CN109182308A - 一种利用pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用pH响应型木质素基聚醚回收溶液中纤维素酶的方法；该方法将pH响应型木质素基聚醚加入到含纤维素酶的溶液中溶解，调节溶液pH为3.0～4.0，使pH响应型木质素基聚醚和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离的方法，回收纤维素酶；本发明pH响应型木质素基聚醚是以工业木质素或木质素衍生物为原料经过接枝环氧氯丙烷封端的聚醚链段中间体得到。本发明方法首次提出用pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的方法。本发明方法不仅可以高效地回收溶液中的纤维素酶，很好地保持纤维素酶的活性操作简单，而且绿色环保，有利于木质素的高值化利用。

Description

一种利用pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的方法
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域，特别涉及利用pH响应型木质素基聚醚回收溶液中纤维素酶的方法。
背景技术
将木质纤维素酶解糖化成单糖，在转化成液体燃料或者高价值的化学品不仅可以缓解能源危机，而且符合可持续发展的需求。但是木质纤维素酶解过程中，纤维素酶能否高效水解木质纤维素底物是关键的技术瓶颈。纤维素酶由于活力低、用量大和价格高等特点，使得木质纤维素的酶解成本较高。实现纤维素酶的高效回收利用是降低底物酶解成本的重要途径。由于酶解后水解液中的纤维素酶蛋白浓度一般低于1g/L，且纤维素酶的组分多，不同组分的酶有不同的等电点(pI)，所以常见的蛋白质回收方法，如盐析法和等电点沉降法，不适合回收酶解液中的纤维素酶。目前，纤维素酶回收利用技术主要有超滤膜回收、纤维素酶的固定化和新鲜底物重吸附法。
超滤膜回收几乎可以回收所有的纤维素酶组分，但是滤膜回收存在着设备贵、超滤膜易堵塞、操作成本高的问题(Bioresource Technology,2013.144:186-193.)。酶的固定化可以保持酶的稳定且利于回收利用，但是固定的纤维素酶与木质纤维素之间存在很大的传质障碍，且固定化过程会严重影响酶的活性，因此目前还没有实现工业化应用(Nano,2015.10:2153-2157.)。纤维素酶对纤维素的特异性吸附使得其可以被新鲜底物吸附回收，但是添加新鲜底物回收纤维素酶耗时较长，且该方法无法回收纤维二糖酶(BiotechnolBiofuels,2015.8(1):5.)。
木质素是自然界中最丰富的芳香性天然高分子，制浆造纸工业每年会副产5000万吨左右的木质素，纤维素乙醇工业本身也会产生大量的酶解木质素。但超过90％的木质素仍然没有得到很好的应用，一般直接燃烧发电，因此对木质素进行综合开发利用对环境保护和经济发展都具有重要意义。
Lin等人通过将木质素和木钠上接枝PEG用于促进木质纤维素酶解，发现其和纤维素酶有一定的相互作用且能分散纤维素酶，对木质纤维素的酶解有很好的促进作用(Bioresource Technology,2015.185:165-170.Industrial Crops and Products,2016,80:86-92.)。但是由于产品PEG的接枝量较大使其水溶性很好，没有pH响应性，不能用于回收纤维素酶。
发明内容
本发明的目的在于降低溶液中纤维素酶回收的成本并提高回收效率，提供一种利用pH响应型木质素基聚醚回收溶液中纤维素酶的方法。
本发明以木质素或木质素衍生物为原料，通过调节聚醚链段在木质素上的接枝量并优化提纯方式得到具有灵敏pH响应性的木质素基聚醚，不仅可以降低合成成本，提高产品得率，而且合成的产品可以高效地回收纤维素酶。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种利用pH响应型木质素基聚醚回收溶液中纤维素酶的方法：将pH响应型木质素基聚醚加入到含纤维素酶的溶液中溶解，调节溶液pH为3.0～4.0，使pH响应型木质素基聚醚和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离的方法，回收纤维素酶；
所述的pH响应型木质素基聚醚通过如下步骤制得：
1)将聚醚链段加热升温至40～70℃，加入催化剂，搅拌均匀后，缓慢加入环氧氯丙烷，40～70℃下保温反应1～2h，得到聚醚链段中间体；所述的催化剂为五氟化锑、三氟化硼乙醚络合物、氯化铝、四氯化锡、五氯化锑或四丁基溴化铵中的一种以上；
2)将木质素或木质素衍生物配置成悬浮液，调节悬浮液的pH值至10～13，加热升温至60～75℃，缓慢加入聚醚链段中间体，70～90℃下保温2～4h，反应结束后提纯，得pH响应型木质素基聚醚；
以质量份数计，聚醚链段、催化剂、环氧氯丙烷和木质素或木质素衍生物的用量分别为20～100份、1～2份、2～10份和100份。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的含纤维素酶的溶液的pH为4.0～10.0，离子强度为0～100mmol/L，纤维素酶蛋白浓度为40～2500mg/L，纤维素酶包括来源于李氏木霉真菌和黑曲霉真菌的纤维素酶。
优选地，所述的木质素或木质素衍生物为碱木质素、有机溶剂木质素、生物质炼制木质素、木质素磺酸盐、木质素羧酸盐、木质素磷酸盐、烷基化木质素、乙酰化木质素或羟基化木质素。
优选地，所述的聚醚链段为聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、甲基烯丙醇聚氧乙烯醚或烯丙基聚氧乙烯醚，聚醚链段的重均分子量为500～5000。
优选地，所述pH响应型木质素基聚醚与含纤维素酶的溶液的质量比为0.1～2:100。
优选地，所述的调节溶液pH是通过加入有机酸或无机酸调节；所述的有机酸或无机酸包括盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸和马来酸中的一种或多种。
优选地，所述的固液分离的方法包括自然沉降法、倾析法、过滤法和离心法中的一种或多种。
优选地，所述的缓慢加入环氧氯丙烷是在3～20min内加入完毕。
优选地，所述的缓慢加入聚醚链段中间体是在5～40min内加入完毕。
优选地，所述的提纯的方法为多次碱溶酸析的方法。
本发明pH响应型木质素基聚醚是以工业木质素或木质素衍生物为原料经过接枝环氧氯丙烷封端的聚醚链段中间体得到。
所述的回收的纤维素酶能够应用于纤维素或木质素纤维素的水解。
本发明的机理为：木质素中含有一定的羧基和酚羟基团，当pH升高时，这些基团的电离使得pH响应型木质素基聚醚的溶解度增加，当pH>3.0～4.0，pH响应型木质素基聚醚完全溶解于纤维素酶溶液中。当pH<3.0～4.0，pH响应型木质素基聚醚基团的电离减弱，分子间由于相互作用力增强而析出；而且由于pH响应型木质素基聚醚与纤维素酶存在一定的相互作用(静电作用、疏水作用、氢键作用)，所以在pH响应型木质素基聚醚析出时会将溶液中的纤维素酶一起沉淀下来。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1)相比于发明人课题组前期用pH响应型木质素两性表面活性剂(将阴离子和阳离子基团接枝到木质素上)回收纤维素酶的工作，利用木质素基聚醚回收纤维素酶时，木质素基聚醚的pH响应性更加灵敏，通过调节pH，98％以上的产品可以被回收利用；
2)pH响应型木质素基聚醚可以有效地回收纤维素酶，优化的产品可以回收90％以上纤维素酶滤纸酶活。
3)本发明实现了木质素资源化利用，有利于木质纤维素的综合利用。
4)本发明中回收纤维素酶的操作简单、不需要额外的设备，只需要调节pH就能回收纤维素酶。
附图说明
图1为对应实施例3在EHL上接枝分子量为1000的MPEG前后的红外光谱图。
图2为实施例3的EHL-MPEG-0.4在5mM醋酸钠缓冲液中的pH响应情况图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的纤维素酶是目前被广泛使用的Cellic CTec2。实施例中纤维素酶的滤纸酶活以不添加pH响应型木质素基聚醚的滤纸酶活为标准，具体的测量参考了文献(Methods in Enzymology,1988,160:87-112.)。
实施例涉及到三种pH响应型木质素基聚醚。一种是由湘江碱木质素(KL，湖南永州湘江纸业有限责任公司)接枝聚乙二醇(PEG)得到，简称KL-PEG；一种是由酶解木质素(EHL，山东龙力有限公司)接枝不同重均分子量(Mn)的PEG得到，简称EHL-PEG；一种是由EHL接枝不同重均分子量的单甲氧基聚乙二醇(MPEG)得到，简称EHL-MPEG。三种pH响应型木质素基聚醚的具体合成方法如下：
PEG(Mn:600，1000，4000)中间体的合成：将100g PEG放入250mL三口烧瓶，放入水浴锅中，设置温度为55-65℃，设置搅拌器的转速为250rpm，待PEG融化之后，将0.8g BF3-Et2O加入到烧瓶中，接着加入与PEG相等摩尔量的环氧氯丙烷，在60-65℃下反应2h后得到PEG中间体。
MPEG(Mn:550，1000，4000)中间体合成：将100g MPEG放入250mL三口烧瓶，放入水浴锅中，设置温度为55-65℃，设置搅拌器的转速为250rpm，待PEG融化之后，将0.8g BF3-Et2O加入到烧瓶中，接着加入与MPEG相等摩尔量的环氧氯丙烷，在60-65℃下反应2h后得到MPEG中间体。
KL-PEGm-x：配制pH＝12的100g KL水溶液(KL占溶液质量分数为20％)，倒入250mL的三口烧瓶，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将20x g的PEG中间体溶液往烧瓶中缓慢滴加，滴加完成后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用5L去离子水洗涤后调节到pH＝3，离心分离出固体后，再用5L的去离子水洗涤后调节到pH＝3，重复4次，离心分离得到产品。(m为PEG的重均分子量，x为PEG中间体占KL的质量分数，m取值范围为500～5000，x取值范围为0.2～1.0)
EHL-PEGm-x：配制pH＝12的100g EHL水溶液(EHL占溶液质量分数为20％)，倒入250mL的三口烧瓶，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将20x g的PEG中间体溶液往烧瓶中缓慢滴加，滴加完成后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用5L去离子水洗涤后调节到pH＝3，离心分离出固体后，再用5L的去离子水洗涤后调节到pH＝3，重复4次，离心分离得到产品。(m为PEG的重均分子量，x为PEG中间体占EHL的质量分数，m取值范围为500～5000，x取值范围为0.2～1.0)
EHL-MPEGm-x：配制pH＝12的100g EHL水溶液(EHL占溶液质量分数为20％)，倒入250mL的三口烧瓶，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将20x g的MPEG中间体溶液往烧瓶中缓慢滴加，滴加完成后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用5L去离子水洗涤后调节到pH＝3，离心分离出固体后，再用5L的去离子水洗涤后调节到pH＝3，重复4次，离心分离得到产品。(m为PEG的重均分子量，x为MPEG中间体占EHL的质量分数，m取值范围为500～5000，x取值范围为0.2～1.0)
实施例1
将5质量分的KL-PEG1000-0.4加入到纤维素酶蛋白浓度为200mg/L的5000质量分的溶液中(纯水配置，pH＝7.0)，用盐酸调节溶液的pH至3.0使KL-PEG1000-0.4和纤维素酶沉淀析出，通过离心机分离固液，固相即为回收的木质素基聚醚和纤维素酶。测量并计算回收的纤维素酶的相对滤纸酶活，结果如表1所示。
实施例2
将25质量分的EHL-PEG1000-0.6加入到纤维素酶蛋白浓度为400mg/L的5000质量分的溶液中(纯水配置，pH＝7.0)，用硫酸调节溶液的pH至3.2使EHL-PEG1000-0.6和纤维素酶沉淀析出，通过布氏漏斗抽滤分离固液，固相即为回收的木质素基聚醚和纤维素酶。测量并计算回收的纤维素酶的相对滤纸酶活，结果如表1所示。
实施例3
将10质量分的EHL-MPEG1000-0.4加入到纤维素酶蛋白浓度为100mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝5.5，5mM)，用醋酸调节溶液的pH至3.5使EHL-MPEG1000-0.4和纤维素酶沉淀析出，通过自然沉降法分离固液，固相即为回收的木质素基聚醚和纤维素酶。测量并计算回收的纤维素酶的相对滤纸酶活，结果如表1所示。
实施例4
将50质量分的KL-PEG4000-0.2加入到纤维素酶蛋白浓度为200mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝6.0，100mM)，用盐酸调节溶液的pH至3.5使KL-PEG4000-0.2和纤维素酶沉淀析出，通过离心机分离固液，固相即为回收的木质素基聚醚和纤维素酶。测量并计算回收的纤维素酶的相对滤纸酶活，结果如表1所示。
实施例5
将25质量分的EHL-PEG1000-0.4加入到纤维素酶蛋白浓度为400mg/L的5000质量分的葡萄糖溶液中(葡萄糖为100质量分，pH＝7.0)，用硝酸调节溶液的pH至3.2使EHL-PEG1000-0.4和纤维素酶沉淀析出，经过布氏漏斗抽滤分离固液，固相即为回收的木质素基聚醚和纤维素酶。测量并计算回收的纤维素酶的相对滤纸酶活，结果如表1所示。
表1 pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的相对滤纸酶活
根据表1中可以看出，pH响应型木质素基聚醚可以有效地回收溶液中的纤维素酶，回收的纤维素酶保持了较高的滤纸酶活。实施例5溶液中含有2％质量分数的葡萄糖，但是纤维素酶滤纸酶活的回收没有受到明显的影响，说明该方法可以有效地回收木质纤维素酶解糖化液中的纤维素酶。
图1是在EHL上接枝分子量为1000的MPEG前后的红外光谱图，相比于EHL，EHL-MPEG1000-0.4在1114和951cm-1的红外吸收峰有明显增强，这属于C-O-C伸缩振动，同时，在2910和2857cm-1的吸收峰也有明显的增强，这源于甲基和甲氧基的伸缩振动。在1216cm-1的红外吸收峰却明显的减弱了，这属于酚羟基的红外特征峰，说明酚羟基被MPEG中间体酯化了。说明MPEG已经成功的接枝在了EHL上。
图2是EHL-MPEG-0.4在5mM醋酸钠缓冲液中的pH响应情况，将pH从5.0调至3.5，EHL-MPEG-0.4的沉淀率超过98％，说明了产品具有灵敏的pH响应性。
相比于论文(Bioresource Technology,2015.185:165-170.Industrial Cropsand Products,2016,80:86-92.)中涉及的产品(在木质素或木质素磺酸钠上接枝聚乙二醇，并由丁酮反复抽提得到产品)。本发明降低了聚醚链段的用量，并且只需要简单的碱溶酸析就可以得到产品，合成成本明显降低，且产品具有灵敏的pH响应性，可以用于回收纤维素酶。
相比于发明人课题组前期用pH响应型木质素两性表面活性剂(将阴离子和阳离子基团接枝到木质素上)回收纤维素酶的工作，本发明利用木质素基聚醚回收纤维素酶具有如下优点：1)木质素基聚醚的pH响应性更加灵敏，通过调节pH，98％以上的产品可以被回收利用，而pH响应型木质素两性表面活性剂需要消耗更多的酸或碱来达到相同的产品沉淀率；2)pH响应型木质素基聚醚可以更有效地回收纤维素酶，优化的产品可以回收95％以上纤维素酶滤纸酶活，而pH响应型木质素两性表面活性剂回收纤维素酶滤纸酶活小于92％。这说明pH响应型木质素基聚醚的重复使用性更好，并且可以更有效地减少纤维素酶的用量，这对降低木质纤维素酶解的成本有重要的意义。
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用pH响应型木质素基聚醚回收溶液中纤维素酶的方法，其特征在于：将pH响应型木质素基聚醚加入到含纤维素酶的溶液中溶解，调节溶液pH为3.0～4.0，使pH响应型木质素基聚醚和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离的方法，回收纤维素酶；
所述的pH响应型木质素基聚醚通过如下步骤制得：
1)将聚醚链段加热升温至40～70℃，加入催化剂，搅拌均匀后，缓慢加入环氧氯丙烷，40～70℃下保温反应1～2h，得到聚醚链段中间体；所述的催化剂为五氟化锑、三氟化硼乙醚络合物、氯化铝、四氯化锡、五氯化锑或四丁基溴化铵中的一种以上；
2)将木质素或木质素衍生物配置成悬浮液，调节悬浮液的pH值至10～13，加热升温至60～75℃，缓慢加入聚醚链段中间体，70～90℃下保温2～4h，反应结束后提纯，得pH响应型木质素基聚醚；
以质量份数计，聚醚链段、催化剂、环氧氯丙烷和木质素或木质素衍生物的用量分别为20～100份、1～2份、2～10份和100份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含纤维素酶的溶液的pH为4.0～10.0，离子强度为0～100mmol/L，纤维素酶蛋白浓度为40～2500mg/L，纤维素酶包括来源于李氏木霉真菌和黑曲霉真菌的纤维素酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的木质素或木质素衍生物为碱木质素、有机溶剂木质素、生物质炼制木质素、木质素磺酸盐、木质素羧酸盐、木质素磷酸盐、烷基化木质素、乙酰化木质素或羟基化木质素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚醚链段为聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、甲基烯丙醇聚氧乙烯醚或烯丙基聚氧乙烯醚，聚醚链段的重均分子量为500～5000。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH响应型木质素基聚醚与含纤维素酶的溶液的质量比为0.1～2:100。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节溶液pH是通过加入有机酸或无机酸调节；所述的有机酸或无机酸包括盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸和马来酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固液分离的方法包括自然沉降法、倾析法、过滤法和离心法中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓慢加入环氧氯丙烷是在3～20min内加入完毕。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓慢加入聚醚链段中间体是在5～40min内加入完毕。
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