CN113549662B - 一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法及应用 - Google Patents

一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于材料和生物技术领域，具体公开了一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L‑4‑Cl‑犬尿氨酸的方法及应用。本发明首次利用2种酶进行L‑4‑氯犬尿氨酸生物合成方法，该方法只需要总共2个蛋白（Pf0A9和Tar13）参与，同时MOF固定化酶进行反应；不仅克服了酶化学稳定性和热稳定性差的缺点，而且还在保证酶催化活性和选择性的前提下，实现了酶与反应体系的分离从而确保了酶的重复回收利用，而这则为低成本的实现目标分子的工业化生产提供了潜在可能。

Description

一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸 的方法及应用
技术领域
本发明属于材料和生物技术领域，具体涉及一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法及应用。
背景技术
L-4-氯犬尿氨酸(L-4-chlorokynurenine)作为7-氯犬尿喹啉酸的前体药物，不仅可以通过口服后快速被肠道吸收，并且能被大型神经氨基酸转运体通过主动运输穿越血脑屏障送达大脑神经部位。在大脑内，星形胶质细胞里的犬尿氨酸氨基转移酶(kynurenineaminotransferases，KATs)会将L-4-氯犬尿氨酸转化为7-氯犬尿喹啉酸，然后释放并作用于神经元GlyB位点来进行N-甲基-D-门冬氨酸受体的间接拮抗阻断。综上，L-4-氯犬尿氨酸可以作为前体药物来治疗由N-甲基-D-门冬氨酸受体过度兴奋引起的神经性疼痛疾病。
目前，L-4-氯犬尿氨酸的合成基本都是由有机合成方法来实现。但是目前的有机合成需要使用超低温等极端反应条件来进行合成，限制了其大规模合成，也造成了其造价成本较高。此外，L-4-氯犬尿氨酸类似物药物的研发也受到其类似物合成供应的制约，阻碍了其药物优化的研发进程。
体外生物合成利用酶催化技术的高效性、反应条件温和、反应选择性高等优势，已被应用于生物合成生产高附加值化学品等领域。但由于酶自身的不稳定性，导致体外生物催化有催化循环少、酶易降解、遇热遇有机溶剂失活等问题。近些年发展的有机金属框架(Metallo-Organic Frameworks,以下简称MOF)载酶技术使用便宜易得原料，可将酶进行固载化，从而增加酶的稳定性和循环利用能力，为解决体外生物合成方法的局限性提供了手段，并使体外生合成应用到更加广泛的领域中。
本申请从目标产物的化学结构出发，通过从头设计其生物合成通路，将其原来的5步生物合成骤缩减至2步生物催化反应，大大提升目标产物的生产效率和产量。原来的生物合成L-4-氯犬尿氨酸需要5步生物合成的步骤，总共需要Tar14、Tar15、PtdH、Tar13、Tar16这5个蛋白完成L-4-氯犬尿氨酸的生物合成(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,8394–8399)。
基于我们优化后的两步酶催化合成步骤，用MOF对这两个酶进行固载再进行L-4-氯犬尿氨酸的体外生物合成，不仅可以进一步提升催化酶的稳定性、酶级联反应效率和使用寿命，还可以回收固载酶催化剂循环催化使用，进一步提升累积的产物产量。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法，该方法在高效获得L-4-Cl-犬尿氨酸的同时，实现酶与反应体系的分离从而确保酶的重复回收利用为低成本的实现目标分子的工业化生产提供潜在可能。
本发明的另一个目的是提供了一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法：包括以6-Cl-吲哚和L-丝氨酸为底物，加入磷酸吡哆醛，MOF复合酶为催化剂进行催化反应后，离心，上清液中加酸溶液进一步反应，提纯即得；
所述的MOF复合酶为MOF、Pf0A9酶和Tar13酶混合孵育获得；
所述的，Pf0A9酶为：色氨酸合成酶的类似酶(Tryptophan synthetasehomologue)；
Tar13酶为：色氨酸2,3双加氧酶的类似酶(Tryptophan 2,3,-dioxygenasehomologue)；
以上所述的方法中，优选的，所述的MOF为HZIF-8。
以上所述的方法中，优选的，所述方法中的催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5～8.0；所述的缓冲液例如：KPi缓冲液、磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
以上所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～37℃反应24～48h；
以上所述的方法中，优选的，所述的酸溶液为pH小于等于2的溶液，例如盐酸、三氟乙酸、醋酸、甲酸等；最优选为三氟乙酸溶液；
以上所述的方法中，优选的，催化体系中包括：6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚0.2～5mM、L-丝氨酸0.2～5mM、磷酸吡哆醛0.01～0.05mM、Pf0A9酶100～500U/mL、Tar13酶100～500U/mL，所述的浓度为该物质在催化体系中的终浓度；
以上所述的方法中，优选的，加酸溶液反应的温度与催化反应温度相同；
以上所述的方法中，优选的，所述的HZIF-8的制备方法包括：
将1.5-3mol/L三聚氰胺溶液和1.5-3mol/L水杨酸溶液加入到0.05-0.20mol/L硝酸锌水溶液中，60-80℃恒温搅拌；将反应完的10-30mL热混合物加入到70-100mL己烷中，并加入表面活性剂，然后50-70℃恒温搅拌；将反应混合物转移至冰水浴中搅拌；将25-40mL0.5-2mol/L2-甲基咪唑水溶液加入到冰水浴后的混合物中并移至常温搅拌；所得混合溶液离心并收集沉淀；离心得到的沉淀在60-80℃水中悬浮；悬浮后离心并收集沉淀，最后用乙醇清洗后在烘箱中烘干。
一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法的应用，包括利用上述方法来制备L-4-Cl-犬尿氨酸。
上述的L-4-Cl-犬尿氨酸的结构式为：
Figure BDA0002467832520000031
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次提出2种酶进行L-4-氯犬尿氨酸生物合成方法，该方法只需要总共2个蛋白(Pf0A9和Tar13)参与，并且该方法不仅可以用于生物合成L-4-氯犬尿氨酸，还能用于生物合成L-4-氯犬尿氨酸类似物。
进一步的，MOF固定化酶反应的应用，不仅克服了酶化学稳定性和热稳定性差的缺点，而且还在保证酶催化活性和选择性的前提下，实现了酶与反应体系的分离从而确保了酶的重复回收利用，而这则为低成本的实现目标分子的工业化生产提供了潜在可能。合成过程条件温和，且催化剂多次重复使用后效果依然较好，同时这种高效的无细胞酶催化生物合成对环境的污染也很小。
附图说明
图1为扫描电镜下HZIF-8和Pf0A9/Tar13@HZIF-8的示意图；
其中A为：为HZIF-8的扫描电镜图；B为Pf0A9/Tar13@HZIF-8催化剂的扫描电镜图。
图2为本发明构建的抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的MOF载酶合成通路。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步解释说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，则已被公开或来源于商业渠道。本发明的Pf0A9酶为：色氨酸合成酶的类似酶(Tryptophan synthetase homologue)；Tar13酶为：色氨酸
Figure BDA0002467832520000032
双加氧酶的类似酶(Tryptophan 2,3,-dioxygenase homologue)。本发明以MOF材料中的HZIF-8作为载酶材料为例进行实验，其他的MOF载酶材料也能完成本发明。
实施例1：
L-4-Cl-犬尿氨酸的体外生物合成制备方法，包括：
在50mL生物合成反应体系中加入6-Cl-吲哚(1mM)、L-丝氨酸(1mM)、磷酸吡哆醛(0.025mM)、Pf0A9酶(200U/mL)和Tar13酶(300U/mL)，其余为50mM磷酸缓冲溶液(pH＝8.0)，30℃反应36小时。反应结束后，加入2mLCF3COOH，30℃继续反应6h。待反应结束后，然后12000rpm离心10min，上清液过滤膜后用HPLC进行分离纯化，产量为180mg/L。
以上所述的浓度为体系中物质的终浓度。
而分离出的L-4-Cl-犬尿氨酸进行结构验证后氢谱数据与文献值一致。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ＝7.63(d,J＝8.8,1H),6.69(d,J＝2.1,1H),6.47(dd,J＝8.7,2.1,1H),3.90(dd,J＝8.9,2.6,1H),3.58(dd,J＝18.6,2.8,1H),3.40(dd,J＝18.7,9.0,1H).
得到的产物L-4-Cl-犬尿氨酸的分子结构式为：
Figure BDA0002467832520000041
实施例2：
用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸，通过以下方法实现：
1)HZIF-8的合成方法：
20mL水溶液体系中加入硝酸锌(0.1M)、三聚氰胺(1.89M)和水杨酸(1.89M)，70℃恒温搅拌15min(转速为300rpm)；将反应完的20mL热混合物(即Zn水凝胶水溶液)加入到80mL己烷中，并加入5.0g Span 85表面活性剂，然后60℃恒温搅拌1h(转速为600rpm)；将反应混合物转移至冰水浴中搅拌30min(转速为400rpm)；将32mL 1M 2-甲基咪唑水溶液加入到冰水浴后的混合物中并移至常温搅拌12h(转速为400rpm)；所得混合溶液离心并收集沉淀(10000rpm，10min)；离心得到的沉淀在70℃水中悬浮6h；悬浮后离心并收集沉淀(10000rpm，10min)，然后用乙醇清洗后在烘箱中放置6h进行烘干，既得HZIF-8纳米材料。
以上所述的各物质的浓度均为混合体系中的各物质的终浓度；
2)酶和HZIF-8的混合孵育
取10k U Pf0A9蛋白、15k U Tar13蛋白和按上述方法制备的HZIF-8纳米材料900mg加入到10mMKPi buffer(50mM KH2PO4，pH＝8.0)中(总液体体积控制在50mL)，然后在旋转混匀仪上混合孵育24h(转速设置为20rpm/min)；孵育所得混合物离心并收集沉淀(8000rpm，15min)，沉淀即为后续反应所用的催化剂(即Pf0A9/Tar13@HZIF-8)。
3)在50mL生物合成反应体系中加入6-Cl-吲哚(1mM)、L-丝氨酸(1mM)、磷酸吡哆醛(0.025mM)和从上述步骤2中混合孵育的Pf0A9/Tar13@HZIF-8催化剂，30℃反应36小时。
Pf0A9/Tar13@HZIF-8催化剂的回收：离心并收集Pf0A9/Tar13@HZIF-8催化剂(8000rpm，15min)，为后续循环反应所用的催化剂。
离心收集的反应上清液中加入2mLCF3COOH，30℃继续反应6h。反应结束后经HPLC纯化和1H NMR、HRMS验证即可得到抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸，本次抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的产量为210mg/L。
HPLC提纯的具体操作为：待反应结束后，加入等体积的色谱级甲醇使反应停止，然后12000rpm离心10min，上清液过滤膜后用HPLC进行分离纯化。具体分离纯化条件为：C18反相高效液相色谱柱，水(A相，含有0.1％甲酸(v/v))和乙腈(B相)为流动相，流速为0.75mL/min；0-5min 5％B，5-15min 5-12％B，15-30min 12-15％B，30-35min 15-100％B，35-38min100％B，38-40min 100-5％B，40-45min 5％B。
1H NMR验证结构时所需产物用量为将反应规模扩大为原来的30倍，即1mL×30。结构验证后所得氢谱数据与文献值一致。
具体如下：1H NMR(400MHz,MeOD)δ＝7.64(d,J＝8.8,1H),6.70(d,J＝2.1,1H),6.48(dd,J＝8.7,2.1,1H),3.91(dd,J＝9.0,2.7,1H),3.59(dd,J＝18.5,2.8,1H),3.40(dd,J＝18.6,9.0,1H)。
HRMS-ESI数据如下：calcm/z[M+H]+243.0531,found m/z[M+H]+243.0526,error[ppm]-2.0.
将Pf0A9/Tar13@HZIF-8催化剂回收，按照上述的MOF载酶生物催化的方法，循环利用相同量级生物合成再生产4次，每次抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的产量依次为：205mg/L、190mg/L、180mg/L、90mg/L。
实施例2中，在与实施例1中使用相同催化蛋白量的条件下，实施例2的累积产物产量是实施例1中的产物产量的4.8倍。
本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。

Claims (8)

1.一种用MOF载酶技术高效制备抗抑郁药前药L-4-Cl-犬尿氨酸的方法：包括以6-Cl-吲哚和L-丝氨酸为底物，加入磷酸吡哆醛，MOF复合酶为催化剂进行催化反应后，离心，上清液中加酸溶液进一步反应，提纯即得；
所述的MOF复合酶为MOF、Pf0A9酶和Tar13酶混合孵育获得，所述的MOF为HZIF-8。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法中的催化反应的体系中包括缓冲液，缓冲液的pH为 6.5~8.0。
3. 根据权利要求1所述的方法，所述的催化反应的条件是：25~37 oC反应24~48 h。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的酸溶液为pH小于等于2的溶液。
5. 根据权利要求1所述的方法，催化体系中包括：6-Cl-吲哚0.2~5mM、L-丝氨酸0.2~5mM、磷酸吡哆醛 0.01~0.05 mM、Pf0A9酶100~500 U/mL、Tar13酶100~500 U/mL，所述的浓度为该物质在催化体系中的终浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，加酸溶液反应的温度与催化反应温度相同。
7.根据权利要求1所述的方法，所述的HZIF-8的制备方法包括：
将1.5-3 mol/L三聚氰胺溶液和1.5-3 mol/L水杨酸溶液加入到0.05-0.20 mol/L硝酸锌水溶液中，60-80 oC恒温搅拌；将反应完的10-30 mL热混合物加入到70-100 mL己烷中，并加入表面活性剂，然后50-70 oC恒温搅拌；将反应混合物转移至冰水浴中搅拌；将25-40mL 0.5-2 mol/L2-甲基咪唑水溶液加入到冰水浴后的混合物中并移至常温搅拌；所得混合溶液离心并收集沉淀；离心得到的沉淀在60-80 oC水中悬浮；悬浮后离心并收集沉淀，最后用乙醇清洗后在烘箱中烘干。
8.权利要求1所述的方法在制备L-4-Cl-犬尿氨酸中的应用。
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