CN104805148B - 一种(1r,2s)-n-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法 - Google Patents

一种(1r,2s)-n-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种(1R,2S)‑N‑吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，中间体在酮还原酶、辅酶及辅酶再生体系的存在下，在pH 7~9.5的缓冲溶液中，在20℃~50℃下反应生成(1R,2S)‑N‑吡咯烷基去甲麻黄碱，其中，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、或者异丙醇，在起始反应体系中，中间体的浓度为90~150g/L，酮还原酶、辅酶与中间体的投料质量比为0.01~0.03:0.001~0.003:1。本发明从廉价易得的底物出发得到中间体，然后利用酮还原酶对S构型的中间体进行不对称还原，得到(1R,2S)‑N‑吡咯烷基去甲麻黄碱，剩余的R构型中间体在反应条件下发生自发消旋，使产品的产率超过50%的理论收率，降低了生产成本。

Description

一种(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法。
背景技术
(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱是合成重要的抗艾滋药物依非韦伦(efavirenz)的关键手性中间体(EP 0582455，WO 9520389和WO 9637457等)。合成(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱通常使用的方法如附图1所示(US5856492和J.Org.Chem.1998,63,8536-8543等)。该合成方法需要用到去甲麻黄碱作为原料，去甲麻黄碱为易制毒的管制原料，而且价格高，从而使得生产成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生产成本低的一种(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，中间体在酮还原酶、辅酶及辅酶再生系统的存在下，在pH7～9.5的缓冲溶液中，在20℃～50℃下反应生成所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱，其中，所述的氢供体为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、或者异丙醇，在起始反应体系中，所述的中间体的浓度为90～150g/L，所述的酮还原酶、所述的辅酶与所述的中间体的投料质量比为0.01～0.03:0.001～0.003:1，
所述的中间体的结构式为：(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)，
所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱为：
具体地，所述的酮还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW104的酮还原酶。
具体地，所述的辅酶为NADP。
具体地，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
具体地，所述的缓冲溶液的pH为7.5～8.5，摩尔浓度为95～105mM。
具体地，所述的反应温度为30℃～40℃。
具体地，在起始反应体系中，所述的中间体的浓度为95～105g/L，所述的酮还原酶、所述的辅酶与所述的中间体的投料质量比为0.018～0.022:0.0018～0.0022:1。
具体地，当所述的辅酶再生体系为异丙醇时，所述的异丙醇与所述的缓冲溶液的投料体积比为1:4～10；当所述的辅酶再生体系为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶时，所述的中间体、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的酮还原酶的投料质量比为1：1.2～1.3：0.005～0.015：0.01～0.03。
具体地，所述的中间体通过如下方法制备获得：
底物在乙酸丁酯和溴的存在下，在25℃～35℃下反应，静置分层，取有机相，向所述的有机相中加入碳酸钠溶液和吡咯烷，在pH为5～7、15℃～25℃下反应，静置分层，取有机相，然后干燥得到所述的中间体，其中，所述的底物的结构式为：(苯丙酮)。
更具体地，在起始反应体系中，所述的底物、所述的乙酸丁酯、所述的溴、所述的碳酸钠溶液、所述的吡咯烷的投料质量比为1:2～2.4:1～1.3:2.8～3.2:0.8～1，所述的碳酸钠溶液的质量百分比为12％～18％。
更具体地，制备所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的具体步骤如下：
步骤(1)、在反应器中加入所述的乙酸丁酯和所述的底物，在29℃～31℃下滴加所述的溴，并将生成的溴化氢吸出，滴加完毕后继续反应18min～22min，然后加入冰水，静置分层，水层以乙酸丁酯洗涤多次后，合并有机相，19℃～21℃下同时滴加吡咯烷和质量百分比为14％～16％的碳酸钠溶液，控制pH 5.0～7.0，滴加结束后继续反应18min～22min，然后加入冰水静置分层， 水层以乙酸丁酯洗涤多次后，合并有机相，旋蒸干燥得到所述的中间体；
将所述的中间体、所述的酮还原酶、所述的辅酶、所述的辅酶再生体系加至装有所述的缓冲溶液的反应器中，在34℃～36℃下搅拌23～25小时，HPLC/MS检测转化率，调节反应体系的pH为2.8～3.2，加入乙酸乙酯搅拌，过滤后弃有机相，调节水相的pH为9.8～10.2，然后用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相旋蒸获得所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明从廉价易得的底物出发得到中间体，中间体为消旋体，然后利用酮还原酶对S构型的中间体进行不对称还原，得到(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱，剩余的R构型中间体在反应条件下发生自发消旋，本发明避免了去甲麻黄碱的使用，使产品的产率超过50％的理论收率，降低了生产成本。
附图说明
附图1为现有技术的合成路线；
附图2为本发明的合成路线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
本发明的合成路线参见图2。
实施例1：
反应器中加入300g乙酸丁酯和134g底物(苯丙酮)，30℃下缓慢滴加溴160g，保持负压将生成的溴化氢吸出，滴加完毕后继续搅拌20min，加入100g冰水后静置分层，水层以100g乙酸丁酯洗涤三次后，合并有机相，20℃下同时滴加400g 15％碳酸钠溶液和120g吡咯烷，控制pH5.5，滴加结束后继续搅拌20min，加入150g冰水后静置分层，水层以150g乙酸丁酯洗涤三次后，合并有机相，旋蒸干燥得到中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)160g，HPLC纯度99％。
实施例2：
中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)100g、异丙醇200mL加至装有800mL100mM pH 8.5磷酸盐缓冲溶液的2L反应器中搅拌均匀，依次加入 KRED(采购自苏州汉酶，牌号EW104)2g，NADP 0.2g，在35℃下搅拌24小时，HPLC/MS检测转化率99.5％，调节pH至3.0，加入1L乙酸乙酯搅拌，过滤后弃有机相，调节水相的pH至10.0，用1L乙酸乙酯萃取3次，合并有机相旋蒸获得产物(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱95g，ee值99.5％，de值99.9％，纯度99.0％。
实施例3：
中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)100g、异丙醇100mL加至装有900mL100mM pH 8.5磷酸盐缓冲溶液的2L反应器中搅拌均匀，依次加入KRED(采购自苏州汉酶，牌号EW104)2g，NADP 0.2g，在35℃下搅拌20小时，HPLC/MS检测转化率99.5％，调节pH至3.0，加入1L乙酸乙酯搅拌，过滤后弃有机相，调节水相的pH至10.0，用1L乙酸乙酯萃取3次，合并有机相旋蒸获得产物(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱95g，ee值99.5％，de值99.9％，纯度99.0％。
实施例4：
中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)100g、异丙醇100mL加至装有900mL100mM pH 8.5磷酸盐缓冲溶液的2L反应器中搅拌均匀，依次加入KRED(采购自苏州汉酶，牌号EW104)2g，NADP 0.2g，分别于20℃和50℃下搅拌24小时，HPLC/MS检测转化率分别为85.1％和52.5％，产物ee值分别为98.5％和98.0％。
实施例5：
中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)100g、异丙醇100mL分别加至装有900mL100mM pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液和9.0的三乙醇胺-盐酸缓冲溶液的2L反应器中搅拌均匀，依次加入KRED(采购自苏州汉酶，牌号EW104)2g，NADP 0.2g，在35℃下搅拌24小时，HPLC/MS检测转化率分别为87.7％和96,6％，ee值分别为99.0和98.3％。
实施例6：
中间体(1-苯基-2-吡咯烷-1-基丙-1-酮)100g、葡萄糖123g加至装有900mL 100mMpH 7.5的磷酸盐缓冲溶液的2L反应器中搅拌均匀，依次加入KRED(采购自苏州汉酶，牌号EW104)2g，葡萄糖脱氢酶GDH(采购自苏州汉酶，牌号EW102)1g，NADP 0.2g，在35℃下搅拌24小时，HPLC/MS 检测转化率为99.1％，de值95.0％，ee值为99.0％。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1. 一种(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：中间体在酮还原酶、辅酶及辅酶再生系统的存在下，在pH 7~9.5的缓冲溶液中，在20℃~50℃下反应生成所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱，其中，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、或者异丙醇，在起始反应体系中，所述的中间体的浓度为90~150g/L，所述的酮还原酶、所述的辅酶与所述的中间体的投料质量比为0.01~0.03:0.001~0.003:1，所述的辅酶为NADP，
所述的中间体的结构式为：，
所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱为：。
2.根据权利要求1所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：所述的酮还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW104的酮还原酶。
3.根据权利要求1所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液的pH为7.5~8.5，摩尔浓度为95~105mM。
5.根据权利要求1所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：所述的反应温度为30℃~40℃。
6.根据权利要求1所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：当所述的辅酶再生体系为异丙醇时，所述的异丙醇与所述的缓冲溶液的投料体积比为1:4~10；当所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶时，所述的中间体、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的酮还原酶的投料质量比为1：1.2~1.3：0.005~0.015：0.01~0.03。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：所述的中间体通过如下方法制备获得：
底物在乙酸丁酯和溴的存在下，在25℃~35℃下反应，静置分层，取有机相，向所述的有机相中加入碳酸钠溶液和吡咯烷，在pH为5~7、15℃~25℃下反应，静置分层，取有机相，然后干燥得到所述的中间体，其中，所述的底物的结构式为：。
8.根据权利要求7所述的所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：在起始反应体系中，所述的底物、所述的乙酸丁酯、所述的溴、所述的碳酸钠溶液、所述的吡咯烷的投料质量比为1:2~2.4:1~1.3:2.8~3.2:0.8~1，所述的碳酸钠溶液的质量百分比为12%~18%。
9.根据权利要求8所述的所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的生物制备方法，其特征在于：制备所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱的具体步骤如下：
步骤（1）、在反应器中加入所述的乙酸丁酯和所述的底物，在29℃~31℃下滴加所述的溴，并将生成的溴化氢吸出，滴加完毕后继续反应18 min ~22 min，然后加入冰水，静置分层，水层以乙酸丁酯洗涤多次后，合并有机相，19℃~21℃下同时滴加吡咯烷和质量百分比为14%~16%的碳酸钠溶液，控制pH 5.0~7.0，滴加结束后继续反应18 min ~22 min，然后加入冰水静置分层，水层以乙酸丁酯洗涤多次后，合并有机相，旋蒸干燥得到所述的中间体；
步骤（2）、将所述的中间体、所述的酮还原酶、所述的辅酶、所述的辅酶再生系统加至装有所述的缓冲溶液的反应器中，在34℃~36℃下搅拌23~25小时，HPLC/MS检测转化率，调节反应体系的pH为2.8~3.2，加入乙酸乙酯搅拌，过滤后弃有机相，调节水相的pH为9.8~10.2，然后用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相旋蒸获得所述的(1R,2S)-N-吡咯烷基去甲麻黄碱。
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