KR20080036060A - 프레가발린의 중간체의 제조에 효소 분할을 이용하는 방법 - Google Patents

프레가발린의 중간체의 제조에 효소 분할을 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, (3S)-시아노-5-메틸헥산산 및 이의 염 그리고 R-(+)-3-(카르바모일메틸)-5-메틸헥산산 및 이의 염을 포함하는, 프레가발린의 중간체를 제조하기 위해 효소 분할을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

프레가발린의 중간체의 제조에 효소 분할을 이용하는 방법{THE USE OF ENZYMATIC RESOLUTION FOR THE PREPARATION OF INTERMEDIATES OF PREGABALIN}
관련 출원 상호 참조
본 출원은 본원에 참고로 인용되어 있는, 미국 가출원 제60/809,978호(2006년 5월 31일 출원됨), 제60/831,591호(2006년 7월 17일 출원됨), 제60/836,730호(2006년 8월 9일 출원됨), 제60/860,360호(2006년 11월 20일 출원됨), 제60/879,870호(2007년 1월 10일 출원됨), 제60/919,201호(2007년 3월 20일 출원됨) 및 제60/926,059호(2007년 4월 23일 출원됨)를 기초로 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은, (3S)-시아노-5-메틸헥산산 및 이의 염 그리고 R-(+)-3-(카르바모일메틸)-5-메틸헥산산 및 이의 염을 포함하는, 프레가발린의 중간체를 제조하기 위해 효소 분할을 이용하는 방법을 포함한다.
발명의 배경
하기 화학 구조를 갖는 화합물인 (S)-프레가발린, 즉, (S)-(+)-3-(아미노메틸)-5-메틸헥산산은 γ-아미노 부티르산 또는 (S)-3-이소부틸 GABA로도 공지되어 있다:
Figure 112008008287647-PCT00001
(S)-프레가발린은 GAD(L-클루탐산 데카르복실라제)를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. (S)-프레가발린은, 발작에 대해 투여량 의존적인 보호 효과를 가지며 CNS-활성 화합물이다. (S)-프레가발린은, 뇌의 시냅스의 30%에서 방출되는, 뇌의 주요한 억제성 신경 전달 물질 중 하나인 GABA의 생성을 촉진하는 GAD를 활성화하기 때문에 항경련 요법에서 유용하다. (S)-프레가발린은 진통, 항경련 및 불안 완화 활성을 갖는다.
(S)-프레가발린의 균형적 제조는, 미국 특허 5,616,793호 및 문헌[DRUGS OF THE FUTURE, 24 (8), 862-870 (1999)]에 개시되어 있으며, 하기 반응식 1에 기술된 바와 같이, 중간체 (±)3-(카르바모일메틸)-5-메틸헥산산("CMH" 또는 "CMH-라세미체")을 얻고, 이어서 이를 광학 분할하여 R-(+)3-(카르바모일메틸)-5-메틸헥산산("R-CMH")을 제공한 다음, 이를 (S)-프레가발린으로 전환함으로써 실시한다:
Figure 112008008287647-PCT00002
다른 균형적 공정은 미국 특허 5,637,767호에 기재되어 있으며, 여기서 (S)-프레가발린의 제조는, 하기 구조:
Figure 112008008287647-PCT00003
의 생성물 II를 가수분해 및 탈카르복실화하여, 하기 구조:
Figure 112008008287647-PCT00004
의 3-시아노-5-메틸헥산산 에틸 에스테르("II-CN-모노에스테르")를 제공하고, 이것을 더 수소화하여 하기 구조:
Figure 112008008287647-PCT00005
의 라세미 프레가발린("PRG-라세미체")을 얻은 다음, 이를 광학 분할하여 프레가발린의 S-거울상이성체를 얻음으로써 성취할 수 있다.
미국 공개 공보 2005/0283023호는 중간체 (3S)-시아노-5-메틸헥산산["(S)-프레가발린 니트릴" 또는 "S-PRG-니트릴"]의 제조를 기술하는데, 이 제조는 시아노-디알킬에스테르를 효소 속도론적 분할하고, 이어서 분할된 거울상이성체를 여러 가지 중간체로 전환한 다음, 이를 S-PRG-니트릴로 전환함에 의한다.
프레가발린의 중간체, 특히 S-PRG-니트릴 및 이의 염, 그리고 R-CMH 및 이의 염의 제조를 위한 추가의 공정이 필요하다.
발명의 개요
한 구체예에서, 본 발명은 완충제 및 임의로 염기의 존재 하에 하기 화학식 II의 에스테르를 효소 가수분해하는 것을 포함하는, 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00006
Figure 112008008287647-PCT00007
상기 화학식들에서 R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; M은 금속이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 a) 하기 화학식 II의 에스테르, 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 배합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 b) 상기 혼합물을 약 5℃∼약 60℃의 온도에서 유지하여 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 얻는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다.
Figure 112008008287647-PCT00008
Figure 112008008287647-PCT00009
상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; M은 금속이다.
다른 구체예에서, 본 발명은,
a) 하기 화학식:
Figure 112008008287647-PCT00010
의 (±)-2-카르복시알킬-3-시아노-5-메틸 헥산산 알킬 에스테르를 알칼리 수산화물과 배합함으로써 탈카르복실화하여 하기 화학식 II-CN-모노에스테르의 에스테르를 얻는 단계;
b) 하기 화학식 II-CN-모노에스테르의 얻어진 화합물을 단리하는 단계;
c) 하기 화학식 II-CN-모노에스테르의 화합물, 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 배합하여 혼합물을 얻는 단계;
d) 상기 혼합물을 약 5℃∼약 60℃의 온도에서 유지하여 하기 화학식 I-CN의 화합물을 얻는 단계
를 포함하는, 하기 화학식 I-CN의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00011
Figure 112008008287647-PCT00012
상기 식들에서 R'는 C1 -6 히드로카르빌이고; M은 금속이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물을 효소적으로 에스테르화하는 것을 포함하는, 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00013
Figure 112008008287647-PCT00014
상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물과 알콜 또는 에스테르와 효소를 배합하여 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 얻는 것을 포함하는, 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00015
Figure 112008008287647-PCT00016
상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 임의의 전술한 공정에 의해 화학식 I 또는 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 제조하고, 이 프레가발린 중간체를 (S)-프레가발린으로 전환하는 것을 포함하는, (S)-프레가발린의 제조 방법을 포함한다.
상세한 설명
본원에 사용된 바와 같이, 달리 정의하지 않은 한, 용어 "PRG"는 프레가발린을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 정의하지 않은 한, 용어 "라세미체"는 동량의 거울상이성체들을 함유하는 혼합물을 가리킨다.
본 발명은 효소 분할을 통한 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함하며, 이 방법은 속도론적 분할 공정이다. 바람직하게는, 본 발명은 효소 분할을 통한, 프레가발린 중간체들인 S-PRG-니트릴 및 이의 염, 그리고 R-CMH 및 이의 염의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법들을 하기의 반응식 2로 도시할 수 있다:
Figure 112008008287647-PCT00017
상기 반응식에서, 분할, 즉, 효소 분할은 가수분해 또는 에스테르화에 의해 실시될 수 있다.
효소가 이의 활성 부위에 존재하는 아미노산 때문에 작용이 매우 특이적임은 널리 공지되어 있다. 또한, 효소는 키랄성이고 비대칭 결합 부위를 가지며, 이 비대칭성은 효소 입체 특이성의 원인이 되며, 이로써 다른 거울상이성체에 비해 한 거울상이성체에 결합하려는 선호도가 생성된다. 또한, 효소는 이의 구조가 반응 동안 변하지 않는다는 사실 때문에 재활용될 수 있으며, 따라서 효소의 이용은 공정을 더 용이하게 하는데, 반응 혼합물로부터 효소가 단리되는 것이 간단하기 때문이 다.
바람직하지 않은 거울상이성체의 재활용은 용이한 반면, 프레가발린의 바람직하지 않은 거울상이성체의 재활용은 매우 어렵기 때문에, 프레가발린 라세미체 대신에 상기 중간체들에서 광학 분할을 실시하는 것이 현저하게 이롭다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 반응식 3으로 도시할 수 있는, 화학식 I의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00018
상기 반응식에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; M은 금속이고, 여기서 금속은 완충제 또는 염기에 의해 제공된다. 바람직하게는, CH2CONR"2는 CH2CONH2이다. 바람직하게는, CH2CO2R'는 CH2CO2Me, CH2CO2Et, CH2CO2- 비닐, CH2CO2- 프로필, 또는 CH2CO2- 이소프로필이고, 더 바람직하게는 CH2CO2Me, CH2CO2Et, 또는 CH2CO2- 비닐이다. 가장 바람직하게는, R은 CN 또는 CH2CONH2이다. 바람직하게는, C1 -6 히드로카르빌은 C1 -3 히드로카르빌이고, 더 바람직하게는 에틸 또는 메틸이다. 바람직하게는, M은 알칼리 금속이고, 더 바람직하게는 칼륨 또는 나트륨이다.
상기 방법은, (a) 화학식 II의 에스테르와 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 배합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 약 5℃∼약 60℃의 온도에서 유지하여 화학식 I의 프레가발린 중간체를 얻는 단계를 포함하며, 여기서 금속은 완충제 또는 염기에 의해 제공된다. 완충제 및 염기는 바람직하게는 동일한 금속을 함유한다.
상기 방법은 가수분해 효소, 즉, 화학식 II의 에스테르의 오직 하나의 거울상이성체와 반응하여 화학식 I의 키랄성 프레가발린 중간체를 제공함으로써 입체선택성 가수분해 반응을 실시하는 효소를 사용한다. 따라서, 화학식 I의 키랄성 프레가발린 중간체는 속도론적 분할을 통해 선택적으로 생성될 수 있다.
R이 CN이고 R'가 에틸인 경우, 화학식 II의 화합물은 하기 구조의 (±)-3-시아노-5-메틸헥산산-에틸 에스테르("II-CN-모노에스테르")이며, R이 CN이고 M이 Na인 경우, 화학식 I의 화합물은 하기 구조의 S-PRG-니트릴 나트륨("I-CN-Na")이다:
Figure 112008008287647-PCT00019
Figure 112008008287647-PCT00020
R이 CH2CONH2이고 R'가 에틸인 경우, 화학식 II의 화합물은 하기 구조의 (±)3-(카르바모일메틸)-5-메틸헥산산 에틸 에스테르("II-아미드-모노에스테르")이며, R이 CH2CONH2이고 M이 Na인 경우, 화학식 I의 화합물은 하기 구조의 R-CMH-나트륨("I-아미드-Na")이다:
Figure 112008008287647-PCT00021
Figure 112008008287647-PCT00022
바람직하게는, 가수분해 효소는 에스테라제, 리파제 또는 프로테아제이다. 바람직하게는, 에스테라제는 이 콜라이(E. Coli) 중의 에스테라제 PF2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS1 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 CLEA 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS4 재조합체, 돼지 간 유래의 에스테라제 PL, 이 콜라이 중의 에스테라제 SD 재조합체, 에스테라제 RO, 및 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzae) 중의 에스테라제 TL 재조합체로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 리파제는 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 리파제, 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 유래의 리파제 P2, 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) 유래의 리파제 PS, 리조푸 스종(Rhizopus sp .) 유래의 리파제 RS, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas Fluorescens) 유래의 리파제 PF, 페니실리움 카멘베르티(Penicillium camenbertii) 유래의 리파제 PC, 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 P1, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 리파제 AN, 아크로모박터종(Achromobacter sp .) 유래의 리파제 A, 알칼리진스종(Alcaligenes sp .) 유래의 리파제 AS1, 알칼리진스종 유래의 리파제 AS2, 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 유래의 리파제 C2, 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C1, 리파제 리포짐 TL IM, 리파제 리포짐 TL 10OL, 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 리파제 B(CALB), CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 슈도모나스종(Pseudomonas sp .) 유래의 리파제 L-6, 칸디다 안타르크티카 리파제 A(CALA), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제(L-3), USP 등급의 췌장 리파제, 리파제 QLM 및 리파제 TL로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 프로테아제는 키모트립신이다.
더 바람직하게는, 가수분해 효소는 CALB, CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 또는 돼지 간 유래의 에스테라제 PL이다.
일반적으로, 효소는 완충제와 배합하여 사용한다. 완충제는 효소 활성에 적합한 pH를 제공한다. 바람직하게는, 완충제는 약 6∼약 9, 더 바람직하게는 약 6.5∼약 8, 가장 바람직하게는 약 7의 pH를 제공하기에 충분한 양으로 존재한다.
일반적으로, 염기는 단계 a)의 배합물의 pH를 조절하는 데 도움을 주기 위해 첨가된다. 염기는 알칼리 금속의 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염, 또는 알칼리 토금속 수산화물일 수 있다. 바람직하게는, 염기는 알칼리 금속의 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염이다. 더 바람직하게는, 염기는 알칼리 금속 수산화물이고, 가장 바람직하게는 NaOH 또는 KOH이다.
일반적으로, 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 먼저 배합하고, 이어서 화학식 II의 에스테르를 첨가하여 혼합물을 얻는다. 화학식 II의 에스테르는 라세미체 또는 임의의 비율의 거울상이성체들의 혼합물일 수 있다. 공용매는 기질의 가용화를 촉진하기 위해 완충제에 첨가될 수 있다. 적합한 공용매로는 술폭시드, 아미드, 알콜, 케톤 및 니트릴이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 술폭시드는 C2 -4 술폭시드이고, 더 바람직하게는 디메틸술폭시드("DMSO")이다. 바람직하게는, 아미드는 C3 -6 아미드이고, 더 바람직하게는 디메틸포름아미드("DMF")이다. 바람직하게는, 알콜은 C1 -6 알콜이고, 더 바람직하게는 이소프로필 알콜이다. 바람직하게는, 케톤은 C2 -6 케톤이고, 더 바람직하게는 아세톤이다. 바람직하게는, 니트릴은 C1 -5 니트릴이고, 더 바람직하게는 아세토니트릴이다.
바람직하게는, 혼합물을 교반하면서 유지하여 화학식 I의 프레가발린 중간체를 얻는다. 더 바람직하게는, 혼합물은 약 8∼약 32 시간, 좀 더 바람직하게는 약 24 시간 동안 유지한다. 바람직하게는, 혼합물은 약 20℃∼약 27℃, 더 바람직하게는 약 22℃∼약 25℃의 온도에서 교반한다.
화학식 I의 프레가발린 중간체는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 회수할 수 있다. 이러한 방법으로 추출이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
이렇게 제조한 화학식 I의 프레가발린 중간체는 임의로 하기 화학식 I-산의 중간체로 전환될 수 있다:
Figure 112008008287647-PCT00023
상기 화학식에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'은 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이다. 전환은, 화학식 I의 중간체를 HBr, H2SO4, H3PO4 및 HCl로 이루어진 군에서 선택되는 무기산과 배합하는 것을 포함하는 공정으로 실시할 수 있다. 바람직하게는, 무기산은 HCl이다.
이렇게 제조한 화학식 I 또는 화학식 I-산의 프레가발린 중간체는 (S)-프레가발린으로 전환할 수 있다. 상기 전환은, 예를 들어, 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 공개 공보 2007/0073085호 또는 미국 특허 5,637,767호에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, R이 CN인 경우, 화학식 II의 에스테르("H-CN-모노에스테르")는 (±)-2-카르복시알킬-3-시아노-5-메틸 헥산산 알킬 에스테르("PRG-니트릴 디에스테르")를 탈카르복실화하여 제조할 수 있다. 이 방법은 하기 반응식 4 로 도시할 수 있다.
Figure 112008008287647-PCT00024
상기 반응식에서, R'는 C1 -6 히드로카르빌이다. 바람직하게는, C1 -6 히드로카르빌은 C1 -3 히드로카르빌이고, 더 바람직하게는 에틸 또는 메틸이다.
상기 방법은 (a) PRG-니트릴-디에스테르와 알칼리 수산화물을 배합하여 II-CN-모노에스테르를 갖는 혼합물을 얻는 단계; (b) 상기 혼합물로부터 II-CN-모노에스테르를 단리하는 단계를 포함한다.
일반적으로, PRG-니트릴-디에스테르 및 알칼리 수산화물은 용매의 존재 하에 배합한다. 바람직하게는, 상기 용매는 물, 극성 유기 용매, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 극성 유기 용매는 극성 양성자성 유기 용매이다. 바람직하게는, 극성 양성자성 유기 용매는 C1 -5 알콜이다. 바람직하게는, C1-5 알콜은 C1 -3 알콜이고, 더 바람직하게는 C1 -2 알콜이다. 바람직하게는, C1 -2 알콜은 메탄올 또는 에탄올이다.
바람직하게는, 알칼리 수산화물은 수산화칼륨이다.
바람직하게는, PRG-니트릴-디에스테르 및 알칼리 수산화물의 배합물을 가열 하여 PRG-니트릴-디에스테르를 탈카르복실화하고 II-CN-모노에스테르를 갖는 혼합물을 얻는다. 바람직하게는, 상기 배합물은 약 6O℃∼약 180℃, 더 바람직하게는 약 8O℃∼약 140℃의 온도까지 가열한다. 바람직하게는, 상기 배합물은 약 8∼약 24 시간 동안 가열한다.
이렇게 얻은 II-CN-모노에스테르는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 단리할 수 있다. 이러한 방법으로는, 용매를 이용하여 혼합물로부터 II-CN-모노에스테르를 추출하고 용매를 증발시키는 방법이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, II-CN-모노에스테르는, 혼합물을 냉각시키는 단계; 용매를 제거하는 단계; 디클로로메탄("DCM"), 에테르, 아세트산에틸 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 첨가하여 유기상을 얻는 단계; 물을 이용하여 유기상을 추출하는 단계; 및 유기상으로부터 용매를 제거하여 II-CN-모노에스테르의 잔류물을 얻는 단계를 포함하는 공정으로 회수한다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 약 40℃∼약 1O℃의 온도에서 냉각한다. 상기 용매는, 진공 하에 증발시켜 제거할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용매는 DCM이다.
단리된 II-CN-모노에스테르는 하기 구조의 거울상이성체들의 혼합물이다:
Figure 112008008287647-PCT00025
상기 혼합물은 거울상이성체들을 임의의 비율로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 거울상이성체들의 라세미 혼합물이다.
임의로, II-CN-모노에스테르의 단리된 잔류물을 정제할 수 있다. 바람직하게 는, 상기 잔류물을 증류로 정제한다. 바람직하게는, 증류는 약 1∼약 10 mm Hg의 압력 및 약 8O℃∼약 100℃의 온도에서 실시한다.
이어서, II-CN-모노에스테르는 하기 반응식 5로 도시한 바와 같이, 하기 화학식 I-CN의 화합물로 전환될 수 있다.
Figure 112008008287647-PCT00026
전환은, 전술한 바와 같이, 화학식 II-CN-모노에스테르의 화합물, 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 배합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 혼합물을 약 5℃∼약 60℃의 온도에서 유지하는 단계를 포함하는 공정으로 실시한다.
이렇게 얻은 I-CN을 (S)-프레가발린으로 전환할 수 있다. 전환은, 예를 들어 미국 특허 5,637,767호에 개시된 공정에 따라 실시할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 반응식 6으로 도시할 수 있는, 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법을 포함한다:
Figure 112008008287647-PCT00027
상기 반응식에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고, R'는 C1 -6 히드로카르빌이며, R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이다. 바람직하게는, CH2CONR"2는 CH2CONH2이다. 바람직하게는, CH2CO2R'는 CH2CO2Me, CH2CO2Et, CH2CO2- 비닐, CH2CO2- 프로필 또는 CH2CO2- 이소프로필이고, 더 바람직하게는 CH2CO2Me, CH2CO2Et 또는 CH2CO2- 비닐이다. 가장 바람직하게는, R은 CN 또는 CH2CONH2이다. 바람직하게는, C1 -6 히드로카르빌은 C1 -3 히드로카르빌이고, 더 바람직하게는 에틸 또는 메틸이다.
상기 방법은 화학식 III의 화합물과 알콜 또는 에스테르와 효소를 배합하여 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 얻는 것을 포함한다.
R이 CN인 경우, 화학식 III의 화합물은 하기 구조의 (±)-3-시아노-5-메틸헥산산("III-CN-산")이고 화학식 I-산의 화합물은 하기 구조의 S-PRG-니트릴("I-CN-산")이다:
Figure 112008008287647-PCT00028
Figure 112008008287647-PCT00029
R이 CH2CONH2인 경우, 화학식 III의 화합물은 하기 구조의 CMH("III-아미드-산")이고, 화학식 I-산의 화합물은 하기 구조의 R-CMH("I-아미드-산")이다:
Figure 112008008287647-PCT00030
Figure 112008008287647-PCT00031
일반적으로, 화학식 III의 화합물과 알콜 또는 에스테르와 효소를 용매의 존재 하에 배합한다. 바람직하게는, 상기 용매는 유기 용매이다. 바람직하게는, 유기 용매는 방향족 탄화수소, 에테르, 케톤, 니트릴, 염소화 탄화수소, 아미드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 방향족 탄화수소 C6 -8 방향족 탄화수소이고, 더 바람직하게는 톨루엔이다. 바람직한 에테르는 C2 -8 선형, 분지형 또는 환형 에테르이다. 더 바람직한 C2 -8 선형, 분지형 또는 환형 에테르는 C2-6 선형, 분지형 또는 환형 에테르이고, 가장 바람직한 C2 -8 선형, 분지형 또는 환형 에스테르는 디이소프로필에테르, 메틸-t-부틸에테르 또는 테트라히드로푸란이다. 바람직하게는, 케톤은 C2 -8 케톤이다. 더 바람직한 C2 -8 케톤은 C2 -4 케톤이고, 가장 바람직한 C2 -8 케톤은 메틸-에틸 케톤, 메틸-이소부틸 케톤 또는 아세톤이다. 바람직하게는, 니트릴은 C2 -5 니트릴이고, 더 바람직하게는 아세토니트릴이다. 바람직하게는, 염소화 탄화수소는 C1 -4 염소화 탄화수소이고, 더 바람직하게는 디클로로메탄 또는 테트라클로로메탄이다. 바람직하게는, 아미드는 C3 -6 아미드이고, 더 바람직하게는 디메틸포름아미드이다. 가장 바람직한 유기 용매는 톨루엔, 메틸-t-부틸에테르 또는 톨루엔과 아세톤의 혼합물이다.
일반적으로, 화학식 III의 출발 화합물은 하기 구조의 거울상이성체들의 혼합물이다:
Figure 112008008287647-PCT00032
상기 혼합물은 거울상이성체들을 임의의 비율로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 거울상이성체들의 라세미 혼합물이다.
효소는 에스테르화 또는 에스테르교환 반응에 적합한 임의의 효소이다. 바람직하게는, 효소는 가수분해 효소이고, 더 바람직하게는 에스테라제, 리파제 또는 프로테아제이다. 바람직하게는, 이 반응에서 사용될 수 있는 효소는 전술한 바와 같다.
바람직하게는, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 n-부탄올, 및 이의 혼합 물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 에스테르는 아세트산비닐 또는 부티르산비닐이다.
일반적으로, 화학식 III의 화합물과 알콜 또는 에스테르와 효소의 배합물을 약 5℃∼약 70℃의 온도에서 유지하여 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 얻는다. 바람직하게는, 상기 배합물을 약 25℃∼약 37℃의 온도에서 유지한다. 바람직하게는, 상기 배합물을 약 2∼약 96 시간, 더 바람직하게는 약 48 시간 동안 유지한다.
에스테르 또는 알콜은, 화학식 III의 출발 산과 비교하여 화학량론적 양으로 또는 초과량으로 사용될 수 있으며, 따라서 용매로도 작용할 수 있다. 화학량론적 양을 사용하는 경우, 에스테르 또는 알콜 및 화학식 III의 화합물은, 에스테르 또는 알콜 약 1 몰 대 화학식 III의 화합물 약 1 몰의 비율로 배합한다. 바람직하게는, 알콜 또는 에스테르는 과량으로 사용한다. 바람직하게는, 알콜 또는 에스테르 대 화학식 III의 출발 산의 몰 비는, 각각 약 3:약 10을 갖는다. 바람직하게는, 비율은 각각 약 2:1∼약 3:1을 갖는다.
이 시간 동안, 효소는 화학식 I-산의 화합물의 S-거울상이성체에 선택적으로 결합함으로써, R-거울상이성체에 비해 S-거울상이성체의 에스테르화를 촉진한다.
화학식 I-산의 프레가발린 중간체는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 회수할 수 있다. 바람직하게는, 화학식 I-산의 프레가발린 중간체는, 여과하고; 염기를 이용하여 여과액을 추출하여 화학식 I-산의 화합물의 염을 얻으며; 산을 첨가하여 상기 염을 유리산, 즉, 화학식 I-산의 화합물로 전환하고, 이를 여과함으로써 회수한다. 상기 염기는 무기 염기, 바람직하게는 무기 염기의 수용액일 수 있다. 바람직하게는, 무기 염기는 수산화나트륨이다. 바람직하게는, 산에 첨가하기 전에, 수상을 유기 용매를 이용하여 추출한다. 바람직하게는, 상기 유기 용매는 톨루엔이다. 산은 무기산일 수 있다. 바람직하게는, 무기산은 HCl, HBr, H2SO4 또는 H3PO4이다. 바람직하게는, 상기 산은 수상에 첨가되어 약 1∼약 4, 더 바람직하게는 약 2∼약 3의 pH를 제공한다.
이렇게 제조한 화학식 I-산의 프레가발린 중간체는 (S)-프레가발린으로 전환할 수 있다. 상기 전환은, 예를 들어 미국 공개 공보 2007/073085호 또는 미국 특허 5,637,767호에 개시된 공정에 따라 실시할 수 있다.
특정의 바람직한 구체예를 참고로 하여 본 발명을 설명하였으며, 명세서를 고려함으로써 다른 구체예가 당업자에게 명백해질 것이다. 하기의 실시예를 참고로 하여 본 발명을 더 정의한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 물질 및 방법 모두에 대해 다수의 변형을 실시할 수 있음이 당업자에게 명백해질 것이다.
효소적 가수분해
실시예 1: (±)3-( 카르바모일메틸 )-5- 메틸헥산산 에틸 에스테르( CMH -에틸 에스테르)의 효소적 가수분해
반응기(1.5 ℓ)에 완충제(250 ㎖), 물 (200 ㎖) 및 리파제를 충전한다. 투명한 용액을 얻은 후, CMH-에틸 에스테르를 상기 용액에 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반한다. NaOH(30% 용액)를 상기 혼합물에 첨가하여 pH를 7로 조절한다. 이어서, 유기상을 분리하고, 톨루엔을 이용하여 수상을 2회 추출한다(2 × 78 g). 상기 수상은 (3S)-시아노-5-메틸헥산산 나트륨 염을 함유하고, 효소적 에스테르화 단계에서 사용된다.
실시예 2: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테르(215 mg) 및 써모마이세스 라누기토서스(Thermomyces lanugittosus) 유래의 리파제(100 mg)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일간 교반하였다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 3: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테르(215 mg) 및 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 37℃에서 4일간 교반하였다. CMH의 존재는 HPLC로 측정하였다.
실시예 4: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테르(215 mg), 아스퍼질러스 나이거 유래의 리파제 AN(20 mg) 및 테트라히드로푸란(0.6 ㎖, 20%)을 충전하였다. 혼합물을 실온에서 3일간 교반하였다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 5∼10: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
실시예 4의 절차를, 아스퍼질러스 나이거 유래의 리파제 AN을 하기 효소들로 각각 대체하여 반복하였다: 아크로모박터종 유래의 리파제 A(실시예 5); 알칼리진 스종 유래의 리파제 AS1(실시예 6); 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C2(실시예 7); 알칼리진스종 유래의 리파제 AS2(실시예 8); 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C1(실시예 9); 및 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C2(실시예 10).
실시예 11: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테르(215 mg) 및 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C2(20 mg)를 충전하였다. 혼합물을 실온에서 약 2∼3일 동안 교반하였다. 생성된 용액을 아세트산에틸(6 ㎖)을 이용하여 추출하였다. 유기층을 분리하고 건조할 때까지 증발시켰다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 13: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
실시예 12의 절차를, 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C2를 알칼리진스종 유래의 리파제 AS1(실시예 13)으로 대체하여 반복하였다.
실시예 14: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테르(215 mg), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 테트라히드로푸란(0.6 ㎖, 20%)을 충전하였다. 혼합물을 37℃에서 4일간 교반하였다. 톨루엔(6 ㎖)을 상기 혼합물에 첨가하여 2상 혼합물을 형성하였다. 유기상을 분리하고 건조할 때까지 증발시켰다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 15: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(3 ㎖), CMH-에틸 에스테 르(215 mg), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 디메틸 술폭시드(0.6 ㎖, 20%)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 37℃에서 4일간 교반하였다. 톨루엔(6 ㎖)을 상기 혼합물에 첨가하여 2상 혼합물을 형성하였다. 유기상을 분리하고 건조할 때까지 증발시켰다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 16: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(0.1 M의 K2HPO4, pH=7, 9 ㎖), CMH-에틸 에스테르(600 mg) 및 CHIRAZYME E-1(151 mg)을 충전하였다. 혼합물(황갈색)을 실온에서 3일간 교반하였다. 생성된 용액을, 톨루엔을 이용하여 추출하였다. 수성층을 증발시키고 R-CMH를 얻었다(광학 순도 - 60%).
실시예 17: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(0.1M의 K2HPO4, pH=7, 9 ㎖), CMH-에틸 에스테르(613.4 mg) 및 CAL B(153 mg)를 충전하였다. 혼합물(백색 슬러리)을 실온에서 3일간 교반하였다. 생성된 용액을, 톨루엔을 이용하여 추출하였다. 수성층을 증발시키고 R-CMH를 얻었다(광학 순도 - 98%).
실시예 18: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(0.1M의 K2HPO4, pH=7, 9 ㎖), CMH-에틸 에스테르(ge-1349-3, 606.21 mg) 및 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체(156.12 mg)를 충전하였다. 황색 에멀션을 실온에서 3일간 교반하였다. 생성된 용액을, 톨루엔을 이용하여 추출하였다. 수성층을 증발시키고 S-CMH를 얻었다(광학 순도 - 79%).
실시예 19: CMH -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(0.1 M의 K2HPO4, pH=7, 9 ㎖), CMH-에틸 에스테르(606.2 l mg) 및 돼지 간 유래의 에스테라제 PL(150 mg)을 충전하였다. 갈색 에멀션을 실온에서 3일간 교반하였다. 생성된 용액을, 톨루엔을 이용하여 추출하였다. 수성층을 증발시키고 R-CMH를 얻었다(광학 순도 - 68%).
실시예 20: 3- 시아노 -5-메틸헥산산-에틸 에스테르의 효소적 가수분해
반응기(1.5 1ℓ)에 완충제(250 ㎖), 물(200 ㎖) 및 가수분해 효소를 충전한다. 투명한 용액을 얻은 후, 3-시아노-5-메틸헥산산 에틸 에스테르를 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반한다. NaOH(30% 용액)를 상기 혼합물에 첨가하고 pH를 7로 조절한다. 유기상을 분리하고, 수상은 톨루엔을 이용하여 2회 추출한다(2 × 78 g). 상기 수상은 (3S)-시아노-5-메틸헥산산 나트륨 염을 함유하고, 효소적 에스테르화 단계에서 사용된다.
실시예 21 : 3- 시아노 -5- 메틸헥산산 -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(2.5 ㎖), 시아노 에틸 에스테르(183 mg), USP 등급의 췌장 리파제(20 mg) 및 테트라히드로푸란(0.5 ㎖, 20%)을 충전하였다. 혼합물을 실온에서 4일간 교반한다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 22∼24: 3- 시아노 -5- 메틸헥산산 -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
실시예 22의 절차를, USP 등급의 췌장 리파제를 각각의 하기 효소들로 대체 하여 반복하였다: 리파제 TL Meito Sangyo(실시예 22); 리파제 QLM(실시예 23); 및 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(실시예 24).
실시예 25: 3- 시아노 -5- 메틸헥산산 -에틸 에스테르의 효소적 가수분해
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 완충제(2.5 ㎖), 시아노 에틸 에스테르(186 mg) 및 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3일간 교반하였다. CMH의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 26: (±)-2- 카르복시에틸 -3- 시아노 -5- 메틸 헥산산 에틸 에스테르의 탈카르복실화
반응기(0.5 ℓ)에 에탄올(225 ㎖) 및 KOH(31.8 g)를 투입하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, (±)-2-카르복시에틸-3-시아노-5-메틸 헥산산 에틸 에스테르(150 g)를 첨가하였다. 혼합물을 환류로 21 시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 CH2Cl2(600 ㎖)에 용해시켰다. 용액을, 물(600 ㎖)을 이용하여 추출하였으며, 유기상을 분리하고 증발시켰다. 생성물 (±)-3-시아노-5-메틸헥산산 에틸을 황색 오일(77 g)로 얻었다. 증류(80∼100℃, 1 mm Hg)에 의한 정제 후, 57 g의 황색빛 오일을 얻었다.
효소적 에스테르화
실시예 27: CMH 의 효소적 에스테르화
반응기(1.5 L)에 톨루엔(250 ㎖), 아세트산비닐(300 mmol), 효소(2 g) 및 CMH-라세미체(100 mmol)를 충전한다. 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반한다. 용액을 여과하고, 여과액을 NaOH(30% 용액)를 이용하여 추출한다. 유기상을 분리하고, 수상은 톨루엔을 이용하여 추출한다. 상기 수상을 pH 2로 산성화하여 R-CMH를 침전시키며, R-CMH를 여과하고 물로 세정한다.
실시예 28: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(3 ㎖), 부탄올(0.25 ㎖, 2.76 mmol), USP 등급의 췌장 리파제(20 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 29∼31 : CMH 의 효소적 에스테르화
실시예 28의 절차를, USP 등급의 췌장 리파제를 각각의 하기의 효소들로 대체하여 반복하였다: 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(실시예 29); Meito Sangyo로부터의 리파제 QLM(실시예 30); 및 Meito Sangyo로부터의 리파제 TL(실시예 31).
실시예 32: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), USP 등급의 췌장 리파제(20 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 실온에서 6일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 33∼35: CMH 의 효소적 에스테르화
실시예 32의 절차를, USP 등급의 췌장 리파제를 각각의 하기의 효소들로 대체하여 반복하였다: 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(실시예 33); 리파제 QLM(실시예 34); 및 리파제 TL(실시예 35).
실시예 36: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 실온에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 37: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg), 테트라히드로푸란 98%(0.3 ㎖, 10%) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 38: CMH 의 효소적 에스테르화
실시예 37의 절차를, 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제를 사용하여 반복하였다.
실시예 39: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 이소프로필 에테르 99%(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 40: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 메틸 t-부틸 에테르(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 41: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 메틸 이소-부틸 케톤(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 42: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(3 ㎖), 아세트산비닐(0.255 ㎖, 2.76 mmol), 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제(100 mg), 테트라히드로푸란 98%(0.6 ㎖, 20%) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.092 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 37℃에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(0.5 ㎖), N2 흐름으로 건조하였다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 43: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 50 ㎖ 3구 플라스크에 톨루엔(4 ㎖), 무수 EtOH(0.3 ㎖, 5 mmol), CAL B(300 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), 건조할 때까지 증발시켰다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 44: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 톨루엔(4 ㎖), 아세트산비닐(0.25 ㎖, 5 mmol), CAL B(144.5 mg) 및 CMH-라세미체(O.1 g, O.535 mmol)를 충전하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 4일간 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), 및 건조할 때까지 증발시켰다. 샘플 중의 CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 45: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 메틸 이소부틸 케톤(10 ㎖), 아세트 산비닐(0.46 ㎖, 5 mmol), 안정화된 CAL B(~400 mg), 분자체(3 Å, ∼100 mg) 및 CMH-라세미체(187 mg, 0.647 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃에서 47 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 46: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 아세톤 30%와 톨루엔 70%의 용액(10 ㎖), 아세트산비닐(0.46 ㎖, 5 mmol), 안정화된 CAL B(~400 mg), 분자체(3 Å, ∼100 mg) 및 CMH-라세미체(193 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃에서 47 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 47: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 아세톤 30%와 톨루엔 70%의 용액(10 ㎖), 부티르산비닐(0.46 ㎖, 3.6 mmole), 안정화된 CAL B(~400 mg), 분자체(3 Å, 100 mg) 및 CMH-라세미체(199 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃에서 47 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 48: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 메틸 이소부틸 케톤의 용액(10 ㎖), 부티르산비닐(0.46 ㎖, 3.6 mmole), 안정화된 CAL B(~400 mg), 분자체(3 Å, 100 mg) 및 CMH-라세미체(189.5 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃에서 47 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 49: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 아세톤 70%와 톨루엔 30%의 용액(10 ㎖), 아세트산비닐(0.46 ㎖, 5 mmole), CAL B 안정화 효소(823.5 mg), 분자체(3 Å, 113 mg) 및 CMH-라세미체(186 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃ 이하에서 64 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 50: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 아세톤 50%와 톨루엔 50%의 용액(10 ㎖), 아세트산비닐(0.46 ㎖, 5 mmole), CAL B 안정화 효소(802 mg), 분자체(3 Å, 100 mg) 및 CMH-라세미체(201.3 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃ 이하에서 64 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 51: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 아세톤 30%와 톨루엔 70%의 용액(10 ㎖), 아세트산비닐(0.46 ㎖, 5 mmole), TL 안정화 효소(802.5 mg), 분자체(3 Å, 105.5 mg) 및 CMH-라세미체(194 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃ 이하에서 48 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 52: CMH 의 효소적 에스테르화
자석 교반기를 구비한 바이알(20 ㎖)에 메틸 이소부틸 케톤의 용액(10 ㎖), 아세트산비닐(0.46 ㎖, 5 mmole), TL 안정화 효소(825 mg), 분자체(3 Å, 107 mg) 및 CMH-라세미체(183 mg, 1 mmol)를 충전하였다. 혼합물을 50℃ 이하에서 48 시간 동안 교반하였다. 혼합물로부터 샘플을 취하여(1 ㎖), CMH-에스테르의 존재는 HPLC로 분석하였다.
실시예 53: (S)- 프레가발린의 제조: 미국 특허 제5,637,767호( 컬럼 12, 1. 46∼ 컬럼 13, 1. 32)의 실시예
800 ℓ 스틸(still)을 (S)-3-시아노-5-메틸 헥산산 에틸 에스테르(50.1 kg, 273 mol) 및 에틸 알콜 2B(53 kg)를 충전하였다. 수산화칼륨(17.8 kg, 317 mol)의 수용액(56 ℓ)을 첨가하면서, 그 첨가 속도를 조절하여 뱃치 온도를 25℃ 이하로 유지하였다. 혼합물을 20℃∼25℃에서 약 1.5 시간 동안 교반하였다. 뱃치를, 스펀지 니켈(15.0 kg, 함수량 50%)을 함유하는 수소 처리기(hydrogenator)로 이송하고, 이어서 에틸 알콜 2B(27 kg)로 씻어내었다. 혼합물을 약 50 psi에서 약 19 시간 동안 수소로 처리하였다(수소 흡수는 멈춤).
니켈을 여과로 제거하고, 여과 케이크를 39 kg 에틸 알콜 2B와 111 ℓ의 물의 혼합물로 씻어내었다. 뱃치 온도를 40℃ 미만으로 유지하면서, 빙초산(22.8 kg, 380 mol)을 여과액에 첨가하였다. 뱃치를 70℃∼75℃까지 가열하여 고체를 용해시켰다. 뱃치는 0℃∼5℃까지 서서히 냉각시켜 생성물을 결정화하였다.
고체를 원심분리기에서 수거하고, 미리 0℃∼5℃까지 냉각시킨 160 ℓ 이소 프로필 알콜로 씻어낸다.
습윤 고체를 진공 트레이 건조기에서 진공 하에 35℃∼45℃(28 시간)로 건조하여 (S)-3-아미노메틸-5-메틸헥산산을 얻었다.
실시예 54: (R)- CMH 에서 (S)- 프레가발린으로의 전환: 미국 공개 공보 2007/0073085의 실시예 12
반응기(0.5 L)에 물(165 ㎖) 및 NaOH(35.5 g)를 투입하여 용액을 얻었다. 상기 용액을 15℃까지 냉각시키고 (R)-CMH(33 g)를 첨가한다. 온도를 25℃ 이하로 유지하면서 Br2(28.51 g)를 적가하였다(15 분). 혼합물을 60℃까지 15분간 가열한 다음, 15℃까지 냉각시켰다. 이소-부탄올을 첨가(100 ㎖)한 다음, H2SO4(66%)의 용액(33 ㎖)을 첨가하였다. 상들을 분리하고, 수상은 이소-부탄올(83 ㎖)을 이용하여 추출하였다. 합한 유기상에 BU3N(34.2 g)을 첨가하고, 혼합물을 2℃까지 냉각시키며, 2 시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 세정하며, 진공 하에 55℃에서 건조하여, 총 순도가 HPLC에 의해 99.86 면적%인 (S)-프레가발린을 얻었다.

Claims (52)

  1. 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체의 제조 방법으로서,
    a) 하기 화학식 II의 에스테르, 가수분해 효소, 완충제 및 임의로 염기를 배합하여 혼합물을 얻는 단계; 및
    b) 상기 혼합물을 약 5℃∼약 60℃의 온도에서 유지하여 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 얻는 단계
    를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00033
    Figure 112008008287647-PCT00034
    상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1-6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; M은 금속이다.
  2. 제1항에 있어서, R은 CN 또는 CH2CONH2인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R'는 에틸 또는 메틸인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, M은 알칼리 금속인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 에스테라제, 프로테아제 또는 리파제인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에스테라제는 이 콜라이(E. Coli) 중의 에스테라제 PF2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS1 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 CLEA 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS4 재조합체, 돼지 간 유래의 에스테라제 PL, 이 콜라이 중의 에스테라제 SD 재조합체, 에스테라제 RO, 및 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzae) 중의 에스테라제 TL 재조합체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 리파제는 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 리파제, 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 유래의 리파제 P2, 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) 유래의 리파제 PS, 리조푸스종(Rhizopus sp .) 유래의 리파제 RS, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas Fluorescens) 유래의 리파제 PF, 페니실리움 카멘베르티(Penicillium camenbertii) 유래의 리파제 PC, 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 P1, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 리파제 AN, 아크로모박터종(Achromobacter sp .) 유래의 리파제 A, 알칼리진스종(Alcaligenes sp .) 유래의 리파제 AS1, 알칼리진스종 유래의 리파제 AS2, 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 유래의 리파제 C2, 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C1, 리파제 리포짐 TL IM, 리파제 리포짐 TL 10OL, 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 리파제 B(CALB), CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 슈도모나스종(Pseudomonas sp.) 유래의 리파제 L-6, 칸디다 안타르크티카 리파제 A(CALA), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제(L-3), USP 등급의 췌장 리파제, 리파제 QLM 및 리파제 TL로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 키모트립신인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스테라제는 CALB, CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 또는 돼지 간 유래의 에스테라제 PL인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 약 6∼약 9의 pH를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기는 알칼리 금속의 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염, 또는 알칼리 토금속 수산화물인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해 효소, 상기 완충제 및 임의로 상기 염기를 배합하고, 이어서 화학식 II의 에스테르를 첨가하여 혼합물을 얻는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공용매를 상기 완충제와 배합하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 공용매는 술폭시드, 아미드, 알콜, 케톤 및 니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 공용매는 C2 -4 술폭시드, C3 -6 아미드, C1 -6 알콜, C2 -6 케톤 및 C1 -5 니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공용매는 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 이소프로필 알콜, 아세톤 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물을 약 20℃∼약 27℃의 온도에서 유지하여 화학식 I의 프레가발린 중간체를 얻는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R은 CN인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 화학식 II의 에스테르는 하기 화학식의 (±)-2-카르복시알킬-3-시아노-5-메틸 헥산산 알킬 에스테르를 알칼리 수산화물과 배합함으로써 탈카르복실화하여 제조하는 것인 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00035
    상기 화학식에서, R'는 C1 -6 히드로카르빌이다.
  21. 제20항에 있어서, R'는 에틸 또는 메틸인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 알칼리 수산화물은 수산화칼륨인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (±)-2-카르복시알킬-3-시아노-5-메틸 헥산산 알킬 에스테르와 상기 알칼리 수산화물은 용매의 존재하에 배합하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 용매는 물, 극성 유기 용매, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 극성 유기 용매는 C1 -5 알콜인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 C1 -5 알콜은 메탄올 또는 에탄올인 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈카르복실화는 가열 하에 실시하여 상기 화학식 II의 에스테르를 얻는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 가열은 약 6O℃∼약 180℃의 온도까지 실시하는 것인 방법.
  29. 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체의 제조 방법으로서, 완충제 및 임의로 염기의 존재 하에 하기 화학식 II의 에스테르를 효소 가수분해하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00036
    Figure 112008008287647-PCT00037
    상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이고; M은 금속이다.
  30. 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법으로 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 제조하는 단계; 및
    b) 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체로 전환하는 단계
    를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00038
    Figure 112008008287647-PCT00039
  31. (S)-프레가발린의 제조 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법으로 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 제조하는 단계; 및
    b) 하기 화학식 I의 프레가발린 중간체를 (S)-프레가발린으로 전환하는 단계
    를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00040
  32. 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법으로서, 하기 화학식 III의 화합물과 알콜 또는 에스테르와 효소를 배합하여 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 얻는 단계를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00041
    Figure 112008008287647-PCT00042
    상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이다.
  33. 제32항에 있어서, R은 CN 또는 CH2CONH2인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물과 상기 알콜 또는 에스테르와 상기 효소는 용매의 존재 하에 배합하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 용매는 방향족 탄화수소, 에테르, 케톤, 니트릴, 염소화 탄화수소, 아미드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 용매는 C6 -8 방향족 탄화수소, C2 -8 선형, 분지형 또는 환형 에테르, C2 -8 케톤, C2 -5 니트릴, C1 -4 염소화 탄화수소, C3 -6 아미드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 톨루엔, 디이소프로필에테르, 메틸-t-부틸에테르, 테트라히드로푸란, 메틸-에틸 케톤, 메틸-이소부틸 케톤, 아세톤, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 테트라클로로메탄, 디메틸포름아미드, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 톨루엔, 또는 톨루엔과 아세톤의 혼합물인 방법.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 가수분해 효소인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 에스테라제, 프로테아제 또는 리파제인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 에스테라제는 이 콜라이 중의 에스테라제 PF2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS1 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS2 CLEA 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS4 재조합체, 돼지 간 유래의 에스테라제 PL, 이 콜라이 중의 에스테라제 SD 재조합체, 에스테라제 RO, 및 아스퍼질러스 오리지 중의 에스테라제 TL 재조합체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 리파제는 써모마이세스 라누지노서스 유래의 리파제, 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 P2, 슈도모나스 스투체리 유래의 리파제 PS, 리조푸스종 유래의 리파제 RS, 슈도모나스 플루오레센스 유래의 리파제 PF, 페니실리움 카멘베르티 유래의 리파제 PC, 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 P1, 아스퍼질러스 나이거 유래의 리파제 AN, 아크로모박터종 유래의 리파제 A, 알칼리진스종 유래의 리파제 AS1, 알칼리진스종 유래의 리파제 AS2, 칸디다 실린드라세아 유 래의 리파제 C2, 칸디다 실린드라세아 유래의 리파제 C1, 리파제 리포짐 TL IM, 리파제 리포짐 TL 10OL, 칸디다 안타르크티카 리파제 B(CALB), CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 슈도모나스종 유래의 리파제 L-6, 칸디다 안타르크티카 리파제 A(CALA), 칸디다 루고사 리파제(L-3), USP 등급의 췌장 리파제, 리파제 QLM 및 리파제 TL로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 프로테아제는 키모트립신인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 에스테라제는 CALB, CHIRAZYME E-1 돼지 간 에스테라제, 이 콜라이 중의 에스테라제 BS3 재조합체, 또는 돼지 간 유래의 에스테라제 PL인 방법.
  45. 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 및 이의 혼합물에서 선택되는 것인 방법.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스테르는 아세트산비닐 또는 부티르산비닐인 방법.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물과 상기 알콜 또는 에스테르와 상기 효소의 배합물을 약 5℃∼약 50℃의 온도에서 유 지하여 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 얻는 것인 방법.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스테르 또는 알콜과 상기 화학식 III의 화합물은, 에스테르 또는 알콜 약 1 몰 대 화학식 III의 화합물 약 1 몰의 비율로 배합하는 것인 방법.
  49. 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스테르 또는 알콜과 상기 화학식 III의 화합물은 에스테르 또는 알콜 약 1 몰 초과 대 화학식 III의 화합물 약 1 몰의 비율로 배합하는 것인 방법.
  50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스테르 또는 알콜과 상기 화학식 III의 화합물은 에스테르 또는 알콜 약 3 몰∼약 10 몰 대 화학식 III의 화합물 약 1 몰의 비율로 배합하는 것인 방법.
  51. 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체의 제조 방법으로서, 하기 화학식 III의 화합물을 효소적으로 에스테르화하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00043
    Figure 112008008287647-PCT00044
    상기 화학식들에서, R은 CH2CONR"2, CH2CO2R' 또는 CN이고; R'는 C1 -6 히드로카르빌이며; R"는 수소 또는 C1 -6 히드로카르빌이다.
  52. (S)-프레가발린의 제조 방법으로서,
    a) 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법으로 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 제조하는 단계; 및
    b) 하기 화학식 I-산의 프레가발린 중간체를 (S)-프레가발린으로 전환하는 단계
    를 포함하는 방법:
    Figure 112008008287647-PCT00045
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