CN113549661B - 生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用 - Google Patents

生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术和发酵领域，具体公开了生物催化合成L‑4‑Cl‑犬尿氨酸或L‑4‑Br‑犬尿氨酸的方法及应用。本发明以廉价易得的6‑Cl/Br‑吲哚和L‑丝氨酸为底物，在Pf0A9酶和Tar13酶的串联催化下一步合成L‑4‑Cl/Br‑犬尿氨酸。同时通过构建Pf0A9‑Tar13双基因表达质粒，成功实现了L‑4‑Cl/Br‑犬尿氨酸的发酵生产。与之前已报道的有机和生物合成方法相比，本发明所构建的生物合成通路不仅降低了合成过程中所用酶的数量，而且还能应用于发酵生产，因此更加经济环保，具有很大的市场开发价值。

Description

生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及 应用
技术领域
本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用。
背景技术
通过N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptors，简称NMDARs)介导的谷氨酸能突触传递过度活跃是造成中枢敏化和持续的神经性疼痛的一个重要原因，目前为实现对N-甲基-D-门冬氨酸受体的阻断，除了使用氯胺酮等这类直接受体拮抗剂，还可通过对N-甲基-D-门冬氨酸受体复合物中的甘氨酸协同激动剂变构位点进行阻断来实现。其中，7-氯犬尿喹啉酸(7-chlorokynurenic acid)是最具药效和专一的甘氨酸(glycine B，GlyB)协同激动剂变构位点拮抗剂之一，但由于其较差的生物可用度而不能直接作为药物来用于治疗神经性疼痛。相比之下，L-4-氯犬尿氨酸(L-4-chlorokynurenine)作为7-氯犬尿喹啉酸的前体药物，不仅可以通过口服后快速被肠道吸收，并且能被大型神经氨基酸转运体通过主动运输穿越血脑屏障送达大脑神经部位。在大脑内，星形胶质细胞里的犬尿氨酸氨基转移酶(kynurenine aminotransferases，KATs)会将L-4-氯犬尿氨酸转化为7-氯犬尿喹啉酸，然后释放并作用于神经元GlyB位点来进行N-甲基-D-门冬氨酸受体的间接拮抗阻断。综上，L-4-氯犬尿氨酸可以作为前体药物来治疗由N-甲基-D-门冬氨酸受体过度兴奋引起的神经性疼痛疾病。
目前，L-4-氯犬尿氨酸的合成基本都是由有机合成方法来实现。但是目前的有机合成需要使用超低温等极端反应条件来进行合成，限制了其大规模合成，也造成了其造价成本较高。此外，L-4-氯犬尿氨酸类似物药物的研发也受到其类似物合成供应的制约，阻碍了其药物优化的研发进程。
本申请从目标产物的化学结构出发，通过从头设计其生物合成通路，将其原来的5步生物合成骤缩减至2步生物催化反应，大大提升目标产物的生产效率和产量。原来的生物合成L-4-氯犬尿氨酸需要5步生物合成的步骤，总共需要Tar14、Tar15、PtdH、Tar13、Tar16这5个蛋白完成L-4-氯犬尿氨酸的生物合成(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,8394–8399)。
目前尚无利用我们所提出的两步生物合成L-4-氯犬尿氨酸以及更高效的L-4-氯犬尿氨酸类似物等治疗神经性疼痛药物的相关报道。本申请为大规模生产L-4-氯犬尿氨酸以及更高效的L-4-氯犬尿氨酸类似物等治疗神经性疼痛药物提供一种新的高效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法，方法简单，适合大规模推广。
本发明的另一个目的在于提供了上述方法在制备L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法，包括以6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚和L-丝氨酸为底物，Pf0A9酶和Tar13酶为催化剂进行催化反应后，加酸溶液进一步反应，提纯即得。
所述的，Pf0A9酶为：色氨酸合成酶的类似酶(Tryptophan synthetasehomologue)；
Tar13酶为：色氨酸2,3双加氧酶的类似酶(Tryptophan 2,3,-dioxygenasehomologue)；
以上所述的方法中，优选的，所述方法中的催化反应的体系中还包括：磷酸吡哆醛；
以上所述的方法中，优选的，所述方法中的催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5～8.0；所述的缓冲液例如：KPi缓冲液，磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
以上所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～37℃反应24～48h；
以上所述的方法中，优选的，所述的酸溶液为pH小于等于2的溶液，例如盐酸、三氟乙酸、醋酸、甲酸等；最优选为三氟乙酸溶液；
以上所述的方法中，优选的，催化体系中包括：6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚0.2～5mM、L-丝氨酸0.2～5mM、磷酸吡哆醛0.01～0.05mM、Pf0A9酶100～500U/mL、Tar13酶100～500U/mL，所述的浓度为该物质在催化体系中的终浓度；
以上所述的方法中，优选的，加酸溶液反应的温度与催化反应温度相同；
以上所述的方法中，优选的，所述的缓冲液为如下两种缓冲溶液以体积比1：0.5～1：2混合：KPi缓冲液(50mM KH2PO4,pH＝8.0)和缓冲液(50mM Tris-HCl,20mM NaCl,10％甘油,pH＝8.0)。
以上所述的方法中，优选的，所述的提纯使用的方法包括：C18反相高效液相色谱柱，水(A相，含有0.1％甲酸(v/v))和乙腈(B相)为流动相，流速为0.75mL/min；0-5min5％B，5-15min 5-12％B，15-30min 12-15％B，30-35min 15-100％B，35-38min 100％B，38-40min100-5％B，40-45min 5％B。
一种L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的生物发酵生产方法，包括：
将Pf0A9-Tar13双基因表达质粒转入大肠杆菌中，诱导表达后加入6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚、L-丝氨酸和磷酸吡哆醛，将培养温度调至25～37℃并持续搅拌继续培养，然后加入酸溶液，经纯化后即得；
所述的Pf0A9-Tar13双基因表达质粒通过将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列插入到pACYCDuet-1载体的两个基因表达框中得到。
上述方法在制备L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明中，所述的L-4-Cl-犬尿氨酸的结构式为：
Figure BDA0002467741760000031
所述的L-4-Br-犬尿氨酸的结构式为：
Figure BDA0002467741760000032
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以廉价易得的6-Cl/Br-吲哚和L-丝氨酸为底物，在Pf0A9酶和Tar13酶的串联催化下一步合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸。
根据上述新的合成通路，申请人还构建Pf0A9-Tar13双基因表达质粒，成功实现了L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的发酵生产。与之前已报道的有机和生物合成方法相比，本发明所构建的生物合成通路不仅降低了合成过程中所用酶的数量，而且还能应用于发酵生产，因此更加经济环保，具有很大的市场开发价值。
本发明提供的2步L-4-氯犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸生物合成方法，该方法只需要总共2个蛋白(Pf0A9和Tar13)参与，并且该方法不仅可以用于生物合成L-4-氯犬尿氨酸，还能用于生物合成L-4-氯犬尿氨酸类似物。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
L-4-Cl-犬尿氨酸的体外生物合成制备方法，包括：
在50mL生物合成反应体系中加入6-Cl-吲哚(1mM)、L-丝氨酸(1mM)、磷酸吡哆醛(0.025mM)、Pf0A9酶(200U/mL)和Tar13酶(300U/mL)，其余为缓冲液；30℃反应36小时。反应结束后，加入2mLCF3COOH，30℃继续反应6h。待反应结束后，然后12000rpm离心10min，上清液过滤膜后用HPLC进行分离纯化得到L-4-Cl-犬尿氨酸，产量为180mg/L。
以上所述的浓度为体系中物质的终浓度；
所述的缓冲液为以下两种缓冲溶液以体积比1：1混合：KPi缓冲液(50mM KH2PO4,pH＝8.0)和缓冲液(50mM Tris-HCl,20mM NaCl,10％甘油,pH＝8.0)。
所述的分离纯化使用的方法包括：C18反相高效液相色谱柱，水(A相，含有0.1％甲酸(v/v))和乙腈(B相)为流动相，流速为0.75mL/min；0-5min 5％B，5-15min 5-12％B，15-30min 12-15％B，30-35min 15-100％B，35-38min 100％B，38-40min 100-5％B，40-45min5％B。
分离出的L-4-Cl-犬尿氨酸进行结构验证后氢谱数据与文献值一致。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ＝7.63(d,J＝8.8,1H),6.69(d,J＝2.1,1H),6.47(dd,J＝8.7,2.1,1H),3.90(dd,J＝8.9,2.6,1H),3.58(dd,J＝18.6,2.8,1H),3.40(dd,J＝18.7,9.0,1H).
得到的产物L-4-Cl-犬尿氨酸的分子结构式为：
Figure BDA0002467741760000041
实施例2：
L-4-Br-犬尿氨酸的体外生物合成制备方法，包括：
反应步骤：在50mL生物合成反应体系中加入6-Br-吲哚(1mM)、L-丝氨酸(1mM)、磷酸吡哆醛(0.025mM)、Pf0A9酶(200U/mL)和Tar13酶(300U/mL)，其余为缓冲液，30℃反应36小时。反应结束后，加入2mLCF3COOH，30℃继续反应6h。待反应结束后，然后12000rpm离心10min，上清液过滤膜后用HPLC进行分析，得率为200mg/L。而分离出的L-4-Br-犬尿氨酸进行结构验证后氢谱数据与文献值一致。
所述的分离纯化使用的方法包括：C18反相高效液相色谱柱，水(A相，含有0.1％甲酸(v/v))和乙腈(B相)为流动相，流速为0.75mL/min；0-5min 5％B，5-15min 5-12％B，15-30min 12-15％B，30-35min 15-100％B，35-38min 100％B，38-40min 100-5％B，40-45min5％B。
所述的缓冲液为以下两种缓冲溶液以体积比1：1混合：KPi缓冲液(50mM KH2PO4,pH＝8.0)和缓冲液(50mM Tris-HCl,20mM NaCl,10％甘油,pH＝8.0)。
得到的产物L-4-Br-犬尿氨酸的分子结构式为：
Figure BDA0002467741760000051
实施例3：
L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的微生物发酵生产：
1)Pf0A9-Tar13双基因表达质粒的构建：
Pf0A9-Tar13双基因表达质粒为将Pf0A9基因(SEQ ID NO.1所示)和Tar13基因(SEQ ID NO.2所示)分别插入到pACYCDuet-1载体的两个基因表达框中得到；
2)生物发酵：
Pf0A9-Tar13双基因表达质粒转入BL21感受态细胞，涂布平板，12h后挑取单菌落于50mL LB肉汤中，加入氯霉素抗生素(50μg/mL)，37℃220rpm培养至OD600达到0.6时，加入诱导剂IPTG(0.2mM)，加入6-Cl-吲哚(1mM)、L-丝氨酸(1.1mM)和磷酸吡哆醛(0.025mM)，将培养温度调至30℃并以转速220rpm继续培养36h，然后加入2mL CF3COOH，继续反应6h，反应结束后12000rpm离心10min，上清液过滤膜后用HPLC进行分离纯化：C18反相高效液相色谱柱，水(A相，含有0.1％甲酸(v/v))和乙腈(B相)为流动相，流速为0.75mL/min；0-5min 5％B，5-15min 5-12％B，15-30min 12-15％B，30-35min 15-100％B，35-38min 100％B，38-40min 100-5％B，40-45min 5％B。L-4-Cl-犬尿氨酸的产量为0.15克每升发酵液。
上述生物发酵过程中，将6-Cl-吲哚换成6-Br-吲哚，也能完成L-4-Br-犬尿氨酸的发酵生产。
序列表
<110> 立科时代（武汉）生物科技有限公司
<120> 生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggtttg gcgaattcgg cggccaatac gttccggaaa ccctcgtggg cccgctgaag 60
gagctggaaa aagcgtacaa gcgcttcaag gacgacgagg agttcaatcg ccagctgaac 120
tactacctga agacgtgggc cggtcgtcca accccactgt actacgccaa acgcctgacc 180
gagaaaatcg gtggcgccaa ggtgtatctg aagcgcgaag atctcgtgca cggtggcgcg 240
cataaaacca acaacgcgat cggtcaggcc ctgctggcca aactcatggg caaaacccgc 300
ctgattgcgg aaaccggtgc gggtcaacat ggtgttgcca ccgccatggc gggtgcgctg 360
ctgggcatga aagtggacat ctacatgggc gcggaggacg ttgagcgcca gaaactgaac 420
gtgttccgca tgaagctgct gggcgcgaat gttattccag tgaacagtgg cagccgcacg 480
ctgaaggatg cctttgatga agccctgcgc gattgggttg cgaccttcga gtacacccac 540
tacctgattg gcagcgttgt tggtccgcat ccatacccga ccatcgtgcg cgattttcag 600
agcgttatcg gccgtgaagc gaaagcccag atcctcgaag cggaaggtca gctgccagat 660
gttatcgtgg cgtgtgtggg cggcggtagt aacgccatgg gcatcttcta cccgttcgtg 720
aatgacaaaa aagttaagct ggtgggtgtt gaagcgggcg gtaaaggcct ggaaagcggc 780
aagcacagtg ccagtctgaa cgccggtcag gtgggcgtga gccatggtat gctgagctac 840
ttcctgcagg atgaggaggg tcagatcaag ccgagtcaca gtattgcccc aggtctggat 900
catccaggtg tgggtccgga acacgcctac ctgaagaaga ttcagcgcgc ggaatacgtg 960
gccgttacgg acgaagaagc cctgaaagcc ttccacgaac tgagccgtac ggaaggcatc 1020
atcccagcgc tcgaaagtgc gcatgcggtt gcctatgcga tgaagctggc gaaggagatg 1080
agccgcgacg agatcatcat cgttaacctg agcggccgcg gtgacaagga cctggacatc 1140
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<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaccgaac gcacggcgac ccgtaccgaa ccagcctatg gcgaaattct gcgtctggat 60
gaactgctgg aactggcgtg cgttaatgat gaagcggatc gcgcgctgtt tctgagcgcc 120
catcaagcgt gcgaaatctg gttcgccgtt gttctgcgcc atctggagga tgttaccgat 180
gcgctgagtc tggatgatgg tgcgaccgcc gccgaactgc tcgaacgtct gccacgcatc 240
atcaccgtga tcatcgagca cttcgaggtg ctgggcacgc tgaaaccgga agcgtttgat 300
cgcatccgcg ccgatctggg cagcagcagt ggcttccaga gcgttcagta ccgcgaaatc 360
gagtatctgt gcggtgcgcg cgatacccgc tttctgaaca ccgccggttt tcgcgatcgt 420
gatcgtcgtc gtctgcgcga acgtctggcc aagcgtagtc tgagcaacgt ttttctggaa 480
taccgcggtc gcgcgggtga tcgtgatgcg tgccgcatca gcgatgcgct gcatgaattc 540
gacgatagcg ttcgtgcgct gcgtctgcgt catgccggca ttgccgaact gtttctgggc 600
agcattccgg gcaccgcggg taccgccggt gcggcgtatc tgcgtcgtag tgcgagccgc 660
acgctgttcc cggaactgtt cgatcgccgt gccagcggta cgggtggcta a 711

Claims (9)

1.一种生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法，包括以6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚和L-丝氨酸为底物，Pf0A9酶和Tar13酶为催化剂进行催化反应后，加酸溶液进一步反应，提纯即得，所述方法中的催化反应的体系中包括：磷酸吡哆醛。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法中的催化反应的体系中包括缓冲液，缓冲液的pH为 6.5~8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的催化反应的条件是：25~37 oC反应24~48 h。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的酸溶液为pH小于等于2的溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，催化体系中包括：6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚0.2~5mM、L-丝氨酸0.2~5mM、磷酸吡哆醛 0.01~0.05 mM、Pf0A9酶100~500 U/mL、Tar13酶100~500 U/mL，所述的浓度为该物质在催化体系中的终浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，加酸溶液反应的温度与催化反应温度相同。
7.根据权利要求2所述的方法，所述的缓冲液为如下两种缓冲溶液以体积比1：0.5~ 1：2混合：KPi缓冲液50 mM KH2PO4, pH = 8.0和缓冲液50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10%甘油, pH = 8.0。
8.一种L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的生物发酵生产方法，包括：
将Pf0A9-Tar13双基因表达质粒转入大肠杆菌中，诱导表达后加入6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚、L-丝氨酸和磷酸吡哆醛，将培养温度调至25~37oC并持续搅拌继续培养，然后加入酸溶液，经纯化后即得；
所述的Pf0A9-Tar13双基因表达质粒通过将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列插入到pACYCDuet-1载体的两个基因表达框中得到。
9.权利要求1或权利要求8所述的方法在制备L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸中的应用。
CN202010338765.1A 2020-04-26 2020-04-26 生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用 Active CN113549661B (zh)

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