CN112457307B - 一种r-奎宁醇的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取R‑3‑奎宁醇的方法，涉及奎宁醇提取制备技术领域。本发明所述方法将催化合成R‑3‑奎宁醇的反应液与碳酸钾进行混合，形成R‑3‑奎宁醇粗品，使得R‑3‑奎宁醇和水相完全分离，从而降低了R‑3‑奎宁醇的流失，提高了R‑3‑奎宁醇的回收率；将粗品R‑3‑奎宁醇热溶于乙酸乙酯中，减少了乙酸乙酯的浪费，不但降低了产品的成本，而且降低了环境污染；采用低温晶体析出，得到的R‑3‑奎宁醇产品纯度高，其光学纯度达到100％，而且回收率达到95～98％，为生物催化合成药物或者药物中间体的纯化提供新的思路及开辟新的途径,同时为微生物复杂环境中的开发应用提供更广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于奎宁醇提取制备技术领域，具体涉及一种R-奎宁醇的提取方法。
背景技术
R-3-奎宁醇是很多抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛、瑞伐托酯等都是含有R-3-奎宁醇结构的最新抗胆碱药物，对于治疗尿失禁和慢性阻塞性肺病(COPD)有很好的疗效，而是用于治疗有尿急、尿频症状的膀胱过度活动症原料药琥珀酸索菲那新的中间体；索非那新中间体。R-奎宁醇品质的好坏以及价格的高低对于由其合成药物的品质及生产成本有着很重要的影响。因此对R-奎宁醇合成的研究具有很重要的意义。
目前，国内外文献专利所报道的R-奎宁醇的合成方法主要是化学法和生物法两种。化学合成R-3-奎宁醇法：(1)不对称催化加氢还原方法，以3-奎宁酮为原料，利用各种手性催化剂，以氢气为氢源，将3-奎宁酮还原成R-3-奎宁醇，然后利用乙酸乙酯进行萃取纯化，其结果导致其纯度较低；(2)不对称拆分方法，利用各种手性拆分剂将消旋的3-奎宁醇拆分得到R-3-奎宁醇，然后利用乙酸乙酯进行萃取纯化，在产物里，会残留金属催化剂，其纯度较低；(3)磺酰胺-钌络合物方法，将醇和3-奎宁酮在碱和手性磺酰胺-钌络合物的作用下，进行反应获得，然后采取多次丁酮和丙酮依次对产物进行重结晶方法，获得R-3-奎宁醇纯品。生物合成R-3-奎宁醇法:具有反应条件温和、转化率高、立体选择性强多种优点，主要是以奎宁酮盐酸盐为底物催化合成R-3-奎宁醇(Zhenhua Jia,Hong Ma,Yali,Huang etal..Production of(R)-3-quinuclidinol by a whole-cell biocatalyst with highefficiency.Biocatalysis and Biotransformation,2017,36:4,316-323)，其纯化条件主要是利用乙酸乙酯或者利用碳酸钾和乙酸乙酯进行萃取获得纯品，由于奎宁醇在乙酸乙酯中的溶解度较小，萃取R-3-奎宁醇效率较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取R-3-奎宁醇的方法，工艺路线简单，条件温和，环境友好，原子经济性高，对R-3-奎宁醇的收率高，得到的产品质量和纯度高，并成功地解决了在温和条件下从反应液中提取纯化产物的问题，解决了传统耗能大，溶剂萃取不充分，溶剂不能套用等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提取R-3-奎宁醇的方法，包括以下步骤：(1)将生物催化合成R-3-奎宁醇的反应液与碳酸钾混合，得反应液乳浊液；
(2)将所述反应液浑浊液与乙酸乙酯搅拌混匀，静置分层后，弃去底层水相，将剩余3层在200rpm转速下混匀，加热温度升至50～70℃时停止旋转，静置不少于60min，弃去沉淀，得R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液；
(3)析出所述R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液中的晶体，干燥、粉碎后得白色粉状R-3-奎宁醇。
优选的，步骤(1)所述反应液包括利用工程菌BW25113催化合成R-3-奎宁醇的反应液。
优选的，步骤(1)所述混合时，包括将所述反应液与饱和碳酸钾溶液混合，或向所述反应液中添加碳酸钾反应液与饱和碳酸钾溶液的体积比为1：3～3：1。
优选的，经所述混合后，反应液乳浊液碳酸钾的质量百分浓度为25～75％。
优选的，步骤(2)中所述乙酸乙酯的体积为所述反应液浑浊液体积的0.5～2倍。
优选的，将所述乙酸乙酯和所述反应液浑浊液搅拌混匀，搅拌的时间不低于30min。
优选的，步骤(2)所述静置分层的时间不低于60min。
优选的，步骤(3)中，将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液放置0～8℃温度下过夜，析出R-3-奎宁醇晶体，或者利用真空旋蒸将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液在50～70℃进行浓缩，获得晶体。
本发明提供一种提取R-3-奎宁醇的方法，具有以下有益效果：
(1)将催化合成R-3-奎宁醇的反应液与一定比例的碳酸钾溶液进行混合，充分的利用了R-3-奎宁醇和碳酸钾溶解度不同，使它们在水溶液中竞争性溶解，致使R-3-奎宁醇从反应液中析出，形成R-3-奎宁醇粗品，使得R-3-奎宁醇和水相完全分离，从而降低了R-3-奎宁醇的流失，提高了R-3-奎宁醇的回收率，为R-3-奎宁醇进一步纯化提供了一条新途径。
(2)将粗品R-3-奎宁醇热溶于乙酸乙酯中，使得R-3-奎宁醇得到进一步纯化，致使克服了其他溶剂对R-3-奎宁醇纯化不好的缺点，而且乙酸乙酯实行套用，以至于减少了乙酸乙酯的浪费，不但降低了产品的成本，而且降低了环境污染，因此，该方法具显著的经济效益与环保效益。
(3)该技术采用了低温晶体析出，得到的R-3-奎宁醇产品纯度高，其光学纯度达到100％，而且回收率达到95～98％，这很大程度上降低了R-3-奎宁醇的成本，为生物催化合成药物或者药物中间体的纯化提供新的思路及开辟新的途径,同时为微生物复杂环境中的开发应用提供更广阔的前景。
具体实施方式
本发明提供了一种提取R-3-奎宁醇的方法，包括以下步骤：(1)将生物催化合成R-3-奎宁醇的反应液与碳酸钾混合，得反应液乳浊液；
(2)将所述反应液浑浊液与乙酸乙酯搅拌混匀，静置分层后，弃去底层水相，将剩余3层在200rpm转速下混匀，加热温度升至50～70℃时停止旋转，静置不少于60min，弃去沉淀，得R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液；
(3)析出所述R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液中的晶体，干燥、粉碎后得白色粉状R-3-奎宁醇。
本发明将生物催化合成R-3-奎宁醇的反应液与碳酸钾混合，得反应液乳浊液，所述反应液优选包括利用工程菌BW25113催化合成R-3-奎宁醇的反应液，且工程菌BW25113催化合成R-3-奎宁醇的反应液已经在文章中公开(Zhenhua Jia,Hong Ma,Yali,Huang etal..Production of(R)-3-quinuclidinol by a whole-cell biocatalyst with highefficiency.Biocatalysis and Biotransformation,2017,36:4,316-323)。
本发明所述混合时，优选包括将所述反应液与饱和碳酸钾溶液混合，或向所述反应液中添加碳酸钾。其中，所述反应液与饱和碳酸钾溶液的体积比优选为1：3～3：1，更优选为1：2～2：1，最优选为1：1。本发明所述饱和碳酸钾溶液优选为20～80℃时的饱和溶液，即为110～139g/ml，更优选为114～126g/ml，最优选为117g/ml；如果在反应液中加入的是固体碳酸钾，则加入碳酸钾的量优选为55～69g/ml，更优选为57-63g/ml，最优选为59g/ml；经所述混合后，反应液乳浊液碳酸钾的质量百分浓度优选为25～75％。
本发明将所述反应液浑浊液与乙酸乙酯搅拌混匀，静置分层后，弃去底层水相，将剩余3层在200rpm转速下混匀，加热温度升至50～70℃时停止旋转，静置不少于60min，弃去沉淀，得R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液。本发明优选向所述反应液乳浊液加入0.5～2倍的乙酸乙酯进行萃取，200rpm转速混匀，混匀时间不低于30min，将获得的反应液和乙酸乙酯的混合物进行静置，静置时间大于60min，混合液会分层为四层，其中最底层为水相，将水相弃掉，将剩余三层在200rpm转速下加热混匀，当温度升至50℃～70℃后，停止旋转，混合液进行静置，静置时间大于60min，弃掉沉淀，得到R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液。在本发明中，所述乙酸乙酯的加入量优选为反应乳浊液的0.5～2倍，更优选为0.8～1.5倍，最优选为1倍。本发明所述反应乳浊液和乙酸乙酯混合时，其温度直接影响到R-3-奎宁醇溶解度，其温度优选为50℃～70℃，更优选为55℃-65℃，最优选为60℃。
本发明析出所述R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液中的晶体，干燥、粉碎后得白色粉状R-3-奎宁醇。本发明优选将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液放置0～8℃温度下过夜，析出R-3-奎宁醇晶体，或者利用真空旋蒸将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液在50～70℃进行浓缩，获得晶体。在本发明中，采用低温析出方法获得高纯度的R-3-奎宁醇，其最佳析出R-3-奎宁醇晶体的温度为0℃～8℃，优选为2℃～7℃，更优选为4℃，析出R-3-奎宁醇晶体纯度为100％；如果利用真空旋蒸浓缩方法获得R-3-奎宁醇晶体，其温度也是关键因子，最佳旋蒸温度为50℃～70℃，优选为55℃-65℃，更优选为60℃，同样获得的R-3-奎宁醇晶体浓度为100％。
下面结合实施例对本发明提供的一种提取R-3-奎宁醇的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
工程酶的制备
将构建的工程菌BW25113(pAQkg-YG4，Zhenhua Jia,Hong Ma,Yali,Huang etal..Production of(R)-3-quinuclidinol by a whole-cell biocatalyst with highefficiency.Biocatalysis and Biotransformation,2017,36:4,316-323)，该菌株在LB培养基中复活，将复活的菌株培养液接种于LB培养基中，进行IPTG诱导培养。培养条件为：37℃、pH为7.0、250rpm。诱导条件为：30℃诱导，IPIG浓度为0.6mM，诱导时间为8小时。将菌液在6000rpm转速下离心20min，收集菌体，获得工程酶备用。
实施例2
催化合成R-3-奎宁醇反应
借鉴文章(Zhenhua Jia,Hong Ma,Yali,Huang et al..Production of(R)-3-quinuclidinol by a whole-cell biocatalyst with high efficiency.Biocatalysisand Biotransformation,2017,36:4,316-323)和专利(申请号为：201811533994.8)的方法进行催化合成R-3-奎宁醇反应，按照最佳反应条件进行催化合成反应，即磷酸二氢钠10g/L、磷酸氢二钠27g/L、葡萄糖400g/L、奎宁酮250g/L，辅酶(100mM NAD+)0.1mL，调节转化液pH值到7.0，加入实施1中发酵的工程酶45g(湿重)。30℃进行转化反应。反应过程中pH维持在pH7.0。反应时间为7小时，GC检测反应完全，收集反应液，备用。
实施例3
碳酸钾的终浓度对R-3-奎宁醇反应回收率的影响
在纯化R-3-奎宁醇反应的初步试验中，发现不同的碳酸钾浓度会影响R-3-奎宁醇反应的回收率，根据试验的初步结果，在R-3-奎宁醇反应液中分别加入终浓度为55g/ml、57g/ml、59g/ml、63g/ml、69g/ml碳酸钾溶液或者固体碳酸钾，温度加热至60℃，加入等体积的乙酸乙酯混合。在4℃下进行晶体析出，获得R-3-奎宁醇晶体进行干燥、称重、光学纯度(e.e.％)检测，结果如表1，R-3-奎宁醇的回收率和纯度都受到碳酸钾浓度的影响，当碳酸钾在反应液中的终浓度为59g/ml时，其回收率达到99％，光学纯度达到100％，而在碳酸钾其他浓度下，获得的R-3-奎宁醇回收率和光学纯度都有一定程度的下降。
表1碳酸钾浓度对R-3-奎宁醇反应的回收率的影响
| K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>浓度(g/ml) | 55 | 57 | 59 | 63 | 69 |
| 回收率(％) | 80 | 89 | 99 | 96 | 93 |
| 光学纯度(e.e.％) | 87 | 91 | 100 | 100 | 100 |
实施例4
乙酸乙酯用量对R-3-奎宁醇反应的回收率的影响
在R-3-奎宁醇反应液中加入终浓度为59g/ml的碳酸钾，取1L上述反应液，分别加入300ml，500ml，1000ml，1200ml，1500ml的乙酸乙酯，反应液和乙酸乙酯混合到60℃，在4℃下进行晶体析出，获得R-3-奎宁醇晶体进行干燥、称重、光学纯度(e.e.％)检测，结果如表2，R-3-奎宁醇的回收率和纯度都受到乙酸乙酯量的影响，当乙酸乙酯与反应液等体积时，其回收率达到99％，光学纯度达到100％，而在乙酸乙酯其他用量时，获得的R-3-奎宁醇回收率和光学纯度都有一定程度的下降。
表2乙酸乙酯用量对R-3-奎宁醇反应的回收率的影响
| 乙酸乙酯用量(ml) | 300 | 500 | 1000 | 1200 | 1500 |
| 回收率(％) | 36 | 65 | 99 | 94 | 91 |
| 光学纯度(e.e.％) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提取R-3-奎宁醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物催化合成R-3-奎宁醇的反应液与碳酸钾混合，得反应液乳浊液；所述反应液为利用工程菌BW25113催化合成R-3-奎宁醇的反应液；所述混合时，包括将所述反应液与饱和碳酸钾溶液混合，或向所述反应液中添加碳酸钾；所述反应液与饱和碳酸钾溶液的体积比为1：3～3：1；经所述混合后，反应液乳浊液碳酸钾的质量百分浓度为25～75％；
(2)将所述反应液乳浊液与乙酸乙酯搅拌混匀，静置分层后，弃去底层水相，将剩余3层在200rpm转速下混匀，加热温度升至50～70℃时停止旋转，静置不少于60min，弃去沉淀，得R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液；
(3)析出所述R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液中的晶体，干燥、粉碎后得白色粉状R-3-奎宁醇。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙酸乙酯的体积为所述反应液乳浊液体积的0.5～2倍。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，将所述乙酸乙酯和所述反应液乳浊液搅拌混匀，搅拌的时间不低于30min。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述静置分层的时间不低于60min。
5.根据 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液放置0～8℃温度下过夜，析出R-3-奎宁醇晶体，或者利用真空旋蒸将R-3-奎宁醇乙酸乙酯溶液在50～70℃进行浓缩，获得晶体。
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