CN103710405A - 一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法，化合物1在酮还原酶、助溶剂、辅酶和辅酶循环系统的作用下发生还原反应生成所述的孟鲁斯特中间体，助溶剂由体积比为2～4∶1的异丙醇和甲苯组成，辅酶循环系统由葡萄糖和葡萄糖脱氢酶组成，还原反应在pH为7～8.5的缓冲溶液中进行，反应温度为25～40℃。本发明方法通过对助溶剂、辅酶循环系统、反应条件的改进，实现了更高的反应效率和更加绿色、环保的生物转化过程，解决了化学法生产孟鲁斯特中间体中的效率低和污染问题；解决了生物法生产孟鲁斯特中间体中危险和反应控制困难等问题。

Description

一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体地涉及一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法。
背景技术
孟鲁斯特(Montelukast，CAS号158966-92-8)是美国默克公司研究开发的一种选择性白三烯受体拮抗剂（LTRA），商品名顺尔宁(英文商品名Singulair)，其结构式如化合物2所示。孟鲁斯特适用于15岁及15岁以上成人哮喘的预防和长期治疗，包括预防白天和夜间的哮喘症状，治疗对阿司匹林敏感的哮喘患者以及预防运动诱发的支气管收缩，也适用于减轻过敏性鼻炎引起的症状。
哮喘是世界范围内的常见病，被WHO列为四大顽疾之一，由于环境污染而变得日趋严重。由于孟鲁斯特是目前唯一一种每日服一次的LTRA药物，应用范围较广，服用方便，目前已经得到临床医师的广泛认同及临床应用。1998年该药获批上市后，2004年销售额达到24亿美元，具有重要的市场价值。
Figure BDA0000450531250000011
孟鲁斯特的分子结构由美国专利5,565,473，该专利于2012年8月3日到期。因此，能够有效地合成化合物2将具有广阔的应用前景。孟鲁斯特分子虽然较为复杂，但是只含有一个手性碳原子，因此很多公司用化合物3所示的分子作为合成孟鲁斯特的前体：
Figure BDA0000450531250000012
化合物3分子可以由化合物1所示的分子，在催化剂的存在下通过不对称还原获得：
Figure BDA0000450531250000021
在由式化合物1制备化合物3的化学法生产工艺中，由于其含有大量的活泼基团，利用常见的化学还原方法并没有良好的效果。迄今为止，文献报道的唯一有效方法是利用(-)-二异松蒎基氯硼烷类催化剂（(-)-DIP-Cl）进行不对称加氢催化(J.Am.Chem.Soc.1996,118,2521和WO2008/009970)。(-)-DIP-Cl催化剂虽然应用广泛，但是仍存在诸多问题，如成本高，原子经济性差，操作步骤繁琐，分离复杂，污染严重等。
与化学法相比，生物转化方法条件温和，效率高，三废少，是具有极高工业化应用价值的技术。生物转化方法能够有效地实现类似的还原反应。Codexis公司开发的利用基因改造过的来自高加索乳酸杆菌(LactobacillusKefir)的酮还原酶(KRED)还原该中间体对应的酮得到手性醇（Org.ProcessRes.Dev.2010,14,193和WO2009/042984A1）。该反应存在的主要问题是在45℃下进行，温度较高，由于该方法采用异丙醇作为氢供体，会产生易挥发、易燃、高毒性的丙酮副产物，从而生产有较大安全隐患。此外，由于丙酮对反应平衡不利，需在较高温度下进行负压力控制，工艺稳定性控制较难（例如必须采用密封的反应容器，氮气保护，控制反应压强等），对生产设备和中控要求高；同时较高的反应温度不符合绿色化学的基本原则，能耗大。由于温度高，该工艺放大生产时由于异丙醇和丙酮难以控制，易导致酶的活性和稳定性下降，直接影响了酶催化的工艺稳定性，阻碍了该酶催化工艺的规模化放大生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种反应条件绿色、温和、无毒副产物，同时工艺更稳定和更易产业化的生物法制备孟鲁斯特中间体的方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法，化合物1在酮还原酶、助溶剂、辅酶和辅酶循环系统的作用下发生还原反应生成所述的孟鲁斯特中间体，所述的助溶剂由体积比为2～4:1的异丙醇和甲苯组成，所述的辅酶循环系统由葡萄糖和葡萄糖脱氢酶组成，所述的还原反应在pH为7～8.5的缓冲溶液中进行，反应温度为25～40℃，
所述的化合物1的结构式为：
Figure BDA0000450531250000031
所述的孟鲁斯特中间体的结构式为：
Figure BDA0000450531250000032
优选地，所述的酮还原酶的商品名为EW133。
优选地，在起始状态的反应体系中，所述的异丙醇与所述的化合物1的质量比为2～3:1。
优选地，所述的辅酶为NAD或NADP。
优选地，在起始状态的反应体系中，所述的辅酶与所述的化合物1的质量比为0.0015～0.06:1。
优选地，在起始状态的反应体系中，所述的葡萄糖与化合物1的质量比为0.9～1.1:1。
优选地，在起始状态的反应体系中，所述的化合物1的浓度为5～120mg/mL，所述的化合物1、所述的酮还原酶、葡萄糖脱氢酶的质量比为1:0.02～0.5:0.02～0.5。
优选地，所述的缓冲溶液为0.09～0.5mol/l、pH为7.5～8.5的三乙醇胺-盐酸缓冲溶液。
具体地，制备孟鲁斯特中间体的方法具体步骤如下：将所述的化合物1、所述的甲苯、所述的异丙醇、所述的葡萄糖加入反应器中，搅拌均匀；将所述的酮还原酶、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的辅酶溶解在所述的缓冲溶液中形成混合溶液，将所述的混合溶液加入到所述的反应器中搅拌反应，6～24小时后，加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥、过滤、浓缩后即得所述的孟鲁斯特中间体。
上述原料均可市购获得，酮还原酶购自苏州汉酶生物技术有限公司、商品名为EW133。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明方法通过对助溶剂、辅酶循环系统、反应条件的的优化，实现了高反应效率和更加绿色、温和的生物转化过程，解决了化学法生产孟鲁斯特中间体中的效率低和污染问题；解决了生物法生产孟鲁斯特中间体中反应温度高，产生毒副产品等危险和反应控制困难等问题。
具体实施方式
本发明的反应式如下：
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1：酶的筛选
在5mL的反应器中加入10mg化合物1，400μL助溶剂乙腈，20mg葡萄糖搅拌均匀；称取5mg不同种类的市售酮还原酶酶粉，5mg葡萄糖脱氢酶(GDH)和0.36mg NAD溶于1400μL pH8.0的三乙醇胺-盐酸缓冲溶液中，并将此混合溶液加入至反应器中搅拌，30℃水浴开始反应；6小时后取样HPLC检测，各反应转化率和产物光学纯度见表1。
表1
酶 转化率 光学纯度
EW110 3% >99%
EW112 79% 43%
EW115 67% 98%
EW117 32% >99%
EW120 5% 92%
EW130 7% >99%
EW133 98% >99%
其中，EW110、EW112、EW115、EW117、EW120、EW130、EW133均购自苏州汉酶生物技术有限公司。
实施例2：EW133酶反应验证
向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物1，1.5mL异丙醇，0.5mL甲苯和3mL、0.1M、pH8.0的三乙醇胺-盐酸缓冲液，用磁力搅拌子缓慢搅拌成均匀状。再投入50mg葡萄糖，用25%NaOH溶液调节pH至8.0。最后向反应瓶中投入5mg EW133酶粉，5mg GDH，3mg NADP。将反应瓶置于35℃水浴锅中300rpm搅拌（由于底物难以溶解，故需根据搅拌器及桨叶等因素控制合适的转速保证搅拌均匀且液面稳定，液体不飞溅）。反应8h，取样中控，转化率99.8%，HPLC图谱见图1（底物保留时间为14.463min，产物保留时间为8.575min）。
实施例3：EW133助溶剂的优化
向10mL圆底烧瓶中依次加入50mg化合物1，50mg葡萄糖，不同的助溶剂，10mg EW133，10mg GDH，1mg NADP，3ml、0.1M、pH8.0的三乙醇胺-盐酸缓冲液中，35℃下搅拌，24小时取样检测，结果如表2所示。
表2
助溶剂 转化率
1.5ml异丙醇+0.5ml甲苯 98%
1.5ml甲醇+0.5ml甲苯 20%
1.5ml乙醇+0.5ml甲苯 23%
2ml异丙醇 67%
实施例4：EW133放大反应
在2L的反应器中加入100g化合物1，100mL甲苯，300ml异丙醇以及100g葡萄糖，搅拌均匀；称取2g EW133酶粉、2g GDH酶粉和0.15gNAD溶于600mL、0.1M、pH8.0的三乙醇胺-盐酸缓冲液中，并将此混合溶液加入至反应器中搅拌，35℃水浴开始反应（由于底物难以溶解，故需根据搅拌器及桨叶等因素控制合适的转速保证搅拌均匀且液面稳定，液体不飞溅）；24小时后HPLC检测，底物转化率为99%。加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥过滤，浓缩得到固体产物95g，收率为95%，纯度为98%，光学纯度为99.9%，HPLC图谱见图2（S-产物保留时间为13.202min，R-产物保留时间为11.234min。）。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：化合物1在酮还原酶、助溶剂、辅酶和辅酶循环系统的作用下发生还原反应生成所述的孟鲁斯特中间体，所述的助溶剂由体积比为2～4:1的异丙醇和甲苯组成，所述的辅酶循环系统由葡萄糖和葡萄糖脱氢酶组成，所述的还原反应在pH为7～8.5的缓冲溶液中进行，反应温度为25～40℃，
所述的化合物1的结构式为：
所述的孟鲁斯特中间体的结构式为：
Figure FDA0000450531240000012
2.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：所述的酮还原酶的商品名为EW133。
3.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：在起始状态的反应体系中，所述的异丙醇与所述的化合物1的质量比为2～3:1。
4.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：所述的辅酶为NAD或NADP。
5.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：在起始状态的反应体系中，所述的辅酶与所述的化合物1的质量比为0.0015～0.06:1。
6.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：在起始状态的反应体系中，所述的葡萄糖与化合物1的质量比为0.9～1.1:1。
7.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：在起始状态的反应体系中，所述的化合物1的浓度为5～120mg/mL，所述的化合物1、所述的酮还原酶、葡萄糖脱氢酶的质量比为1:0.02～0.5:0.02～0.5。
8.根据权利要求1所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为0.09～0.5mol/l、pH为7.5～8.5的三乙醇胺-盐酸缓冲溶液。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于：其具体步骤如下：将所述的化合物1、所述的甲苯、所述的异丙醇、所述的葡萄糖加入反应器中，搅拌均匀；将所述的酮还原酶、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的辅酶溶解在所述的缓冲溶液中形成混合溶液，将所述的混合溶液加入到所述的反应器中搅拌反应，6～24小时后，加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥、过滤、浓缩后即得所述的孟鲁斯特中间体。
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