ook worden uitgevoerd in de reactiemengsels die bestaat uit drie fasen: een waterfase die aanvankelijk opgelost 2-isobutylsuccinonitril bevat, 30 een organische fase die hoofdzakelijk uit racemisch 2-isobutylsuccinonitril bestaat en een vaste fase die bestaat uit enzym dat op een onoplosbare drager geïmmobiliseerd is. Driefasenreactiemengsels worden bereid,volgens de voor tweefasenreactiemengsels beschreven procedure, behalve dat 35 een op een onoplosbare drager geïmmobiliseerd enzym wordt gebruikt in plaats van een niet-geïmmobiliseerd enzym.
1028762- 16
Eventueel kan het enzym worden geïmmobiliseerd in een polymeermatrix of een onoplosbare drager. Geïmmobiliseerde enzymkatalysatoren kunnen meerdere malen en in continue werkwijzen worden gebruikt en kunnen gemakkelijker van de 5 producten van de enzymatische werkwijze worden gescheiden dan niet-geïmmobiliseerde enzymkatalysatoren. Werkwijzen voor het immobiliseren van enzymen in een polymeermatrix, zoals calciumalginaat of polyacrylamide, of een onoplosbare drager zoals celiet, zijn de deskundige goed.bekend. 10 NIT-102 C2 (BioCatalytics Ine., Pasadena, CA) dat een op een onoplosbare drager geïmmobiliseerd nitrilase-enzym is, is bijzonder nuttig voor de omzetting van II in III, omdat het meerdere malen kan worden gebruikt bij ladingsgewijze of continue werkwijzen. De bij een reactie gebruikte con-15 centratie van NIT-102 C2 wordt zo gekozen dat een gewenste reactiesnelheid wordt verkregen en hangt af van de specifieke activiteit van de katalysator en de substraatconcen-tratie. Gewoonlijk wordt NIT-102 C2 gebruikt in het traject van ongeveer 0,001 g tot 0,3 g nat gewicht per ml re-20 actievolume niet een voorkeurstrajeet van 0,01 tot 0,15 g nat gewicht per ml reactievolume.
Daarnaast zijn verscheidene gevriesdroogde lysaten die zijn bereid uit microbiële cellen en worden aangeduid als NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalytics Ine., Pasade-25 na, CA) en nitrilase uit Arabidopsis thaliana (Jülich Fine Chemicals, Jülich, Duitsland) ook bruikbaar voor de omzetting van II in III. Het in contact brengen van NIT-101, NIT-102, NIT-103 A. thaliana-nitrilase met I in een waterig reactiemengsel leidt tot de vorming van II. Reacties 30 waarbij NIT-101, NIT-102, NIT-103 en nitrilase uit Ara bidopsis thaliana worden gebruikt, kunnen worden uitgevoerd in tweefasereactiemengsels met gebruikmaking van ka-talysatorconcentraties in het traject van 0,001-0,04 g droog gewicht per ml reactievolume, waarbij een traject 35 van 0,002-0,02 g droog gewicht per ml reactievolume de voorkeur heeft.
1028762- 17
De temperatuur van de hydrolysereactie wordt zodanig gekozen dat zowel de reactiesnelheid als de stabiliteit van de enzymkatalysatoractiviteit worden geoptimaliseerd. De temperatuur van de reactie kan liggen tussen temperatu-5 ren juist boven het vriespunt van de suspensie (circa 0°C) en 60°C, waarbij de reactietemperatuur bij voorkeur in het traject van 5 tot 35°C ligt.
Het isoleren van de (3S)-isomeer van de verbinding met formule I en het terugwinnen van onveranderde (3R)-10 isomeer van de verbinding met formule II kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van de deskundige bekende geschikte scheidings-, isolatie- en zuiveringstechnieken.
Bij een voorkeursterugwinningswerkwijze wordt de onveranderde (3R)-isomeer van de verbinding met formule II 15 gescheiden van het basische waterige reactiemengsel door extractie met een organisch oplosmiddel zoals ethylace-taat. Het zuur zout van de (3S)-isomeer van de verbinding met formule I wordt preferent opgelost in de waterlaag en vervolgens geïsoleerd door aanzuring en extractie met een 20 organisch oplosmiddel zoals ethylacetaat.
De verbindingen met formule I kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van verbindingen zoals pregabaline, die bruikbaar zijn bij de behandeling van stoornissen zoals epilepsie, convulsies, angst, pijn en neurodegenera-25 tieve stoornissen waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Huntington en de ziekte van Parkinson.
Voorbeelden van specifieke verbindingen met formule I zijn de volgende verbindingen: (5)-3-cyaan-5-methyloctaanzuur; 30 (5)-3-cyaan-5-methylheptaanzuur; (5)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur; (S)-3-cyaan-5-methylnonaanzuur; (S)-2-cyaan-5-ethoxyhexaanzuur ; (S)-3-cyaan-5-cyclohexylhexaanzuur; en 35 (S)-3-cyaan-5-trifluormethylhexaanzuur.
1028762- 18 VOORBEELD 1
Bereiding van 2-isobutylsuccinonitril
Een mengsel van ethylcyaanacetaat (733 g, 6,48 mol), isovaleeraldehyde (613,9 g, 7,13 mol), piperidine (5,5 g, 5 0, 065 mol) en hexaan (0,5 1) werd tot reflux gebracht, waarbij continu water werd verwijderd. Toen geen extra water meer werd verzameld, werd het mengsel afgekoeld en onder vacuüm gedestilleerd om oplosmiddel te verwijderen. Isopropanol (1 1) werd aan de resterende olie toegevoegd, 10 gevolgd door een oplossing van kaliumcyanide (422 g, 6,48 mol) in water (2 1). Het reactiemengsel werd gedurende het toevoegen van het kaliumcyanide onder 35°C en vervolgens gedurende 4 uur op ongeveer 35°C gehouden. Het reactiemengsel werd onder atmosferische druk gedestilleerd totdat 15 een temperatuur van 95°C was bereikt en vervolgens gedurende 5 uur bij deze temperatuur gerefluxt. Het reactiemengsel werd afgekoeld, verdund met water (0,5 1) en met 1 1 methyl-tert-butylether (MTBE) geëxtraheerd. Het MTBE-extract werd met water (0,5 1) gewassen, op watervrij mag-20 nesiumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd, waarbij 873,4 g 2-isobutylsuccinonitril als een olie werd verkregen. Gezuiverde monsters 2-isobutylsucci-nonitril kunnen worden verkregen door vacuümdestillatie (90°C bij 0,275 mmHg).
25 1H-NMR (CDC13, 400 MHz): 6 0, 93-0,99 (m, 6H), 1,43-1,50 (m, 1H) , 1,71-1,78 (m, 1H) , 1,81-1,91 (m, 1H), 2,69 (d, 2H, J=6,5 Hz), 2,90-2,97 (m, 1H) .
VOORBEELD 2 30 Bereiding van (5)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit 2-isobutylsuccinonitril met NIT-101, NIT-102, NIT-103 en Ara-bidopsis thaliana-nitrilase
Drie glazen schroefdopflesjes van 8 ml werden elk gevuld met twee isobutylsuccinonitril (20 mg), 1 ml 50 mM
35 kaliumfosfaatbuffer (pH 7,5, 2 mM dithiothreïtol (DTT)) en 10 mg van een nitrilase-enzym, gekozen uit NIT-101, NIT-102 en NIT-103 (BioCatalytics Ine., Pasadena, CA). Eén |i028762- 19 glazen schroefdopflesje van 8 ml werd gevuld met 2-isobutylsuccinonitril (20 mg) en 1 ml van een oplossing van Arabidopsis thaliana-nitrilase in 50 mM fosfaatbuffer (pH 7,8) die 100 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) 5 en 2 mM DTT.(Jülich Fine Chemicals, Jülich, Duitsland) bevatte. De vier reactiemengsels werden 15 uur bij 30°C met magnetische roerstaafjes geroerd en vervolgens afzonderlijk geëxtraheerd met ethylacetaat (2x6 ml) . Na het verwijderen van de ethylacetaatextracten werden de waterige 10 gedeelten behandeld met 4 N HC1 (0,15 ml) en met ethylacetaat (3x6 ml)geëxtraheerd. De ethylacetaatextracten van de aangezuurde waterige gedeelten werden onder vacuüm geconcentreerd, waarbij 7,8 mg (34,2% opbrengst), 8,8 mg (38,6% opbrengst), 8,1 mg (35,5% opbrengst) en 4,0 mg (17,5% op-15 brengst) (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur ((S)-CMHA) werd verkregen voor de reacties uitgevoerd met respectievelijk NIT-101, NIT-102, NIT-103 en A. thaliana-nitrilase. Mon sters (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit elk van de reacties werden met een overmaat (trimethylsilyl)diazomethaan 20 behandeld om de methylesterderivaten te verkrijgen en geanalyseerd met gaschromatografie (GC) op een Chiraldex™ G-TA-kolom (30 mx0,25 mm inwendige diameter, filmdikte van 125 micron) om de enantiomere zuiverheid te bepalen. De enantiomere zuiverheid van de met NIT-101, NIT-102, 25 NIT-103 en A. thaliana-nitrilase verkregen reactieproduc- ten was respectievelijk 96,3%, 91,1%, 95,5% en 98,5% e.e. (e.e. betekent "enantiomere overmaat").
VOORBEELD 3 30 Bereiding van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit 2-isobutylsuccinonitril met NIT-102
Een op 30°C gehouden dubbelwandig reactievat van 125 ml werd gevuld met 2-isobutylsuccinonitril (3,33 g), NIT-102 (0,5 g) en 122 ml 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,5) 35 die 5 mM DTT en 1 mM EDTA (reactiebuffer) bevatte. Na 12,5 uur roeren werd het productmengsel geëxtraheerd met ethylacetaat (4x50 ml). De ethylacetaatextracten werden verwij- 1028762- 20 derd en het waterige gedeelte werd bijgesteld tot pH 2,5 met 4 M HC1 en met ethylacetaat (3x50 ml) geëxtraheerd. De ethylacetaatextracten van het aangezuurde waterige gedeelte werden gecombineerd, met watervrij MgS04 gedroogd, ge-5 filtreerd en onder vacuüm geconcentreerd, waarbij 1,56 g (S)-CMHA (41,1%) werd verkregen. Een monster van het reac-tieproduct werd met (trimethylsilyl)diazomethaan behandeld en met GC geanalyseerd, zoals beschreven bij voorbeeld 2, wat een enantiomere zuiverheid van 98,5% e.e. aangaf.
10 1H-NMR (CDC13, 400 MHz); δ 0, 93-0,97 (m, 6H) , 1,30- 1,37 (m, 1H) , 1,61-1,68 (m, 1H) , 1,82-1,89 (m, 1H)., 2,57- 2,63 (m, 1H), 2,72-2,78 (m, 1H), 2,98-3,06 (m, 1H).
VOORBEELD 4 15 Bereiding van kalium-(S)-3-cyaan-5-methylhexanoaat uit 2-isobutylsuccinonitril met NIT-102 C2
Twee op 30°C gehouden dubbelwandige reactievaten van 125 ml werden elk gevuld met 2-isobutylsuccinonitril (6,81 g), NIT-102 C2 (1,70 g) en 118,2 ml reactiebuffer.
20 Na 24 uur roeren werden de productmengsels gedecanteerd, waarbij de enzymkatalysator in de reactievaten achterbleef. Reactiebuf fer (20 ml) werd aan elk reactievat toegevoegd, ongeveer 2 minuten geroerd en vervolgens gedecanteerd en aan de productmengsels toegevoegd. De reacties 25 werden herhaald door het toevoegen van 2-isobutylsuccinonitril (6,81 g) en reactiebuf fer (118,2 ml) aan elk reactievat en de reactiemengsels 24 uur te roeren. Nadat vier reacties waren voltooid in elk vat (in totaal acht la-dingsgewijze reacties) werden de productmengsels gecombi-30 neerd en met MTBE (3x500 ml) geëxtraheerd. De MTBE-extrac-ten werden verwijderd en het waterige gedeelte werd bijgesteld tot pH 2,1 met fosforzuur en met MTBE (2x500 ml) geëxtraheerd. Het MTBE-extract van het aangezuurde waterige gedeelte werd onder vacuüm geëxtraheerd, waarbij een olie 35 achterbleef die werd behandeld met water (100 ml) en KOH
(8,5 g) . De verkregen oplossing werd onder vacuüm gecon- ! centreerd, waarbij 24,2 g (31,3%) kalium-(S)-3-cyaan-5-me- 1 1028762- 21 thylhexanoaat werd verkregen. Methyl-(S)-3-cyaan-5-methyl-hexanoaat werd bereid uit kalium-(S)-3-cyaan-5-methylhexa-noaat en met chirale GC geanalyseerd die een enantiomere zuiverheid van 99,1% e.e. aangaf.
5 ‘H-NMR (D20, 400 MHz): 5 0,75-0,78 (m, 6H), 1,18-1,25 (m, 1H), 1,43-1,50 (m, 1H), 1,53-1,68 (m, 1H) , 2,28-2,38 (d, 2H, J=6,5 Hz), 2,86-2,93 (m, 1H).
VOORBEELD 5 10 Bereiding van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit 2-iso-butylsuccinonitril met NIT-102 C2 onder een stikstofatmosfeer
Een op 30°C gehouden dubbelwandig reactievat van 125 ml werd gevuld met 2-isobutylsuccinonitril (6,53 g), NIT-15 102 C2 (2,61 g) en 120 g reactiebuffer en met stikstof ge spoeld. Het verkregen mengsel werd 24 uur geroerd en vervolgens gedecanteerd in een glazen fles van 250 ml, waarbij de katalysator in het reactievat achterbleef. De reactie werd herhaald door het vat dat de gebruikte buffer be-20 vatte, opnieuw te vullen met 2-isobutylsuccinonitril (6,53 g) en 120 g reactiebuffer, met stikstof te spoelen en het verkregen mengsel 24 uur te roeren. Reactiemonsters (0,1 ml) werden gemengd met 0,4 ml wa-ter:methanol:trifluorazijnzuur (60:40:0,09, v/v/v) en door 25 HPLC op een Symmetry1” C8-kolom (150x3,9 mm) die op 30°C werd gehouden, geanalyseerd. De kolom werd geëlueerd met water:methanol:trifluorazijnzuur (60:40:0,09, v/v/v) en er werd gedetecteerd met een brekingsindexdetector.
In totaal vijftig ladingsgewijze reacties werden uit-30 gevoerd met katalysatorhergebruik. Productmengsels van twee opeenvolgende ladingsgewijze reacties werden gecombineerd en geëxtraheerd met ethylacetaat (2x150 ml). Het waterige gedeelte werd vervolgens bijgesteld tot een pH van 2 met 4 M HC1 en met ethylacetaat (2x150 ml) geëxtraheerd. 35 De ethylacetaatextracten van het aangezuurde waterige gedeelte werden gecombineerd, op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd, 1028762- 22 waarbij (S)-CMHA werd verkregen. In totaal 160,8 g (43,2% opbrengst) (S)-CMHA werd verkregen uit vijftig ladingsge-wijze reacties. Beginsnelheden voor reacties één, zesentwintig en vijftig waren respectievelijk 14,8, 17,4 en 5 15,1 mM (S)-CMHA/h. Analyse met chirale GC van het methy- lesterderivaat van (S)-CMHA geïsoleerd uit ladingsgewijze reacties 39 tot 50 gaf een gemiddelde enantiomere zuiverheid van 99,0% e.e. aan.
10 VOORBEELD 6
Bereiding van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit 2-isobu-tylsuccinonitril met NIT-102 C2 onder omgevingsatmosfeer
Een reeks ladingsgewijze reacties voor de omzetting van 2-isobutylsuccinonitril in (S)-CMHA met gebruikmaking 15 van NIT-102 C2 werd uitgevoerd op de in voorbeeld 5 bè-schreven wijze, behalve dat de reacties werden uitgevoerd onder omgevingsatmosfeer, in plaats van een stikstofatmos-feer. Reactiemonsters werden op de in voorbeeld 5 beschreven wijze mét HPLC geanalyseerd.
20 In totaal vijftig ladingsgewijze reacties werden uit gevoerd met katalysatorhergebruik onder omgevingsatmosfeer. Beginreactiesnelheden die werden bepaald voor monsters die na vier uur werden genomen, waren respectievelijk 14,2, 13,2 en 9,3 mM (S)-CMHA/h voor respectievelijk 25 reacties één, zesentwintig en vijftig.
VOORBEELD 7
Bereiding van iert-butylammonium-(S)-3-cyaan-5-methyl- hexaan 30 Productmengsels van de omzetting van 2-isobutylsucci nonitril in (S)-CMHA (voorbeeld 6, reacties 37-44) werden gecombineerd en geëxtraheerd met ethylacetaat (2x250 ml) . De ethylacetaatextracten werden gedroogd op watervrij mag-nesiumsulfaat, gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd, 35 waarbij een olie (32,5 g, 62,2% opbrengst) werd verkregen die hoofdzakelijk (R)-2-isobutylsuccinonitril was. Het waterige gedeelte werd bijgesteld tot pH 2 met 4 M HC1 en 1028762- 23 met ethylacetaat (2x250 ml) geëxtraheerd. De ethylacetaat-extracten werden geconcentreerd tot een volume van 470 ml en vervolgens geroerd, terwijl tert-butylamine (15,9 ml, 151,5 mmol) druppelsgewijs werd toegevoegd. Het witte 5 kris-tallijne zout dat werd gevormd, werd door filtreren verzameld en gedurende de nacht aan de lucht gedroogd, waarbij 30,0 g tert-butylammonium-(S)-3-cyaan-5-methyl-hexanoaat werd verkregen. Methyl-(S)-3-cyaan-5-methylhexa-noaat werd bereid uit t-butylammonium-(S)-3-cyaan-5-me-10 thylhexanoaat en met chirale GC geanalyseerd, wat een enantiomere zuiverheid van 99,5% e.e. aangaf.
1H-NR (CDC13, 400 MHz): δ 0,90-0, 94 (m, 6H) , 1,26-1,32 (m, 10H), 1,54-1,61 (m, 1H), 1,78-1,88 (m, 1H), 2,30-2,35 (m, 1H), 2,43-2,50 (m, 1H), 2,96-3,04 (m, 1H).
15 VOORBEELD 8
Bereiding van (S)-3-aminomethyl-5-methylhexaanzuur uit kalium- (S)-3-cyaan-5-methylhexanoaat
Een mengsel van kalium-(S)-3-cyaan-5-methylhexanoaat 20 (20 g, 103,5 mmol), water (50 ml), 45% KOH (12 g) , isopro- panol (12 g) en Raney-nikkel werd gedurende de nacht in een Parr-schudapparaat onder 50 psi waterstof geschud. Het mengsel werd gefiltreerd, tot ongeveer 50°C verwarmd, met azijnzuur (6,5 ml) behandeld en gedurende de nacht bij ka-25 mertemperatuur geroerd. Het mengsel werd vervolgens tot iets boven pH 7 bijgesteld met 45% KOH en onder vacuüm geconcentreerd om het grootste gedeelte van de isopropanol te verwijderen. Isopropanol (20 ml) werd aan het mengsel toegevoegd dat vervolgens werd aangezuurd met azijnzuur, 30 gedurende de nacht bij kamertemperatuur werd geroerd en werd gefiltreerd, waarbij 4,3 g (S)-3-aminomethyl-5-me-thylhexaanzuur als een witte kristallijne vaste stof werd verkregen. De enantiomere zuiverheid werd bepaald en bleek 100% e.e te zijn door het bereiden van een derivaat van 35 (S)-3-aminomethyl-5-methylhexaanzuur met gebruikmaking van
Marfey's reagens (Na-(2,4-dinitro-5-5-fluorfenyl)-L-ala-nineamide) en te analyseren door middel van HPLC op een 1028762- 24 BDS Hypersil C18-kolom (250x4,5 mm, 5μ) waarbij werd geë-lueerd met acetonitril:1% triëthylamine (pH 3) (38:62, v/v) .
5 VOORBEELD 9
Bereiding van (S)-3-aminomethyl-5-methylhexaanzuur uit t-butylammonium-(S)-3-cyaan-5-methylhexanoaat
Een mengsel van t-butylammonium-(S)-3-cyaan-5-methyl-hexanoaat (26 g, 113,9 mmol), water (48,8 ml), ethanol 10 (35,8 ml), KOH (7,2 g, 91% vlokken) en Sponge Nickel™ (A-7000, 16,3 g Water nat, Activated Metals & Chemicals,
Ine., Sevierville, TN) werd gedurende de nacht in een Parr-schudapparaat onder 50 psi waterstof .geschud. Het mengsel werd gefiltreerd (celiet) en de filterkoek werd 15 met water (10 ml) en ethanol (5 ml) gewassen. Azijnzuur (9,4 ml) werd aan het filtraat toegevoegd en het verkregen mengsel werd gedurende de nacht bij 4°C geroerd. Het product werd gefiltreerd, met 10 ml isopropylalcohol gespoeld en onder vacuüm gedroogd, waarbij 11,1 g (61%) witte vaste 20 stof werd verkregen. Een gedeelte (10,0 g) van dit materiaal werd gekristalliseerd uit een l:l-mengsel van isopropylalcohol en water, waarbij 8,8 g (S)-3-aminomethyl-5-me-thylhexaanzuur in 100% ee. werd verkregen.
25 VOORBEELD 10
Racemisatie van (R)-2-isobutylsuccinonitril met gebruikmaking van DBU
De racemisatie van (R)-2-isobutylsuccinonitril werd uitgevoerd op materiaal dat was teruggewonnen uit een bio-30 logische omzetting van racemisch 2-isobutylsuccinonitril met NIT-102 C2. Een mengsel van (R)-2-isobutylsuccinoni-tril (1,36 g, 10 mmol, 69% ee), tolueen (5 ml) en 1,8-di-azabicyclo[5.4.0]undec-7-een (DBU, 0,076 g, 5 mmol) werd 2 uur gerefluxt. Water (10 ml) werd aan de reactie toege-35 voegd en het verkregen mengsel werd met ethylacetaat (2x10 ml) geëxtraheerd. De gecombineerde organische extracten werden achtereenvolgens met 5% HC1 (20 ml) en ver- 11028762- 25 zadigd waterig natriumchloride (20 ml) gewassen, op water-vrij magnesiumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd, waarbij racemisch 2-isobutylsuccinoni-tril (1,14 g, 84%). werd verkregen. Enantiomere zuiverheid 5 werd bepaald door middel van GC met gebruikmaking van een Chiraldex™ G-TA-kolom (30 mx0,25 mm inwendige diameter, filmdikte 125 micron).
VOORBEELD 11 10 Racemisatie van (R)-2-isobutylsuccinonitril met gebruikmaking van Amberlite® IRA-400
Amberlite® IRA-400-hars (1 g nat gewicht, Rohm & Haas, Philadelphia, PA) werd 10 minuten met 5% NaOH (10 ml) geroerd en met water gewassen totdat het waswater 15 neutraal was. Ethanol (25 ml) en (R)-2-isobutylsuccinoni-tril (69% ee) werden aan de hars toegevoegd en het verkregen mengsel werd 2 uur gerefluxt. Het reactiemengsel werd gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd. Het residu werd opgenomen in ethylacetaat (25 ml) en met water (3x100 20 ml) gewassen. De organische fase werd op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en onder vacuüm geconcentreerd, waarbij racemisch 2-isobutylsuccinonitril (0,81 g, 81%) werd verkregen.
1028762-
Claims (13)
1. Werkwijze voor het bereiden van een verbinding met 10 formule I: 1COOH R2 2/ 15 j[ 1 ch3 ^V^^CN R1 . ' 20 waarin C3 een (S)-configuratie heeft; R1 waterstof, (Ci-C6)alkyl of fenyl is; en R2 (Ci-C8) alkyl, (C2-C8) alkenyl, (C3-C8) cycloalkyl, 25 -O(Ci-Ce) alkyl, -CH2-CH2-0- (Ci-C6) alkyl, (Ci-C6) alkyl-OH, -fenyl-(Ci-Ce) alkyl-OH, -fenyl-O- (Ci-Ce) alkyl, fenyl of gesubstitueerd fenyl is; met dien verstande, dat als R2 methyl is, R1 waterstof, (Ci-Cö)alkyl of fenyl is; 30 die de volgende stappen omvat: (a) het in een reactiemedium in contact brengen van een verbinding met formule II: 10287Θ2- lCN R2 l/ 5. n CH3 xn R? 10 met een enzymkatalysator met nitrilaseactiviteit; en (b) het isoleren van de (3S)-isomeer van de verbinding met formule I uit het reactiemengsel en eventueel het 15 terugwinnen van onveranderde (3i?)-isomeer van de verbinding met formule II.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de teruggewonnen onveranderde (3R)-isomeer van de verbinding met formule II van stap (b) wordt geracemiseerd tot een race- 20 maat van de verbinding met formule II door de (3R)-isomeer te verwarmen met een base in aanwezigheid van een organisch oplosmiddel.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij stap (a) wordt herhaald met gebruikmaking van het racemaat dat ge- 25 racemiseerd is uit de teruggewonnen onveranderde (31?) -isomeer van stap (b).
4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de enzymkatalysator is gekozen uit de groep bestaande uit NIT-101, NIT-102, NIT-103 en nitrilase uit Arabidopsis thaliana.
5. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het reac tiemengsel is samengesteld uit gedestilleerd water, of water dat gebufferd is op een pH in het traject van ongeveer 5,0 tot ongeveer 10,0.
6. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de verbin- 35 ding met formule I (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur is, de verbinding met formule II racemisch 2-isobutylsuccino- ‘1028762- nitril is en de teruggewonnen onveranderde isomeer van stap (b) (R)-2-succinonitril is.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het teruggewonnen onveranderde (R)-2-isobutylsuccinonitril van stap 5 (b) wordt geracemiseerd tot racemisch 2-isobutylsuccinoni tril door verwarming met een base in een oplosmiddel.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij stap (a) wordt herhaald met gebruikmaking van het racemische 2-isobutylsuccinonitril dat geracemiseerd is uit het terugge- 10 wonnen onveranderde (R)-2-isobutylsuccinonitril van stap (b) .
9. Werkwijze voor het bereiden van (S)-3-(amino-ethyl)-5-methylhexaanzuur (pregabaline) die de volgende stappen omvat: 15 > (a) het in een reactiemedium in contact brengen van 2-isobutylsuccinonitril met een enzymkatalysator met ni-trilaseactiviteit; (b) het isoleren van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur uit het reactiemedium; 20 (c) het omzetten van (S)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur in een zuurzout; en (d) het hydrogeneren van het zuurzout om (S)-3-(ami-nomethyl)-5-methylhexaanzuur (pregabaline) te vormen.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij onveran- 25 derd (R)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur wordt teruggewonnen uit het reactiemedium van stap (a) .
11. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het onveranderde {R)-3-cyaan-5-methylhexaanzuur van stap (a) wordt geracemiseerd door verwarming met een base in de aanwezig- 30 heid van een organisch oplosmiddel om racemisch 2-isobutylsuccinonitril te vormen en stap (a) wordt herhaald met gebruikmaking van dit racemische 2-isobutylsuccinonitril.
12. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij de enzymkatalysator een nitrilase in de vorm van gehele microbiële 35 cellen, gepermeabiliseerde microbiële cellen, extracten van microbiële cellen, gedeeltelijk gezuiverde enzymen, 1028762" gezuiverde enzymen of een op een drager geïmmobiliseerde enzymkatalysator is.
13. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij de enzymkatalysator wordt gekozen uit de groep bestaande uit 5 NIT-101, NIT-102, NIT-103 en nitrilase uit Arabidopsis thaliana. •k k’k k k 1028762"
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56213304P | 2004-04-14 | 2004-04-14 | |
| US56213304 | 2004-04-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL1028762A1 NL1028762A1 (nl) | 2005-10-17 |
| NL1028762C2 true NL1028762C2 (nl) | 2006-07-25 |
Family
ID=34962755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1028762A NL1028762C2 (nl) | 2004-04-14 | 2005-04-13 | Stereoselectieve biologische omzetting van alifatische dinitrillen in cyaancarbonzuren. |
Country Status (44)
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003167A1 (en) | 1996-07-24 | 1998-01-29 | Warner-Lambert Company | Isobutylgaba and its derivatives for the treatment of pain |
| AT412092B (de) * | 2003-02-27 | 2004-09-27 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Verfahren zur herstellung chiraler alpha-hydroxycarbonsäuren durch enzymatische hydrolyse von chiralen cyanhydrinen |
| WO2006108151A1 (en) | 2005-04-06 | 2006-10-12 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Crystalline forms of pregabalin |
| US7488846B2 (en) | 2005-04-11 | 2009-02-10 | Teva Pharmaceuical Industries Ltd. | Pregabalin free of lactam and a process for preparation thereof |
| ATE523484T1 (de) | 2005-05-10 | 2011-09-15 | Teva Pharma | Optische lösung a us 3-carbamoylmethyl-5-methyl- hexansäure |
| EP1879853A1 (en) | 2005-05-10 | 2008-01-23 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd | Pregabalin free of isobutylglutaric acid and a process for preparation thereof |
| ATE486841T1 (de) | 2005-05-10 | 2010-11-15 | Teva Pharma | Verfahren zur herstellung von pregabalin und salzen daraus |
| CA2619472A1 (en) | 2005-09-19 | 2007-03-29 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Chiral 3-carbamoylmethyl-5-methyl hexanoic acids, key intermediates for the new synthesis of (s)-pregabalin |
| US20070141684A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-21 | Pfizer Inc | Preparation of gamma-amino acids having affinity for the alpha-2-delta protein |
| US7462738B2 (en) | 2006-05-24 | 2008-12-09 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Processes for the preparation of R-(+)-3-(carbamoyl methyl)-5-methylhexanoic acid and salts thereof |
| WO2007143113A2 (en) * | 2006-05-31 | 2007-12-13 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | The use of enzymatic resolution for the preparation of intermediates of pregabalin |
| EP1881077A1 (en) * | 2006-07-19 | 2008-01-23 | Solvay Organics GmbH | Process for the production of fluorine containing a-hydroxy carboxylic acids |
| BRPI0803092A2 (pt) | 2007-03-22 | 2011-08-30 | Teva Pharma | sìntese de (s)-(+)-3-(aminometil)-5-metil ácido hexanóico, (s)-pregabalina |
| WO2009087650A2 (en) * | 2007-10-15 | 2009-07-16 | V.B. Medicare Pvt. Ltd. | A novel process for synthesis of pregabalin from substituted cyclopropane intermediate and a process for enzymatic resolution of racemic pregabalin |
| US8546112B2 (en) | 2008-05-21 | 2013-10-01 | Sandoz Ag | Process for the stereoselective enzymatic hydrolysis of 5-methyl-3-nitromethyl-hexanoic acid ester |
| US8614081B2 (en) | 2009-07-23 | 2013-12-24 | Codexis, Inc. | Nitrilase biocatalysts |
| WO2011141923A2 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Lupin Limited | Improved synthesis of optically pure (s) - 3-cyano-5-methyl-hexanoic acid alkyl ester, an intermediate of (s)- pregabalin |
| US8604062B2 (en) * | 2011-10-20 | 2013-12-10 | Hoffman-La Roche Inc. | Process for the preparation of isoxazolyl-methoxy nicotinic acids |
| US10023885B2 (en) | 2012-11-07 | 2018-07-17 | Hikal Limited | Process for the preparation of pregabalin |
| WO2016075082A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Sandoz Ag | Stereoselective reductive amination of alpha-chiral aldehydes using omega-transaminases for the synthesis of precursors of pregabalin and brivaracetam |
| CN105017072B (zh) * | 2015-06-30 | 2017-10-03 | 河北诚信有限责任公司 | 异丁基琥珀腈的合成方法 |
| CN105176955B (zh) | 2015-08-27 | 2018-11-02 | 浙江工业大学 | 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用 |
| CN108424900B (zh) * | 2018-02-09 | 2020-11-03 | 浙江工业大学 | 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用 |
| CN114164197B (zh) * | 2020-01-13 | 2023-08-18 | 浙江工业大学 | 一种热稳定性和活力提高的腈水解酶突变体及其应用 |
| CN113651717A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-16 | 浙江工业大学 | 一种光学纯异丁基丁二腈的消旋方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5593871A (en) * | 1990-09-20 | 1997-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles |
| JP3218133B2 (ja) * | 1993-02-03 | 2001-10-15 | 三菱レイヨン株式会社 | フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
| US5637767A (en) | 1995-06-07 | 1997-06-10 | Warner-Lambert Company | Method of making (S)-3-(aminomethyl)-5-methylhexanoic acid |
| US5858736A (en) | 1996-05-17 | 1999-01-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Preparation of lactams from aliphatic α,ω-dinitriles |
| EP1032555B1 (en) | 1997-10-27 | 2006-04-12 | Warner-Lambert Company Llc | Cyclic amino acids and derivatives thereof useful as pharmaceutical agents |
| US6642398B2 (en) | 1999-06-10 | 2003-11-04 | Warner-Lambert Company | Mono-and disubstituted 3-propyl gamma-aminobutyric acids |
| US6551804B2 (en) | 1999-07-12 | 2003-04-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing 4-cyanopentanoic acid |
| US20040014195A1 (en) * | 1999-12-29 | 2004-01-22 | Diversa Corporation | Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6891059B2 (en) | 2000-01-27 | 2005-05-10 | Warner-Lambert Company | Asymmetric synthesis of pregabalin |
| FR2824823A1 (fr) * | 2001-05-21 | 2002-11-22 | Aventis Animal Nutrition Sa | Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques |
| MXPA05013754A (es) * | 2003-06-19 | 2006-03-08 | Pfizer Prod Inc | Una preparacion biocatalitica del acido 1-cianociclohexanoacetico. |
-
2005
- 2005-01-04 UA UAA200610837A patent/UA82292C2/uk unknown
- 2005-04-01 RS RSP-2009/0451A patent/RS50994B/sr unknown
- 2005-04-01 ME MEP-2009-320A patent/ME01107B/me unknown
- 2005-04-01 US US10/599,899 patent/US7727749B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-01 AP AP2006003764A patent/AP2301A/xx active
- 2005-04-01 BR BRPI0509908-0A patent/BRPI0509908A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-04-01 JP JP2007507859A patent/JP4051082B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-01 AU AU2005233371A patent/AU2005233371B2/en not_active Ceased
- 2005-04-01 ES ES05718347T patent/ES2331140T3/es active Active
- 2005-04-01 SI SI200530805T patent/SI1745136T1/sl unknown
- 2005-04-01 EP EP05718347A patent/EP1745136B1/en active Active
- 2005-04-01 DE DE602005017027T patent/DE602005017027D1/de active Active
- 2005-04-01 CN CN2005800109287A patent/CN1942587B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-01 DO DO2005000055A patent/DOP2005000055A/es unknown
- 2005-04-01 KR KR1020067021286A patent/KR100887777B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-04-01 WO PCT/IB2005/000873 patent/WO2005100580A1/en active Application Filing
- 2005-04-01 GE GEAP20059657A patent/GEP20084530B/en unknown
- 2005-04-01 NZ NZ549698A patent/NZ549698A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-04-01 PT PT05718347T patent/PT1745136E/pt unknown
- 2005-04-01 AT AT05718347T patent/ATE445019T1/de active
- 2005-04-01 CA CA2563307A patent/CA2563307C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-01 EA EA200601574A patent/EA010305B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-04-01 DK DK05718347T patent/DK1745136T3/da active
- 2005-04-01 PL PL05718347T patent/PL1745136T3/pl unknown
- 2005-04-12 HN HN2005000162A patent/HN2005000162A/es unknown
- 2005-04-12 AR ARP050101423A patent/AR048690A1/es not_active Application Discontinuation
- 2005-04-12 UY UY28851A patent/UY28851A1/es not_active Application Discontinuation
- 2005-04-12 PE PE2005000405A patent/PE20060252A1/es not_active Application Discontinuation
- 2005-04-12 MY MYPI20051622A patent/MY144296A/en unknown
- 2005-04-13 PA PA20058629801A patent/PA8629801A1/es unknown
- 2005-04-13 NL NL1028762A patent/NL1028762C2/nl not_active IP Right Cessation
- 2005-04-13 TW TW094111638A patent/TWI304095B/zh not_active IP Right Cessation
- 2005-04-13 GT GT200500086A patent/GT200500086A/es unknown
- 2005-04-14 SV SV2005002085A patent/SV2005002085A/es active IP Right Grant
-
2006
- 2006-09-06 IL IL177918A patent/IL177918A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-09-07 ZA ZA200607476A patent/ZA200607476B/en unknown
- 2006-10-10 EC EC2006006917A patent/ECSP066917A/es unknown
- 2006-10-12 CR CR8686A patent/CR8686A/es unknown
- 2006-10-13 MA MA29391A patent/MA28536B1/fr unknown
- 2006-10-13 TN TNP2006000329A patent/TNSN06329A1/fr unknown
- 2006-11-10 NO NO20065181A patent/NO335624B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-25 HK HK07110403.3A patent/HK1105215A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-21 HR HR20090562T patent/HRP20090562T1/xx unknown
- 2009-10-30 CY CY20091101131T patent/CY1109556T1/el unknown
-
2010
- 2010-04-20 US US12/763,570 patent/US8304252B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-06-22 CR CR20110356A patent/CR20110356A/es unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL1028762C2 (nl) | Stereoselectieve biologische omzetting van alifatische dinitrillen in cyaancarbonzuren. | |
| Holt et al. | Enantioselective enzyme-catalysed synthesis of cyanohydrins | |
| JPH09503658A (ja) | 酵素触媒作用アシル化による１級及び２級アミンのラセミ分割 | |
| Felfer et al. | The substrate spectrum of mandelate racemase: minimum structural requirements for substrates and substrate model | |
| JPWO2011078172A1 (ja) | 光学活性３−置換グルタル酸モノアミドの製造法 | |
| FI106266B (fi) | Stereospesifisten GABA-T-inhibiittoreiden raseemisen seoksen entsymaattinen erotus | |
| JP4129077B2 (ja) | アシル化されたアミノ酸エステルおよび光学活性アミノ酸エステルの製造法、ならびに光学活性アミノ酸エステルおよびｎ−アシルアミノ酸エステル | |
| Vink et al. | Nitrile hydrolysis activity of Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 whole cells | |
| JP4577513B2 (ja) | ２−アルキルシステインアミド又はその塩、並びに、それらの製造方法及び用途 | |
| MXPA06010259A (en) | Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids | |
| US11884623B2 (en) | Process for the preparation of (R)-4-propyl pyrrolidine-2-one, a key intermediate for synthesis of brivaracetam | |
| JP5595400B2 (ja) | 光学活性３−置換グルタル酸モノアミドの製造法 | |
| Sigmund et al. | Enantioselective enzymatic aminolysis of a racemic 2-isoxazolylacetate alkyl ester | |
| Leemans Martin | Design and optimization of (chemo-) enzymatic processes for the synthesis of hydroxynitriles and their derivatives | |
| JP2000086605A (ja) | Ｌ―アリシンアセタ―ルの製造法 | |
| JP3659123B2 (ja) | ４−ハロゲノ−３−アルカノイルオキシブチロニトリルの光学分割方法 | |
| JPWO2008105493A1 (ja) | 光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| Klempier et al. | Nitrilase‐and Nitrile Hydratase‐Catalyzed Enantioselective Preparation of Non‐Proteinogenic Amino Acids | |
| WO2004007741A1 (ja) | 光学活性β−アミノニトリル化合物及びその対掌体アミド化合物の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AD1A | A request for search or an international type search has been filed | ||
| RD2N | Patents in respect of which a decision has been taken or a report has been made (novelty report) |
Effective date: 20060323 |
|
| PD2B | A search report has been drawn up | ||
| MM | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 20180501 |